Name: Warunkowe przeprogramowanie pediatrycznych ludzkich komórek nabłonka przełyku do wykorzystania w inżynierii tkankowej i badaniach chorób (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj metodę warunkowego przeprogramowania pediatrycznych komórek nabłonka przełyku z biopsji endoskopowych bez modyfikacji genetycznej. Technika umożliwia badanie chorób przełyku i inżynierię tkankową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Connecticut Children's Medical Center Strategic Research Funding za wsparcie tej pracy.

Biopsje przełyku wykonano po uzyskaniu świadomej zgody rodziców/opiekunów pacjentów pediatrycznych i zgodnie z instytucjonalną komisją rewizyjną (IRB#13-094).
1. Narzędzia do sterylizacji i roztwór żelatyny
<ol>
	<li>Autoklaw kleszczy, żyletki i nożyczki przed kontaktem z tkanką, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
	<li>Aby przygotować 200 ml 0,1% roztworu żelatyny, połącz 200 ml wody destylowanej z 0,2 g żelatyny. Autoklaw i schłodzić przed użyciem.</li>
</ol>
2. Powlekanie płytek do hodowli tkanek
<ol>
	<li>Około 2 godziny przed izolacją komórek dodać 0,1 % żelatyny w ilości wystarczającej do pokrycia naczynia do hodowli tkankowej (100 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych. 
	UWAGA: Płytki te można również wykonać z wyprzedzeniem i przechowywać w inkubatorze przed użyciem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworu enzymatycznego do dysocjacji
<ol>
	<li>Około 30 minut przed izolacją komórek odważyć 10 jednostek dypazy na wadze opartej na stężeniu jednostek na miligram w fiolce. Umieścić proszek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Wytwarzanie pożywki do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Aby uzyskać 50 ml warunkowego przeprogramowania, wymieszaj następujące składniki w sterylnej stożkowej probówce: 35 ml F12 (pożywka szynki), 11,5 ml DMEM, 0,5 ml L-glutaminy, 0,5 ml 100x penicylina/streptomycyna, 2,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 250 μg insuliny ludzkiej, 500 ng ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).</li>
	<li>Aby uzyskać 500 ml pożywki 3T3, wymieszaj 50 ml FBS, 5 ml 100x penicyliny/streptomycyny i 5 ml L-glutaminy z 500 ml DMEM.</li>
	<li>Aby przygotować 500 ml pożywki wolnej od keratynocytów, należy rozmrozić EGF i suplementy ekstraktu z przysadki bydlęcej (BPE) (dostarczone z pożywką). Dodaj suplementy do 500 ml butelki z podłożem bazowym i dodaj 5 ml 100x penicyliny/streptomycyny</li>
</ol>
5. Hodowla i napromienianie komórek 3T3 jako źródła zasilającego
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę 3T3, zawierającą DMEM, 10% FBS, 1x penicylinę/streptomycynę i 2 mM L-glutaminę.</li>
	<li>Hodowla komórek 3T3 w kolbach T-75 poddanych działaniu tkanek co najmniej 3 dni przed przybyciem próbek od pacjenta.
	<ol>
		<li>Tuż przed przybyciem próbek od pacjenta trypsynować komórki 3T3 za pomocą 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA na kolbę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy większość komórek zacznie unosić się na wodzie</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 5 ml pożywki 3T3, aby zatrzymać reakcję. Odessać zawiesinę komórkową i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w określonej objętości błękitu trypanowego w celu zliczenia komórek. Połącz 10 μl komórek z 10 μl błękitu trypanowego, aby wykluczyć martwe komórki. Załadować 10 μl tego roztworu do hemocytometru do zliczania komórek. 
	UWAGA: W przypadku tego protokołu gęstość wysiewu dla napromieniowanych komórek 3T3 wynosi 10 900 komórek na cm2, co jest równe 600 000 komórek na płytkę 100 mm.</li>
	<li>Podwielokrotnić liczbę komórek niezbędną do nałożenia płytki o średnicy 100 mm na próbkę pacjenta i ponownie zawiesić w 25 ml pożywki 3T3 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i napromienić 3000 radów.</li>
	<li>Po napromieniowaniu należy odwirować komórki przez 5 minut przy 300 x g i ponownie zawiesić w warunkowym podłożu przeprogramowującym w ilości 5 ml na 100 mm płytki.</li>
	<li>Odłóż probówkę na bok do czasu, gdy posiew komórek pacjenta odbędzie się w dalszej części protokołu (patrz krok 7.6).</li>
</ol>
6. Pozyskiwanie, przechowywanie i transport pediatrycznych biopsji przełyku
<ol>
	<li>Dodaj 5 ml kompletnej pożywki bez surowicy keratynocytów ze 100 μg/ml primocyny do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i przynieś do placówki medycznej na lodzie. 
	UWAGA: Te probówki z medium można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.</li>
	<li>Wykonaj około 8 biopsji przełyku w czasie endoskopii i oddziel je w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Umieścić sześć biopsji w stożkowym roztworze o pojemności 15 ml zawierającym kompletną pożywkę wolną od surowicy keratynocytów ze 100 μg/ml prymocyny i umieścić na mokrym lodzie.</li>
		<li>Umieścić jedną biopsję w 5 ml buforowanej formaliny i umieścić na mokrym lodzie.</li>
		<li>Umieścić jedną biopsję w małym kriofordzie biopsyjnym ze związkiem o optymalnej temperaturze cięcia.
		<ol>
			<li>Natychmiast wrzuć tę formę do zlewki z izopentanem umieszczoną w ciekłym azocie. Po zamrożeniu umieść kriomold w torbie na próbki i przechowuj na suchym lodzie w pojemniku z pianki polistyrenowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić probówki zawierające biopsje w pożywce lub formalinie w zamykanej torbie, a następnie w pudełku transportowym zawierającym mokry lód. Zapieczętować i oznaczyć pudełko etykietą zagrożenia biologicznego i przetransportować je do laboratorium. 
	UWAGA: Pojemnik zawierający suchy lód i zamrożoną biopsję jest również zapieczętowany i oznaczony etykietą zagrożenia biologicznego.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie tkanek pacjenta do dalszej hodowli i analizy
<ol>
	<li>Po przybyciu do laboratorium przenieść zamrożoną biopsję na suchym lodzie do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu dalszego cięcia lub ekstrakcji RNA. Umieść próbkę w formalinie. Przechowywać w lodówce o temperaturze 4°C i pozostawić na noc do zastygnięcia.</li>
	<li>Odkręć pozostałe biopsje w dół przy 300 x g i odessaj pożywkę. Dodać 10 ml roztworu dypazy do stożkowej probówki, zamknąć i pozostawić do inkubacji w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 15 minut.</li>
	<li>Po inkubacji odwirować biopsje w temperaturze 300 x g. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić biopsje w 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Przenieś 5 ml trypsyny-EDTA zawierającej biopsje na sterylną płytkę o średnicy 100 mm i zmiel biopsje za pomocą 2 wysterylizowanych żyletek tak drobno, jak to możliwe.</li>
	<li>Przenieść 5 ml biopsji mielonej zawierającej trypsynę-EDTA do nowego stożkowego biopsji o pojemności 15 ml. Opłucz płytkę dwukrotnie dodatkowymi 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA i dodaj do stożkowej probówki. Inkubować probówkę przez 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji należy odwirować biopsje przy 300 x g (1,4 obr./min) przez 5 minut i odessać pożywkę. Dodać 5 ml pożywki do przeprogramowania warunkowego do probówki stożkowej, jak również 5 ml pożywki do przeprogramowania warunkowego zawierającej napromieniowane ogniwa zasilające (patrz krok 5.7).</li>
	<li>Dodać inhibitor ROCK (1 μl/ml) do 10 ml zawiesiny komórkowej i płytki po odessaniu żelatyny z szalki do hodowli tkankowej. Inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
8. Hodowla i rozszerzanie komórek
<ol>
	<li>Po około 5 dniach hodowli należy odessać początkową pożywkę zawierającą kawałki biopsji mielonej i spłukać naczynie 2-3 razy sterylnym PBS o pojemności 5 ml. Dodać nową pożywkę do płytki wraz z inhibitorem ROCK w dawce 10 μM.</li>
	<li>Po osiągnięciu 70% konfluencji rozszerz komórki. Dodać 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA do płytki i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C nie dłużej niż 2,5 minuty w celu usunięcia komórek zasilających. Po tej inkubacji odessać trypsynę-EDTA i przepłukać płytkę 5 ml PBS.</li>
	<li>Odessać PBS i dodać 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA do płytki i inkubować przez 5-10 minut lub do momentu, gdy komórki zostaną luźno oderwane od płytki. Dodać równe ilości pożywki do płytki, aby zatrzymać reakcję i przenieść cały płyn do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować w dół z prędkością 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić komórki w określonej objętości pożywki do warunkowego przeprogramowania i zmieszać 10 μl zawiesiny z 10 μl błękitu trypanowego. Licz na hemocytometr, aby określić całkowitą liczbę komórek.</li>
	<li>Aby namnażać komórki, dodaj 1 milion ludzkich komórek przełyku do płytki o średnicy 150 mm wraz z 1,2 miliona napromieniowanych komórek 3T3 w łącznej objętości 15 ml. Dodać świeży inhibitor ROCK w temperaturze 10 μM i dodać zawiesinę komórek do naczynia pokrytego żelatyną o średnicy 150 mm.</li>
</ol>
9. Zamrażanie i przechowywanie ludzkich komórek nabłonka przełyku
<ol>
	<li>Aby uzyskać pożywkę do zamrażania, dodaj 10% DMSO do warunkowego medium do przeprogramowywania. Po trypsynizacji i zliczeniu podziel komórki na porcje, aby zamrozić je w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i wirować w dół z prędkością 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać pożywkę i dodać pożywkę do zamrażania w objętości 2 ml na kriowial. Gdy zawiesina komórek jest jednorodna, podwielokrotność 106 komórek we wstępnie znakowanych cyrovialach. Umieścić w pojemniku do zamrażania w temperaturze -80 °C na co najmniej 24 godziny przed przeniesieniem fiolek do długotrwałego przechowywania ciekłego azotu.</li>
</ol>

<ol><li>Clark, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+atresia+and+tracheoesophageal+fistula%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula.</a> Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).</li>
<li>Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+prevalence+of+eosinophilic+esophagitis+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Gastroenterol+Nutr%22%5BJournal%5D)">Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children.</a> J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).</li>
<li>Sjöqvist, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+orthotopic+transplantation+of+a+tissue-engineered+oesophagus+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats.</a> Nat Commun. 5, 3562(2014).</li>
<li>Saxena, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophagus+tissue+engineering%3A+designing+and+crafting+the+components+for+the+%27hybrid+construct%27+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach.</a> Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).</li>
<li>Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+ovine+esophageal+epithelial+cells+and+in+vitro+esophagus+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering.</a> Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).</li>
<li>Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophagus+tissue+engineering%3A+hybrid+approach+with+esophageal+epithelium+and+unidirectional+smooth+muscle+tissue+component+generation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastrointest+Surg%22%5BJournal%5D)">Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro.</a> J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).</li>
<li>Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+isolation+of+epithelial+cells+from+ovine+esophagus+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater+Eng%22%5BJournal%5D)">A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering.</a> Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).</li>
<li>Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Mouse+Models+in+Dissecting+the+Mechanism+of+Human+Eosinophilic+Gastrointestinal+Diseases+%28EGID%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol+Hepatol+Res%22%5BJournal%5D)">Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID).</a> J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).</li>
<li>Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Problems+and+Advantages+when+Applying+them+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine.</a> Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).</li>
<li>Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering tissue from human embryonic stem cells.</a> J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).</li>
<li>Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+an+argument+for+continued+research+on+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells.</a> Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).</li>
<li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2013).</li>
<li>Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+system+for+differentiation+of+intestinal+epithelium+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells.</a> Sci Rep. 5, 17297(2015).</li>
<li>Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human alveolar epithelial cells.</a> Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).</li>
<li>Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+and+human+tissue-engineered+esophagus+form+from+sufficient+stem%2Fprogenitor+cells+and+do+not+require+microdesigned+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+urothelial+cells+in+vitro%3A+proliferation+and+induction+of+stratification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification.</a> Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Geraghty, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+cell+lines+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of cell lines in biomedical research.</a> Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).</li>
<li>Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLodish%2C+H+%22Molecular+Cell+Biology%22">Molecular Cell Biology</a>. , W.H. Freeman. New York. (2000).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li>
<li>Davis, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+that+retains+epithelial+characteristics+after+prolonged+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).</li>
<li>Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+inflammation+on+the+proliferation+of+human+gingival+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro.</a> J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najważniejszymi krokami w celu wyizolowania i rozszerzenia komórek nabłonka przełyku z biopsji pacjenta są: 1) odpowiednia dysocjacja tkanki biopsyjnej przy minimalnej śmierci komórki; 2) upewnić się, że inhibitor ROCK jest dodawany do pożywki do hodowli komórkowej przy każdej zmianie pożywki; 3) Nie używaj więcej ogniw zasilających niż jest to zalecane; 4) utrzymuj czystą kulturę aseptyczną; oraz 5) komórki pasażowe tuż przed osiągnięciem konfluencji.
Ze względu na związane z pacjentem różnic...

Inżynieria tkankowa przełyku i eozynofilowe zapalenie przełyku (EoE) były przedmiotem badań w wielu laboratoriach w ciągu ostatniej dekady. Wady wrodzone, takie jak atrezja przełyku, występują u około 1 na 4 000 żywych urodzeń, co skutkuje niepełnym rozwojem przełyku prowadzącym do niezdolności do jedzenia1. Częstość występowania i rozpowszechnienie EoE wzrasta od czasu zidentyfikowania jednostki chorobowej w 1993 roku. Częstość występowania EoE wahała się od 0,7 do 10/100 000 na osoborok, a częstość występowania wahała się od 0,2 do 43/100 0002. Nowe, atrakcyjne podejście chirurgiczne do leczenia zarośnięcia przełyku polega na generowaniu konstruktów tkankowych do implantacji z wykorzystaniem własnych komórek pacjenta. Komórki te w połączeniu z syntetycznym rusztowaniem wygenerują autologiczny konstrukt, który nie wymaga supresji immunologicznej. Niektóre grupy już zaczęły badać wykorzystanie komórek macierzystych do inżynierii tkankowej przełyku 3, a także wykorzystanie natywnych komórek nabłonka przełyku do ponownego zasiedlenia błony śluzowej4-7. Choroby występujące w przełyku pacjentów pediatrycznych są często trudne do zdiagnozowania lub zbadania bez interwencji. Co więcej, wykorzystanie modeli zwierzęcych lub unieśmiertelnionych modeli linii komórkowych in vitro w chorobach dziecięcych, takich jak EoE, nie obejmuje dokładnej patogenezy choroby ani różnic specyficznych dla pacjenta8. W związku z tym możliwość badania procesu chorobowego pacjenta in vitro w celu zidentyfikowania określonych antygenów wywołujących chorobę, oceny mechanizmów leżących u podstaw choroby i zbadania leczenia farmakologicznego byłaby nowatorska i dostarczyłaby klinicystom informacji, które mogą pomóc w leczeniu pacjentów.
Było wiele autologicznych lub specyficznych dla pacjenta typów komórek, które zostały zaproponowane do wykorzystania w inżynierii tkankowej i badaniu patogenezy chorób ludzkich. Jednak niektóre z tych typów komórek mają ograniczoną zdolność do generowania wystarczającej liczby komórek o określonym fenotypie, aby zasiać duże rusztowanie lub przeprowadzić wysokoprzepustowe badania in vitro. Wykorzystanie pluripotencjalnych lub multipotencjalnych komórek macierzystych było tematem wielu dyskusji badawczych, jednak ograniczenia i niedociągnięcia w stosowaniu tych komórek zostały dobrze opisane9. Wykorzystanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych jest przedmiotem wielu dyskusji i wiąże się z wieloma kwestiami etycznymi. Co najważniejsze, komórki te tworzą potworniaki, które są podobne do guza, jeśli nie są różnicowane ze stanu pluripotencjalnego przed dostarczeniem ich do żywego gospodarza10. Co więcej, wykorzystanie embrionalnych komórek macierzystych nie byłoby specyficzne dla pacjenta i mogłoby wywołać odpowiedź allogeniczną i potrzebę supresji immunologicznej10. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) to komórki pluripotencjalne, które mogą pochodzić z własnych komórek pacjenta. Komórki somatyczne, takie jak komórki skóry, mogą być indukowane do stanu pluripotencjalnego przy użyciu różnych technik integracyjnych i nieintegracyjnych. Komórki te służą następnie jako specyficzne dla pacjenta źródła komórek do inżynierii tkankowej lub badania chorób. Integracja niechcianego materiału genetycznego z tymi komórkami jest problemem opisanym przez wielu, a nawet jeśli sekwencje zostaną całkowicie usunięte, iPSC wydają się zachowywać epigenetyczną "pamięć" w stosunku do typu komórki, z której pochodzą11. Komórki te również tworzą potworniaki in vivo, jeśli nie są zróżnicowane przed przeszczepem11. Zbadano wiele protokołów różnicowania, koncentrując się na liniach nabłonkowych12,13,14, jednak bardzo ważne jest, aby pamiętać, że typy komórek powstające na końcu różnicowania nie są jednorodne i posiadają tylko ułamek interesującego typu komórki. Skutkuje to niską wydajnością i koniecznością oczyszczenia pożądanego typu komórek. Chociaż komórki iPS są potencjalnym źródłem komórek specyficznym dla pacjenta, proces uzyskiwania typu komórek interesujących zarówno dla inżynierii tkankowej, jak i badań nad chorobą jest bardzo nieefektywny.
Ludzkie komórki nabłonkowe zostały pomyślnie wyizolowane z różnych zarówno chorych, jak i niechorych tkanek w ludzkim ciele, w tym: lung15, breast16, jelito cienkie17, colon18, bladder19 i esophagus20. Ważne jest, aby pamiętać, że ludzkie komórki pierwotne mają skończoną liczbę przejść, w których utrzymywany jest fenotyp21,22. Niestety, oznacza to, że liczba komórek potrzebnych do badania choroby lub do zasiania zmodyfikowanego rusztowania do implantacji może nie zostać osiągnięta. Dlatego potrzebne są nowe techniki, aby namnażać komórki pacjenta przy jednoczesnym zachowaniu fenotypu nabłonka. Warunkowe przeprogramowanie prawidłowych i nowotworowych komórek nabłonka z wykorzystaniem komórek zasilających i inhibitora ROCK zostało opisane w 2012 roku przez Liu i wsp.23. Technika ta została wykorzystana do namnażania nowotworowych komórek nabłonkowych uzyskanych z biopsji raka prostaty i piersi przy użyciu napromieniowanych komórek zasilających, inhibitora ROCK i warunkowego podłoża przeprogramowującego. Celem było wygenerowanie wystarczającej liczby komórek do testów in vitro, takich jak badania przesiewowe leków. Technika ta jest w stanie rozszerzać komórki nabłonkowe w nieskończoność poprzez "przeprogramowanie" tych komórek do stanu podobnego do macierzystego lub progenitorowego, który jest wysoce proliferacyjny. Wykazano, że komórki te nie są rakotwórcze i nie mają zdolności do tworzenia teratomas23,24. Co więcej, nie stwierdzono żadnych nieprawidłowości chromosomalnych ani manipulacji genetycznych po pasażowaniu tych komórek w hodowli przy użyciu tej techniki23,24. Co najważniejsze, komórki te są w stanie różnicować się tylko w natywny typ komórek. W związku z tym technika ta oferuje duży rezerwuar komórek nabłonkowych specyficznych dla pacjenta do badania chorób lub inżynierii tkankowej bez konieczności unieśmiertelniania.
Uzyskanie tkanki nabłonkowej z określonego narządu w celu zbadania procesów chorobowych jest często ograniczone i nie zawsze możliwe ze względu na ryzyko pacjenta. W przypadku pacjentów cierpiących na choroby lub wady przełyku, biopsja endoskopowa jest minimalnie inwazyjnym podejściem do uzyskania tkanki nabłonkowej, którą można zdysocjować i warunkowo przeprogramować, aby zapewnić nieokreślone źródło komórek, które jest specyficzne dla błony śluzowej przełyku tego pacjenta. Pozwala to na przeprowadzenie badań in vitro komórek nabłonka w celu oceny procesów chorobowych i badań przesiewowych pod kątem potencjalnych środków terapeutycznych. Jednym z procesów chorobowych, który może znacznie skorzystać z tego podejścia, jest eozynofilowe zapalenie przełyku, które zostało opisane jako choroba alergiczna przełyku8. Testy alergiczne, jak również podejścia terapeutyczne, mogą być oceniane in vitro przy użyciu własnych komórek nabłonkowych pacjenta, a dane te mogą być następnie przekazywane lekarzowi prowadzącemu w celu opracowania zindywidualizowanych planów leczenia. Technika warunkowego przeprogramowania w połączeniu z uzyskaniem biopsji endoskopowych od pacjentów pediatrycznych daje możliwość rozszerzania normalnych komórek nabłonka przełyku w nieskończoność u każdego pacjenta. To źródło komórek można zatem połączyć z naturalnymi lub syntetycznymi rusztowaniami, aby zapewnić specyficzną dla pacjenta opcję chirurgiczną w przypadku wad, chorób lub urazów. Posiadanie nieokreślonej liczby komórek pomogłoby w inżynierii konstruktów przełyku, które mają całkowicie ponownie wypełnione światło komórkami nabłonka przełyku, aby ułatwić regenerację pozostałych typów komórek.

<table><tbody><tr><td>Primocin</td><td>InVivogen</td><td>ant-pm2</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258-1L</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry wieprzowej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>TissueTek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Cryomatrix OCT</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>6769006</tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>Denville Scientific</td><td>C1017-p</td><td></td></tr><tr><td>Kompletna surowica bezkeratynocytów</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10724011</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór insuliny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ml</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK (Y-27632)</td><td>Fisher Scientific</td><td>125410</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Średni&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu</td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Naczynia Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>100 mm</td><td>Denville Naczynia Scientific</td><td>T1110-20</td><td></td></tr><tr><td>150 mm</td><td>Denville Scientific</td><td>T1115</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Stożkowe</td><td>Denville Scientific</td><td>&nbsp; C1062-9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>5 ml</td><td>Pipety Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipety</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>25 ml</td> Fisher <td>Scientific</td><td>1367811</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura 9"</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Komórki NIH 3T3 ATCC</td><td></td><td>CRL1658</td><td></td></tr></tbody></table>

warunkowe przeprogramowanie pediatrycznych ludzkich komórek nabłonka przełyku do wykorzystania w inżynierii tkankowej i badaniach chorób

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Identyfikacja i rozszerzanie komórek specyficznych dla pacjenta w hodowli do wykorzystania w inżynierii tkankowej i badaniach chorób może być bardzo trudne. Wykorzystanie różnych typów komórek macierzystych do uzyskania interesujących typów komórek jest często kosztowne, czasochłonne i wysoce nieefektywne. Co więcej, niepożądane typy komórek muszą zostać usunięte przed użyciem tego źródła komórek, co wymaga kolejnego kroku w procesie. Aby uzyskać wystarczającą ilość komórek nabłonka przełyku do inżynierii światła konstruktu przełyku lub do badań przesiewowych podejść terapeutycznych w leczeniu chorób przełyku, natywne komórki nabłonka przełyku muszą zostać namnażone bez zmiany ich ekspresji genów lub fenotypu. Warunkowe przeprogramowanie tkanki nabłonka przełyku stanowi obiecujące podejście do rozszerzania komórek nabłonka przełyku specyficznych dla pacjenta. Co więcej, komórki te nie muszą być sortowane ani oczyszczane i powrócą do dojrzałego stanu nabłonka po usunięciu ich z warunkowej hodowli przeprogramowującej. Technika ta została opisana w wielu badaniach przesiewowych w kierunku raka i pozwala na nieskończoną ekspansję tych komórek przez wiele pasaży. Możliwość wykonywania badań przesiewowych przełyku pomogłaby zrewolucjonizować leczenie chorób przełyku u dzieci, takich jak eozynofilowe zapalenie przełyku, poprzez identyfikację mechanizmu wyzwalającego powodującego objawy pacjenta. W przypadku pacjentów, którzy cierpią na wadę wrodzoną, chorobę lub uraz przełyku, to źródło komórek może być wykorzystane jako środek do zasiewu syntetycznego konstruktu do implantacji w celu naprawy lub zastąpienia dotkniętego obszaru.

Podsumowanie kluczowych etapów izolacji komórek nabłonkowych przełyku z biopsji pacjentów przedstawiono na Ryc. 1. Kolonie komórek nabłonkowych utworzą się w ciągu około 4-5 dni i będą otoczone przez fibroblastowe komórki dokarmiające (Ryc. 2A). W miarę rozrostu kolonie te będą łączyć się z innymi, tworząc większe skupiska (Ryc. 2B). Po osiągnięciu przez hodowle 70% konfluencji konieczne jest ich pasażowanie (Ryc. 2C). Ab...

Ekspansja ludzkich pediatrycznych komórek nabłonka przełyku za pomocą warunkowego przeprogramowania dostarcza badaczom specyficznej dla pacjenta populacji komórek, które mogą być wykorzystane do inżynierii konstrukcji przełyku do autologicznej implantacji w celu leczenia wad lub urazów i służyć jako rezerwuar dla terapeutycznych testów przesiewowych.

Warunkowe przeprogramowanie pediatrycznych ludzkich komórek nabłonka przełyku do wykorzystania w inżynierii tkankowej i badaniach chorób

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest namnożenie pochodzących od pacjenta komórek nabłonkowych przełyku z biopsji endoskopowych w celu badania chorób przełyku lub stworzenia trójwymiarowego (3D) rusztowania przełykowego do dalszego modelowania lub zastąpienia tkanki przełyku. Metoda ta może zostać wykorzystana do lepszego zrozumienia roli komórek nabłonkowych przełyku w chorobach przełyku. Mogą one być również wykorzystane do tworzenia rusztowań 3D do modelowania lub implantacji.Zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na generowanie specyficznych dla pacjenta komórek nabłonkowych z bardzo małego fragmentu tkanki, bez konieczności wprowadzania jakichkolwiek modyfikacji genetycznych lub trwałych. Implikacje tej techniki obejmują zrozumienie patogenezy ezofagitu eozynofilowego, a także opracowanie metod leczenia atrezji przełyku oraz ezofagitu eozynofilowego. Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice mają trudności z całkowitym usunięciem komórek karmicieli przed zbiorem ludzkich komórek nabłonkowych przełyku w celu zachowania czystości preparatu.Technikę tę zaprezentuje Christopher Foster, technik z naszego laboratorium. Co najmniej na trzy dni przed pobraniem próbek od pacje

conditional-reprogramming-pediatric-human-esophageal-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Ten manuskrypt opisuje produkcję, charakterystykę i potencjalne zastosowania konstruktu przełyku 3D wykonanego z normalnego pierwotnego ludzkiego fibroblastu przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych umieszczonych w pozbawionym komórek rusztowaniu wieprzowym. Wyniki wskazują na tworzenie się dojrzałego nabłonka warstwowego podobnego do normalnego ludzkiego przełyku.

Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Ta publikacja demonstruje metody skutecznego pobierania próbek i hodowli błony śluzowej nabłonka nosa od dzieci oraz przeprogramowania tych komórek na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC).

Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Rekonstrukcja przełyku jest wymagającą procedurą, a opracowanie inżynierii tkankowej przełyku, która umożliwia regenerację błony śluzowej i mięśni przełyku i która może być wszczepiona jako sztuczny przeszczep, jest konieczna. Tutaj przedstawiamy nasz protokół generowania sztucznego przełyku, w tym produkcję rusztowań, hodowlę bioreaktorów i różne techniki chirurgiczne.

Przeszczep inżynierii tkankowej do obwodowej rekonstrukcji przełyku u szczurów

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Obecny protokół opisuje możliwości i podstawowe metody hodowli Open-Top Organ-Chip do pomyślnego zakładania i dojrzewania pełnogrubych kultur narządów na chipach tkanek pierwotnych (skóry, pęcherzyków płucnych, dróg oddechowych i jelit), dając możliwość zbadania różnych funkcjonalnych aspektów interfejsu ludzkiej nabłonka/mezenchymalnej i niszy naczyniowej in vitro.

Odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym

Współhodowle organoidów i fibroblastów dostarczają modelu do badania niszy komórek macierzystych in vivo. W tym miejscu opisano protokół dla kokultur organoidów i fibroblastów przełyku. Dodatkowo obrazowanie całego mocowania służy do wizualizacji interakcji fibroblast-organoid.

Charakterystyka funkcjonalna i wizualizacja fibroblastów przełyku przy użyciu kokultur organoidowych

Tutaj dostępny jest protokół hodowli ludzkich organoidów przełykowych i kultury na granicy faz powietrze-ciecz. Kultura granicy faz powietrze-ciecz organoidów przełyku może być wykorzystana do badania wpływu cytokin na barierę nabłonkową przełyku.

Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych w celu zbadania bariery nabłonkowej w eozynofilowym zapaleniu przełyku

Niniejszy protokół opisuje tworzenie i analizę histologiczną modeli organoidów przełyku, które reprezentują różne etapy progresji nowotworu. Metoda ta umożliwia naukowcom badanie zmian w morfologii komórek, organizacji przestrzennej i wzorcach ekspresji markerów molekularnych podczas przejścia od tkanek normalnych do nowotworowych.

Ustalenie i analiza histologiczna organoidów przełyku modelujących progresję od tkanek prawidłowych do nowotworowych

Poznaj metodę warunkowego przeprogramowania pediatrycznych komórek nabłonka przełyku z biopsji endoskopowych bez modyfikacji genetycznej. Technika umożliwia badanie chorób przełyku i inżynierię tkankową.

Warunkowe przeprogramowanie pediatrycznych ludzkich komórek nabłonka przełyku do wykorzystania w inżynierii tkankowej i badaniach chorób (Wideo) | JoVE Journal

Warunkowe przeprogramowanie pediatrycznych ludzkich komórek nabłonka przełyku do wykorzystania w inżynierii tkankowej i badaniach chorób

Przeglądaj więcej filmów