Name: Rozmnażanie na małą skalę ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w rutynowej charakterystyce immunocytochemicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Naucz się metody rozmnażania ludzkich iPSC na małą skalę w warunkach wolnych od surowicy do rutynowej immunocytochemicznej charakterystyki. Technika ta umożliwia oszczędne i szybkie hodowanie komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Źródła finansowania: Uniwersytet Arizony, Fundacja Jima Himelica i Centrum Biologii Chorób Złożonych w Arizonie.

hiPSC pochodziły z ludzkich fibroblastów skórnych wyizolowanych z biopsji 4 mm i przeprogramowanych wewnętrznie za pośrednictwem wirusa Sendai11. Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Uniwersytetu Arizony zatwierdziła wszystkie procedury rekrutacji uczestników i pobierania biopsji.
1. Przygotowanie powierzchni pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową do hodowli iPSC
<ol>
	<li>Na dzień przed konfluencją kultur hiPSC rosnących na iMEFach należy przygotować płytki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową (Matrigel).</li>
	<li>Powolne rozmrażanie podwielokrotności macierzy zewnątrzkomórkowej (w zależności od partii, postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w karcie specyfikacji) na lodzie w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>W kapturze bezpieczeństwa biologicznego, używając zimnych końcówek pipet (przechowywanych w temperaturze -20 °C), dodać 1 porcję macierzy zewnątrzkomórkowej do zimnej mieszanki Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12/HEPES) zgodnie ze współczynnikiem rozcieńczenia właściwym dla partii.</li>
	<li>Dozować ~ 600 μL macierzy zewnątrzkomórkowej na studzienkę z każdej potrzebnej nowej 12-dołkowej płytki poddanej działaniu hodowli komórkowej.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. W tym przypadku należy zastosować 3 godziny czasu inkubacji. 
	UWAGA: Płytki można zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.</li>
</ol>
2. Przenoszenie hiPSC wyhodowanych na komórkach zasilających iMEF do macierzy zewnątrzkomórkowej w celu rozmnażania
<ol>
	<li>W dniu pasażowania należy zdjąć płytkę pokrytą matrycą z temperatury 4 °C i pozostawić płytkę do aklimatyzacji do temperatury pokojowej przez 1 godzinę w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Odessać pożywkę z 1 dołka z 6-dołkowej płytki kultury hiPSC rosnącej na iMEF i zastąpić 500 μl odczynnikiem dysocjacyjnym kolagenazy (1 mg/ml w podstawowej pożywce hodowlanej).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez ~ 10 - 30 minut, aż krawędzie kolonii iPSC zaczną się nieznacznie unosić. 
	UWAGA: Czas inkubacji jest zależny od linii i będzie się różnił. Monitoruj dysocjację pod mikroskopem.</li>
	<li>Ostrożnie odessać odczynnik dysocjacyjny i delikatnie przemyć 2 razy roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Dodać 1 ml kompletnej pożywki mTeSR1 o temperaturze pokojowej z 10 ng/ml inhibitora kinazy białkowej związanej z Rho (inhibitor Y-27632 ROCK) do dołka. 
	UWAGA: Sugeruje się użycie mieszaniny pożywki kondycjonowanej iMEF i mTeSR1 w proporcji 50:50 podczas tego początkowego pasażu, co może być korzystne dla przetrwania hiPSC podczas tej przemiany w pożywkę.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym umieszczonym częściowo wewnątrz kaptura, ręcznie naciąć i pobrać 1-2 kolonie hiPSC (~ 700 - 1,000 μm średnicy) za pomocą strzykawki i igły (25 G, 11/2 cala). Wypchnij nacięte kawałki kolonii do pożywki za pomocą końcówki pipety P200.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić matrycę z nowej płytki, uważając, aby nie naruszyć powłoki.</li>
	<li>Przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej ze starej studzienki zawierającej nacięte iPSC do nowej studzienki pokrytej matrycą.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Kołysz płytką kilkoma szybkimi ruchami w przód iw tył i na boki, aby równomiernie rozłożyć komórki. Nie naruszaj płyty przez 24 godziny.</li>
	<li>Wykonuj codzienne pełne zmiany pożywki za pomocą kompletnej pożywki mTeSR1 (dodanie inhibitora Y-27632 ROCK nie jest potrzebne po wstępnym posiewie w kroku 2.5).</li>
</ol>
3. Małe przenoszenie hiPSC na płytach pokrytych matrycą
UWAGA: Generalnie, po początkowym przeniesieniu hiPSC na płytki pokryte matrycą, komórki powinny być ponownie przepasywane w podobny sposób, aby upewnić się, że wszystkie iMEF-y zostały wyeliminowane, a komórki przystosowały się do warunków wolnych od zasilania.
<ol>
	<li>Na dzień przed konfluencją iPSC należy przygotować świeżo pokryte płytki matrycowe, jak omówiono w punkcie 1.</li>
	<li>W dniu pasażu wyjąć płytkę pokrytą matrycą z inkubacji w temperaturze 4 °C i pozostawić płytkę do aklimatyzacji do temperatury pokojowej przez 1 godzinę w kapturze do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Odessać pożywkę z 1 dołka z 6-dołkowej płytki hiPSC (pierwotnie przeniesionej z podajnika do matrycy) i zastąpić 500 μl buforem dysocjacji komórek. 
	UWAGA: Zastosowany tutaj komercyjny bufor dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) jest bardziej odpowiedni do stosowania z pożywką mTeSR1 w porównaniu z kolagenazą.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 - 7 minut, aż krawędzie kolonii iPSC wydają się lekko unosić. Jak wspomniano wcześniej, czas inkubacji jest zależny od linii i zmienny. Dlatego monitoruj dysocjację komórkową pod mikroskopem, aby określić optymalny czas.</li>
	<li>Ostrożnie odessać bufor dysocjacyjny i delikatnie przemyć 2 razy PBS.</li>
	<li>Dodać do studzienki 500 μl kompletnej pożywki mTeSR1 o temperaturze pokojowej z 10 ng/ml inhibitora Y-27632 ROCK.</li>
	<li>Zamiast oceniać kolonie, jak w kroku 2.6, wepchnij żądaną liczbę kolonii do pożywki za pomocą końcówki P200 i delikatnie rozetrzyj zawiesinę komórek 2 razy na jednym rogu studzienki, aby rozbić kolonie hiPSC na grudki o wielkości ~ 50 - 200 μm. Na przykład, aby uzyskać 12-dołkową płytkę, wybierz 1-2 kolonie, aby przenieść je do każdej 1 nowej studzienki. Przenieść zawiesinę komórek ze starej studzienki do pojedynczej nowej studzienki z 12-dołkową płytką.</li>
	<li>Kołysz płytką kilkoma szybkimi ruchami w przód iw tył i na boki, aby równomiernie rozłożyć komórki, i pozwól płytce spoczywać przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wykonuj codzienną pełną wymianę podłoża za pomocą kompletnego podłoża mTeSR1. Jak wspomniano wcześniej, nie jest konieczne dodawanie inhibitora Y-27632 ROCK po wstępnym posiewie. 
	UWAGA: Niewykorzystane kolonie iPSC z kroku 3.7 mogą być w tym momencie łatwo poddane kriokonserwacji.</li>
</ol>
4. Przygotowanie preparatów komorowych i nakrywkowych do wysiewu hiPSC do immunocytochemii
UWAGA: Poniższy protokół wykorzystuje 4-dołkowe plastikowe szkiełka nakrywkowe i 12-milimetrowe szklane szkiełka nakrywkowe z odpowiednią ilością pożywki w wielodołkach, aby wspierać opłacalną immunocytochemię. Jednak objętość nośników można zwiększyć, jeśli pożądane jest użycie większych rozmiarów studni i szkiełek nakrywkowych.
<ol>
	<li>Na dzień przed konfluencją hiPSC należy przygotować szkiełka komorowe świeżo pokryte macierzą zewnątrzkomórkową, jak omówiono w punkcie 1. Dodać wystarczającą ilość roztworu matrycowego (~ 300 - 500 μL na studzienkę 4-dołkowego szkiełka podstawowego), aby w pełni pokryć każdą studzienkę bez obawy o parowanie. Alternatywnie, po umieszczeniu 1 oczyszczonego i wysterylizowanego szkiełka nakrywkowego w każdym dołku 24-dołkowej płytki, pokryj 500 μl macierzą zewnątrzkomórkową i upewnij się, że szkiełko nakrywkowe nie unosi się na wierzchu roztworu.</li>
	<li>W dniu przejścia usunąć powlekane szkiełka komorowe/szkiełka nakrywkowe z 4 °C i pozostawić do aklimatyzacji do temperatury pokojowej przez 1 godzinę w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Odessać pożywkę z 1 dołka z 12-dołkowej płytki hiPSC i zastąpić 500 μl buforem dysocjacyjnym</li>.
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez ~ 3 - 7 minut, aż krawędzie kolonii iPSC wydają się lekko unosić.</li>
	<li>Ostrożnie odessać bufor dysocjacyjny i dodać do studzienki 1 ml kompletnej pożywki mTeSR1 o temperaturze pokojowej z 10 ng/ml inhibitora Y-27632 ROCK.</li>
	<li>Używając mikroskopu z małym kontrastem fazowym umieszczonego w kapturze do hodowli tkankowych, ręcznie wybierz 1 kolonię/nowy dołek z 4-dołkowego szkiełka podstawowego lub 1 nowe szkiełko nakrywkowe do posiewu (o średnicy ~ 1 000 - 1 500 μm) za pomocą końcówki pipety P200, popychając ją z powierzchni płytki do pożywki.</li>
	<li>Zassać matrycę z nowego szkiełka nakrywkowego/szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie naruszyć powłoki.</li>
	<li>Delikatnie rozcieraj zawiesinę komórkową 2 razy o jeden róg studzienki, aby rozbić kolonie hiPSC na grudki o wielkości ~ 50 - 200 μm. Przenieść 250 μl zawiesiny komórek ze starej studzienki do każdej nowej studzienki 4-dołkowego szkiełka nakrywkowego/szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Zwiększ objętość każdej nowej studzienki do 500 μl za pomocą mTeSR1 zawierającego 10 ng/ml inhibitora Y-27632 ROCK.</li>
	<li>Umieścić szkiełko komorowe/szkiełka nakrywkowe w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Po 24 godzinach wykonuj codzienną pełną wymianę pożywki za pomocą kompletnej pożywki mTeSR1. Ponownie, jak wspomniano wcześniej, dodanie inhibitora Y-27632 ROCK nie jest konieczne po wstępnym posiewaniu.</li>
</ol>
5. Przygotowanie iPSC do immunocytochemii
<ol>
	<li>Po zlaniu należy zachować kolonie hiPSC poprzez utrwalenie, usuwając pożywkę ze studzienek i dodając wstępnie podgrzany UWAGA 4% paraformaldehydu (~ 300 μL/studzienkę 4-dołkowego szkiełka podstawowego/szkiełka nakrywkowego). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Wyrzuć paraformaldehyd zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi zagrożeń biologicznych i bezpieczeństwa chemicznego.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy po 5 minut na wytrząsarce stołowej z PBS. 
	UWAGA: Na tym etapie komórki na szkiełkach nakrywkowych/szkiełkach nakrywkowych mogą być przechowywane z dużą ilością PBS w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony. Alternatywnie można je od razu wykorzystać do ICC.</li>
</ol>
6. Barwienie immunologiczne hiPSC za pomocą markerów pluripotencji
UWAGA: Immunostainy hiPSC ze standardowymi przeciwciałami pluripotencji. Na przykład, tutaj komórki są podwójnie barwione przeciwciałami skierowanymi przeciwko jednemu antygenowi powierzchniowemu i 1 antygenowi wewnątrzkomórkowemu w sposób sekwencyjny w następujący sposób: antyspecyficzny antygen embrionalny-4 (SSEA4) z białkiem wiążącym anty-oktamery 4 (OCT-4) i anty-Tra-1-60 z genem 2 HMG BOX związanym z anty-SRY (SOX2) (szczegółowe informacje na temat przeciwciał można znaleźć w tabeli materiałów).
<ol>
	<li>Odessać PBS ze studzienek i dodać 500 μl/dołek roztworu blokującego bez Triton-X-100. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować z góry określone stężenie (w tym przypadku należy użyć 1:200) przeciwciał powierzchniowych, SSEA4 lub Tra-1-60, rozcieńczając w roztworze blokującym bez Triton X-100.
	<ol>
		<li>W przypadku szkiełek komorowych należy przygotować 300 μl/dołek 4-dołkowego szkiełka podstawowego, mieszając 298,5 μl roztworu blokującego powyżej i 1,5 μl przeciwciała pierwszorzędowego anty-SSEA4 lub Tra-1-60.</li>
		<li>W przypadku szkiełek nakrywkowych należy przygotować 40 μl/szkiełko nakrywkowe, mieszając 199 μl roztworu blokującego i 1 μl przeciwciała pierwszorzędowego anty-SSEA4 lub Tra-1-60.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać roztwór blokujący ze szkiełka komory i dozować przeciwciało pierwszorzędowe do odpowiednich studzienek. W przypadku szkiełek nakrywkowych należy umieścić kawałek parafilmu na szalce Petriego i nanieść 40 μl przeciwciała pierwszorzędowego na wierzch w postaci kropelki. Używając zgiętej igły strzykawki i kleszczyków, ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z hodowli i umieść je komórką do dołu na kropli przeciwciała na parafilmie. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego ranka przemyj komórki 3 razy po 5 - 10 minut każda, usuwając przeciwciało ze szkiełka komory i dodając PBS. W przypadku szkiełek nakrywkowych należy zdjąć każdy z nich z parafilmu i umieścić go z powrotem w dołku na 24-dołkowej płytce, komórką do góry. Ostrożnie dodaj PBS.</li>
	<li>Przygotować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:500 w roztworze blokującym.
	<ol>
		<li>W przypadku szkiełek komorowych należy przygotować 300 μl/studzienkę 4-dołkowego szkiełka komorowego, mieszając 499 μl roztworu blokującego i 1 μl koziego anty-mysiego IgG3 Alexa Fluor 488 (dla SSEA4) lub 1 μl koziego anty-mysiego IgM Alexa Fluor 488 (dla Tra-1-60).</li>
		<li>W przypadku szkiełek nakrywkowych należy przygotować 40 μl/szkiełko nakrywkowe, mieszając 499 μl roztworu blokującego i 1 μl koziego anty-mysiego IgG3 Alexa Fluor 488 (dla SSEA4) lub 1 μl koziego anty-mysiego IgM Alexa Fluor 488 (dla Tra-1-60).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać PBS ze szkiełka komory i dozować przeciwciało wtórne do odpowiednich studzienek. W przypadku szkiełek nakrywkowych, postępując zgodnie z krokiem 6.2, odwróć szkiełka nakrywkowe na roztwór przeciwciała umieszczony na parafilmie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny 
	UWAGA: W przypadku stosowania przeciwciał drugorzędowych znakowanych fluorescencyjnie, komórki muszą być chronione przed światłem. Umieść szkiełka komorowe i szkiełka nakrywkowe w ciemnym otoczeniu podczas inkubacji i przemywania się.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy przez 5 - 10 minut każda, usuwając przeciwciało ze szkiełka komory i dodając PBS. W przypadku szkiełek nakrywkowych należy ostrożnie wyjąć każde z nich z parafilmu i umieścić z powrotem w dołku z 24-dołkową płytką, komórką do góry. Delikatnie dodawaj PBS podczas prania.</li>
	<li>Przed sondowaniem w poszukiwaniu drugiego antygenu, w tym przypadku wewnątrzkomórkowego OCT-4 lub SOX2, należy ponownie inkubować w roztworze blokującym przygotowanym z odczynnikiem do permeabilizacji (Triton-X-100) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby przeprowadzić barwienie immunologiczne na OCT-4 lub SOX2, po prostu postępuj zgodnie z metodologią opisaną w krokach 6.1-6.6 w celu zastosowania przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych. Do celów niniejszego protokołu należy użyć OCT-4 i SOX2 w stężeniu 1:200 oraz drugorzędowego przeciwciała koziego anty-królika IgG Alexa Fluor 594 w stężeniu 1:500.</li>
	<li>Po wyżej wymienionych pierwotnych i wtórnych zabiegach z przeciwciałami, przemyć komórki 3 razy przez 5 - 10 minut za pomocą PBS i przeciwbarwić 4',6'-diamidino-2-fenyloindolem, dichlorowodorkiem (DAPI) zgodnie ze standardowymi protokołami, jeśli pożądana jest wizualizacja jądrowa.</li>
</ol>
7. Przygotowanie do oglądania
<ol>
	<li>W przypadku szkiełek komorowych ostrożnie wyjmij górną komorę z prowadnicy, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie spłucz w wodzie destylowanej i dodaj podłoże montażowe i szkło nakrywkowe, aby umożliwić mikroskopię.</li>
	<li>W przypadku szkiełek nakrywkowych należy odwrócić szkiełka nakrywkowe na kroplę podłoża mocującego umieszczoną na szklanym szkiełku mikroskopowym.</li>
	<li>Obraz pod standardowym lub konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Hallett, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+function+of+autologous+iPSC-derived+dopamine+neurons+following+transplantation+in+a+non-human+primate+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease.</a> Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).</li>
<li>Haston, K. M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Trials+in+a+Dish%3A+The+Potential+of+Pluripotent+Stem+Cells+to+Develop+Therapies+for+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+rev+pharm+toxicol%22%5BJournal%5D)">Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases.</a> Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+heart+fail%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).</li>
<li>Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+subpopulation+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts.</a> PloS one. 4, 7118(2009).</li>
<li>Sivapatham, R., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+Characterization+of+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+for+Disease+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling.</a> Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Ruff, D., Lieu, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+stem+cells+using+quantitative+PCR+protein+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays.</a> Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).</li>
<li>Pripuzova, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protein+marker+panel+for+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28hiPSCs%29+using+global+quantitative+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res%22%5BJournal%5D)">Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis.</a> Stem cell res. 14, 323-338 (2015).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+jpn+acad+ser+B+phys+biol+sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Bigdeli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+embryonic+stem+cells+to+feeder-free+and+matrix-free+culture+conditions+directly+on+plastic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces.</a> J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj systematyczny protokół oferuje oszczędzającą czas i opłacalną metodę w postaci techniki hodowli w zmniejszonej skali, zaprojektowanej specjalnie w celu wspierania skutecznej analizy pluripotencji za pomocą immunocytochemii.
Główne zalety opisanej metodologii są następujące. Tradycyjnie potrzeba więcej niż 3 do 4 pasaży, aby przejść iPSC z warstw zasilających do warunków hodowli bez karmienia, w celu wyeliminowania szczątkowych iMEF pozostałych po zastosowaniu technik dysocj...

Przeprogramowanie ludzkich dorosłych komórek somatycznych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) umożliwia uzyskanie potencjalnie nieograniczonej ilości komórek specyficznych dla pacjenta do badania choroby1,2. Rekapitulacja fenotypu choroby in vitro umożliwiłaby zbadanie mechanizmów komórkowych i molekularnych związanych z chorobą, a także usprawniłoby odkrywanie leków i medycynę spersonalizowaną3. Ponadto ludzkie iPSC (hiPSC) oferują możliwość wyprowadzenia określonych typów komórek, które mogą być wykorzystane jako unikalny zasób do zastąpienia martwych lub dysfunkcyjnych komórek i przywrócenia funkcji w kontekście kilku zaburzeń4,5.
Ważnym warunkiem wstępnym do korzystania z iPSC w powyższych aplikacjach jest zapewnienie, że ich pluripotencjalny i niezróżnicowany stan jest utrzymywany podczas ekspansji w hodowli. Zazwyczaj techniki takie jak cytometria przepływowa, western blotting, reakcja łańcuchowa polimerazy i testy funkcjonalne, które wymagają dużej ilości komórek i specjalistycznego sprzętu, są wykorzystywane do szczegółowej analizy pluripotencji iPSC6,7,8,9,10. Jednak rutynowa ocena stanu niezróżnicowanego iPSC może być skutecznie osiągnięta dzięki ograniczonej namnażaniu tych komórek specyficznie dla immunocytochemii (ICC), co wiąże się z redukcją czasu i zasobów.
Ostatnie osiągnięcia pozwalają na wzrost iPSC w określonych warunkach bez surowicy, co jest znaczącym postępem w porównaniu z konwencjonalnymi systemami hodowli, które wymagają warstw zasilających mysie fibroblasty i pożywki zawierającej surowicę. Obecna literatura nie zawiera jednak jasnych protokołów krokowych, które opisywałyby, w jaki sposób przenieść iPSC z warstwy zasilającej do systemów bez zasilania.
W tym kontekście, obecny protokół systematycznie szczegółowo opisuje, w jaki sposób hiPSC hodowane na napromieniowanych warstwach fibroblastów embrionalnych myszy (iMEF) mogą być (1) przystosowane do rozmnażania się w pożywce wolnej od surowicy, oraz (2) hodowane na małą skalę, aby wspierać solidną analizę immunocytochemiczną. Ogólnie rzecz biorąc, metodologia ta stanowi terminową i opłacalną procedurę namnażania ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w celu rutynowego potwierdzania ich pluripotencji przy użyciu immunocytochemii.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12/HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Technologie zastępowania surowicy nokautującej 10828028</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-Podstawowe</td><td>nauki o komórkach</td><td>CRF001B</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK Inhibitor</td><td>R& D</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel z kwalifikacją hESC Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Basal Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 5x Suplement</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>Delikatny bufor dysocjacyjny</td><td>komórek Technologie komórek</td> macierzystych<td>07174</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M PO4 Bufor</td><td>własny</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehydu, pryl</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>n/</td><td>a n/a</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td> Life <td>Technologies</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4A (C30A3) MAb królika, Sox2 (D6D9) MAb królika, SSEA4 (MC813) MAb myszy, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mysia mAb</td><td>Sygnalizacja komórkowa Sygnalizacja komórkowa Sygnalizacja komórkowa Sygnalizacja komórkowa</td><td>2840 3579 4755 4746</td><td>Alternatywnie, kombinację 6 pierwszorzędowych przeciwciał pluripotencji można kupić razem jako zestaw w katalogu #9656</td></tr><tr><td>Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21151</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Cell Culture Plates</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>0720080/0720081</td><td>Dostępne w rozmiarach 6, 12, 24, 48, 96 dołków</td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie komorowe</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12 565 21</td><td>Dostępne w wersji ze szkła lub tworzywa permanoksowego W rozmiarach 1, 2, 4, 8, 16 dołków</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe do uprawy</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12 545 82</td><td>Dostępne w rozmiarach 12, 15, 18, 22 i 25 mm</td></tr></tbody></table>

rozmnażanie na małą skalę ludzkich ipsc w warunkach wolnych od surowicy w rutynowej charakterystyce immunocytochemicznej

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

Istnieje duże zainteresowanie wykorzystaniem ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) do modelowania chorób i terapii komórkowej ze względu na ich specyficzność dla pacjenta i charakterystyczną macierzystość. Jednak pluripotencja iPSC, która ma zasadnicze znaczenie dla ich funkcjonalności, musi zostać potwierdzona, zanim komórki te będą mogły być wykorzystane w takich zastosowaniach. Podczas gdy rygorystyczna charakterystyka iPSC za pomocą różnych testów komórkowych i funkcjonalnych jest niezbędna do ustalenia ich pluripotencji, rutynowa ocena utrzymania pluripotencji może być osiągnięta prościej i skuteczniej za pomocą technik immunocytochemicznych. W tym miejscu przedstawiamy systematyczny protokół hodowli hiPSC, w sposób pomniejszony, aby szczególnie ułatwić weryfikację ich stanu pluripotencjalnego za pomocą immunocytochemii. Dokładniej rzecz ujmując, metodologia ta obejmuje wydajny i opłacalny sposób hodowli iPSC w warunkach wolnych od surowicy i posiewania ich na szkiełkach podstawowych o małej komorze lub szklanych szkiełkach nakrywkowych, idealnych do celów immunocytochemicznych.

Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku procesu przenoszenia ludzkich iPSC z warstwy komórek karmicielskich do warunków bez karmicieli, a następnie ich ograniczonej propagacji w celu umożliwienia kosztowo efektywnej immunocytochemii służącej do potwierdzenia utrzymania pluripotencji. Rysunek 1 przedstawia schematyczną reprezentację tego protokołu. Rysunek 2A przedstawia kolonie hiPSC rosnące na iMEF w płytkach 6-dołkowych. Kolonie te wyk...

Regularna charakterystyka indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), w celu zapewnienia utrzymania ich stanu pluripotencjalnego, jest ważnym krokiem przed wykorzystaniem tych komórek do innych zastosowań. W tym miejscu opisujemy metodę rozmnażania ludzkich iPSC na małą skalę, zaprojektowaną specjalnie w celu umożliwienia ich łatwej i rutynowej charakterystyki za pomocą immunocytochemii.

Rozmnażanie na małą skalę ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w rutynowej charakterystyce immunocytochemicznej

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

Ogólnym celem tej metody hodowli jest namnażanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, czyli ludzkich iPSC, w małej skali, aby w szczególności umożliwić ich rutynową charakterystykę za pomocą immunocytochemii. Niniejszy protokół z mojego laboratorium przedstawia technikę zmniejszenia skali w celu przeniesienia ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z warstwy podłoża płodowego na substrat, który jest bardziej odpowiedni do wykrywania antygenów przy użyciu specyficznych przeciwciał przeciwko pluripotencji. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona efektywny pod względem czasu i kosztów sposób hodowli komórek pluripotencjalnych w małych szkiełkach z komorami lub na szkiełkach nakrywkowych, które są idealne do immunocytochemii.W dniu pasażowania wyjąć płytkę pokrytą macierzą z temperatury 4°C i pozwolić jej aklimatyzować się do temperatury pokojowej przez jedną godzinę w dygestorze do hodowli tkankowych. Następnie odessać medium z jednej studni płytki 6-dołkowej z hodowlą ludzkich iPSC rosnących na iMEF i zastąpić je 500 µL odczynnika dysocjującego z kolagenazą. Następnie inkubować komórki w temperaturze 37°C od 10 do 30 minut

small-scale-propagation-human-ipscs-serum-free-conditions-for-routine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Immunocytochemiczne barwienie w zawiesinie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) pod kątem markerów powierzchniowych komórek (SSEA-3/SSEA-4) zostało przeprowadzone z wykorzystaniem własnego urządzenia do cytocentryfugacji w celu stworzenia monowarstwy komórek do obserwacji i kwantyfikacji.

Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego urządzenia do cytocentryfugacji

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Tutaj przedstawiamy protokół rozwoju trójwymiarowego (3-D) systemu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) o nazwie surowica wolnego od embrionów (SFEB). Ten model 3D może być używany jak organotypowa kultura plasterków do modelowania rozwoju ludzkiej kory mózgowej i do fizjologicznego badania rozwijających się obwodów neuronalnych.

Opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur 3-D komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Przedstawiono protokół przygotowania hydrożeli z polialkoholu winylowego i kwasu ko-itakonowego o różnej sztywności, które zostały zaszczepione z oligopeptydami i bez nich, w celu zbadania wpływu sztywności biomateriałów na różnicowanie i proliferację komórek macierzystych. Sztywność hydrożeli była kontrolowana przez czas sieciowania.

Ludzka pluripotencjalna hodowla komórek macierzystych na hydrożelach z polialkoholem winylowym i kwasem ko-itakonowym o różnej sztywności w warunkach wolnych od ksenotypów

Prezentujemy tutaj protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na każdą pochodną somitu (miotom, sklerotom, dermatom i syndetom) w chemicznie zdefiniowanych warunkach, który ma zastosowanie w przyszłym modelowaniu chorób i terapiach komórkowych w chirurgii ortopedycznej.

Wytwarzanie in vitro pochodnych somitów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Tutaj opisujemy protokół, który ułatwia różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne astrocyty specyficzne dla przodomózgowia. Umożliwia to badania nad rolą komórek glejowych w patogenezie zaburzeń neurorozwojowych, takich jak zespół łamliwego chromosomu X, oraz modelowanie innych zaburzeń mózgu.

Wytwarzanie i charakterystyka indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych astrocytów pochodzących z komórek macierzystych, pozbawionych kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika X

Naucz się metody rozmnażania ludzkich iPSC na małą skalę w warunkach wolnych od surowicy do rutynowej immunocytochemicznej charakterystyki. Technika ta umożliwia oszczędne i szybkie hodowanie komórek macierzystych.

Rozmnażanie na małą skalę ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w rutynowej charakterystyce immunocytochemicznej

Przeglądaj więcej filmów