Warunkowe przeprogramowanie pediatrycznych ludzkich komórek nabłonka przełyku do wykorzystania w inżynierii tkankowej i badaniach chorób

Ogólnym celem tej procedury jest rozszerzenie komórek nabłonka przełyku pochodzących od pacjenta z biopsji endoskopowych w celu zbadania chorób przełyku lub stworzenie rusztowania 3D przełyku do dalszego modelowania lub wymiany tkanki przełyku. Metodę tę można wykorzystać do lepszego zrozumienia roli komórek nabłonka przełyku w chorobie przełyku. Mogą być również używane do oglądania rusztowań 3D do modelowania lub implantacji.

Zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona na generowanie komórek nabłonkowych specyficznych dla pacjenta z bardzo małego kawałka tkanki bez konieczności jakichkolwiek modyfikacji genetycznych lub trwałych. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zrozumienia patogenezy eozynofilowego zapalenia przełyku, a także opracowania metod leczenia atrezji przełyku i eozynofilowego zapalenia przełyku. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej technice będą miały trudności ze zdolnością do całkowitego usunięcia komórek zasilających przed pobraniem ludzkich komórek nabłonka przełyku w celu utrzymania czystości.

Technikę tę zademonstruje Christopher Foster, technik z naszego laboratorium. Co najmniej trzy dni przed pobraniem próbek od pacjenta należy umieścić komórki 3T3 w pożywce hodowlanej 3T3 w kolbach T75 poddanych działaniu tkanek. W dniu eksperymentu, tuż przed pobraniem próbek, odłącz komórki 3T3 z 5 mililitrami 0,25% trypsyny-EDTA na kolbę na około pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Gdy większość komórek unosi się na wodzie, dodaj 5 mililitrów pożywki 3T3, aby zatrzymać reakcję i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić osad w podłożu w celu policzenia. Następnie przenieś odpowiednią liczbę komórek do wysiewu do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Następnie dodaj 25 mililitrów świeżej pożywki 3T3 do komórek w celu napromieniowania pod ciśnieniem 3000 radów. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w pożywce do programowania warunkowego w ilości pięciu mililitrów na 100 milimetrową płytkę. Po uzyskaniu około sześciu biopsji przełyku w czasie endoskopii, umieść sześć biopsji w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej kompletną pożywkę keratynocytów bez surowicy, uzupełnioną Primociną na mokrym lodzie.

Umieścić jedną biopsję w pięciu mililitrach buforowanej formaliny na mokrym lodzie i umieścić jedną biopsję w małym kriofordzie biopsyjnym zawierającym podłoże do zatapiania. Natychmiast zanurz formę w zlewce z lodem lub pentanem w pojemniku z ciekłym azotem. Po zamrożeniu tkanki umieść kriomold w worku na próbki na suchym lodzie, w pojemniku z pianki polistyrenowej.

Następnie umieść probówki z biopsjami w zamykanej torbie w pudełku wysyłkowym z etykietą zagrożenia biologicznego zawierającą mokry lód, a następnie zamknij i oznacz oba pojemniki naklejką zagrożenia biologicznego do transportu do laboratorium. Po wejściu do laboratorium natychmiast przenieś zamrożoną biopsję do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu dalszego cięcia lub ekstrakcji RNA. Umieść próbkę w formalinie w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu utrwalenia przez noc, a pozostałe biopsje umieść w wirówce.

Zastąp pożywkę w każdej probówce 10 mililitrami roztworu dispazy i zamknij probówki na 15-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Pod koniec inkubacji ponownie odkręć biopsje i ponownie zawieś próbki w pięciu mililitrach 0,25% trypsyny-EDTA. Przenieś biopsje na pojedynczą sterylną płytkę o pojemności 100 mililitrów i użyj dwóch wysterylizowanych maszynek do golenia, aby zmielić tkanki tak drobno, jak to możliwe.

Po przecięciu całej tkanki przenieś fragmenty tkanki do nowej 15-mililitrowej probówki i przepłucz płytkę dwa razy pięcioma mililitrami 0,05% trypsyny-EDTA. Zebrać popłuczyny w probówce i umieścić próbki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 10 minutach odwirować strawione fragmenty próbki i komórki podające, a następnie ponownie zawiesić granulki w pięciu mililitrach warunkowego podłoża przeprogramowującego każde.

Następnie połącz próbki z biopsji przełyku i karmnika w jednej probówce i dodaj kinazę rho lub inhibitor ROCK do komórek w celu ich wspólnej hodowli na pokrytym żelatyną naczyniu do hodowli tkankowej. Po około pięciu dniach usuń pożywkę i rozdrobnione kawałki biopsji przez aspirację i spłucz naczynie dwa do trzech razy pięcioma mililitrami sterylnego PBS. Po ostatnim myciu dodaj do płytki 10 mililitrów świeżej pożywki uzupełnionej inhibitorem ROCK i włóż kokulturę z powrotem do inkubatora, aż komórki osiągną 70% zbieżności.

Aby rozszerzyć komórki, wyjmij podajniki z pięcioma mililitrami 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza na nie dłużej niż dwie i pół minuty. Przepłucz płytkę pięcioma mililitrami świeżego PBS, aby usunąć pływające komórki zasilające, i dodaj pięć mililitrów 0,25% trypsyny-EDTA na pięć do 10 minut inkubacji, aż próbki biopsji zostaną poluzowane od spodu płytki. Następnie przerwij reakcję za pomocą 10 mililitrów świeżej pożywki i przenieś komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania.

Ponownie zawiesić osad na świeżym warunkowym pożywce do przeprogramowania w celu liczenia, a teraz umieścić jeden razy 10 do szóstych ludzkich komórek przełyku w nowej stożkowej probówce. Dodaj 1,2 razy 10 do szóstych napromieniowanych komórek 3T3 do komórek przełyku i doprowadź całkowitą objętość w probówce do 15 mililitrów za pomocą świeżego warunkowego podłoża do przeprogramowywania. Następnie dodaj świeży inhibitor ROCK do komórek i umieść kokulturę na pokrytym żelatyną 150-milimetrowym naczyniu.

Aby zamrozić komórki przełyku do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, wyjmij podajniki i odłącz komórki przełyku, jak właśnie pokazano. Następnie przenieś komórki do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów w celu odwirowania i ponownie zawiesić osad w stężeniu od jednego razy 10 do szóstego na dwa mililitry roztworu zamrażającego. Następnie przenieś dwa mililitry komórek do każdego wstępnie znakowanego kriowialu i przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny przed przeniesieniem ich do długotrwałego przechowywania ciekłego azotu.

Kolonie komórek nabłonkowych utworzą się w ciągu około czterech do pięciu dni i będą otoczone komórkami odżywiającymi fibroblasty. W miarę rozwoju tych kolonii będą łączyć się z innymi koloniami, tworząc większe kolonie. Gdy kultura stanie się w 70% zlewna, należy je rozszerzyć.

Po usunięciu komórek zasilających, przylegające komórki nabłonkowe mogą zostać poddane trypsonizacji i ponownie posiane na nowych napromieniowanych komórkach zasilających. Charakterystyka fenotypowa tych komórek za pomocą qRT-PCR ujawnia regulację w górę P63, markera komórek progenitorowych na końcu pierwszego pasażu, w porównaniu z początkową próbką bioszpiegowską, co wskazuje, że komórki zostały przeprogramowane do stanu bardziej przypominającego progenitor. Kiedy komórki te są przenoszone na normalne płytki hodowlane tkankowe, ekspresja P63 zmniejsza się, a ekspresja białka ścisłego połączenia lub TJP1 i E-kadheryny wzrasta, co świadczy o przesunięciu fenotypu z komórki progenitorowej do bardziej zróżnicowanej komórki nabłonkowej.

Analiza cytometryczna przepływowa komórek po pasażu pierwszym wskazuje, że ponad 90% komórek jest również dodatnich dla EpCAM. Barwienie immunofluorescencyjne pokazuje, że komórki zachowują marker nabłonkowy, marker progenitorowy, marker proliferacji i ekspresję białka ścisłego połączenia nabłonkowego. Czas podwojenia komórek przełyku od niechorego pacjenta został obliczony na około 36 do 40 godzin, chociaż jest prawdopodobne, że czas podwojenia chorych komórek będzie wolniejszy.

Po opanowaniu tej techniki należy ją wykonać w ciągu około godziny. Próbując wykonać tę procedurę, należy użyć sterylnej techniki, aby zapobiec zanieczyszczeniu, i należy działać szybko, aby utrzymać żywotność komórek. Po tej procedurze można wykonać inne testy, takie jak hodowla transwell, w celu oceny, które antygeny powodują zapalenie przełyku lub patogenezę.

Po opracowaniu, test ten utoruje naukowcom drogę do zidentyfikowania antygenów wyzwalających powodujących eozynofilowe zapalenie przełyku, a także nowych opcji leczenia tych pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i rozszerzać komórki nabłonka przełyku z biopsji endoskopowych do wykorzystania w badaniu chorób przełyku lub generowaniu modeli 3D. Nie zapominaj, że praca z ostrymi narzędziami i tkankami biologicznymi może być niebezpieczna.

Pamiętaj, aby odpowiednio utylizować ostre narzędzia i stosować dobre praktyki bezpieczeństwa biologicznego.