Rozmnażanie na małą skalę ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w rutynowej charakterystyce immunocytochemicznej

Ogólnym celem tej metody hodowli jest namnażanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub ludzkich iPSC na małą skalę, aby umożliwić ich rutynową charakterystykę za pomocą immunocytochemii. Ten protokół z mojego laboratorium przedstawia technikę zmniejszania skali w celu przejścia ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z leżącej poniżej warstwy płodu do substratu, który jest bardziej odpowiedni do wykrywania antygenu przy użyciu specyficznych przeciwciał pluripotencji. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona efektywny czasowo i kosztowo sposób hodowli komórek pluripotencjalnych w małych szkiełkach komorowych lub na szkiełkach nakrywkowych, które są idealne do immunocytochemii.

W dniu pasażowania należy zdjąć płytkę pokrytą matrycą z czterech stopni Celsjusza i pozostawić płytkę do zaaklimatyzowania się do temperatury pokojowej przez jedną godzinę w kapturze do hodowli tkankowej. Następnie odessać pożywkę z jednej studzienki z sześciodołkowej płytki ludzkiej kultury iPSC rosnącej na iMEF i zastąpić ją 500 mikrolitrami odczynnika dysocjacji kolagenazy. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 30 minut, aż krawędzie kolonii iPSC wydają się lekko unosić, jak obserwowano pod mikroskopem, a następnie ostrożnie odessać odczynnik dysocjacyjny i delikatnie umyć komórki dwa razy PBS.

Ponieważ profil dysocjacji każdej specyficznej linii iPSC może się różnić, ważne jest, aby monitorować odrywanie kolonii pod mikroskopem w celu określenia optymalnego okresu inkubacji wymaganego z odczynnikiem dysocjacyjnym. Dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża mTeSR o temperaturze pokojowej z 10 nanogramami na mililitr inhibitora ROCK do studzienki. Używając małego mikroskopu z kontrastem fazowym umieszczonego częściowo wewnątrz kaptura, ręcznie oceń i wybierz jedną lub dwie ludzkie kolonie iPSC.

Wypchnij nacięte kawałki kolonii do pożywki za pomocą końcówki pipety P200. Następnie odessać matrycę z nowych studzienek, które mają być platerowane, uważając, aby nie naruszyć powłoki. Przenieść jeden mililitr zawiesiny komórkowej ze starej studzienki zawierającej nacięte iPSC do nowej studzienki pokrytej matrycą.

Umieść płytkę w inkubatorze i kołysz płytką w kilku szybkich ruchach w przód iw tył oraz na boki, aby równomiernie rozłożyć komórki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po przeniesieniu ludzkich iPSC z iMEF do macierzy zewnątrzkomórkowej, są one przenoszone na 12-dołkową płytkę w sposób podobny do poprzednich etapów pasażowania.

To przejście pozwala na eliminację wszelkich pozostałych iMEF z hodowli i zapewnia, że komórki przystosowują się do warunków wolnych od karmienia. Wepchnij żądaną liczbę kolonii do pożywki za pomocą końcówki P200 i delikatnie miareczkuj zawiesinę komórek dwa razy w jednym rogu studzienki, aby rozbić ludzkie kolonie iPSC na grudki o wielkości około 50 do 200 mikrometrów. W przypadku płytki 12-dołkowej należy odepchnąć od jednej do dwóch kolonii do pożywki, a następnie przenieść zawiesinę komórkową ze starej studzienki do pojedynczej nowej studzienki na płytce 12-dołkowej.

Rozbujaj płytkę kilkoma szybkimi ruchami w przód iw tył oraz na boki, aby równomiernie rozłożyć komórki i pozwól płytce odpocząć przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ta sekcja obejmuje pasażowanie iPSC w 12-dołkowych płytkach i posiewanie ich na małych szkiełkach komorowych i szkiełkach nakrywkowych, idealnych do immunocytochemii. W tej procedurze należy odessać pożywkę z jednej studzienki z 12-dołkowej płytki ludzkich iPSC i zastąpić ją 500 mikrolitrami buforu dysocjacyjnego.

Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez około trzy do siedmiu minut, aż krawędzie kolonii iPSC wydają się nieznacznie unosić. Następnie ostrożnie zassaj bufor dysocjacyjny i dodaj do studzienki jeden mililitr kompletnej pożywki mTeSR o temperaturze pokojowej z 10 nanogramami na mililitr inhibitora ROCK. Za pomocą mikroskopu z małym kontrastem fazowym umieszczonego w kapturze do hodowli tkankowych zepchnij poluzowane kolonie z powierzchni płytki do pożywki, a następnie odessaj matrycę z nowej 24-dołkowej płytki z szkiełkami nakrywkowymi i szkiełkiem komorowym, uważając, aby nie naruszyć powłoki.

Delikatnie miareczkować zawiesinę komórek dwa razy w jednym rogu studzienki, aby rozbić ludzkie kolonie iPSC na grudki o wielkości około 50 do 200 mikrometrów. Przenieść 250 mikrolitrów zawiesiny komórkowej ze starej studzienki do każdej nowej studzienki szkiełka czterodołkowego. Podczas powlekania na szkiełkach przykrywkowych odepchnąć jedną kolonię z pierwotnego dołka, miareczkować i przenieść na nie zawiesinę komórek w nowych dołkach płytki 24-dołkowej.

Następnie zwiększ objętość każdej nowej studzienki do 500 mikrolitrów za pomocą mTeSR1 zawierającego 10 nanogramów na mililitr inhibitora Y27632 ROCK. Następnie umieść szkiełko komorowe i szkiełka nakrywkowe w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy ludzkie iPSC osiągną konfluencję, komórki są przygotowywane do immunocytochemii przy użyciu standardowego utrwalania i blokowania paraformaldehydu przed inkubacją z przeciwciałem pierwotnym.

Teraz przygotuj z góry określone stężenie przeciwciała powierzchniowego, SSEA4 lub TRA-1-60, rozcieńczając je w roztworze blokującym bez Triton X-100. W przypadku szkiełek komorowych przygotuj wystarczającą ilość roztworu przeciwciała, mieszając 298,5 mikrolitrów roztworu blokującego i 1,5 mikrolitra przeciwciała pierwszorzędowego anty-SSEA4 lub TRA-160, tak aby każda studzienka otrzymała 300 mikrolitrów roztworu przeciwciała. Odessać roztwór blokujący ze szkiełka komory i dozować przeciwciało pierwotne do odpowiednich studzienek.

W przypadku szkiełek nakrywkowych umieść 40 mikrolitrów roztworu przeciwciał na naczyniu wyłożonym Parafilm. Ostrożnie obrócić szkiełko nakrywkowe do dołu na roztwór i inkubować komórki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka wyjmij roztwór przeciwciała z czterech szkiełek studzienkowych i przemyj komórki trzy razy przez pięć do 10 minut za każdym razem za pomocą PBS.

W przypadku szkiełek nakrywkowych umieść je z powrotem w dołkach 24-dołkowej płytki i umyj je PBS, a następnie postępuj w podobny sposób, jak inkubacja przeciwciał pierwotnych do inkubacji przeciwciał wtórnych przed przygotowaniem komórek wybarwionych immunologicznie do mikroskopii fluorescencyjnej. Pokazano tutaj gęstą kolonię iPSC wyhodowaną na komórkach zasilających iMEF. Po wstępnym przejściu na pokrytą matrycą 12-dołkową płytkę w pożywce wolnej od surowicy, w kulturze można jeszcze zaobserwować kilka iMEF.

Obraz ten przedstawia typową morfologię jednowarstwowej kolonii iPSC hodowanej bez karmnika i na tym etapie w hodowli nie ma żadnych iMEF-ów. Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne iPSC uzyskane za pomocą mikroskopu konfokalnego wykazujące dodatnią ekspresję markerów pluripotencji Oct-4 i SSEA4 z barwieniem jądrowym DAPI oraz Sox2 i TRA-1-60 z DAPI. Te dwa są obrazami nakładki.

Po opanowaniu technika ta zapewnia ekonomiczny sposób przenoszenia iPSC z warstw zasilających iMEF na powierzchnie matrycy i przeprowadzania immunocytochemii, oszczędzając czas i drogie odczynniki. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że każda pierwotna linia iPSC zachowuje się inaczej w hodowli i musi być monitorowana podczas procesów pasażowania i powlekania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ekonomicznie hodować i pasować ludzkie iPSC na małą skalę w celu rutynowej charakterystyki immunocytochemicznej.