Name: Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj metodę SPLASH do mapowania interakcji RNA-RNA in vivo na skalę genomową. Technika ta umożliwia badanie dynamiki RNA w drożdżach, bakteriach i komórkach ludzkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Wan i laboratorium Nagarajan za pouczające dyskusje. Projekt N.Nagarajan jest finansowany przez A*STAR. Y.Wan jest wspierany przez fundusze A*STAR i Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

<ol><li>Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+transcriptome+through+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Understanding the transcriptome through RNA structure.</a> Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Measurement+of+RNA+Folding+Energies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies.</a> Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).</li>
<li>Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+RNA+structure+using+nuclease+digestion+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing.</a> Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA-RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+interactions+enable+specific+targeting+of+noncoding+RNAs+to+nascent+Pre-mRNAs+and+chromatin+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.</a> Cell. 159 (1), 188-199 (2014).</li>
<li>Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+determination+of+RNA+structure+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation.</a> Nat.Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Duplex+Map+in+Living+Cells+Reveals+Higher-Order+Transcriptome+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure.</a> Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).</li>
<li>Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Human+RNA-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions.</a> Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).</li>
<li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Mapping+of+Eukaryotic+RNA+Interactomes+Reveals+Principles+of+Higher-Order+Organization+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation.</a> Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu szczegółowo opisujemy eksperymentalny i obliczeniowy przepływ pracy dla SPLASH, metody, która pozwala nam identyfikować interakcje RNA parami w sposób obejmujący cały genom. Z powodzeniem wykorzystaliśmy SPLASH w hodowlach bakterii, drożdży i ludzi i przewidujemy, że strategia ta może być szeroko stosowana do różnych organizmów w różnych stanach komórkowych. Jednym z krytycznych kroków w protokole jest rozpoczęcie od co najmniej 20 μg usieciowanego RNA, aby uzyskać odpowiedni materiał do dalszych procesów. ...

Badanie, jak makromolekuły się fałdują i oddziałują ze sobą, jest kluczem do zrozumienia regulacji genów w komórce. Podczas gdy w ciągu ostatniej dekady wiele wysiłku skupiono na zrozumieniu, w jaki sposób DNA i białka przyczyniają się do regulacji genów, stosunkowo mniej wiadomo na temat potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów. RNA przenosi informacje zarówno w swojej sekwencji liniowej, jak i w swojej drugorzędowej i trzeciorzędowej strukturze1. Jego zdolność do łączenia się w pary z samym sobą i innymi jest ważna dla jego funkcji in vivo. Ostatnie postępy w wysokoprzepustowym badaniu struktury drugorzędowej RNA dostarczyły cennych informacji na temat lokalizacji dwu- i jednoniciowych regionów w transkryptomie2,3,4,5,6,7,8, jednak nadal w dużej mierze brakuje informacji na temat partnerów do interakcji w parowaniu. Aby określić, która sekwencja RNA oddziałuje z innym regionem RNA w transkryptomie, potrzebujemy globalnych informacji dotyczących par.
Mapowanie par oddziaływań RNA w globalny, bezstronny sposób tradycyjnie było dużym wyzwaniem. Podczas gdy poprzednie podejścia, takie jak CLASH9, hiCLIP10 i RAP11, są używane do identyfikacji interakcji RNA w sposób wielkoskalowy, techniki te zazwyczaj mapują parowanie zasad RNA dla podzbioru RNA, które oddziałują z określonym białkiem lub gatunkiem RNA. Ostatnie osiągnięcia w badaniu globalnych oddziaływań RNA obejmują metodę RPL12, która nie stabilizuje oddziaływań RNA in vivo, a zatem może uchwycić tylko podzbiór oddziaływań in vivo. Aby przezwyciężyć te wyzwania, wraz z innymi opracowaliśmy obejmujące cały genom, bezstronne strategie mapowania interakcji RNA in vivo, przy użyciu zmodyfikowanych wersji środka sieciującego psoralen13,14,15. W tym protokole opisujemy szczegóły przeprowadzania sekwencjonowania Susieciowanych krzyżowo, Ligowanych i wybranych przez SH ybridów (SPLASH), które wykorzystuje biotynylowany psoralen do sieciowania RNA parowania zasad in vivo, a następnie ligacji zbliżeniowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji partnerów parowania zasad RNA w całym genomie (Figura 1)15.
W tym manuskrypcie opisujemy kroki, które należy wykonać, aby wykonać SPLASH przy użyciu hodowanych komórek przylegających, w tym przypadku komórek HeLa. Ten sam protokół można łatwo dostosować do zawiesinowych komórek ssaków oraz do komórek drożdży i bakterii. Krótko mówiąc, komórki HeLa są traktowane biotynylowanym psoralenem i napromieniane przy 365 nm w celu sieciowania oddziałujących par zasad RNA in vivo. RNA są następnie ekstrahowane z komórek, fragmentowane i wzbogacane w celu sieciowania regionów za pomocą kulek streptawidyny. Oddziałujące fragmenty RNA są następnie ligowane razem za pomocą ligacji zbliżeniowej i przekształcane w bibliotekę cDNA w celu głębokiego sekwencjonowania. Po sekwencjonowaniu chimeryczne RNA są mapowane na transkryptom/genom w celu zidentyfikowania regionów oddziałujących z RNA, które są ze sobą sparowane. Z powodzeniem wykorzystaliśmy SPLASH do identyfikacji tysięcy interakcji RNA in vivo w drożdżach i różnych komórkach ludzkich, w tym parowania zasad wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych RNA w różnych klasach RNA, takich jak snoRNA, lncRNA i mRNA, aby przyjrzeć się organizacji strukturalnej i wzorcom interakcji RNA w komórce.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus Drabina DNA</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10787026</td><td>Drabinka</td></tr><tr><td>DNA 10 pz Drabinka DNA</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10821-015</td><td>Drabinka DNA</td></tr><tr><td>20% roztwór SDS</td><td>Pierwsza</td><td>BAZA BUF-2052-1L&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>First BASE</td><td>BUF-3050-20X1L</td><td></td></tr><tr><td>3,0 M roztwór octanu sodu</td><td>Pierwsza baza</td><td>BUF-1151-1L-pH 5.2&nbsp; &nbsp;</td><td>Wymagane do wytrącania kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>40% roztwór akrylamidu/bis, 19:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610145</td><td>TBE Składnik żelu mocznikowego</td></tr><tr><td>Zestaw buforowy</td><td>Ambion Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu, klasa molekularna&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega</td><td>V3131&nbsp;</td><td>Składnik żelu mocznikowego TBE</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Chloroform Ekstrakcja RNA</td><td>Merck</td><td>1.02445.1000</td></tr><tr><td>Ligaza DNA jednoniciowa</td><td>Epicentrum</td><td>CL9025K</td><td>CircLigase II ssDNA Ligaza</td></tr><tr><td>Filtry probówkowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8160-96EA</td><td>Costar Spin-X Filtry probówkowe wirówki</td></tr><tr><td>D5628-1G DIGITONINA KRYSTALICZNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628-1G</td><td>Do leczenia komórek</td></tr><tr><td>Nadajnik ciemnego czytnika&nbsp;</td><td>Clare Chemical Research</td><td>Dark Reader Nadajnik DR89X Nadajnik</td> światła <td>niebieskiego</td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel DNA (6x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>R0611</td><td>Wymagany do elektroporacji żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Pan BioTech</td><td>P04-03500</td><td>Do hodowli komórek Hela</td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne Streptawidyny</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>65002</td><td>Dynabeads MyOne Streptawidyna C1&nbsp;</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny na 15&nbsp; Probówki mL</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12301D</td><td>DynaMag-15</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny na 15&nbsp; probówki mL</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.015</td><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp; C</td></tr><tr><td>Biotynylowany psoralen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>29986</td><td>EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotyna</td></tr><tr><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>Żarówka UV 365 nm</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10270106&nbsp; &nbsp;</td><td>Składniki pożywki Hela</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Promega</td><td>H5052&nbsp; &nbsp;</td><td>Składnik w buforze hybrydyzacyjnym</td></tr><tr><td>G8T5</td><td>Sankyo-Denki</td><td>G8T5</td><td>Żarówka UV 254 nm</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10814010</td><td>Wymagana do wytrącania kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td> Spektrofotometr <td>Nanodrop 2000</td><td>do kwantyfikacji kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz&nbsp;</td><td>Pierwsza BAZA</td><td>BUF-1180-500ml&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15140122&nbsp; &nbsp;</td><td>Składniki pożywki Hela</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności (2x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>F531L&nbsp;</td><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF (2x)</td></tr><tr><td>Zestaw podkładów 1</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335L&nbsp;</td><td>Startery PCR</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu DNA</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td></tr><tr><td>Zestaw do kwantyfikacji fluorometrycznej</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Q32854</td><td>Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HS</td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia RNA</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNeasy Mini Kit Kolumna z membraną krzemionkową</td></tr><tr><td>Inhibitor rnazy</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM2696</td><td>SUPERase In</td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>18080400</td><td>SuperScript III Synteza pierwszej nici SuperMix</td></tr><tr><td>Żel kwasu nukleinowego Stain</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>S11494</td><td>SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL</td></tr><tr><td>T4 Kinaza polinukleotydowa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>Enzym naprawy końca</td></tr><tr><td>Ligaza RNA T4</td> 1 <td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>Enzym do ligacja zbliżeniowa</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligaza 2, skrócona KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373L</td><td>Enzym do ligacji adaptorowej</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>TBE Składnik żelu mocznikowego</td></tr><tr><td>Guanidinium tiocyjanian-fenol-chloroform</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15596018</td><td>TRIzol&reg; Odczynnik do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>First BASE</td><td>BIO-2070-5kg&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sieciownik UV</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Stratalinker 1800</td></tr><tr><td>Oświetlacz UVP</td><td></td><td>95-0417-01</td><td>Do wizualizacji pasm</td></tr><tr><td>Ksylen Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczanie DNA Zymo</td><td>Research&nbsp;</td><td>D4004</td><td>Koncentrator DNA Zymo-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Lista wymaganego oprogramowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FastQC</td><td>0.11.4</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td></tr> <tr><td>Oprogramowanie SeqPrep</td><td>1.0.7</td><td>https://github.com/jstjohn/SeqPrep</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie BWA</td><td>0.7.12</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>Oprogramowanie SAMTOOLS</td><td>1.2.1</td><td>Oprogramowanie http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>PULLSEQ</td><td>1.0.2</td><td>https://github.com/bcthomas/pullseq</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie STAR</td><td>2.5.0c</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td></td></tr><tr><td>rem_dups.py skrypt PYTHON</td><td>PYTHON PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>find_chimeras.py Skrypt PYTHON</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td></td><td></td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</tr><tr><td>pickJunctionReads.awk Skrypt AWK</td><td>AWK GNU 4.1.2</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>Skład bufora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 M octan</td><td></td><td></td><td></td> sodu</tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zawsze dodawaj Superase-in świeżo przed użyciem, z wyjątkiem prania kulek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Buffer&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>750 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15% formamid (przechowywać w ciemności w temperaturze 4 & C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zawsze dodawaj Superase-in świeżo przed użyciem</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td> 2x bufor do płukania SSC</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>2x NaCl i cytrynian sodu (SSC) (rozcieńczony z 20x zapasu SSC Invitrogen)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0,5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>2x bufor do fragmentacji RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM Tris-Cl pH 8,3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x ładowanie RNA Barwnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% Formamid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,02% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,02% błękit</td><td></td> bromofenolowy<td></td><td></td></tr><tr><td>0,01% Xylene Cyanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">3' sekwencja adaptera RNA: 
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC</td></tr><tr><td colspan="4">Sekwencja starterów RT: 
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG</td></tr></tbody></table>

mapowanie interakcji rna-rna na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Wiedza o tym, jak RNA oddziałują ze sobą i z innymi, jest kluczem do zrozumienia regulacji genów w komórce opartej na RNA. Chociaż wykazano, że przykłady interakcji RNA-RNA, takich jak interakcje mikroRNA-mRNA, regulują ekspresję genów, pełny zakres, w jakim interakcje RNA zachodzą w komórce, jest nadal nieznany. Poprzednie metody badania interakcji RNA koncentrowały się przede wszystkim na podzbiorach RNA, które oddziałują z określonym gatunkiem białka lub RNA. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodę zwaną sekwencjonowaniem Susieciowanych, Ligowanych i wybranych przez S Hybridów (SPLASH), która umożliwia uchwycenie interakcji RNA w całym genomie in vivo w bezstronny sposób. SPLASH wykorzystuje sieciowanie in vivo, ligację zbliżeniową i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych partnerów parowania zasad RNA na całym świecie. SPLASH może być stosowany do różnych organizmów, w tym bakterii, drożdży i komórek ludzkich, a także do różnych warunków komórkowych, aby ułatwić zrozumienie dynamiki organizacji RNA w różnych kontekstach komórkowych. Ukończenie całego eksperymentalnego protokołu SPLASH zajmuje około 5 dni, a obliczeniowy przepływ pracy trwa około 7 dni.

Rysunek 1 przedstawia schemat przebiegu procedury SPLASH. Po dodaniu biotynilowanego psoralenu w obecności 0,01% digitoniny i sieciowaniu promieniami UV, z komórek izoluje się całkowite RNA, a następnie wykonuje analizę dot blot, aby upewnić się, że sieciowanie biotynilowanego psoralenu z RNA przebiegło efektywnie (Rysunek 2). Jako kontrole dodatnie wykorzystujemy biotynilowane oligonukleotydy o długości 20 zasad, aby miareczkowa...

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę sekwencjonowania Susieciowanych, Ligowanych i Swybranych Hybridów (SPLASH), która umożliwia mapowanie całego genomu wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych interakcji RNA-RNA in vivo. SPLASH może być stosowany do badania interakcji RNA w organizmach, w tym drożdżach, bakteriach i ludziach.

Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Ogólnym celem tego filmu jest opisanie metody sekwencjonowania hybryd ligowanych i selekcjonowanych, sieciowanych psoralenem (ang. sequencing of psoralen crosslinked ligated and selected hybrids, SPLASH), w której oddziaływania RNA-RNA w parach in vivo są mapowane w skali całego genomu. Technika ta jest prostą, wysokoprzepustową metodą mapowania oddziaływań RNA in vivo. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny genomiki RNA, takie jak sposób, w jaki różne regiony wzdłuż pojedynczej nici RNA lub między różnymi nićmi RNA oddziałują ze sobą.Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat komórek drożdżowych i ludzkich, można ją również zastosować w badaniach nad innymi współczesnymi organizmami, w tym bakteriami oraz błonami komórkowymi. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy opracować sposób mapowania oddziaływań molekularnych. Należy pamiętać, że poniższa procedura zawiera kilka punktów przerwania procesu.W tych momentach eksperyment można przerwać na krótko lub na czas nieokreślony. Szczegóły znajdują się w tekście towarzyszącym. Rozpocznij procedurę od dwukrotnego przemycia komórek HeLa pięcioma mililitrami PBS.Ustaw naczynie pionowo na jedną minutę, aby całkowicie odprowadzić nadmiar PBS. Następnie dodaj jeden mililitr PBS zawierającego 200 µM biotynilowanego psoralenu oraz 0,01% digitoniny, która zwiększa przepuszczalność komórek. Należy zadbać o równomierne rozprowadzenie roztworu na powierzchni komórek.Inkubować w temperaturze 37°C przez pięć minut. Po inkubacji zdjąć pokrywkę naczynia i umieścić je na lodzie wewnątrz urządzenia do sieciowania UV w odległości trzech centymetrów od żarówki UV. Naświetlać promieniowaniem UV o długości fali 365 nm przez 20 minut.Po 20 minutach wyjmij szalkę z urządzenia do sieciowania (Crosslinker), a następnie wyizoluj fragment i wytrąć RNA z komórek HeLa zgodnie z instrukcjami zawartymi w załączonym dokumencie. Naniesienie denaturowanego markera wielkości oraz próbek RNA na kwadratowy żel 6% TBE-mocznik o boku 8,6 centymetra. Przeprowadź frakcjonowanie według wielkości za pomocą elektroforezy przy napięciu 180 voltów przez 40 minut.Barwić żel w 10 ml buforu TBE zawierającego rozcieńczenie barwnika do żeli kwasów nukleinowych w stosunku 1:10 000 przez pięć minut w ciemności. Podczas barwienia żelu, użyć igły o rozmiarze 24 G, aby przebić dno czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 0,6 ml. Umieścić ją w probówce do mikrowirówki o pojemności dwóch ml.Przy użyciu transiluminatora należy zlokalizować prążki na zabarwionym żelu i wyciąć fragment żelu odpowiadający 90–110 nukleotydom. Wycięty fragment należy przenieść do nakłutej probówki mikrocentryfugacyjnej o pojemności 0,6 ml umieszczonej w probówce mikrocentryfugacyjnej o pojemności 2 ml. Selekcja według wielkości pozwala na ustalenie minimalnej długości fragmentów chimerycznych oraz późniejsze odróżnienie produktów ligacji od produktów nieligowanych.Wiruj wycinki żelu przy 12 000 ×g w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, aby rozdrobić wycinek żelu i zebrać go w probówce mikroodwirowej o pojemności 2 ml. Po wirowaniu usuń pustą probówkę mikroodwirową o pojemności 0,6 ml. Do rozdrobnionego wycinka żelu dodaj 700 µL buforu eluującego.Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc przy stałym obrocie, aby umożliwić dyfuzję próbek do buforu. Przenieść plastry żelu oraz bufor elucyjny do probówki z filtrem do wirówki i wirować przy 20 000 ×g przez 20 minut. Po wirowaniu plastry żelu zostaną zatrzymane w górnej komorze filtra, którą można usunąć.Wytrącić i określić ilość RNA zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie. RNA należy szybko zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C w ciekłym azocie do momentu użycia. Aby wzbogacić regiony sieciowania RNA, należy rozpocząć od dodania 100 µL buforu do lizy zawierającego inhibitor RNazy do probówki do mikrowirówki w celu przemycia magnetycznych kulek pokrytych streptawidyną.Do 15-mililitrowej stożkowej probówki do wirówek dodać 2 ml świeżo przygotowanego buforu do hybrydyzacji, 1 ml uzupełnionego buforu do lizy, 1,5 µg RNA poddanego frakcjonowaniu wielkościowemu oraz 100 µl resuspendowanych kulek. Delikatnie wymieszać zawartość probówki za pomocą wortexa. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy rotacji koniec-do-końca.Po inkubacji przemyj kuleczki pięciokrotnie podgrzanym buforem do płukania. Po piątym płukaniu umieść probówkę do mikrocentryfugi z kuleczkami na statywie magnetycznym na jedną minutę, a następnie usuń bufor do płukania. Do przemytych kuleczek dodaj 1 mL zimnego buforu do polinukleotydowej kinazy T4.Inkubować kuleczki przez pięć minut w temperaturze four degrees Celsius przy rotacji end-to-end. Umieścić probówkę do wirówki zawierającą kuleczki na pasku magnetycznym. Po jednej minucie delikatnie usunąć bufor.Powtórz ten krok, aby przeprowadzić łącznie dwa płukania, a po ostatnim płukaniu usuń bufor. Następnie, zgodnie z instrukcjami w załączonym dokumencie, przekształć końce 5' i 3', aby były kompatybilne z ligacją, i przeprowadź ligację bliskościową. Po płukaniu dodaj 100 µL buforu RNA PK do kulek i resuspenduj je, pipetując w górę i w dół.Podgrzewaj próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut na bloku grzewczym. Następnie schłodź próbkę na lodzie przez jedną minutę. Do próbki dodaj 500 µL tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu.Mieszaj intensywnie za pomocą wortexa przez 10 sekund. Inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji użyj zestawu do precypitacji, oczyszczania i odzyskiwania RNA, upewniając się, że zachowane zostaną nawet małe RNA.Eluuj RNA w 100 µL wody wolnej od nukleaz. Przenieś 100 µL elowanych próbek do dołka płytki 24-dołkowej i umieść ją na lodzie. Utrzymując próbkę w niskiej temperaturze, poddaj ją naświetlaniu UV przy długości fali 254 nm przez pięć minut.Przenieś próbkę po odwróceniu sieciowania do czystej probówki do wirówki. Dodaj 10 µL octanu sodu, 1 µL glikogenu oraz 300 µL 100% etanolu. Wytrąć RNA w temperaturze -20 °C przez co najmniej jedną godzinę.Aby odzyskać RNA, odwirować osadzone RNA przy 20 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu usunąć naddatek i dodać 1 ml 70% zimnego etanolu, aby przemyć granulat RNA. Odwirować przemyty granulat przy 20 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.Usunąć bufor do płukania i dodać 4,25 µl wody wolnej od nukleaz, aby resuspenderować RNA. Przenieść RNA do probówki PCR o pojemności 0,2 ml. Na koniec przeprowadzić odwrotną transkrypcję, cyrkularyzację i amplifikację cDNA zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie.Ten schemat przedstawia przebieg procedury SPLASH. Po dodaniu biotynilowanego psoralenu w obecności 0,01% digitoniny i przeprowadzeniu sieciowania promieniami UV, z komórek ekstrahuje się całkowite RNA i wykonuje dot blot, aby upewnić się, że sieciowanie przebiegło efektywnie. Następnie wykorzystuje się biotynilowane oligonukleotydy o długości 20 zasad jako kontrole pozytywne do miareczkowania ilości biotynilowanego psoralenu dodawanego do komórek w taki sposób, aby sieciowana była w przybliżeniu jedna z każdych 150 zasad.Następnie przeprowadza się małkoskalową amplifikację PCR, stosując zwiększoną liczbę cykli PCR, aby określić minimalną liczbę cykli wymaganą do głębokiego sekwencjonowania. W wydajnym procesie przygotowania biblioteki, bibliotekę sekwencjonowania cDNA można amplifikować z 1.5 µg wejściowego RNA o wyselekcjonowanej wielkości w mniej niż 15 cyklach amplifikacji PCR. Następnie bibliotekę sekwencjonuje się, wykonując dwa odczyty po 150 bp na wysokoprzepustowej maszynie do sekwencjonowania.Odczyty z sekwencjonowania są następnie przetwarzane zgodnie z potokiem obliczeniowym. Wynikiem końcowym jest lista przefiltrowanych interakcji chimerycznych, obejmująca zarówno wewnątrz- jak i międzycząsteczkowe interakcje RNA-RNA w transkryptomie. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o sprawdzeniu wbudowania biotynylowanego psoralenu przy stosowaniu metody SPLASH u nowych organizmów.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii RNA do eksploracji oddziaływań RNA w różnych organizmach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować bibliotekę do sekwencjonowania, która pozwala na globalne wychwytywanie par oddziaływań RNA w komórce.

mapping-rna-rna-interactions-globally-using-biotinylated-psoralen

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Przedstawiono szczegółowy protokół stosowania strategii CARIC (ang. click chemistry-assisted RNA-interactome capture) do identyfikacji białek wiążących się zarówno z kodującymi, jak i niekodującymi RNA.

Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC)

Kompleksy RNA/białkowe oczyszczone przy użyciu strategii botyna-streptawidyna są eluowane do roztworu w warunkach denaturacji w formie nieodpowiedniej do dalszego oczyszczania i analizy funkcjonalnej. Tutaj opisujemy modyfikację tej strategii, która wykorzystuje fotorozszczepialny łącznik w RNA i delikatny etap elucji UV, dając natywne i w pełni funkcjonalne kompleksy RNA / białko.

Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

Tutaj opisujemy składanie kompleksów elongacyjnych polimerazy II (Pol II) wymagających jedynie krótkich syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA oraz oczyszczonego Pol II. Kompleksy te są przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego przetwarzania transkryptów związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Poznaj metodę SPLASH do mapowania interakcji RNA-RNA in vivo na skalę genomową. Technika ta umożliwia badanie dynamiki RNA w drożdżach, bakteriach i komórkach ludzkich.

Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

Przeglądaj więcej filmów