Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie mitochondriów mięśni szkieletowych metodą wirowania różnicowego oraz oznaczenie szybkości oddychania kompleksów I, II i IV mitochondrialnego łańcucha oddechowego. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu bioenergetyki mitochondrialnej, dotyczące m.in. chorób i zespołów związanych z dysfunkcją mitochondriów, takich jak różnorodne schorzenia neurologiczne, sepsa oraz zaburzenia związane z wiekiem. Główną zaletą tej techniki jest brak większości czynników cytologicznych w wyizolowanym preparacie mitochondrialnym, które mogłyby zakłócić analizę funkcji mitochondriów. Procedurę zaprezentuje Sandra Nansoz, technik z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować zlewkę z próbkami mięśnia szkieletowego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść zlewkę w pojemniku z lodem. Za pomocą precyzyjnych nożyczek posiekaj mięsień na kawałki o rozmiarze od 1 do 2 mm.

Następnie dwa razy przepłucz rozdrobnioną tkankę lodowatym buforem izolacyjnym, używając 20 ml na każde płukanie. Zawieś wypłukaną tkankę w 10 ml buforu izolacyjnego na gram tkanki, a następnie dodaj pięć mg proteazy-G do tkanki. Następnie umieść zlewkę w łaźni lodowej z mieszadłem magnetycznym i mieszaj przez 10 minut.

Następnie rozcieńczyć zawiesinę dodatkowymi 10 mililitrami buforu do izolacji uzupełnionego o 0,2% odtłuszczonego BSA na gram tkanki. Następnie odlać cały bufor do izolacji z zlewki. Przemyć tkankę dwukrotnie lodowatym buforem do izolacji uzupełnionym o 0,2% BSA, używając 20 mililitrów do każdego płukania.

Następnie ponownie zawiesić tkankę w 10 ml buforu izolacyjnego z dodatkiem BSA na gram tkanki. Do homogenizacji tkanki należy użyć półautomatycznego homogenizatora szklanego z luźno dopasowanym tłokiem. Następnie przenieść homogenat do probówki do wirowania i wirować z prędkością 10 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

Za pomocą pipety serologicznej odessać nadsącz. Osad zawiesić ponownie w 10 mililitrach lodowatego medium do izolacji uzupełnionego o BSA na każdy gram tkanki. Zawiesinę wirować z prędkością 350 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie za pomocą pipety serologicznej należy odobrać nadsącz, odrzucając osad. Nadsącz przefiltrować przez dwie warstwy gazy do zlewki umieszczonej w lodzie. Przefiltrowaną zawiesinę przenieść do probówki do wirowania i wirować z prędkością 7 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie odlej nadsącz. Ponownie zawieś surowy osad mitochondrialny w pięciu mililitrach buforu izolacyjnego z dodatkiem BSA na gram tkanki. Wirowarkuj tę zawiesinę z prędkością 7 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsiusza.

Następnie odlej nadsącz i ponownie zawieś osad w 20 ml buforu do płukania. Wirować z prędkością 7 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powtórz proces ponownego zawieszenia i wirowania jeszcze raz.

Następnie odrzuć nadsącz i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze buforu piorącego. Określ stężenie białka, stosując dowolną standardową metodę. Następnie przechowuj zagęszczoną zawiesinę mitochondrialną w lodzie do czasu rozpoczęcia pomiarów respirometrycznych.

W celu rozpoczęcia, resuspendować koncentrat mitochondriów w buforze do oddychania do końcowego stężenia 0,4 mg/ml białka mitochondrialnego. Następnie odprowadzić medium do oddychania z komory oksygrafu skalibrowanej pod kątem powietrza. Dodać 2,1 ml zawiesiny izolowanych mitochondriów.

Włóż korek, aby zamknąć komorę oksygrafu. Następnie stale mieszaj zawiesinę mitochondrialną z prędkością 700 RPM w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rejestruj oddychanie komórkowe w stanie spoczynkowym przez trzy do pięciu minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.

Aby rozpocząć oddychanie zależne od kompleksu I, wstrzyknij 12,5 µL malonianu o stężeniu 0,8 M do komory oksygrafu z zawiesiną wyizolowanych mitochondriów przez tytanowy port wstrzykiwania w korku. Następnie wstrzyknij 10 µL glutaminianu o stężeniu 2 M. Rejestruj oddychanie komórkowe przez trzy do pięciu minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału przepływu tlenu.

Następnie wstrzyknij 10 µL 0,05 M ADP do komory przez port wtryskowy. Rejestruj oddychanie komórkowe do momentu, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie, a następnie spadnie i ustabilizuje się. W przypadku oddychania zależnego od kompleksu II wstrzyknij 2 µL 0,2 mM rotenonu do komory oksygrafu przygotowanej z zawiesiną izolowanych mitochondriów.

Rejestruj oddychanie komórkowe do momentu uzyskania stabilnego sygnału przepływu tlenu. Następnie wstrzyknij 20 µL 1 M bursztynianu. Rejestruj oddychanie komórkowe do momentu uzyskania stabilnego sygnału przepływu tlenu.

Następnie wstrzyknij 10 µL 0,05 M ADP do komory poprzez port wtryskowy. Rejestruj oddychanie komórkowe do momentu, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie, a następnie spadnie i ustabilizuje się. W celu pomiaru oddychania zależnego od kompleksu IV, wstrzyknij 2,5 µL 0,8 mM askorbinianu do komory oksygrafu przygotowanej z zawiesiną izolowanych mitochondriów.

Następnie niezwłocznie wstrzyknij 2,5 µL 0,2 M TMPD oraz 10 µL 0,05 M ADP. Rejestruj oddychanie komórkowe aż do uzyskania stabilnego sygnału przepływu tlenu. Następnie wstrzyknij 10 µL 1 M azotku sodu.

Rejestruj oddychanie komórkowe aż do momentu, gdy sygnał strumienia tlenu spadnie, a następnie się ustabilizuje. W niniejszym badaniu nienaruszone mitochondria są izolowane z mięśnia szkieletowego. Następnie mierzy się tempo oddychania zależne od kompleksu I za pomocą respirometrii wysokiej rozdzielczości.

Jak widać, tempo respiracji mitochondrialnej wzrasta natychmiast po dodaniu ADP. Po wyczerpaniu ADP tempo respiracji spada do poziomów zbliżonych do tych obserwowanych przed dodaniem ADP. Wskazuje to, że stosunek stanu 3 do stanu 4, znany jako wskaźnik kontroli oddechowej (RCR), jest wysoki, a integralność mitochondriów została dobrze zachowana podczas procedury izolacji.

Następnie obserwuje się tempo oddychania zależne od kompleksu II, hamując oddychanie zależne od kompleksu I za pomocą rotenonu i wstrzykując bursztynian jako substrat kompleksu II. Następnie dodaje się ADP, co skutkuje natychmiastowym wzrostem oddychania. Po wyczerpaniu ADP oddychanie spada do poziomów zbliżonych do tych obserwowanych przed dodaniem ADP, co wskazuje na wysoki RCR i świadczy o dobrym zachowaniu integralności mitochondriów podczas izolacji.

Wskaźniki oddychania zależnego od kompleksu IV obserwuje się poprzez dodanie askorbinianu, TMPD i ADP. Następnie dodaje się azydku sodu w celu zahamowania kompleksu IV. Różnica w zużyciu tlenu przed i po dodaniu azydku sodu jest interpretowana jako rzeczywiste oddychanie zależne od kompleksu IV. Wysoki wskaźnik oddychania zależnego od kompleksu IV zaobserwowany w stanie 3 wskazuje, że integralność mitochondrialna została dobrze zachowana podczas procedury izolacji.

Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w czasie krótszym niż półtorej godziny. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o wcześniejszym przeprowadzeniu kalibracji czujników tlenu przed homogenizacją. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak pomiary zawartości ADP w komórkach, potencjału błony mitochondrialnej, aktywności enzymatycznej syntazy ATP oraz poziomu substratów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. czy zmiany w tempie oddychania wynikają z braku substratu mitochondrialnego, potencjału błony lub obniżonej aktywności enzymatycznej syntazy ATP.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować mitochondria z mięśnia szkieletowego metodą wirowania różnicowego oraz jak mierzyć szybkość oddychania kompleksów mitochondrialnych I, II i IV przy użyciu respirometrii wysokiej rozdzielczości. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie mitochondrialnego metabolizmu energetycznego do badania funkcji energetycznej mitochondriów w takich obszarach jak genetyczne choroby mitochondrialne, miopatie oraz uszkodzenia reperfuzyjne w izolowanych mitochondriach. Należy pamiętać, że praca z antymycyną A, rotenonem, azotkiem sodu i FCCP może być niezwykle niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.