Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mitochondriów mięśni szkieletowych poprzez wirowanie różnicowe i określenie częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bioenergetyki mitochondriów, takie jak choroby i zespoły związane z dysfunkcją mitochondriów, takie jak różne choroby neurologiczne, sepsa i zaburzenia związane z wiekiem. Główną zaletą tej techniki jest brak większości czynników cytologicznych w wyizolowanym preparacie mitochondrialnym, które mogą zakłócać analizę funkcji mitochondriów. Procedurę zademonstruje Sandra Nansoz, technik z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy uzyskać zlewkę z próbkami mięśni szkieletowych, jak opisano w protokole tekstowym. Umieść zlewkę na wiaderku z lodem. Za pomocą cienkich nożyczek zmiel mięsień na kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów.

Następnie dwukrotnie przepłucz zmieloną tkankę lodowatym buforem izolacyjnym, używając 20 mililitrów na każde pranie. Zawiesić umytą tkankę w 10 mililitrach buforu izolacyjnego na gram tkanki, a następnie dodać pięć miligramów tkanki proteazy G. Następnie umieść zlewkę w łaźni lodowej z mieszadłem magnetycznym i mieszaj przez 10 minut.

Następnie rozcieńczyć zawiesinę dodatkowymi 10 mililitrami buforu izolacyjnego uzupełnionego 0,2% odtłuszczonym BSA na gram tkanki. Następnie zdekantować cały bufor izolacyjny ze zlewki. Umyj tkankę dwukrotnie lodowatym buforem izolacyjnym uzupełnionym 0,2% BSA, używając 20 mililitrów do każdego przemycia.

Następnie ponownie zawiesić tkankę w 10 mililitrach buforu izolacyjnego uzupełnionego BSA na gram tkanki. Użyj półautomatycznego homogenizatora szklanego z luźno dopasowanym tłuczkiem, aby homogenizować tkankę. Następnie przenieść homogenat do probówki wirówkowej i odwirować w temperaturze 10 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Za pomocą pipety serologicznej odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad za pomocą 10 mililitrów lodowatego podłoża izolacyjnego uzupełnionego BSA na gram tkanki. Odwirować zawiesinę w temperaturze 350 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie należy użyć pipety serologicznej, aby zarezerwować supernatant, odrzucając osad. Przefiltrować sklarowany osad do zlewki trzymanej na lodzie przez dwie warstwy gazy. Przefiltrowaną zawiesinę przenieść do probówki wirówkowej i odwirować 7 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić surowy osad mitochondrialny w pięciu mililitrach buforu izolacyjnego uzupełnionego BSA na gram tkanki. Odwirować tę zawiesinę 7 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach buforu do płukania. Wirować w temperaturze 7 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powtórzyć ten proces ponownego zawieszania i wirowania jeszcze raz.

Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do płukania. Oznaczyć stężenie białka przy użyciu dowolnej metody wzorcowej. Następnie należy trzymać skoncentrowaną zawiesinę mitochondrialną na lodzie, aż będzie gotowa do wykonania testów respirometrycznych.

Na początek ponownie zawiesić koncentrat mitochondrialny w buforze oddechowym do końcowego stężenia 0,4 miligrama na mililitr białka mitochondrialnego. Następnie należy odessać medium oddechowe z komory oksygraficznej kalibrowanej powietrzem. Dodaj 2,1 mililitra izolowanej zawiesiny mitochondrialnej.

Włożyć korek, aby zamknąć komorę oksygraficzną. Następnie mieszaj zawiesinę mitochondrialną w sposób ciągły z prędkością 700 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rejestruj oddychanie komórkowe na początku badania przez trzy do pięciu minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.

Aby rozpocząć złożone oddychanie zależne od I, wstrzyknij 12,5 mikrolitra 0,8 molowego jabłczanu do komory oksygraficznej przygotowanej z izolowaną zawiesiną mitochondrialną przez tytanowy port iniekcyjny korka. Następnie wstrzyknij 10 mikrolitrów dwóch molowych glutaminianu. Rejestruj oddychanie komórkowe przez trzy do pięciu minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.

Następnie wstrzyknąć 10 mikrolitrów 0,05 molowego ADP do komory przez port iniekcyjny. Rejestruj oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie, a następnie zmniejszy się i ustabilizuje. W przypadku oddychania zależnego od kompleksu II wstrzyknąć dwa mikrolitry 0,2 milimolowego rotenonu do komory oksygraficznej przygotowanej z izolowaną zawiesiną mitochondrialną.

Rejestruj oddychanie komórkowe do momentu uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu. Następnie wstrzyknij 20 mikrolitrów jednego molowego bursztynianu. Rejestruj oddychanie komórkowe do momentu uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu.

Następnie wstrzyknąć 10 mikrolitrów 0,05 molowego ADP do komory przez port iniekcyjny. Rejestruj oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu wzrośnie, a następnie zmniejszy się i ustabilizuje. W przypadku złożonego oddychania zależnego dożylnie wstrzyknąć 2,5 mikrolitra 0,8 milimolowego askorbinianu do komory oksygraficznej przygotowanej z izolowaną zawiesiną mitochondrialną.

Następnie natychmiast wstrzyknąć 2,5 mikrolitra 0,2 molowego TMPD i 10 mikrolitrów 0,05 molowego ADP. Rejestruj oddychanie komórkowe do momentu uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu. Następnie wstrzyknąć 10 mikrolitrów jednego molowego azydku sodu.

Rejestruj oddychanie komórkowe, aż sygnał strumienia tlenu zmniejszy się, a następnie ustabilizuje się. W tym badaniu nienaruszone mitochondria są izolowane z mięśni szkieletowych. Częstość oddechów zależnych od złożonej litery I jest następnie mierzona za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Jak widać, częstość oddychania mitochondrialnego wzrasta natychmiast po dodaniu ADP. Częstość oddechów zmniejsza się po wyczerpaniu ADP do poziomów podobnych do obserwowanych przed dodaniem ADP. Wskazuje to, że stosunek stanu 3 do stanu 4, znany jako współczynnik kontroli oddechowej lub RCR, jest wysoki i że integralność mitochondriów jest dobrze zachowana podczas procedury izolacji.

Częstość oddechów zależna od kompleksu II jest następnie obserwowana poprzez hamowanie oddychania kompleksu I za pomocą rotenonu i wstrzykiwanie bursztynianu substratu kompleksu II. Następnie dodawany jest ADP, co powoduje natychmiastowe zwiększenie oddychania. Po wyczerpaniu ADP oddychanie zmniejsza się do poziomów podobnych do tych obserwowanych przed dodaniem ADP, co wskazuje na wysoki RCR, ponieważ integralność mitochondriów jest dobrze zachowana podczas izolacji.

Częstość oddychania zależna od złożonych kroplówek obserwuje się przez dodanie askorbinianu, TMPD i ADP. Następnie dodaje się azydek sodu w celu zahamowania kompleksu IV. Różnica w zużyciu tlenu przed i po dodaniu azydku sodu jest interpretowana jako rzeczywiste oddychanie dożylne kompleksu. Wysoka częstość oddychania zależna od kompleksu IV obserwowana w stanie 3 wskazuje, że integralność mitochondriów jest zachowana podczas procedury izolacji.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż półtorej godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wcześniejszym skalibrowaniu czujników tlenu przed homogenizacją. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak pomiary zawartości ADP w komórkach, potencjału błony mitochondrialnej, aktywności enzymatycznej syntazy ATP jako poziomów substratu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy zmiany w częstości oddechów są spowodowane brakiem substratu mitochondrialnego, potencjału błonowego lub zmniejszonej aktywności enzymatycznej syntazy ATP.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować mitochondria od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego i jak mierzyć częstość oddechów kompleksów mitochondrialnych I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się metabolizmem energii mitochondrialnej do badania funkcji energetycznych mitochondriów w takich dziedzinach, jak genetyczne choroby mitochondriów, miopacie, uszkodzenia reperfuzyjne niedokrwienne w izolowanych mitochondriach. Nie zapominaj, że praca z antymycyną A, rotenonem, azydkiem sodu i FCCP może być bardzo niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.