Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

Ogólnym celem tego filmu jest opisanie metody sekwencjonowania usieciowanych psoralenu, ligowanych i wybranych hybryd lub SPLASH, w których interakcje RNA-RNA in vivo są mapowane parami w sposób obejmujący cały genom. Technika ta jest prostą, wysokoprzepustową metodą mapowania oddziaływań RNA in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki RNA, takie jak to, w jaki sposób różne regiony wzdłuż pojedynczej nici RNA lub między różnymi niciami RNA oddziałują ze sobą.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji o drożdżach i komórkach ludzkich, może być również stosowana do badań na innych współczesnych organizmach, w tym na bakteriach i błonach komórkowych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy chcieliśmy wymyślić sposób na mapowanie interakcji molekularnej. Należy zauważyć, że poniższa procedura obejmuje kilka punktów zatrzymania.

W takich momentach eksperyment można wstrzymać na krótko lub na czas nieokreślony. Szczegóły znajdują się w tekście dołączonym. Rozpocznij tę procedurę od dwukrotnego przemycia komórek HeLa pięcioma mililitrami PBS.

Umieść naczynie pionowo na jedną minutę, aby całkowicie odsączyć nadmiar PBS. Następnie dodaj jeden mililitr PBS zawierającego 200 mikromolowych biotynylowanych psoralenów i 0,01% digitoniny, która zwiększa przepuszczalność komórek. Uważaj, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na powierzchni komórek.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji zdejmij pokrywkę naczynia i umieść ją na lodzie w środku środka sieciującego UV w odległości trzech centymetrów od żarówki UV. Naświetlać promieniowaniem UV o długości 365 nanometrów przez 20 minut.

Po 20 minutach wyjmij szalkę z urządzenia do sieciowania, a następnie wyizoluj fragment i wytrącić RNA z komórek HeLa zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie. Załaduj zdenaturowaną drabinę i próbki RNA na 8,6 centymetra kwadratowego 6% żelu mocznikowego TBE. Frakcjonowanie wielkości przez elektroforezę przy 180 woltach przez 40 minut.

Zabarwić żel w 10 mililitrach buforu TBE zawierającego rozcieńczenie 1:10 000 barwnika żelu kwasu nukleinowego przez pięć minut w ciemności. Podczas gdy żel plami, użyj igły o rozmiarze 24, aby przebić czystą rurkę do mikrofugi o pojemności 0,6 mililitra na dole. Umieść go w dwumililitrowej tubie do mikrofuge.

Za pomocą transiluminatora zwizualizuj pasma na wybarwionym żelu i wytnij plasterek żelu odpowiadający 90 do 110 nukleotydom. Przenieś plasterek żelu do przebitej 0,6 mililitrowej probówki do mikrofugi w dwumililitrowej probówce do mikrofugi. Dobór rozmiaru pozwala nam ustalić minimalną długość fragmentów chimerycznych i później odróżnić produkty podwiązane od niepodwiązanych.

Odwiruj plastry żelu 12 000 razy g w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, aby rozdrobnić plasterek żelu i zebrać go w dwumililitrowej probówce do mikrofugi. Po wirowaniu wyrzuć pustą probówkę o pojemności 0,6 mililitra. Do rozdrobnionego plastra żelu dodaj 700 mikrolitrów buforu elucyjnego.

Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc ze stałą rotacją, aby umożliwić dyfuzję próbek do buforu. Przenieść plastry żelu i bufor elucyjny do filtra w probówce wirówkowej i odwirować pod ciśnieniem 20 000 g przez 20 minut. Po wirowaniu plastry żelu zostaną uwięzione w górnej komorze filtra, które można wyrzucić.

Wytrącić i określić ilościowo RNA zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym. Błyskawiczne zamrożenie i przechowywanie RNA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w ciekłym azocie do momentu jego użycia. Aby wzbogacić regiony sieciowania RNA, zacznij od dodania 100 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego inhibitor RNazy, aby przemyć kulki magnetyczne pokryte streptawidyną w probówce do mikrofuge.

Do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów dodaj dwa mililitry świeżo przygotowanego buforu hybrydyzacyjnego, jeden mililitr uzupełnionego buforu do lizy, 1,5 mikrograma frakcjonowanego RNA i 100 mikrolitrów zawieszonych kulek. Delikatnie przekręć rurkę. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut z rotacją od końca do końca.

Po inkubacji umyj kulki pięciokrotnie wstępnie podgrzanym buforem do mycia. Pod koniec piątego prania umieść probówkę z mikrofugami zawierającą kulki na stojaku magnetycznym na jedną minutę, a następnie wyjmij bufor do mycia. Dodaj jeden mililitr zimnego buforu kinazy polinukleotydowej T4 do umytych kulek.

Inkubuj koraliki przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z obrotem od końca do końca. Umieść rurkę do mikrofuge zawierającą koraliki na pasku magnetycznym. Po minucie delikatnie wyjmij bufor.

Powtórz ten krok, w sumie dwa prania i usuń bufor po ostatnim praniu. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie, aby przekonwertować pięć głównych i trzy główne końce tak, aby były kompatybilne z podwiązaniem i wykonać podwiązanie zbliżeniowe. Po umyciu dodaj 100 mikrolitrów buforu PK RNA do kulek i ponownie je zawieś, pipetując w górę iw dół.

Podgrzewać próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut na bloku grzewczym. Następnie schładzaj próbkę na lodzie przez jedną minutę. Dodać do próbki 500 mikrolitrów tiocyjanianu guanidyny-fenolu-chloroformu.

Mieszaj, energicznie wirując przez 10 sekund. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji użyj zestawu do wytrącenia, oczyszczenia i odzyskania RNA, upewnij się, że nawet małe RNA zostały zachowane.

Eluuj RNA w 100 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Przenieś 100 mikrolitrów wymytych próbek do dołka na 24-dołkowej płytce na ładnej. Utrzymując próbkę na lodzie, promieniowanie UV naświetla ją promieniowaniem o długości 254 nanometrów przez pięć minut.

Przenieś usieciowaną próbkę do czystej probówki do mikrofuge. Dodaj 10 mikrolitrów octanu sodu, jeden mikrolitr glikogenu i 300 mikrolitrów 100% etanolu. Wytrącić RNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.

Aby odzyskać RNA, odwiruj wytrącony RNA w temperaturze 20 000 razy g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu usuń supernatant i dodaj jeden mililitr 70% zimnego etanolu, aby przepłukać osad RNA. Odwirować przemyty osad 20 000 razy g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń bufor płuczący i dodaj 4,25 mikrolitra wody wolnej od nukleaz w celu ponownego zawieszenia RNA. Przenieś RNA do 0,2 mililitrowej probówki do PCR. Na koniec dokonaj odwrotnej transkrypcji, krążenia i amplifikacji cDNA zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie.

Ten schemat przedstawia przebieg pracy SPLASH. Po dodaniu biotynylowanego psoralenu w obecności 0,01% digitoniny i sieciowaniu UV, z komórek ekstrahuje się całkowite RNA i przeprowadza się plamę punktową, aby upewnić się, że sieciowanie było skuteczne. Biotynylowane 20 oligonukleotydów zasad są następnie wykorzystywane jako kontrole pozytywne w celu miareczkowania ilości biotynylowanego psoralenu, który ma być dodany do komórek, tak że około jedna na 150 zasad jest usieciowana.

Amplifikacja PCR na małą skalę jest następnie wykonywana przy użyciu rosnącej liczby cykli PCR w celu określenia minimalnej liczby cykli wymaganych do głębokiego sekwencjonowania. W wydajnym procesie przygotowania biblioteki, biblioteka sekwencjonowania cDNA może być amplifikowana z 1,5 mikrograma wybranego wejścia RNA w mniej niż 15 cyklach amplifikacji PCR. Biblioteka jest następnie sekwencjonowana przy użyciu dwóch odczytów par zasad 150 na maszynie do sekwencjonowania na wysokim poziomie przez cały czas.

Odczyty sekwencjonowania są następnie przetwarzane zgodnie z potokiem obliczeniowym. Efektem końcowym jest lista przefiltrowanych oddziaływań chimerycznych, która obejmuje zarówno wewnątrzcząsteczkowe, jak i międzycząsteczkowe interakcje RNA-RNA w transkryptomie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o sprawdzeniu, czy nie ma włączenia biotynylowanego psoralenu podczas stosowania SPLASH na nowych organizmach.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią RNA do badania interakcji RNA w różnych organizmach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć bibliotekę sekwencjonowania, która przechwytuje interakcje RNA parami globalnie w komórce.