Name: Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Naucz się izolować nienaruszone mitochondria z mięśni szkieletowych metodą wirowania różnicowego. Zmierz aktywność oddechową kompleksów I, II i IV za pomocą respirometrii wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (Grant 32003B_127619).

Biopsja mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, od której mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Świnia jest następnie wykorzystywana do kolejnego eksperymentu. Badanie przeprowadza się zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt doświadczalnych oraz za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Kantonu Berno w Szwajcarii.
1. Homogenizacja mięśni szkieletowych i izolacja mitochondriów
<ol>
	<li>Wyciąć 5-10 g próbki mięśnia czworogłowego uda od znieczulonej świni. W niniejszym teście użyj mięśni szkieletowych świni. Protokół ten może być również stosowany do izolowania mitochondriów od innych gatunków (np. szczurów, myszy, ludzi itp.). 
	UWAGA: Ten krok jest wykonywany przez lekarza specjalistę z doświadczeniem w chirurgii.
	<ol>
		<li>Spokojne świnie z ketaminą (20 mg/kg) i ksylazyną (2 mg/kg), przed znieczuleniem indukowanym dożylnie midazolamem (0,5 mg/kg plus atropina 0,02 mg/kg). Utrzymuj znieczulenie za pomocą ciągłych wlewów dożylnych propofolu (4-8 mg/kg na godzinę) i fentanylu (30 μg/kg na godzinę) podczas operacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast zanurzyć próbkę tkanki w zlewce zawierającej 20 ml lodowatego buforu do izolacji mitochondriów (Tabela 1). 
	UWAGA: używane podczas homogenizacji i wirowania powinny być lodowate i mieć fizjologicznie odpowiednie pH o sile jonowej i osmotycznej zgodnej z cytozolem.</li>
	<li>Zważyć próbkę tkanki w zlewce na tarowanej wadze analitycznej. Wytaruj pozostałą część zlewką zawierającą 20 ml buforu izolacyjnego.</li>
	<li>Umieść zlewkę w wiaderku z lodem. 
	UWAGA: Wykonaj wszystkie kolejne kroki procedury homogenizacji w temperaturze pojemnika na lód i trzymaj wszystkie w pojemniku na lód.</li>
	<li>Miel mięśnie szkieletowe w zlewce (trzymaj na lodzie) na małe kawałki o średnicy 1-2 mm przez 3-4 minuty za pomocą cienkich nożyczek.</li>
	<li>Dwukrotnie przepłukać zmieloną tkankę w zlewce lodowatym buforem izolacyjnym (20 ml na każdym etapie płukania).</li>
	<li>Zawiesić tkankę w 10 objętościach buforu izolacyjnego na masę tkanki (g) zawierającej 5 mg proteazy/g tkanki.</li>
	<li>Umieścić zlewkę w łaźni lodowej na mieszadle magnetycznym i mieszać przez 10 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę w zlewce dodatkowymi 10 objętościami buforu izolacyjnego na masę tkanki (g) uzupełnionymi 0,2% (wagowo/objętościowo) odtłuszczonej albuminy surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Zdekantować cały bufor izolacyjny uzupełniony 0,2% BSA i dwukrotnie przepłukać tkankę w zlewce lodowatym buforem izolacyjnym uzupełnionym 0,2% BSA (20 ml na każdym etapie płukania).</li>
	<li>Zawiesić tkankę w 10 objętościach buforu izolacyjnego na masę tkanki (g) uzupełnionym 0,2% odtłuszczonym BSA.</li>
	<li>Homogenizować tkankę za pomocą półautomatycznego homogenizatora szklanego (trzymanego na lodzie) za pomocą luźno dopasowanego tłuczka (10 uderzeń). 
	UWAGA: Homogenizuj tkankę zawsze w ten sam sposób (ta sama liczba uderzeń, np. 10 uderzeń). Większa liczba udarów może uszkodzić i rozłączyć mitochondria. Najlepiej homogenizować tkankę za pomocą automatycznego homogenizatora. Ręcznie (i subiektywnie) homogenizowane próbki tkanek w homogenizatorach szklanych mogą dawać różne jakości izolowane mitochondria.</li>
	<li>Odwirować homogenizowaną tkankę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 10 000 x g. 
	UWAGA: Wszystkie etapy wirowania są wykonywane w wirówkach z wirnikami o stałym kącie nachylenia.</li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą pipety serologicznej i ponownie zawiesić osad w lodowato zimnym pożywce izolacyjnej uzupełnionej BSA (10 ml/g tkanki).</li>
	<li>Odwirować zawiesinę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 350 x g.</li>
	<li>Zachować supernatant za pomocą pipety serologicznej i wyrzucić osad (resztki komórkowe).</li>
	<li>Przefiltrować sklarowany osad do zlewki (trzymanej na lodzie) przez dwie warstwy gazy (17 zwojów/cm2) w celu usunięcia resztek komórek.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowaną zawiesinę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy sile 7 000 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić surowy osad mitochondrialny w buforze izolacyjnym (5 ml/g tkanki) uzupełnionym 0,2% (wagowo/objętościowo) BSA i odwirować zawiesinę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 7 000 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić surowy osad mitochondrialny w buforze do przemywania (Tabela 1). Zawiesinę należy ponownie odwirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy sile 7 000 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić surowe osady mitochondrialne w buforze do przemywania i ponownie odwirować zawiesinę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 7 000 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić surowy osad mitochondrialny w 1,0 ml buforu do przemywania wody.</li>
	<li>Określić stężenie białka w zawiesinie mitochondrialnej i utrzymać skoncentrowaną zawiesinę mitochondrialną na lodzie. 
	UWAGA: Stężenie białka można zmierzyć dowolną standardową metodą.</li>
	<li>Tuż przed testami respirometrycznymi należy ponownie zawiesić zawiesinę mitochondrialną w buforze oddechowym do końcowego stężenia 0,4 mg/ml białka mitochondrialnego.</li>
</ol>
2. Respirometria o wysokiej rozdzielczości
<ol>
	<li>Odpipetować 2,1 ml buforu oddechowego (Tabela 1) 16 do komory oksygraficznej o wysokiej rozdzielczości i mieszać bufor w sposób ciągły za pomocą mieszadła magnetycznego znajdującego się w komorze (700 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu z polarograficznego czujnika tlenu. 
	UWAGA: Polarograficzne elektrody tlenowe w każdej komorze oksygraficznej mierzą stężenie tlenu i obliczają zużycie tlenu (strumień) w każdej komorze. Stężenie tlenu i wskaźniki zużycia tlenu (strumień) są wyświetlane w czasie rzeczywistym online w komputerze za pomocą oprogramowania do gromadzenia i analizy danych. Ponadto, aby zapewnić dokładne i wiarygodne wyniki, instrumentalną korekcję tła tlenu należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Dokładnie 2,1 ml buforu oddechowego dodaje się do komory w celu kalibracji końcowej objętości komory wynoszącej 2,0 ml po zamknięciu korków.</li>
	<li>Wykonaj kalibrację powietrza polarograficznego czujnika tlenu zgodnie z protokołami producenta 17. 
	UWAGA: Podczas kalibracji powietrza, przy obecności fazy gazowej, stężenie tlenu w medium zrównoważy się rzędu 15-20 minut. W zależności od temperatury, ciśnienia atmosferycznego i rozpuszczalności mediów – stężenia tlenu.</li>
	<li>Po kalibracji powietrza odessać pożywkę oddechową z komory oksygraficznej i dodać 2,1 ml izolowanej zawiesiny mitochondrialnej (0,4 mg/ml białka mitochondrialnego) z kroku 1.24 do komory oksygrafu. 
	UWAGA: Objętość bufora oddechowego zależy od konfiguracji przyrządu i producenta. W przypadku respirometrii o wysokiej rozdzielczości do komory dodaje się 2,1 ml buforu oddechowego w celu kalibracji końcowej objętości komory wynoszącej 2,0 ml po zamknięciu korków.</li>
	<li>Zamknąć komorę oksygraficzną poprzez włożenie korka.</li>
	<li>Mieszać zawiesinę mitochondrialną w sposób ciągły za pomocą mieszadła magnetycznego znajdującego się w komorze (700 obr./min) w temperaturze 37 °C i rejestrować oddychanie komórkowe na linii podstawowej przez 3-5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu. 
	UWAGA: Stężenie tlenu i sygnał strumienia tlenu są wyświetlane w czasie rzeczywistym online na komputerze za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy danych 17.</li>
	<li>Następnie wstrzyknąć substraty i inhibitory oddychania mitochondrialnego przez tytanowe porty iniekcyjne korków, stosując następujące standardowe protokoły.</li>
</ol>
3. Oddychanie złożone zależne od litery I
<ol>
	<li>Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą wyizolowaną zawiesinę mitochondrialną (0,4 mg/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.1-2.5 i poczekać na stabilny sygnał.</li>
	<li>Wstrzyknąć 12,5 μl 0,8 M jabłczanu (5 mM stężenie końcowe) i 10 μl 2 M glutaminianu (10 mM stężenie końcowe) do komory oksygraficznej zawierającej izolowaną zawiesinę mitochondrialną (0,4 mg/ml) przez tytanowy port iniekcyjny korka komory i rejestrować oddychanie komórkowe przez 3-5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu. 
	UWAGA: Wszystkie wstrzyknięcia w poniższych krokach są wykonywane przez tytanowe porty iniekcyjne korków za pomocą strzykawek.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μl 0,05 M ADP (0,25 mM) do komory oksygraficznej przez tytanowy port iniekcyjny korka komory i rejestrować oddychanie mitochondrialne, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie, a następnie zmniejszy się i ustabilizuje (3-5 min). 
	UWAGA: Plateau oddychania po dodaniu ADP wskazuje, że stężenie ADP było wysokie i nasycone. W zależności od ilości mitochondriów wykorzystywanych podczas oddychania, stężenie ADP należy miareczkować w celu uzyskania stabilnego zużycia tlenu w stanie 3 (maksymalne oddychanie). Dodanie ADP do zawiesiny mitochondrialnej spowoduje wzrost zużycia tlenu, a sygnał strumienia tlenu wzrośnie (stan 3 oddychania). Po zużyciu ADP sygnał strumienia tlenu zmniejszy się (stan 4 oddychania).</li>
</ol>
4. Oddychanie zależne od kompleksu II.
<ol>
	<li>Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą izolowaną zawiesinę mitochondrialną (0,4 mg/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.1-2.5 i poczekać na stabilny sygnał.</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl 0,2 mM rotenonu (0,2 μM) "UWAGA" do komory oksygraficznej przez tytanowy otwór iniekcyjny korka komory za pomocą strzykawki i rejestrować oddychanie komórkowe przez 3-5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu. 
	UWAGA: Rotenon jest niebezpieczną trucizną i może mieć znaczący wpływ na zdrowie człowieka.</li>
	<li>Wstrzyknąć 20 μl 1 M bursztynianu (10 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie mitochondrialne przez 3-5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μL 0,05 M ADP (0,25 mM) do komory oksygraficznej przez tytanowy port iniekcyjny korka komory i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie, ustabilizuje się, a następnie zmniejszy i ustabilizuje (3-5 min). 
	UWAGA: Dodanie ADP do zawiesiny mitochondrialnej spowoduje wzrost zużycia tlenu i zwiększy się sygnał strumienia tlenu (stan 3 oddychania). Po zużyciu ADP sygnał strumienia tlenu zmniejszy się (stan 4 oddychania).</li>
</ol>
5. Złożone oddychanie zależne od kroplówki
<ol>
	<li>Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą izolowaną zawiesinę mitochondrialną (0,4 mg/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.1 do 2.5 protokołu i poczekać na stabilny sygnał.</li>
	<li>Następnie wstrzyknąć 2,5 μl askorbinianu o stężeniu 0,8 mM (1 mM). Bezpośrednio po tym wstrzyknąć 2,5 μl 0,2 M TMPD (0,25 mM) i 10 μl 0,05 M ADP (0,25 mM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie i ustabilizuje się (3-5 min).</li>
	<li>Na koniec wstrzyknąć 10 μl 1 M azydku sodu (5 mM) "UWAGA" do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się i ustabilizuje. 
	UWAGA: Azydek sodu jest niebezpieczną trucizną i może mieć znaczący wpływ na zdrowie człowieka.</li>
</ol>
6. Test na cytochrom C
<ol>
	<li>Przygotować komorę oksygraficzną zawierającą izolowaną zawiesinę mitochondrialną (0,4 mg/ml) zgodnie z procedurą opisaną w krokach 2.1 do 2.5 protokołu i poczekać na stabilny sygnał.</li>
	<li>Wstrzyknąć 12,5 μl 0,8 M jabłczanu (5 mM stężenie końcowe) i 10 μl 2 M glutaminianu (10 mM stężenie końcowe) do komory oksygraficznej zawierającej izolowaną zawiesinę mitochondrialną (0,4 mg / ml) przez tytanowy port iniekcyjny korka komory i rejestrować oddychanie komórkowe przez 3-5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 μL 0,5 M ADP (2,5 mM) do komory oksygraficznej przez tytanowy port iniekcyjny korka komory i rejestrować oddychanie mitochondrialne, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie, a następnie zmniejszy się i ustabilizuje (3-5 min).</li>
	<li>Na koniec wstrzyknąć 5 μl 4 mM cytochromu c (10 μM) do komory oksygraficznej i rejestrować oddychanie komórkowe przez 5 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.</li>
</ol>

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues.+I.+Isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Sims, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+brain+and+subregions+using+Percoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation.</a> J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).</li>
<li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Vuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+catecholamines+on+hepatic+and+skeletal+muscle+mitochondrial+respiration+after+prolonged+exposure+to+faecal+peritonitis+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs.</a> Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).</li>
<li>Corrêa, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+in+septic+shock%3A+effects+on+tissue+perfusion%2C+organ+function%2C+and+mitochondrial+respiration+in+a+porcine+model+of+fecal+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis.</a> Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).</li>
<li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074(2015).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%22">Bioenergetics</a>. 3, Academic Press. San Diego. (2002).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Subj.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3076726/">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), e18317(2011).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+crude+mitochondrial+fraction+by+density-gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell.+Biol.+Chapter+3%22%5BJournal%5D)">Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).</li>
<li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), 382392(2013).</li>
<li>Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li>
<li>Lombardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+muscle+mitochondria+subpopulations+in+pig%3A+a+study+using+top-down+elasticity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis.</a> FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym badaniu opisano protokół izolacji wysokiej jakości, nienaruszonych i ściśle sprzężonych mitochondriów mięśni szkieletowych poprzez wirowanie różnicowe, które można wykorzystać do badań funkcjonalnych, takich jak respirometria o wysokiej rozdzielczości.
Aby wyizolować nienaruszone i ściśle sprzężone mitochondria, istnieje kilka krytycznych punktów, które należy wziąć pod uwagę w niniejszym protokole. Po pobraniu tkanki szkieletowej należy ją natychmiast zanurzyć w lodowatym buforze...

Bioenergetyka mitochondriów i zdolności oddechowe mogą być badane nie tylko w przepuszczalnych komórkach lub włóknach, ale także w izolowanych mitochondriach. W niniejszym badaniu opisujemy protokół izolacji nienaruszonych mitochondriów mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego do pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości.
Aby wyizolować nienaruszone mitochondria do respirometrii, tkanka jest homogenizowana, a mitochondria są izolowane za pomocą konwencjonalnej metody wirowania różnicowego. Metoda wirowania różnicowego oparta na sekwencyjnych wirowaniach (w serii o rosnącej prędkości) homogenatów tkankowych została po raz pierwszy wprowadzona przez Pallade i współpracowników prawie 70 lat temu 1. Tkanka jest najpierw mielona nożyczkami i homogenizowana mechanicznie w szklanym homogenizatorze za pomocą luźno dopasowanego tłuczka. Następnie homogenat jest odwirowywany z niską prędkością, a powstały osad, który zawiera nieuszkodzoną tkankę, resztki komórkowe i jądra, jest odrzucany. Następnie supernatant jest kilkakrotnie odwirowywany z dużą prędkością i pobierana jest frakcja wzbogacona w mitochondria. Zalety metody wirowania różnicowego w celu wyizolowania mitochondriów są następujące: i) metoda jest szybka, a mitochondria można wyizolować w ciągu 1-1,5 godziny (eksperymenty oddechowe należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe); ii) jest niedrogi; oraz iii) jest bardzo wydajny, a mitochondria uzyskane przez wirowanie różnicowe są wystarczająco czyste do testów respirometrycznych. Wady metody wirowania różnicowego w celu wyizolowania mitochondriów polegają na tym, że i) mitochondria mogą ulec uszkodzeniu i rozprzęgnięciu podczas homogenizacji; ii) zanieczyszczenie mitochondriów innymi składnikami komórkowymi (można je rozwiązać poprzez dalsze płukanie osadu mitochondrialnego dodatkowymi etapami wirowania); iii) możliwość wyboru różnych subpopulacji mitochondrialnych, np. podczas etapów wirowania różnicowego można wykluczyć mitochondria o mniejszej gęstości 7; oraz iv) brakuje mitochondrialnego otoczenia komórkowego i można zmierzyć tylko teoretyczne maksymalne oddychanie. Inną metodą izolacji mitochondriów do testów respirometrycznych jest wirowanie w gradiencie gęstości 2. W tej technice ekstrakt tkankowy jest nakładany warstwami na roztwór sacharozy lub gradientu Percollu (o większej gęstości na dnie probówki wirówkowej) i odwirowywany z określoną prędkością, co powoduje izolację mitochondriów od innych składników komórkowych zgodnie z ich gęstością. Metoda ta jest często stosowana do izolowania mitochondriów mózgu o bardzo niskim zanieczyszczeniu od synaptosomów. Jednak mitochondria wątroby szczura wyizolowane przez wirowanie w gradiencie gęstości są silnie zanieczyszczone innymi organellami komórkowymi 3. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że gradient sacharozy obecny w probówce wirówkowej może spowodować pęknięcie niektórych mitochondriów (wstrząs osmotyczny).
W zależności od rodzaju tkanki; istnieje kilka ważnych czynników, które należy wziąć pod uwagę przy izolacji nienaruszonych mitochondriów przez różnicowe wirowanie. Pierwszą koniecznością jest homogenizacja tkanek w delikatny sposób. Tkanki miękkie, takie jak nerki, mózg i wątroba, wymagają delikatnych sił mechanicznych przyłożonych podczas homogenizacji. Kontrastuje to z tkankami twardymi, takimi jak mięśnie sercowe i szkieletowe, które wymagają znacznie silniejszych sił mechanicznych. Tkanka mielona jest zwykle traktowana proteinazą przed homogenizacją w celu zmiękczenia tkanki. Wszystkie używane podczas homogenizacji i wirowania powinny być lodowate i mieć fizjologicznie odpowiednie pH o sile jonowej i osmotycznej zgodnej z cytozolem 4,5.
Jedną z zalet badania izolowanej bioenergetyki mitochondrialnej jest to, że błony komórkowe plazmatyczne nie muszą być przesiąknięte detergentami, takimi jak digitonina czy saponina 4,6, co może zagrozić integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej. Kolejną zaletą izolowanych mitochondriów jest brak innych czynników cytozolowych, które mogą zakłócać analizę funkcji mitochondriów, takich jak zużycie tlenu. Wadami stosowania izolowanych mitochondriów są możliwy wybór określonych populacji mitochondriów podczas etapów wirowania, uszkodzenie mitochondriów podczas homogenizacji oraz wymóg dużej ilości próbek biologicznych w celu uzyskania dobrej wydajności izolowanych mitochondriów 7,8.
Po procedurze izolacji, częstość oddechów kompleksów mitochondrialnych zależnych od I, II i IV (stany 2, 3 i 4) jest określana za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości. W przypadku złożonego oddychania sterowanego przez I dodaje się glutaminian i jabłczan, a następnie difosforan adenozyny (ADP). W przypadku złożonego oddychania sterowanego przez II dodaje się bursztynian, a następnie ADP. W przypadku złożonego oddychania sterowanego dożylnie dodaje się askorbinian i tetrametylofenylenodiaminę (TMPD), a następnie ADP 9,10,11,12. Stan 2 odnosi się do zużycia tlenu w obecności samych substratów. Stan 3 odnosi się do zużycia tlenu w obecności substratów i ADP. Stan 4 odnosi się do zużycia tlenu po wyczerpaniu ADP. Współczynnik kontroli oddechu (RCR) jest wskaźnikiem sprzężenia zużycia tlenu produkcji ATP i jest obliczany jako stosunek między stanem 3 a stanem 4 13,15.
Podsumowując, opisujemy protokół izolowania funkcjonalnych i nienaruszonych mitochondriów mięśni szkieletowych poprzez wirowanie różnicowe i używamy tych izolowanych mitochondriów do badań funkcjonalnych i bioenergetycznych, takich jak respirometria o wysokiej rozdzielczości.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Chemiczny, rozpuszcza się w etanolu</td></tr><tr><td>Askorbinian</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A 7699</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma,G</td> <td>1626</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td>Sigma H 7523</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>K-laktobionian</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>kwas morfolinopropanosulfonowy (MOPS)</td><td>Merck</td><td>1.06129</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>rdzeń O2k: Oxygraph-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Przyrząd do respirometrii o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Proteinaza bakteryjna</td><td>Sigma</td><td>P 8038</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Chemiczna, rozpuszczająca się w etanolu</td></tr><tr><td>Bursztynian</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>Schuett homogen-plus homogenizator półautomatyczny&nbsp;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>Homogenizator tkankowy</td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>TMPD</td><td></td><td>Sigma T 3134</td><td>Chemiczny</td></tr></tbody></table>

izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria biorą udział w metabolizmie energii komórkowej i wykorzystują tlen do produkcji energii w postaci adenozynotrójfosforanu (ATP). Wirowanie różnicowe z niską i dużą prędkością jest powszechnie stosowane do izolowania mitochondriów od tkanek i hodowanych komórek. Surowe frakcje mitochondrialne otrzymane przez wirowanie różnicowe stosuje się do pomiarów respirometrycznych. Technika wirowania różnicowego opiera się na rozdzieleniu organelli w zależności od ich wielkości i prędkości sedymentacji. Izolację mitochondriów przeprowadza się natychmiast po pobraniu tkanek. Tkankę zanurza się w lodowatym podłożu homogenizacyjnym, miele nożyczkami i homogenizuje w szklanym homogenizatorze za pomocą luźno dopasowanego tłuczka. Technika wirowania różnicowego jest wydajna, szybka i niedroga, a mitochondria uzyskane przez wirowanie różnicowe są wystarczająco czyste do testów respirometrycznych. Niektóre z ograniczeń i wad izolowanych mitochondriów, opartych na wirowaniu różnicowym, polegają na tym, że mitochondria mogą zostać uszkodzone podczas procedury homogenizacji i izolacji oraz że do izolacji mitochondriów wymagane są duże ilości biopsji tkanki lub hodowanych komórek.

Oddychanie zależne od kompleksu I
Wskaźniki oddychania zależne od mitochondrialnego kompleksu I w izolacie (stany 2, 3 i 4) są wyznaczane przy użyciu respirometrii wysokiej rozdzielczości (Rycina 1, schemat reprezentatywny). Dodaje się substraty mitochondrialnego kompleksu I, glutaminian i jabłczan, a następnie ADP. Stan 2 odnosi się do zużycia tlenu w obecności samych substratów. Stan 3 odnosi ...

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie mitochondriów mięśni szkieletowych metodą wirowania różnicowego oraz oznaczenie szybkości oddychania kompleksów I, II i IV mitochondrialnego łańcucha oddechowego. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu bioenergetyki mitochondrialnej, dotyczące m.in. chorób i zespołów związanych z dysfunkcją mitochondriów, takich jak różnorodne schorzenia neurologiczne, sepsa oraz zaburzenia związane z wiekiem. Główną zaletą tej techniki jest brak większości czynników cytologicznych w wyizolowanym preparacie mitochondrialnym, które mogłyby zakłócić analizę funkcji mitochondriów. Procedurę zaprezentuje Sandra Nansoz, technik z mojego laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować zlewkę z próbkami mięśnia szkieletowego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść zlewkę w pojemniku z lodem. Za pomocą precyzyjnych nożyczek posiekaj mięsień na kawałki o rozmiarze od 1 do 2 mm.Następnie dwa razy przepłucz rozdrobnioną tkankę lodowatym buforem izolacyjnym, używając 20 ml na każde płukanie. Zawieś wypłukaną tkankę w 10 ml buforu izolacyjnego na gram tkanki, a następnie dodaj pięć mg proteazy-G do tkank

isolation-intact-mitochondria-from-skeletal-muscle-differential

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Opisano metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji tkanek ssaków. Preparaty wątroby szczura lub mięśni szkieletowych homogenizowano za pomocą komercyjnego dysocjatora tkanek, a mitochondria izolowano przez filtrację różnicową przez filtry z siatki nylonowej. Czas izolacji mitochondriów wynosi &lt;30 min w porównaniu do 60 - 100 min przy użyciu metod alternatywnych.

Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Mitochondria są kluczowymi organellami metabolicznymi, które wykazują wysoki poziom plastyczności fenotypowej w mięśniach szkieletowych. Import białek z cytozolu jest krytycznym szlakiem biogenezy organelli, niezbędnym do ekspansji retikulum i utrzymania funkcji mitochondriów.  Dlatego import białka służy jako barometr zdrowia komórek.

Pomiar zdolności importowej białek z mitochondriów mięśni szkieletowych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Opisana tutaj jest metoda bezpośredniego pomiaru iskier wapniowych, podstawowych jednostek uwalniania Ca2+ z siateczki sarkoplazmatycznej w nienaruszonych włóknach mięśni szkieletowych. Metoda ta wykorzystuje wyzwalanie za pośrednictwem stresu osmotycznego uwalniania Ca2 + z receptora ryanodine w izolowanych włóknach mięśniowych. Dynamika i zdolność homeostatyczna wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2 + można wykorzystać do oceny funkcji mięśni w zdrowiu i chorobie.

Ocena iskier wapniowych w nienaruszonych włóknach mięśni szkieletowych

Naucz się izolować nienaruszone mitochondria z mięśni szkieletowych metodą wirowania różnicowego. Zmierz aktywność oddechową kompleksów I, II i IV za pomocą respirometrii wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów