Sublimacja matrycy DAN do wykrywania i wizualizacji gangliozydów w tkance mózgowej szczura do obrazowania MALDI Spektrometria mas

Ogólnym celem tego protokołu sublimacji jest zapewnienie szczegółowego, łatwego do naśladowania procesu przygotowania próbki do wykrywania gangliozydów w eksperymentach spektrometrii mas obrazowania MALDI. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, w tym anatomiczne rozmieszczenie i funkcję gangliozydów, zarówno w zdrowym mózgu, jak i w patologii mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją dostosować do wysokiej jakości obrazowania wielu gatunków lipidów przy niewielkiej liczbie zmian w protokole.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać tkankę mózgową od szczura i przygotować się do kriostatu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie umieść tkankę w kriostacie. Przekrój tkankę do pożądanej lokalizacji anatomicznej.

Upewnij się, że grubość cięcia wynosi od ośmiu do 12 mikronów. Za pomocą stabilizatora kriostatu powoli przeciąć spłaszczony wycinek tkanki. lub oznaczenia na tkance mogą wystąpić, jeśli umieszczenie pałąka jest nieprawidłowe lub jeśli ostrze jest.

Przesuń chusteczkę na środek platformy do krojenia za pomocą czystych pędzli. Aby zmapować tkankę, zamroź przewodzące szkiełka lub metalowe płytki, umieszczając je w kriostacie podczas krojenia. Gdy szkiełko jest całkowicie zamrożone, ostrożnie przenieś tkankę przekroju na przewodzącą usługę szkiełka za pomocą czystych pędzli malarskich.

Gdy wszystkie sekcje tkanki zostaną prawidłowo umieszczone na szkiełku, umieść palec pod szkiełkiem naprzeciwko tkanki i dociśnij, aż sekcja się rozmrozi. Następnie umieścić szkiełka z chusteczką w eksykatorze na pięć do 10 minut. Alternatywnie użyj ciepłego szkiełka i lekko dociśnij go przewodzącą stroną do dołu do spłaszczonych odcinków tkanki.

Pracując w dygestorium, umieść kąpiel piaskową w aluminiowym pojemniku na płycie grzejnej. Płyta grzejna powinna znajdować się na metalowym podnośniku nożycowym o odpowiedniej powierzchni. Włącz płytę grzejną i ustaw temperaturę na 140 stopni Celsjusza.

Użyj sondy sprzężenia zwrotnego temperatury, aby monitorować temperaturę piasku przez cały czas trwania eksperymentu i zapewnić stałą temperaturę. Następnie umieść 300 miligramów matrycy DAN na dolnej powierzchni aparatu sublimacyjnego. Rozłóż matrycę równą warstwą na środku aparatu do przybliżonej szerokości i długości sublimowanego szkiełka.

Umieść metalową płytkę na wewnętrznej powierzchni aparatu, tak aby płyta stykała się bezpośrednio z dnem skraplacza. Przyklej puste szkiełko testowe po przekątnej przez powierzchnię metalowej płytki, z taśmą umieszczoną na zewnętrznych krawędziach szkiełka. Połącz górną i dolną część urządzenia za pomocą gumowego pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym pośrodku, aby zapewnić całkowite uszczelnienie.

Umieść metalowy przegub w kształcie litery U wokół środka urządzenia i dokręć imadła, aż górna i dolna połowa aparatu zostaną szczelnie ze sobą połączone. Następnie umieść urządzenie w metalowym O-ringu wokół kąpieli piaskowej. Następnie umieść garść pokruszonego lodu w skraplaczu.

Napełnij skraplacz od jednej czwartej do połowy zimną wodą, aby utworzyć lodową breję. Lodowa breja ochłodzi metalową płytkę po wewnętrznej stronie aparatu, a następnie przylgnie do niej szkiełko. Odczekaj co najmniej pięć minut, aż temperatura osiągnie stan ustalony.

Następnie wlej 300 ml metanolu do pojemnika wymrażarki i umieść szkło w pojemniku. Podłącz pompę próżniową do wyjścia wymrażarki za pomocą gumowej rurki. Użyj innego kawałka gumowej rurki, aby podłączyć wejście wymrażarki do aparatu sublimacyjnego.

Upewnij się, że rurka jest szczelnie zabezpieczona za pomocą metalowych clamps. Użyj pompy próżniowej, aby dostarczyć podciśnienie od 30 do 50 militorów. Pozwól pompom pracować przez co najmniej pięć minut w celu wyrównania ciśnienia.

Wrzuć dwa do trzech małych kawałków suchego lodu do etanolu na dnie pojemnika wymrażarki. Wymrażarka pomaga zapobiegać gromadzeniu się cząstek matrycy w pompie próżniowej. Imadła na pierścieniu U aparatu sublimacyjnego mogą wymagać dokręcenia po włączeniu pompy próżniowej z powodu zmniejszonego ciśnienia w aparacie.

Upewnij się, że temperatura kąpieli piaskowej ustabilizowała się na poziomie 140 stopni Celsjusza. Sprawdź również, czy próżnia jest włączona i czy urządzenie jest zabezpieczone w metalowym pierścieniu uszczelniającym o przekroju okrągłym nad kąpielą piaskową z podłączonymi wszystkimi rurkami. Ustaw minutnik na siedem minut, ale nie uruchamiaj timera.

Powoli podnieś podnośnik nożycowy i kąpiel piaskową do aparatu sublimacyjnego, aż złącze w kształcie litery U sublimatora znajdzie się znacznie powyżej metalowego O-ringu. Ta dodatkowa przestrzeń pozwala na regulację aparatu na piasku. Szybko delikatnie dociśnij sublimator do powierzchni piasku, aby upewnić się, że urządzenie jest równomiernie osadzone na piasku.

A następnie natychmiast uruchom minutnik. Gdy zabrzmi timer, wyłącz pompę próżniową i ostrożnie opuść podnośnik nożycowy, aż sublimator przestanie dotykać kąpieli piaskowej i będzie bezpiecznie osadzony w metalowym pierścieniu uszczelniającym o przekroju okrągłym. Powoli poluzuj zawór mikroodpowietrzający, aby uwolnić ciśnienie w aparacie.

Poluzuj metalowy zacisk wokół gumowej rurki aparatu sublimacyjnego i powoli zacznij odkręcać rurkę. Po lekkim poluzowaniu gumowej rurki zegnij rurkę na bok, aby umożliwić ucieczkę ciśnienia resztkowego. Gdy ciśnienie otoczenia powróci, ostrożnie wyjmij gumową rurkę z aparatu sublimacyjnego.

Następnie poluzuj imadła na przegubie U aparatu i usuń je. Ostrożnie oddziel dwie połówki aparatu sublimacyjnego i zdejmij szkiełko z górnej części wewnętrznego szkła. Przyjrzyj się slajdowi, aby potwierdzić równomierny rozkład macierzy.

Jeśli rozkład i ilość sublimowanej matrycy jest wystarczająca, przyklej nowy szkiełko z tkanką do wnętrza sublimatora i powtórz proces sublimacji. Przystąp do wykonywania obrazowania i analizy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Widmo masowe pokazuje obfitość jonową anolitów w zakresie mas od 1000 do 2000.

Główne gangliozydy serii A są oznaczone wzdłuż spektrum. Pokazany jest tutaj odpowiedni obraz molekularny gangliozydów w mózgu szczura. Obraz molekularny pokazuje anatomiczny rozkład kilku gatunków gangliozydów poprzez kodowanie kolorami, które zostały nałożone i pseudopokolorowane za pomocą oprogramowania ImageJ.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ w procesie przygotowania próbki istnieje wiele zmiennych, które mogą wpływać na jakość wyników IMS, które często są pomijane w raportowanych protokołach. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o monitorowaniu ilości matrycy poddawanej sublimacji po każdym eksperymencie i odpowiednim zmodyfikowaniu czasu sublimacji dla preparatu. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania roli lipidów błonowych, takich jak gangliozydy, po uszkodzeniu mózgu, chorobie ner-jone i naturalnym procesie starzenia.

Ta metoda może zapewnić wgląd w obfitość i anatomiczny rozkład lipidów w mózgu, może być również zastosowana do innych układów, w tym tkanek poza mózgiem, a nawet modeli roślinnych i owadzich. Praca z uszkodzonymi korzeniami może być bardzo niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawiczki, maski i ochrona oczu.