MitoCeption: Przenoszenie izolowanych ludzkich mitochondriów MSC do komórek macierzystych glejaka

Ogólnym celem tej procedury jest przeniesienie wcześniej wyizolowanych mitochondriów z komórek dawcy, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste, do komórek docelowych, takich jak komórki macierzyste glejaka. Procedura ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metabolizmu, takie jak metaboliczne i biologiczne skutki mitochondriów, które są spontanicznie przenoszone między komórkami w procesach takich jak tunelowanie nanorurek lub mikropęcherzyków. Główną zaletą tej techniki jest to, że działanie mitochondriów można ocenić niezależnie od innych czynników obecnych w mikrośrodowisku, takich jak cytokiny lub metabolity, a także innych związków, które również mogą być transportowane w tunelowych nanorurkach.

Do celów obrazowania mitochondria MSC i GSC mogą być znakowane ważnymi barwnikami przed transferem mitochondriów za pomocą MitoCeption. Na początek, po wstępnym znakowaniu GSC ważnymi barwnikami zgodnie z protokołem tekstowym, zbierz neurosfery GSC w 50-mililitrowej probówce przez odwirowanie 270 razy g w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez pięć minut. Użyj pięciu mililitrów HBSS do umycia komórek i ponownie odkręć probówkę.

Odessać supernatant i za pomocą 100 mikrolitrów 0,25% trypsyny-EDTA delikatnie ponownie zawiesić granulkę GSC. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 20-milimolowego chlorku wapnia w dwóch mikrolitrach w stężeniu 10 miligramów na mililitr DNazy I do probówki.

Dysocjuj neurosfery za pomocą pipety P200, aby delikatnie pipetować w górę i w dół od 30 do 50 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków. Dodaj 10 mikrolitrów 5% inhibitora trypsyny w 10 mililitrach HBSS do komórek i odwiruj GSC przez siedem minut. Następnie odrzucić supernatant i 10 mililitrów pożywki podstawowej GSC do próbki.

Teraz, korzystając z komory liczącej Thoma, policz komórki przed ponownym wirowaniem. Dodać odpowiednią objętość pożywki proliferacyjnej GSC, aby osiągnąć koncentrat komórkowy od 10 do szóstego GSC na mililitr. Następnie wysiewaj od 10 do piątych GSC na dołek 96-dołkowej płytki.

Odwirować płytkę tak, aby GSC osiadły na dnie studzienek. Sprawdź komórki pod mikroskopem. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby przeprowadzić izolację mitochondriów MSC, należy rozpocząć od dostosowania temperatury mikrowirówki do czterech stopni Celsjusza. Przygotuj dwie 1,5-mililitrowe probówki oznaczone jako A i C, zawierające odczynniki do ekstrakcji mitochondriów. Przygotuj dwie dodatkowe probówki oznaczone MSC i MiTo.

Trzymaj probówki na lodzie. Przygotuj również probówki do seryjnych rozcieńczeń mitochondriów, które zostaną ustawione z preparatem mitochondriów. Użyj 10 mililitrów PBS podgrzanego do 37 stopni Celsjusza do umycia MSC.

Następnie za pomocą dwóch mililitrów trypsyny wolnej od EDTA myj komórki przez 10 sekund i dodaj dodatkowy jeden mililitr trypsyny przed inkubacją komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Należy unikać stosowania EDTA zgodnie z protokołem, w szczególności w przypadku trypsynizacji MSC oraz inhibitora proteazy stosowanego w preparacie mitochondriów. Odzyskaj MSC, dodając 10 mililitrów Alpha MEM 10% FBS i przenieś zawiesinę do 50-mililitrowej tuby.

Następnie odwiruj komórki. Wyrzuć supernatant i dodaj 10 mililitrów Alpha MEM 10% FBS do osadu komórkowego. Następnie użyj komory liczącej Malasseza, aby policzyć MSC, a następnie obrócić się w dół od czterech do pięciu razy 10 do piątej komórki.

Wyrzuć supernatant, dodaj jeden mililitr lodowatego Alpha MEM 10% FBS do osadu komórkowego i przenieś komórki do wcześniej przygotowanej probówki z oznaczeniem MSC, kontynuując utrzymywanie jej na lodzie. Następnie odwirować probówkę MSC o ciśnieniu 900 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i usunąć całą pozostałą pożywkę z probówki. Następnie dodaj 200 mikrolitrów odczynnika A do izolacji mitochondriów z inhibitorami proteazy wolnych od EDTA do MSC i wiruj ze średnią prędkością przez pięć sekund.

Następnie pozostaw probówki na lodzie dokładnie na dwie minuty. Dodaj 2,5 mikrolitra odczynnika B do izolacji mitochondriów i wiruj komórki z maksymalną prędkością przez 10 sekund przed ponownym umieszczeniem probówek na lodzie. Powtarzaj wir co 30 sekund przez pięć minut.

Teraz dodaj 200 mikrolitrów odczynnika C do izolacji mitochondriów z inhibitorami proteazy wolnymi od EDTA do probówki i wymieszaj zawartość, przechylając probówkę około 30 razy. Odwirować probówki w temperaturze 700 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Przenieść supernatant zawierający mitochondria MSC do wcześniej przygotowanej probówki MiTo.

Odwirować próbkę z prędkością 3 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Po odrzuceniu supernatantu należy użyć 200 mikrolitrów odczynnika C do przepłukania osadu mitochondrialnego. Następnie wiruj zawiesinę pod ciśnieniem 12 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby ogranulować organelle.

Aby przenieść izolowane mitochondria MSC do GSC, dodaj 200 mikrolitrów wstępnie schłodzonej pożywki proliferacyjnej GSC do osadu mitochondrialnego. Rozcieńczyć preparat mitochondrialny w pożywce proliferacyjnej GSC, aby konsekwentnie umożliwić dodanie 20 mikrolitrów zawiesiny mitochondrialnej do GSC. Następnie powoli dodaj mitochondria blisko dna studzienki.

Aby kontrolować wyciek barwnika istotnego dla mitochondriów MSC, należy dodać taką samą ilość preparatu mitochondrialnego do studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej tylko pożywkę proliferacyjną GSC. Odwirować płytki w temperaturze 1 500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie natychmiast umieść kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia, aby przeanalizować studzienki kontrolne pod kątem wycieku barwnika do życia, wysiewaj komórki GSC, jak opisano wcześniej, odwiruj płytkę, a następnie inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Odwirować 96-dołkową płytkę zawierającą tylko mitochondria. Następnie odessać pożywkę z płytki dołkowej GSC 96 i zastąpić ją supernatantem mitochondriów.

Inkubuj GSC z supernatantem mitochondriów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Na koniec przeprowadź analizę transferu mitochondriów, analizę FACS i obrazowanie konfokalne zgodnie z protokołem tekstowym. GSC to rakowe komórki macierzyste hodowane jako neurosfery w celu zachowania ich właściwości komórek macierzystych.

Tuż przed transferem mitochondrialnym są one wysiewane jako pojedyncze komórki, aby umożliwić wysoką wydajność transferu mitochondriów, a następnego dnia, jak pokazano tutaj, obserwuje się, jak komórki ponownie tworzą neurosfery. Na tym rysunku można zobaczyć znakowane fluorescencyjnie mitochondria MSC zlokalizowane wewnątrz Gb4 GSC. Mitochondria MSC pojawiają się w GSC podobnie jak mitochondria GSC.

Transfer mitochondriów MSC można było zaobserwować dla większości GSC w rekonstrukcji 3D z obrazów konfokalnych GSC, które potwierdzają międzykomórkową lokalizację przenoszonych mitochondriów MSC. Wstępne znakowanie GSC zarówno niebieskimi, komórkowymi, jak i czerwonymi mitochondrialnymi barwnikami witalnymi pozwoliło na wizualizację lokalizacji przenoszonych mitochondriów MSC widocznych na zielono w stosunku do endogennych mitochondriów GSC. Jak pokazano tutaj, MitoCeption wraz ze wzrostem ilości fluorescencyjnych mitochondriów MSC doprowadził do zwiększenia sygnałów FACS i o kilka rzędów wielkości wyższych niż sygnał kontrolny.

Przedstawiony tutaj protokół transferu mitochondriów, przeprowadzony na pojedynczych komórkach GSC, wykazał odpowiedź zależną od dawki i względną średnią intensywność fluorescencji. Wreszcie, chociaż transfer mitochondriów MSC osiągnięto również w neurosferach GSC, skuteczność transferu do GSC w tych warunkach była niższa w porównaniu z mitochondriami przeniesionymi do GSC po raz pierwszy wysianych jako pojedyncze komórki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby przez cały czas trzymać preparat mitochondriów na lodzie. Po tych procedurach można wykonać inne metody, takie jak FACS, mikroskopia konfokalna, QPCR na mitochondrialnym DNA w celu wizualizacji i ilościowego określenia transferu mitochondriów MSC do komórek docelowych. Można również przeprowadzić badania funkcjonalne w celu określenia skutków biologicznych przenoszonych mitochondriów.

Należy pamiętać, że badania te będą na ogół wykonywane z mniejszą ilością mitochondriów niż te używane do wizualizacji transferu mitochondriów. Technika ta pozwoli na zbadanie wyników i skutków biologicznych mitochondriów, które są spontanicznie przenoszone między komórkami w normalnych warunkach fizjologicznych lub patologicznych, a tym samym przyczyni się do opracowania nowych metod leczenia.