Name: MitoCeption: Przenoszenie izolowanych ludzkich mitochondriów MSC do komórek macierzystych glejaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę MitoCeption do przenoszenia izolowanych mitochondriów MSC do komórek macierzystych glejaka w celu badania ich wpływu na metabolizm i funkcje komórkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Andrei Parmeggiani (L2C i DIMNP, Montpellier), Benoit Charlotowi (IES, Montpellier) oraz członkom laboratorium za pomocne dyskusje, Christophe'owi Duperrayowi za pomoc w analizie FACS, ośrodkowi obrazowania Montpellier RIO (MRI) za zapewnienie odpowiedniego środowiska dla FACS i mikroskopii konfokalnej. B.N.M był wspierany przez stypendium dla absolwentów LabEx Numev (konwencja ANR-10-LABX-20). A.B. była stypendystką Uniwersytetu Warszawskiego i Unii Europejskiej (nr POKL.04.01.02-00-221/12). M.L.V jest pracownikiem naukowym w Narodowym Centrum Badań Naukowych (CNRS).

Dzień 1
1. Oznaczanie mitochondriów mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Dwa dni przed przygotowaniem mitochondriów należy wysiać ludzkie MSCs w 100 mm szalce hodowlanej, w 10 ml αMEM/FBS 10%, tak aby w dniu 1 w kulturze znajdowały się 4 x 105 MSC.</li>
	<li>Przepłukać MSCs PBS (4 ml) i dodać 4 ml αMEM/FBS 1% (podgrzane do 37 °C).</li>
	<li>Dodać wymaganą ilość barwnika witalnego mitochondriów i inkubować komórki przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór barwnika mitochondriów, dwukrotnie przepłukać komórki 4 ml podgrzanego (37 °C) αMEM/FBS 1% i dodać z powrotem 4 ml αMEM/FBS 10%. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zmienić pożywkę hodowlaną (10 ml αMEM/FBS 10%) po 30 minutach, a innym razem 2 godziny później.</li>
</ol>
Dzień 1
2. Znakowanie komórek macierzystych glejaka (GSC) (opcjonalnie, zobacz sekcję dyskusji)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pożywka do hodowli komórkowych</td>
			<td>kompozycja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Podłoże podstawowe GSC </td>
			<td>DMEM/F-12 uzupełniony o </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulina 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suplement N2 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza 3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="9">Medium proliferacyjne GSC</td>
			<td>Dodaj do podłoża podstawowego: </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 suplement 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grzyb 10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizon 0,25 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparyna 2 mg /ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloksacyna 2 μg / ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycyna 2 μg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Podłoże proliferacyjne MSC </td>
			<td>αMEM uzupełniony o</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF 2 ng/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Pożywki hodowlane.
<ol>
	<li>Dysocjacja GSC (linia komórkowa Gb4 <klasa sup = "xref">32 (10 x 106 komórek) hodowane jako neurosfery na kolbach do hodowli komórkowych pokrytych poli-HEMA (patrz kroki 3.1 do 3.12).</li>
	<li>Nasiona GSC w 48-dołkowej płytce w10-5 komórkach/baseniku w pożywce proliferacyjnej GSC (500 μl) (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Odwirować płytkę o masie 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Dodać wymaganą ilość barwnika do czynności życiowych komórek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 500 μl podłoża podstawowego GSC (Tabela 1) na dołek płytki 48-dołkowej.</li>
	<li>Odwirować płytkę przy 270 x g w temperaturze 20 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.</li>
	<li>Powtórz kroki od 2.5 do 2.6.</li>
	<li>Dodać 500 μl pożywki podstawowej GSC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować płytkę przy 270 x g w temperaturze 20 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.</li>
	<li>Dodać 500 μl pożywki do proliferacji GSC na dołek płytki 48-dołkowej i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Wskazana ilość GSC (10 x 106 komórek) pozwala na przeprowadzenie różnych eksperymentów dawka-odpowiedź i kontroli FACS. Po dokładniejszym określeniu warunków eksperymentalnych wielkość ta może zostać zmniejszona.</li>
</ol>
Dzień 2
3. Wysiewanie komórek macierzystych glejaka
<ol>
	<li>Zebrać neurosfery GSC (10 x 106 komórek) przez odwirowanie w temperaturze 270 x g przez 5 minut, w temperaturze 20 °C w probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przemyć komórki 5 ml HBSS i odwirować przy 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić osad GSC w 100 μl trypsyny-EDTA (0,25%) (na 10 x 106 komórek)</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Dodać 10 μl CaCl2 (20 mM) i 2 μl DNazy I (10 mg/ml).</li>
	<li>Oddziel neurosfery, delikatnie pipetując w górę i w dół (30-50x) za pomocą pipety P200. Unikaj bąbelków. Sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie GSC są zdysocjowane.</li>
	<li>Dodać 10 μl inhibitora trypsyny (5%) i 10 ml HBSS.</li>
	<li>Odwirować GSC przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i dodać 10 ml pożywki podstawowej GSC (tabela 1).</li>
	<li>Policzyć GSC w komorze liczącej Thoma, a następnie odwirować komórki przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość pożywki do proliferacji GSC (Tabela 1), aby osiągnąć stężenie komórkowe 10-6 GSC/ml.</li>
	<li>Wysiew 105 GSC (100 μl zawiesiny komórkowej) na basenik płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Odwirować płytki o sile 270 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C, aby na dnie studzienek znalazły się GSC.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C do sekcji 5.</li>
</ol>
Dzień 2
4. Izolacja mitochondriów MSC
<ol>
	<li>Ustawić temperaturę wirówki z mikroprobówkami na 4 °C.</li>
	<li>Przygotować dwie probówki "A" i "C" o pojemności 1,5 ml zawierające odczynniki do ekstrakcji mitochondriów (200 μl odczynnika A i 400 μl odczynnika C, obie zawierające inhibitory proteazy wolne od EDTA). Przygotuj 2 inne probówki, oznaczone "MSC" i "Mito". Trzymaj wszystkie probówki na lodzie. Przygotuj również probówki do seryjnych rozcieńczeń mitochondriów.</li>
	<li>Umyć MSC 10 ml podgrzanego (37 °C) PBS.</li>
	<li>Przemyj MSCs 2 ml trypsyny (bez EDTA) przez 10 sekund i dodaj 1 ml trypsyny (bez EDTA). Inkubować komórki przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odzyskaj MSCs, dodając 10 ml αMEM/FBS 10%, przenieś do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i dodać 10 ml αMEM/FBS 10% do osadu komórkowego.</li>
	<li>Policz MSC za pomocą komory liczącej Malassez.</li>
	<li>Odwirować MSC (4-5 x 105) przy 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, dodać 1 m lodowaty αMEM/FBS 10% do osadu komórkowego i przenieść komórki do probówki znakowanej "MSC" (przygotowanej w kroku 4.2). Trzymaj probówkę na lodzie.</li>
	<li>Odwirować probówkę zawierającą MSCs o sile 900 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń wszystkie resztki pożywki z probówki.</li>
	<li>Dodać 200 μl odczynnika A do izolacji mitochondriów (zawierającego inhibitory proteazy wolne od EDTA). Wiruj ze średnią prędkością przez 5 sekund i pozostaw rurki na lodzie dokładnie na 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 2,5 μl odczynnika do izolacji mitochondriów B. Wirować z maksymalną prędkością przez 10 sekund, a następnie pozostawić probówki na lodzie. Powtarzaj co 30 sekund przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 200 μl odczynnika C do izolacji mitochondriów (zawierającego inhibitory proteazy wolne od EDTA). Wymieszaj, przechylając rurkę (około 30 razy, nie wirować). Odwirować probówkę o sile 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant (zawierający mitochondria MSC) do probówki "Mito" (przygotowanej w kroku 4.2).</li>
	<li>Odwirować przy 3 000 x g, 15 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad mitochondriów. Odrzucić supernatant. Osad zawiera izolowane mitochondria.</li>
	<li>Przepłukać osad mitochondriów 200 μl odczynnika C. Następnie odwirować przy 12 000 x g, 5 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad mitochondriów.</li>
</ol>
5. Transfer izolowanych mitochondriów MSC do GSC (MitoCeption)
<ol>
	<li>Dodać 200 μl wstępnie schłodzonej (0 °C) pożywki do proliferacji GSC do osadu mitochondriów wyizolowanego z MSCs (4 x 105).</li>
	<li>Rozcieńczyć preparat mitochondriów (w pożywce proliferacyjnej GSC), aby konsekwentnie dodawać 20 μl zawiesiny mitochondrialnej do GSC.</li>
	<li>Dodać objętość wyizolowanych mitochondriów do studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej GSC (od kroku 3.15), w żądanym stężeniu (0,1 do 10 μg). Dodawaj mitochondria powoli, blisko dna studzienki, pokrywając przynajmniej raz całą powierzchnię.</li>
	<li>W celu kontrolowania wycieku barwnika witalnego w mitochondriach MSC, należy dodać takie same ilości preparatu mitochondriów (0,1 do 10 μg) do studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej tylko pożywkę proliferacyjną GSC (bez GSC) (patrz część 6.2 w celu wykrywania wycieku barwnika przyżyciowego).</li>
	<li>Odwirować 96-dołkową płytkę zawierającą biorcę mitochondriów z mitochondriami MSC (etap 5.3) i płytką kontrolną (etap 5.4) w temperaturze 1 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieścić płytki hodowlane w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C natychmiast po odwirowaniu. 
	Uwaga: Protokół transferu mitochondriów opiera się na odwirowaniu zawiesiny mitochondriów na hodowanych komórkach przy odpowiedniej sile wirowania, z liczbą wirowań, które można dostosować w zależności od systemu komórek dawcy/biorcy mitochondriów.</li>
</ol>
Dzień 3
6. Analiza transferu mitochondriów za pomocą FACS i obrazowania konfokalnego
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek GSC do analizy FACS 
	Uwaga: Jeśli mitochondria MSC zostały wcześniej oznaczone barwnikiem życiowym (sekcja 1), wydajność można monitorować za pomocą FACS 24 godziny po transferze mitochondriów.
	<ol>
		<li>Odwirować 96-dołkową płytkę z MitoCepted GSC o sile 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodaj 100 μl trypsyny (bez EDTA) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Pibułuj w górę iw dół, aby oddzielić neurosfery powstałe w ciągu 24 godzin.</li>
		<li>Dodać 100 μl podłoża podstawowego GSC.</li>
		<li>Odwirować płytkę o sile 270 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić GSC w 300 μl pożywki podstawowej GSC i przenieść do probówek dostosowanych do FACS.</li>
		<li>Wykonaj analizę FACS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola wycieku barwnika życiowego mitochondriów z izolowanych mitochondriów (FACS) 
	Uwaga: Celem tego kroku jest określenie sygnału FACS w tle, który nie odzwierciedlałby prawdziwego transferu mitochondriów MSC, ale raczej zwykły wyciek ważnego barwnika z oznaczonych mitochondriów MSC używanych do MitoCeption (krok 5.3).
	<ol>
		<li>Umieść komórki GSC w grupach opisanych w krokach od 3.1 do 3.15.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Odwirować 96-dołkową płytkę zawierającą tylko mitochondria (od kroku 5.4 do 5.6) w temperaturze 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Odessać pożywkę hodowlaną z 96-dołkowej płytki GSC (etap 6.2.2) i zastąpić ją pożywką inkubowaną tylko z mitochondriami (supernatant z etapu 6.2.3).</li>
		<li>Inkubować 96-dołkową płytkę zawierającą GSC w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Postępuj jak w krokach od 6.1.1 do 6.1.7 dla analizy FACS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek GSC do obrazowania konfokalnego 
	Uwaga: Jeśli transfer mitochondriów MSC do GSC ma być analizowany za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, zarówno MSC, jak i GSC muszą być wcześniej znakowane, odpowiednio mitochondriami (krok 1) i komórkami (krok 2) życiodajnymi barwnikami.
	<ol>
		<li>Przygotować SGR jak w krokach od 6.1.1 do 6.1.5.</li>
		<li>Zawiesić GSC w 2 ml pożywki proliferacyjnej GSC zawierającej 2% FBS i nasiona w szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm (szklane dno).</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie konfokalne na GSC z przeniesionymi fluorescencyjnymi mitochondriami MSC 24 godziny później.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+signaling+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as signaling organelles.</a> BMC Biol. 12 (1), 34(2014).</li>
<li>Schulze, A., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cancer+metabolism+is+tuned+for+proliferation+and+vulnerable+to+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption.</a> Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).</li>
<li>Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4879746/">Cancer stem cell metabolism.</a> Breast Cancer Res. 18 (1), 55(2016).</li>
<li>LeBleu, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1alpha+mediates+mitochondrial+biogenesis+and+oxidative+phosphorylation+in+cancer+cells+to+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis.</a> Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).</li>
<li>Liu, S., Feng, M., Guan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+sensing+by+STING+signaling+participates+in+inflammation%2C+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond.</a> Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).</li>
<li>Islam, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+from+bone-marrow-derived+stromal+cells+to+pulmonary+alveoli+protects+against+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury.</a> Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).</li>
<li>Pasquier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transfer+of+mitochondria+from+endothelial+to+cancer+cells+through+tunneling+nanotubes+modulates+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance.</a> J Transl Med. 11, 94(2013).</li>
<li>Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasm+and+organelle+transfer+between+mesenchymal+multipotent+stromal+cells+and+renal+tubular+cells+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture.</a> Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).</li>
<li>Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+between+cells+can+rescue+aerobic+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+rescue+injured+endothelial+cells+in+an+in+vitro+ischemia-reperfusion+model+via+tunneling+nanotube+like+structure-mediated+mitochondrial+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer.</a> Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).</li>
<li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+block+of+tunneling+nanotube+%28TNT%29+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li>
<li>Gurke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunneling+nanotube+%28TNT%29-like+structures+facilitate+a+constitutive%2C+actomyosin-dependent+exchange+of+endocytic+organelles+between+normal+rat+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells.</a> Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).</li>
<li>Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+initiate+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells+by+mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes.</a> Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).</li>
<li>Wang, X., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+mitochondria+via+tunneling+nanotubes+rescues+apoptotic+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells.</a> Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).</li>
<li>Plotnikov, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).</li>
<li>Acquistapace, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+reprogram+adult+cardiomyocytes+toward+a+progenitor-like+state+through+partial+cell+fusion+and+mitochondria+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer.</a> Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).</li>
<li>Hase, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-Sec+promotes+membrane+nanotube+formation+by+interacting+with+Ral+and+the+exocyst+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex.</a> Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).</li>
<li>Phinney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+use+extracellular+vesicles+to+outsource+mitophagy+and+shuttle+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs.</a> Nat Commun. 6, 8472(2015).</li>
<li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+regulates+intercellular+mitochondrial+transport+%26+enhances+mesenchymal+stem+cell+rescue+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy.</a> Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27641650">iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy.</a> Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).</li>
<li>Takeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+intergeneric%2Finterspecies+mitochondrial+injection%3B+parthenogenetic+development+of+bovine+oocytes+after+injection+of+mitochondria+derived+from+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells.</a> J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).</li>
<li>Takeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+cytoplasm+or+mitochondria+derived+from+somatic+cells+affects+parthenogenetic+development+of+murine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes.</a> Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).</li>
<li>Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+between+oocytes%3A+potential+applications+of+mitochondrial+donation+and+the+issue+of+heteroplasmy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy.</a> Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).</li>
<li>Ishikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS-generating+mitochondrial+DNA+mutations+can+regulate+tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis.</a> Science. 320 (5876), 661-664 (2008).</li>
<li>Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+effects+of+cancer+mitochondria+on+energy+metabolism+and+tumorigenesis%3A+utility+of+transmitochondrial+cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids.</a> Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).</li>
<li>Wu, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Transfer+by+Photothermal+Nanoblade+Restores+Metabolite+Profile+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells.</a> Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).</li>
<li>Masuzawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologously+derived+mitochondria+protects+the+heart+from+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).</li>
<li>Kitani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+human+mitochondrial+transfer%3A+a+novel+concept+based+on+the+endosymbiotic+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory.</a> Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).</li>
<li>Caicedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoCeption+as+a+new+tool+to+assess+the+effects+of+mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+mitochondria+on+cancer+cell+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function.</a> Sci Rep. 5, 9073(2015).</li>
<li>Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Mitochondrial+Transformation+into+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells.</a> Sci Rep. 6, 26057(2016).</li>
<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li>
<li>Osswald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumour+cells+interconnect+to+a+functional+and+resistant+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network.</a> Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).</li>
<li>Shinojima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+mediates+homing+of+bone+marrow-derived+human+mesenchymal+stem+cells+to+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells.</a> Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).</li>
<li>Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homing+of+human+cord+blood+stem+cells+to+sites+of+inflammation%3A+unfolding+mysteries+of+a+novel+therapeutic+paradigm+for+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme.</a> Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).</li>
<li>Guichet, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+neuronal+differentiation+of+glioblastoma+stem-like+cells+induced+by+neurogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors.</a> Glia. 61 (2), 225-239 (2013).</li>
<li>Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+Sanger+strategy+for+human+mitochondrial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing.</a> BMC Genomics. 14, 881(2013).</li>
</ol>

INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), z którym C.J. i M-L.V. są powiązane, złożył wniosek patentowy dotyczący techniki MitoCeption (EP14306154.7).

Coraz więcej badań pokazuje, że komórki mogą wymieniać mitochondria i że te mitochondria mają głęboki wpływ na metabolizm i funkcje komórek docelowych. Dlatego konieczne jest opanowanie narzędzi do ilościowego przenoszenia mitochondriów z komórek dawcy do komórek docelowych, aby umożliwić dokładne badanie ich skutków biologicznych.
Opisany tutaj protokół został pierwotnie opracowany w celu przeniesienia mitochondriów wyizolowanych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przylegając...

Mitochondria to organelle znajdujące się w komórkach eukariotycznych, gdzie odgrywają kluczową rolę w pobieraniu składników odżywczych, a także w produkcji energii i metabolitów. Organelle te zawierają koliste mitochondrialne DNA (mtDNA) o długości 16,6 kb, które koduje białka kompleksów łańcucha transportu elektronów, tRNA i rRNA 1. Funkcjonalność tych organelli ma kluczowe znaczenie dla homeostazy komórek, a kilka patologii jest związanych z dysfunkcją mitochondriów 1,2,3. Status mitochondriów został na przykład powiązany ze stanem zapalnym, chorobami zakaźnymi i rakiem, w tym ostatnim przypadku z konsekwencjami dla przerzutów i oporności na terapię 4,5,6,7.
Mitochondria wykazują niezwykłą zdolność do przenoszenia się między komórkami "dawcy" i "celu". Prowadzi to do zmian w metabolizmie energetycznym komórek docelowych, a także w innych modyfikacjach funkcjonalnych, takich jak naprawa tkanek i odporność na chemioterapeutyki, jak ostatnio wykazały różne laboratoria 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wykazują tę zdolność do przenoszenia mitochondriów do szerokiej gamy komórek docelowych, w tym kardiomiocytów, komórek śródbłonka, komórek nabłonka pęcherzyków płucnych, komórek kanalików nerkowych i komórek nowotworowych, co prowadzi do modyfikacji właściwości funkcjonalnych tych komórek 8,9,10,12,17,18.
Wymiana mitochondriów pojawia się teraz jako powszechnie stosowany mechanizm, który pozwala wielu różnym typom komórek komunikować się ze sobą i modyfikować ich właściwości biologiczne. Ta wymiana mitochondriów może zachodzić poprzez tworzenie nanorurek tunelowych (TNT), obejmujących połączenia szczelinowe zawierające koneksynę 43 8 lub M-Sec/TNFaip2 i kompleks egzocyst 19. Alternatywnie, wykazano również, że w transferze mitochondriów pośredniczą mikropęcherzyki (ARMM) zawierające białko 1 zawierające arrestinę 20. Co ciekawe, skuteczność transferu mitochondriów była związana z szybkością ekspresji Rho GTPase 1 MIRO1 21, kluczowym czynnikiem wyjaśniającym różnice w skuteczności transferu mitochondriów między iPSC-MSCs a dorosłymi BM-MSCs 22.
Pomimo tego bogactwa danych dotyczących wymiany mitochondriów między komórkami, stosunkowo niewiele wiadomo o metabolicznym i biologicznym wyniku tego transferu mitochondriów. W związku z tym w pełni uzasadnia to ustanowienie odpowiednich narzędzi w celu pełnej oceny biologicznych skutków tego transferu. Na przestrzeni lat zaproponowano kilka podejść technicznych do przenoszenia mitochondriów z komórek dawcy do komórek akceptorowych. Obejmuje to bezpośrednie wstrzykiwanie mitochondriów do oocytów 23,24,25, fuzję komórek w celu wygenerowania cybridów transmishondrialnych 26,27 oraz, ostatnio, transfer izolowanych mitochondriów za pomocą nanoostrzy fototermicznych 28. 
My i inni wcześniej wykazaliśmy zdolność izolowanych mitochondriów do internalizacji przez żywe komórki, co zaobserwowano zarówno in vitro, jak i in vivo 29,30,31, poprzez mechanizmy proponowane do udziału w makropinocytozie 32. Następnie opracowaliśmy metodę o nazwie MitoCeption, aby ilościowo przenieść izolowane mitochondria (z MSC) do komórek docelowych, czego przykładem jest (przylegająca) linia komórkowa raka piersi MDA-MB-231 31. Protokół ten został tutaj zaadaptowany do transferu izolowanych ludzkich mitochondriów MSC do komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego (GSC).
Glejak wielopostaciowy to agresywne nowotwory złośliwe mózgu, które szybko stają się oporne na leczenie, głównie z powodu komórek macierzystych glejaka (GSC) obecnych w guzie 33. Te GSC rosną jako neurosfery in vitro i generują guzy w modelach ksenoprzeszczepów. Komórki nowotworowe w glejaku mają zdolność do tworzenia połączeń międzykomórkowych, jak wykazano ostatnio w przypadku komórek astrocytowych guza mózgu, które łączą się za pomocą rozszerzonych mikrorurek, przez które mitochondria (a także wapń i jądra komórkowe) mogą migrować, co skutkuje odpornymi na radioterapię sieciami gwiaździaków 34. Glejak wielopostaciowy może rekrutować wiele różnych komórek w mikrośrodowisku guza, w tym MSCs 35,36. Wykazaliśmy, że MSCs mogą nawiązywać połączenia komórka-komórka z GSC w kokulturze i przenosić swoje mitochondria (dane nie pokazane), co ma modyfikować właściwości funkcjonalne GSC. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób technika MitoCeption może być wykorzystana do transferu mitochondriów, wyizolowanych wcześniej z ludzkich MSC, do ludzkich GSC w celu określenia ich funkcjonalnego wyniku biologicznego. W tym badaniu wykorzystano multipotencjalną i wysoce rakotwórczą linię Gb4 GSC 37.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do izolacji mitochondriów dla tkanek&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>10579663</tr><tr><td>Suplement N-2 (100x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement W/O VIT A (50x)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>11500446</tr><tr><td>HBSS bez Ca2+ bez Mg2+</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>H4385</td><td></td></tr><tr><td>poly hem&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>aMEM bez glutaminy</td><td>Ozyme</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 bez glutaminy</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>11540566</tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>25030-024&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I 1882&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek&nbsp; bFGF&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek EGF&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>AF-100-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MERCK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td></td><td></td>10104159001</tr><tr><td>Trypsyna 0,25% / EDTA 1&nbsp; mM</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy wolne od EDTA</td><td>Sigma</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloksacyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>Grzyby&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Euromedex</td><td>EU0410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Zielone sondy</td><td>molekularne</td> FM <td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Czerwone Sondy</td><td>molekularne</td> CMXRos<td>&nbsp; Sondy molekularne FM M7512</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep Red</td><td></td><td>&nbsp; M22426&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Zielone</td><td>sondy molekularne</td> CMFDA <td>C7025</td><td></td></tr><tr>Sondy <td>molekularne</td><td>CellTracker Blue CMF2HC</td><td>C12881</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Sterylne naczynie do hodowli</td> zwierząt <td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Rurki FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>2,523,749</td><td></td></tr><tr><td>Aparat FACS</td><td>Gallios&nbsp;</td><td>&nbsp; 3L 10C</td><td></td></tr><tr><td>LC SZYBKI START DNA MASTER PLUS&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3515885001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitoception: przenoszenie izolowanych ludzkich mitochondriów msc do komórek macierzystych glejaka

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria odgrywają kluczową rolę w metabolizmie komórkowym, produkcji energii i kontroli apoptozy. Stwierdzono, że niewystarczająca funkcja mitochondriów jest odpowiedzialna za bardzo różne choroby, od patologii neurologicznych po raka. Co ciekawe, ostatnio wykazano, że mitochondria wykazują zdolność do przenoszenia między typami komórek, zwłaszcza z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) do komórek nowotworowych w warunkach kokultury, co ma konsekwencje metaboliczne i funkcjonalne dla komórek biorcy mitochondriów, co jeszcze bardziej zwiększa obecne zainteresowanie właściwościami biologicznymi tych organelli.
Ocena efektów przeniesionych mitochondriów MSC w komórkach docelowych ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia biologicznych wyników takich interakcji komórka-komórka. Opisany tutaj protokół MitoCeption pozwala na transfer mitochondriów wyizolowanych wcześniej z komórek dawcy do komórek docelowych, przy użyciu mitochondriów MSC i komórek macierzystych glejaka (GSC) jako systemu modelowego. Protokół ten był wcześniej używany do przenoszenia mitochondriów, wyizolowanych z MSC, do przylegających komórek nowotworowych MDA-MB-231. Ten protokół transferu mitochondriów jest tutaj dostosowany do GSC, które wykazują specyficzną specyfikę wzrostu jako neurosfery in vitro. Po przeniesieniu izolowanych mitochondriów można przeprowadzić sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i obrazowanie konfokalne przy użyciu barwników niezbędnych do utrzymania mitochondriów. Wykorzystanie mitochondriów dawcy i komórek docelowych o odrębnych haplotypach (SNP) umożliwia również wykrywanie przenoszonych mitochondriów na podstawie stężenia ich kołowego mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach docelowych. Po zatwierdzeniu protokołu pod kątem tych kryteriów, komórki zawierające przeniesione mitochondria mogą być dalej analizowane w celu określenia wpływu egzogennych mitochondriów na właściwości biologiczne, takie jak metabolizm komórkowy, plastyczność, proliferacja i odpowiedź na terapię.

Kroki proceduralne opisujące izolację mitochondriów z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) i ich przeniesienie do docelowych komórek macierzystych glejaka (GSC) metodą MitoCeption przedstawiono na Rysunku 1. GSC to nowotworowe komórki macierzyste hodowane w formie neurosfer w celu zachowania ich właściwości macierzystych. W ramach protokołu, GSC są wysiewane jako pojedyncze komórki na kilka godzin przed przeniesieniem mitochondriów (krok 3), aby zapewnić wyższą wyd...

Tutaj przedstawiono protokół (MitoCeption) do transferu mitochondriów, wyizolowanych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), do komórek macierzystych glejaka (GSC), w celu zbadania ich biologicznego wpływu na metabolizm i funkcje GSC. Podobny protokół można dostosować do przenoszenia mitochondriów między innymi typami komórek.

MitoCeption: Przenoszenie izolowanych ludzkich mitochondriów MSC do komórek macierzystych glejaka

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeniesienie wcześniej wyizolowanych mitochondriów z komórek dawców, takich jak mezenchymalne komórki macierzyste, do komórek docelowych, takich jak macierzyste komórki glejaka. Procedura ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny metabolizmu, takie jak metaboliczne i biologiczne skutki działania mitochondriów przenoszonych spontanicznie między komórkami poprzez procesy takie jak nanorurki tunelowe lub mikropęcherzyki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oceny wpływu mitochondriów niezależnie od innych czynników obecnych w mikrośrodowisku, takich jak cytokiny czy metabolity, a także od innych związków, które mogą być transportowane w nanorurkach tunelowych.W celach obrazowania mitochondria MSC oraz GSC można znakować barwnikami witalnymi przed transferem mitochondriów metodą MitoCeption. Aby rozpocząć, po uprzednim oznakowaniu GSC barwnikami witalnymi zgodnie z protokołem tekstowym, należy zebrać neurosfery GSC w probówce o pojemności 50 ml poprzez wirowanie z prędkością 270 ×g w temperaturze 20 °C przez pięć minut. Użyć 5 ml HBSS do przemycia komórek, a następnie ponownie odwirować probówkę.Odssać supernatant i delikatnie resuspender osad GSC w 100 µL 0,25% Trypsyny-EDTA. Następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez trzy minuty. Dalej, do probówki dodać 10 µL 20 mM chlorku wapnia oraz 2 µL DNazy I w stężeniu 10 mg/mL.Rozdziel neurosfery, delikatnie pipetując zawiesinę w górę i w dół od 30 do 50 razy za pomocą pipety P200, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. Do komórek dodaj 10 µL 5% inhibitora trypsyny w 10 mL HBSS i odwiruj GSC przez siedem minut. Następnie odlej supernatant i dodaj 10 mL podstawowej pożywki GSC (GSC Basal Medium) do próbki.Następnie, używając komory Thomy, należy policzyć komórki przed ponownym wirowaniem. Dodać odpowiednią objętość medium do proliferacji GSC, aby uzyskać stężenie komórek na poziomie 10⁶ GSCs na mililitr. Następnie wysiać 10⁵ GSCs do każdego dołka płytki 96-dołkowej.Odwiruj płytkę, aby komórki GSC osiadły na dnie studzienek. Sprawdź komórki pod mikroskopem. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C.Aby przeprowadzić izolację mitochondriów z MSC, należy rozpocząć od ustawienia temperatury mikrocentryfugi na 4°C. Przygotować dwie probówki o pojemności 1,5 ml, oznaczone jako A i C, zawierające odczynniki do ekstrakcji mitochondriów. Przygotować dwie dodatkowe probówki oznaczone jako MSC i MiTo.Przechowywać probówki w lodzie. Przygotować również probówki do rozcieńczeń seryjnych mitochondriów, które zostaną wykonane z preparatu mitochondriów. Do przemycia MSC użyć 10 ml PBS uprzednio ogrzanego do 37 °C.Następnie, za pomocą 2 mL trypsyny bez EDTA, przemyj komórki przez 10 sekund i dodaj kolejny 1 mL trypsyny przed inkubacją komórek w temperaturze 37 °C przez 5 do 10 minut. Zgodnie z protokołem należy unikać stosowania EDTA, w szczególności podczas trypsynizacji MSC oraz przy użyciu inhibitora proteazy w preparacji mitochondriów. Odzyskaj MSC, dodając 10 mL Alpha MEM z 10% FBS, a następnie przenieś zawiesinę do probówki o pojemności 50 mL.Następnie odwiruj komórki. Odlej supernatant i dodaj 10 mililitrów Alpha MEM 10%FBS do osadu komórkowego. Następnie użyj komory Malasseza do zliczenia MSC, przed odwirowaniem od czterech do pięciu razy 10⁵ komórek.Odlać supernatant, dodać jeden mililitr schłodzonego w lodzie Alpha MEM 10% FBS do osadu komórkowego i przenieść komórki do wcześniej przygotowanej probówki oznaczonej jako MSC, cały czas utrzymując ją w lodzie. Następnie odwirować probówkę z MSC przy 900 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i usunąć z probówki całą pozostałą pożywkę. Następnie dodać 200 µL odczynnika A do izolacji mitochondriów z inhibitorami proteaz bez EDTA do MSC i wymieszać na wortexie z umiarkowaną prędkością przez pięć sekund.Następnie pozostaw probówki na lodzie dokładnie przez dwie minuty. Dodaj 2,5 µL odczynnika do izolacji mitochondriów B i wymieszaj komórki w wir器ku (vortex) z maksymalną prędkością przez 10 sekund, a następnie ponownie umieść probówki na lodzie. Powtarzaj mieszanie w wir器ku co 30 sekund przez pięć minut.Następnie do probówki należy dodać 200 µL odczynnika C do izolacji mitochondriów z inhibitorami proteaz bez EDTA i wymieszać zawartość, przechylając probówkę około 30 razy. Probówki należy wirować z prędkością 700 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Następnie przenosi się supernatant zawierający mitochondria MSC do wcześniej przygotowanej probówki MiTo.Wirować próbkę z prędkością 3 000 ×g w temperaturze 4°C przez 15 minut. Po odlaniu supernatantu użyć 200 µL odczynnika C do przemycia osadu mitochondrialnego. Następnie wirować zawiesinę z prędkością 12 000 ×g w temperaturze 4°C przez pięć minut, aby uzyskać osad z organellami.Aby przenieść wyizolowane mitochondria MSC do GSC, należy dodać 200 µL schłodzonego medium do proliferacji GSC do osadu mitochondrialnego. Rozcieńcz preparat mitochondrialny w medium do proliferacji GSC w taki sposób, aby umożliwić powtarzalne dodawanie 20 µL zawiesiny mitochondrialnej do GSC. Następnie powoli dodaj mitochondria blisko dna studzienki.Aby kontrolować wyciek barwnika witalnego z mitochondriów MSC, należy dodać taką samą ilość preparatu mitochondriów do studni płytki 96-dołkowej zawierającej wyłącznie pożywkę do proliferacji GSC. Płytki należy wirować z prędkością 1 500 ×g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Następnie hodowle należy bezzwłocznie przenieść do temperatury 37 °C.Następnego dnia, w celu analizy wycieku barwnika witalnego z dołków kontrolnych, należy zasiać komórki GSC zgodnie z wcześniejszym opisem, odwirować płytkę, a następnie inkubować hodowle w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Odwiruj płytkę 96-dołkową zawierającą wyłącznie mitochondria. Następnie odessij medium z 96-dołkowej płytki z komórkami GSC i zastąp je supernatantenem z mitochondriami.Inkubować GSC z supernatantenem mitochondrialnym w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Na koniec przeprowadzić analizę transferu mitochondriów, analizę FACS oraz obrazowanie konfokalne zgodnie z protokołem tekstowym. GSC to nowotworowe komórki macierzyste hodowane jako neurosfery w celu zachowania ich właściwości macierzystych.Tuż przed transferem mitochondriów komórki są wysiewane jako pojedyncze komórki, aby zapewnić wysoką wydajność transferu mitochondriów, a następnego dnia, jak pokazano tutaj, obserwuje się ponownie tworzenie przez nie neurosfer. Na tej rycinie widać fluorescencyjnie znakowane mitochondria MSC zlokalizowane wewnątrz GSC Gb4. Mitochondria MSC występują w całej objętości GSC, podobnie jak mitochondria GSC.Transfer mitochondriów z MSC można było zaobserwować u większości GSC; rekonstrukcja 3D z obrazów konfokalnych GSC potwierdziła międzykomórkową lokalizację przetransportowanych mitochondriów MSC. Wstępne znakowanie GSC za pomocą niebieskiego barwnika komórkowego i czerwonego witalnego barwnika mitochondrialnego pozwoliło na wizualizację lokalizacji przetransportowanych mitochondriów MSC (widocznych na zielono) w stosunku do endogennych mitochondriów GSC. Jak pokazano tutaj, MitoCeption z zastosowaniem coraz większych ilości fluorescencyjnych mitochondriów MSC prowadził do zwiększenia sygnałów FACS, które były o kilka rzędów wielkości wyższe od sygnału kontrolnego.Przedstawiony tutaj protokół transferu mitochondriów przeprowadzony na pojedynczych komórkach GSC wykazał odpowiedź zależną od dawki oraz względną średnią intensywność fluorescencji. Ostatecznie, choć transfer mitochondriów z MSC udało się również przeprowadzić na neurosferach GSC, skuteczność transferu do GSC w tych warunkach była niższa w porównaniu do mitochondriów przetransferowanych do GSC początkowo wysianych jako pojedyncze komórki. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu trzech godzin.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby preparat mitochondriów przez cały czas przechowywać na lodzie. Po przeprowadzeniu tych czynności można zastosować inne metody, takie jak FACS, mikroskopia konfokalna czy QPCR dla mitochondrialnego DNA, aby zwizualizować i ilościowo ocenić transfer mitochondriów z MSC do komórek docelowych. Można również przeprowadzić badania funkcjonalne w celu określenia biologicznych efektów przeniesionych mitochondriów.Należy pamiętać, że badania te będą zazwyczaj przeprowadzane z wykorzystaniem mniejszych ilości mitochondriów niż te użyte do wizualizacji transferu mitochondriów. Technika ta pozwoli zbadać skutki i efekty biologiczne mitochondriów, które są spontanicznie przenoszone między komórkami zarówno w normalnych warunkach fizjologicznych, jak i w warunkach patologicznych, co przyczyni się do opracowania nowych metod terapeutycznych.

mitoception-transferring-isolated-human-msc-mitochondria-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje izolację, wzbogacanie i utrzymanie komórek macierzystych nowotworu medulloblastoma pochodzących od mutantowych myszy z ektopową aktywnością szlaku Sonic hedgehog.

Izolacja, namnażanie i utrzymanie komórek macierzystych medulloblastomy

W tym filmie zademonstrowano metodę umożliwiającą transfer znakowanych fluorescencyjnie mitochondriów do komórek macierzystych glejaka (GSC) poprzez wirowanie. Pomyślny wychwyt i funkcjonalna integracja mitochondriów dawcy są potwierdzane przez wykrycie fluorescencji za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wspomagany wirowaniem transfer mitochondriów do komórek macierzystych glejaka

Terapeutyczne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obiecujące jako metoda leczenia inwazyjnego glejaka. Optymalna transplantacja polega na dostarczeniu MSCs do jamy resekcji guza na rusztowaniach. W tym miejscu przedstawiono techniki przedkliniczne do badania leczenia glejaka wielopostaciowego MSC, w tym: resekcja guza pod kontrolą obrazu; wszczepianie rusztowań z nasionami MSC; i śledzenie terapii pooperacyjnej.

Resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Ten protokół opisuje technikę generowania cybrydów z komórek nowotworowych rosnących w zawiesinie jako narzędzie do badania roli mitochondriów w procesie nowotworowym.

Wytwarzanie cybridów transmiscyjnych przy użyciu linii komórek rakowych

Tutaj prezentujemy protokół obejmujący śledzenie mitochondriów, procedury bezpośredniej kohodowli mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (ARPE19), a także metody obserwacji i statystycznej analizy tworzenia i transferu mitochondriów przez nanorurki tunelowe (TNT) w celu scharakteryzowania wymiany mitochondrialnej za pośrednictwem TNT między MSC a komórkami ARPE19.

Transfer mitochondrialny za pomocą nanorurek tunelowych między mezenchymalnymi komórkami macierzystymi a nabłonkiem barwnikowym siatkówki in vitro

Organoidy mózgowe stanowią cenny model dla badań nad encefalomiopatią mitochondrialną, kwasicą mlekową oraz epizodami podobnymi do udaru (MELAS), oferując wgląd w ich podstawową patofizjologię i stanowiąc platformę do badań przesiewowych leków. Organoidy pochodzące z linii komórkowych o różnym poziomie heteroplazmy genów wywołujących chorobę wykazują istotne różnice fenotypowe.

Modelowanie chorób mitochondrialnych za pomocą organoidów mózgowych: Skupienie się na encefalomiopatii mitochondrialnej, kwasicy mlekowej oraz epizodach podobnych do udaru

Rozprzestrzenianie się człowieka zarodkowych komórek macierzystych (ES) Cells

Znajomość dokładnej liczby żywych komórek jest niezbędna przy wielu manipulacjach w hodowlach tkankowych. Niniejszy protokół opisuje sposób rozróżniania komórek żywych od martwych oraz ilościowego oznaczania komórek przy użyciu hemacytometru. Choć opisano w nim liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs), można go zastosować również do innych typów komórek.

Liczenie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Poznaj metodę MitoCeption do przenoszenia izolowanych mitochondriów MSC do komórek macierzystych glejaka w celu badania ich wpływu na metabolizm i funkcje komórkowe.

MitoCeption: Przenoszenie izolowanych ludzkich mitochondriów MSC do komórek macierzystych glejaka

Przeglądaj więcej filmów