Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie specyficznych mutacji w genach histonów w ich endogennych lokalizacjach chromosomalnych w pączkujących komórkach drożdży. Metoda ta może być stosowana do określania udziału określonych reszt histonów w różnych procesach wykorzystujących chromatynę jako substrat, takich jak transkrypcja DNA, każda kombinacja. Główną zaletą tej techniki jest to, że określone geny histonowe mogą być celem mutagenezy, pomimo faktu, że w drożdżach każde białko histonowe jest kodowane przez dwa wysoce homologiczne, niealleliczne geny.

Po wygenerowaniu szczepu drożdży z docelowym genem histonu znokautowanym i zastąpionym przez URA3, wygeneruj produkty PCR dla dwóch częściowo nakładających się fragmentów docelowego genu histonowego, ustawiając następującą reakcję dla pierwszej połowy genu. W przypadku drugiej połowy genu należy przeprowadzić podobną reakcję PCR przy użyciu różnych starterów. Umieść reakcje w termocyklerze i skonfiguruj następujący program.

Przeprowadź od 20 do 50 mikrolitrów reakcji PCR na 0,9% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia w buforze TBE. Następnie użyj czystej żyletki, aby wyciąć produkty PCR z żelu i przenieś każdą sekcję do 1,5 mililitrowej tuby. Przechowuj kawałki agarozy w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia.

Aby przygotować matrycę DNA do reakcji PCR w celu wytworzenia pełnowymiarowych produktów PCR, rozpuść skrawki agarozy w bloku grzewczym w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Wirowanie rurek co jedną do dwóch minut, aby pomóc w topnieniu. Przenieś określoną ilość stopionej agarozy z każdej próbki do jednej probówki do mikrowirówki i wymieszaj probówkę przez wirowanie.

Użyj go jako szablonu do fuzji PCR i przechowuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby amplifikować dużą ilość pełnowymiarowego produktu PCR, należy ustawić sześć reakcji PCR, każda z następującymi odczynnikami. Umieść probówki w termocyklerze i uruchom reakcje z następującymi ustawieniami.

Skoncentrować produkty PCR przez wytrącanie i wykorzystać je do kotransformacji z plazmidem szkieletowym zgodnie z protokołem tekstowym. W celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem utraty genu URA3 w wyniku integracji produktu PCR, należy replikować komórki płytki z płytek od 1 do 20, zdejmując pokrywkę płytki i dociskając płytkę zawierającą kolonie do sterylnego aksamitu. Przenieś komórki z aksamitu na płytkę 5-FOA, dociskając płytkę do aksamitu.

Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa dni. Następnie dokładnie sprawdź płytki pod kątem wzrostu. Po smugowaniu i inkubacji kolonii kandydujących na płytkach YPD zgodnie z protokołem tekstowym, replikę każdej płytki oczyszczającej YPD należy umieścić na świeżej płytce YPD, na płytce dropout bez uracylu w celu sprawdzenia utraty genu URA3 i drugiej płytki dropout w celu monitorowania obecności lub braku plazmidu szkieletowego.

Po inkubacji zidentyfikuj kolonię z każdej próbki kandydującej, która rośnie na płytce YPD, ale nie rośnie na żadnej z płytek odpadających. Umieść te kolonie na świeżych płytkach YPD. Powiedzmy, że dla prawidłowej integracji zmutowanego allelu za pomocą PCR zgodnie z protokołem tekstowym.

Rysunek ten przedstawia wyniki PCR dotyczące generowania dwóch częściowo nakładających się fragmentów HHT2 z pożądanymi mutacjami, które ostatecznie skutkują zmianą kodonu AGA na GAA, powodując mutację R53E. Wynik reakcji fusion PCR, w wyniku której uzyskano pełnowymiarowe produkty PCR, przedstawiono tutaj. Pełnowymiarowe produkty PCR zawierały 195 i 220 regionów par zasad homologicznych do regionów odpowiednio przed i za otwartą ramką odczytu HHT2 w celu napędzania rekombinacji homologicznej.

W tej przykładowej transformacji pełnowymiarowe produkty PCR zostały połączone z plazmidem oznaczonym HIS-3, a transformanty wybrano na płytkach pozbawionych histydyny. Dodatnie kolonie HIS zostały następnie przebadane pod kątem oporności na 5-FOA. Przedstawiono przykłady kandydatów, a także próbki, które prawdopodobnie nie będą reprezentować pożądanych wydarzeń integracyjnych.

Zidentyfikowano 12 próbek kandydujących i poddano ich analizie PCR w celu zastąpienia genu URA3 zmutowanymi produktami PCR. Czterech kandydatów wykazało się integracją produktu PCR we właściwym miejscu. Jeden z tych kandydatów jest pokazany na czwartym pasie.

Ponieważ mutacja AG2GA generuje nowe miejsce restrykcyjne EcoR1, trawienie za pomocą EcoR1 przeprowadzono na jednej z próbek PCR, które zakończyły się sukcesem, aby wykazać, że zmutowana sekwencja rzeczywiście została włączona do genomu. Gdy wszystkie odczynniki będą dostępne, powinno być możliwe uzyskanie komórek drożdży zawierających pożądane mutacje histonów w okresie od 15 do 20 dni. Po wygenerowaniu pożądanej mutacji w szczepie gospodarza, komórki wyrażające docelowe białko histonowe wyłącznie z mutagenizowanego genu można uzyskać poprzez odpowiednie krzyżówki genetyczne.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że obwody reakcji PCR mogą wymagać dostosowania w zależności od charakteru konkretnych starterów użytych w eksperymentach i oczekiwanych rozmiarów produktów PCR. Chociaż procedura ta dobrze nadaje się do mutagenezy genów histonów, ponieważ pozwala na celowanie w określony gen histonowy pomimo obecności drugiego wysoce homologicznego, nieallelicznego genu, może być również stosowana do generowania mutacji w innych lokalizacjach genomowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować ukierunkowane mutacje histonów NC2 w pączkujących drożdżach przy użyciu kombinacji podejść PCR i technik genetyki drożdży.

Nie zapominaj, że ekspozycja na światło UV może być bardzo niebezpieczna, a podczas pracy z transiluminatorem UV należy zawsze używać okularów ochronnych, osłon i odzieży. Noś również rękawice, okulary i odzież ochronną przez większość etapów zabiegu.