Name: Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1+ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj czteroetapowy protokół różnicowania ludzkich komórek macierzystych w progenitory trzustki NKX6-1+. Ta metoda umożliwia generowanie wysokich stężeń komórek progenitorowych, dostarczając modelu do badania rozwoju trzustki i terapii cukrzycy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten manuskrypt był wspierany przez fundusze Toronto General and Western Foundation oraz Banting & Best Diabetes Centre-University Health Network Graduate Award.

1. Przygotowanie rozwiązań i mediów
UWAGA: Przygotuj wszystkie podłoża do hodowli komórkowej w sterylnym środowisku. Media muszą być natychmiast wyprodukowane i zużyte. Szczegółowe informacje na temat odczynników znajdują się w tabeli materiałów.
<ol>
	<li>Zróżnicowane media
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę różnicującą dnia 0: Pożywka RPMI z 1% glutaminą, 2 μM CHIR 99021, 100 ng/ml aktywiny A, 104 M MTG.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę różnicującą dzień 1-2: Pożywka RPMI z 1% glutaminą, 100 ng / ml aktywiny A, 104 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 μg / ml kwasu askorbinowego.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę różnicującą dzień 3-5: Pożywka RPMI z 1% glutaminy, 1% B27, 104 M MTG, 0,75 μM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.</li>
		<li>Przygotuj dzień 6-7 Pożywki różnicujące: DMEM z 1% glutaminą, 1% B27, 50 μg/ml Kwas askorbinowy, 50 ng/ml FGF10, 0,25 μM SANT-1, 2 μM Kwas retinowy, 50 ng/ml NOGGIN. 
		UWAGA: Kwas retinowy należy dodać do podłoża na końcu, a podłoże należy chronić przed światłem, aby zapobiec degradacji oksydacyjnej15.</li>
		<li>Przygotuj dzień 8-12 Pożywki różnicujące: DMEM z 1% glutaminą, 1% B27, 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 50 ng/ml NOGGIN, 100 ng/ml hEGF, 10 mM nikotynamidu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor FACS: 10% FBS w PBS, minus wapń i magnez.</li>
</ol>
2. Zróżnicowanie HESC
UWAGA: HESC są rozmrażane, pasażowane i rozprowadzane na napromieniowanych mysich fibroblastach embrionalnych w obecności pożywki opartej na KOSR uzupełnionej bFGF16. HESC są gotowe do różnicowania, gdy komórki osiągną 80-95% konfluencji. W tym czasie kolonie powinny być duże z określonymi granicami i strukturą przypominającą kopułę (ryc. 1A). Cała hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskodennych płytkach poddanych hodowli tkankowej pokrytych 0,1% żelatyną. Zazwyczaj komórki hoduje się na płytkach 6- lub 12-dołkowych, w pożywkach o objętości odpowiednio 2 ml lub 1 ml.
<ol>
	<li>W dniu 0 rozpocznij różnicowanie, zastępując nośniki oparte na KOSR nośnikami różnicującymi dnia 0.</li>
	<li>W dniach 1 i 2 delikatnie potrząśnij płytką, aby usunąć wszelkie martwe komórki z monowarstwy przed aspiracją. Zastąp pożywką różnicującą dnia 1-2.</li>
	<li>W 3 dniu zbierz komórki do cytometrii przepływowej. Jeśli ekspresja komórek przekracza 90% CXCR4+/CD117+, przejdź do kroku 2.4.</li>
	<li>W dniach 3 i 5 delikatnie potrząśnij płytką, aby usunąć wszelkie martwe komórki z monowarstwy przed aspiracją. Zastąp pożywką różnicującą dnia 3-5.</li>
	<li>W dniach 6 i 7 zastąp je pożywką różnicującą z dnia 6-7.</li>
	<li>W dniach 8, 10 i 12 zastąp je pożywką różnicującą z dnia 8-12.</li>
	<li>W 13 dniu zbierz komórki do cytometrii przepływowej w celu określenia ekspresji PDX1 i NKX6-1.</li>
</ol>
3. Pobieranie komórek do analizy cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zdysocjuj komórki za pomocą 1x komercyjnego roztworu trypsyny zgodnie z protokołem producenta i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Usuń dostępny w handlu roztwór trypsyny i ponownie zawieś pojedyncze komórki w 1,000 μl buforze FACS z 30 μl DNazy I.</li>
	<li>Przefiltrować komórki za pomocą sitka z siatki nylonowej o grubości 35 μm i przenieść do probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 455 x g przez 5 minut. Przygotować komórki do barwienia żywego lub utrwalonego.</li>
</ol>
4. Barwienie do cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przygotowanie przepływu do barwienia na żywo w dniu 3
	<ol>
		<li>Zawieś komórki w buforze FACS o pojemności 1 000 μl. Przenieść 200 μl (około 1-3 x 105 komórek) do dwóch dołków 96-dołkowej płytki (zarówno dla próbek niebarwionych, jak i barwionych).</li>
		<li>Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.</li>
		<li>Barwienie pierwszorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi, CXCR4:APC i CD117:PE (patrztabela M) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronione przed światłem.</li>
		<li>Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.</li>
		<li>Zawiesić próbki w buforze FACS o pojemności 100 μl.</li>
		<li>Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.</li>
		<li>Zawiesić każdą próbkę i przenieść w całkowitej objętości 300-500 μl buforu FACS do mikroprobówek o pojemności 1 ml lub probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Uruchom próbki na cytometrze przepływowym17. Jeżeli nie można natychmiast uruchomić próbek, należy je przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie przepływu do trwałego barwienia w 13 dniu
	<ol>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w komercyjnym roztworze utrwalającym/przepuszczalnym przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować próbkę o sile 455 x g przez 5 minut. Zawiesić w 400 μl roztworu do trwałej ondulacji/przemywania (perm).</li>
		<li>Przenieść 200 μl próbki (około 0,5-1 x 106 komórek) do dwóch dołków 96-dołkowej płytki (do kontroli IgG i barwienia PDX1/NKX6-1). Wirować przy 931 x g przez 2 min.</li>
		<li>Zawiesić osady komórkowe w 100 μl roztworu do trwałej ondulacji/przemywania zawierającego przeciwciała pierwszorzędowe lub kontrolne anty-PDX1 i anty-NKX6-1 (patrz tabela materiałów). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki. Zawiesić próbki w 100 μl roztworu do trwałej ondulacji/przemywania.</li>
		<li>Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.</li>
		<li>Zawiesić próbki w 100 μl trwałej ondulacji/przemywania zawierającej przeciwciała drugorzędowe w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.</li>
		<li>Zawiesić próbki w 100 μl roztworu do trwałej ondulacji/przemywania (perm).</li>
		<li>Odwirować płytkę o sile 931 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.2.9 i 4.2.10.</li>
		<li>Zawiesić każdą próbkę i przenieść w całkowitej objętości 300-500 μl buforu FACS do mikroprobówek o pojemności 1 ml lub probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Uruchom próbki na cytometrze przepływowym17. Jeżeli nie można natychmiast uruchomić próbek, należy je przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Canadian Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes">http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes</a> (2016).</li>
<li>Cogger, K., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cell+replacement+therapies+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes.</a> Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Functional+Human+Pancreatic+beta+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2014).</li>
<li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Gouon-Evans, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-4+is+required+for+hepatic+specification+of+mouse+embryonic+stem+cell-derived+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).</li>
<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Pan, F. C., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).</li>
<li>Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6+transcription+factors+and+Ptf1a+function+as+antagonistic+lineage+determinants+in+multipotent+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors.</a> Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomyślne wytworzenie komórek progenitorowych trzustki NKX6-1+ z hPSC in vitro opiera się na wykorzystaniu wysokiej jakości kultur hPSC i ukierunkowanym różnicowaniu obejmującym precyzyjną regulację specyficznych szlaków sygnałowych, które rządzą kluczowymi etapami rozwoju trzustki. Chociaż protokół ten może być używany do indukowania silnej ekspresji NKX6-1 w różnych liniach hPSC, jak pokazano wcześniej3, aby zapewnić wydajne wytwarzanie NKX6-1, należy wziąć pod uwagę następują...

Częstość występowania cukrzycy wzrasta i według Kanadyjskiego Towarzystwa Diabetologicznego szacuje się, że ponad 11 milionów osób w Kanadzie ma cukrzycę lub stan przedcukrzycowy, przy czym 5-10% tych osób ma cukrzycę typu 1 (T1D)1. Cukrzyca typu 1 jest chorobą autoimmunologiczną, która jest spowodowana zniszczeniem β komórek produkujących insulinę, które znajdują się na wyspach Langerhans. Obecnie osoby żyjące z cukrzycą typu 1 wymagają egzogennych źródeł insuliny2. Pomimo postępów w insulinoterapii, pacjenci z cukrzycą typu 1 nadal mają trudności z regulacją poziomu glukozy we krwi i nadal cierpią zarówno na hipo- jak i hiperglikemię. Obiecującą formą leczenia w celu przywrócenia normoglikemii w cukrzycy typu 1 jest wykorzystanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), które mogą być wykorzystane do wygenerowania nieograniczonej ilości komórek β produkujących insulinę zarówno in vivo, jak i in vitro3,4,5,6,7. Różnicowanie komórek hESC w komórki podobne do β może umożliwić badanie cukrzycy in vitro, co pozwoli na identyfikację nowych celów terapeutycznych w cukrzycy typu 2 i dostarczenie komórek do przeszczepów pacjentom z cukrzycą typu 1.
Najbardziej udaną próbą generowania komórek produkujących insulinę z hESC in vitro jest podsumowanie zdarzeń embrionalnych, które zachodzą podczas rozwoju trzustki4,5. Wiąże się to z manipulowaniem odrębnymi szlakami sygnałowymi w celu dokładnego modelowania kluczowych etapów rozwoju trzustki. Rozwój trzustki rozpoczyna się od indukcji ostatecznej endodermy, która charakteryzuje się ekspresją CXCR4 i CD117 (c-KIT)8,9. Precyzyjna regulacja ostatecznej organizacji endodermy jest wymagana do powstania cewy jelitowej, która następnie ulega ukształtowaniu od przodu do tyłu i brzuszno-grzbietowo. Grzbietowe i brzuszne zawiązki trzustki wyłaniają się z obszaru tylnego jelita przedniego, który wyraża gen homeoboksu trzustki i dwunastnicy (Pdx1), który jest niezbędny do rozwoju trzustki10. Pączki grzbietowe i brzuszne łączą się, tworząc trzustkę, która następnie ulega rozległej przebudowie i ekspansji nabłonka11. Przywiązaniu do linii endokrynnej i zewnątrzwydzielniczej towarzyszy wytwarzanie multipotencjalnych komórek progenitorowych (MPC), które wyrażają m.in. czynniki transkrypcyjne Pdx1, Nkx6.1 i Ptf1a12,13. MPC, które staną się komórkami endokrynnymi i przewodowymi, nadal wyrażają Nkx6-1, jednocześnie zmniejszając ekspresję Ptf1a. W przeciwieństwie do tego, komórki linii zewnątrzwydzielniczej stracą ekspresję Nkx6-1 i zachowają wyrażenie Ptf1a12.
Czynnik transkrypcyjny Nkx6-1 odgrywa kluczową rolę w rozwoju trzustki, szczególnie podczas różnicowania komórek progenitorowych endokrynnych do komórek β. Jak opisano wcześniej, delecja Nkx6-1 powoduje upośledzenie tworzenia komórek β podczas rozwoju trzustki14. Dlatego wytwarzanie komórek β produkujących insulinę zarówno in vitro, jak i in vivo wymaga skutecznej indukcji Nkx6-1.
Niedawno opracowaliśmy protokół do efektywnego generowania komórek progenitorowych trzustki PDX1+/NKX6-1+ z komórek progenitorowych hPSC. Te komórki progenitorowe trzustki pochodzące z hPSC generują dojrzałe komórki β po przeszczepieniu myszom z niedoborem odporności3. Protokół różnicowania można podzielić na 4 etapy charakterystyczne: 1) ostateczna indukcja endodermy, 2) wzorzec tylnego jelita przedniego, 3) specyfikacja trzustki i 4) indukcja NKX6-1. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis każdego etapu ukierunkowanego różnicowania.

<table><tbody><tr><td>Media i cytokiny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Tioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash buffer, 1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>Tocris</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)Żubr</td><td></td> <td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R& D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>Enzym ekspresowy TrypLE (1x), czerwień fenolowa</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Przeciwciała do cytometrii przepływowej (rozcieńczenia robocze)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp; Bioscience</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>Osioł Anti-Mouse IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 647 (1:400)</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>Mysz kontrolna Isotype IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.&nbsp;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Koza kontrolna Isotype IgG</td><td>R& D&nbsp; &nbsp;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2,000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R& D</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki nkx6-1+

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotencjalne komórki macierzyste mają zdolność do samoodnawiania się i różnicowania do wielu linii, co czyni je atrakcyjnym źródłem do generowania komórek progenitorowych trzustki, które mogą być wykorzystane do badań i przyszłego leczenia cukrzycy. W artykule przedstawiono czteroetapowy protokół różnicowania mający na celu generowanie komórek progenitorowych trzustki z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC). Protokół ten można zastosować do wielu linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Podejście przyjęte do wygenerowania komórek progenitorowych trzustki polega na różnicowaniu hESC w celu dokładnego modelowania kluczowych etapów rozwoju trzustki. Rozpoczyna się to od indukcji ostatecznej endodermy, którą osiąga się poprzez hodowlę komórek w obecności aktywiny A, podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i CHIR990210. Dalsze różnicowanie i modelowanie za pomocą czynnika wzrostu fibroblastów 10 (FGF10) i Dorsomorphiny generuje komórki przypominające tylne jelito przednie. Dodatek kwasu retinowego, NOGGIN, SANT-1 i FGF10 różnicuje komórki tylnego jelita przedniego w komórki charakterystyczne dla endodermy trzustki. Wreszcie, połączenie naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), nikotynamidu i NOGGIN prowadzi do wydajnego wytwarzania komórek PDX1+/NKX6-1+. Cytometria przepływowa jest wykonywana w celu potwierdzenia ekspresji określonych markerów na kluczowych etapach rozwoju trzustki. Progenitorzy trzustki PDX1 + / NKX6-1 + pod koniec etapu 4 są zdolni do generowania dojrzałych komórek β po przeszczepieniu myszom z niedoborem odporności i mogą być dalej różnicowane w celu wytworzenia komórek produkujących insulinę in vitro. W związku z tym wydajne wytwarzanie komórek progenitorowych trzustki PDX1+/NKX6-1+, jak wykazano w niniejszym protokole, ma ogromne znaczenie, ponieważ stanowi platformę do badania rozwoju trzustki człowieka in vitro i stanowi źródło komórek o potencjale różnicowania się do komórek β, które ostatecznie mogłyby zostać wykorzystane w leczeniu cukrzycy.

Efektywne generowanie progenitorów trzustki zależy od prawidłowego wzrostu i utrzymania niezróżnicowanych komórek, a następnie precyzyjnego dodawania specyficznych cząsteczek sygnałowych podczas protokołu różnicowania, co przedstawiono na schemacie na Rysunku 1A. W dniu 0 komórki niezróżnicowane powinny osiągnąć konfluencję na poziomie 80-95%, a kolonie powinny mieć wyraźne krawędzie (Rysunek 1A). Podczas Etapu 1 pożywka prawdopodobnie będzie wydawać się ...

Tutaj opisujemy 4-etapowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do komórek progenitorowych trzustki NKX6-1+ in vitro. Protokół ten może być stosowany do różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1+

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywne generowanie progenitorów trzustkowych wykazujących ekspresję NKX6.1 z ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych in vitro poprzez różnicowanie komórek w czterech kluczowych etapach rozwoju trzustki. Dzięki różnicowaniu ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych poprzez cztery kluczowe etapy rozwoju trzustki, protokół ten stanowi model do badania rozwoju ludzkiej trzustki in vitro. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi protokołami jest możliwość uzyskania wysokiego odsetka progenitorów trzustkowych NKX6.1-dodatnich przy użyciu różnych linii ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych.Biorąc pod uwagę, że progenitorzy trzustkowe mają potencjał do generowania komórek podobnych do beta-komórek produkujących insulinę, technika ta umożliwi nam opracowanie komórek do leczenia cukrzycy, odkrywania leków oraz modelowania chorób. W dniu zerowym należy rozpocząć różnicowanie, zastępując pożywkę z zamiennikiem surowicy KnockOut pożywką do różnicowania z dnia zerowego. Następnie, w dniu pierwszym i drugim, należy delikatnie potrząsnąć płytką, aby usunąć martwe komórki z monowarstwy przed odessaniem pożywki.Następnie zastąpić je pożywką do różnicowania na pierwszy i drugi dzień. W trzecim dniu zebrać komórki do analizy cytometrycznej. Jeśli ponad 90% komórek wykazuje ekspresję CXCR4 i CD117, oznacza to osiągnięcie wymaganej wydajności.Następnie delikatnie potrząśnij płytką, aby usunąć martwe komórki z monowarstwy przed aspiracją, a następnie zastąp medium różnicującym na dni od trzeciego do piątego. Ważne jest, aby do trzeciego dnia zapewnić efektywną indukcję ostatecznej gleby za pomocą cytometrii przepływowej. Jeśli odsetek komórek wykazujących ekspresję zarówno CXCR4, jak i CD117 będzie niższy niż 90%, różnicowanie do progenitorów trzustkowych prawdopodobnie zostanie upośledzone.W szóstym i siódmym dniu należy wymienić pożywkę na pożywkę różnicującą stosowaną od dnia szóstego do siódmego. W ósmym, dziesiątym i dwunastym dniu należy wymienić pożywkę na pożywkę różnicującą stosowaną od dnia ósmego do dwunastego. Następnie w trzynastym dniu należy zebrać komórki do analizy w cytometrii przepływowej, aby określić ekspresję PDX1 i NKX6.1.Aby zebrać komórki do analizy cytometrycznej, należy rozdzielić je za pomocą komercyjnego roztworu trypsyny zgodnie z protokołem producenta i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez trzy minuty. Po trzech minutach należy usunąć roztwór trypsyny i ponownie zawiesić pojedyncze komórki w 1 000 µL buforu FACS z dodatkiem 30 µL DNA One. Następnie komórki należy przefiltrować przez nylonowe sitko komórkowe o oczkach 35 µm i przenieść do probówki do mikrowirówki.Odwirować komórki przy 455 ×g przez pięć minut przed przygotowaniem ich do barwienia żywych lub utrwalonych komórek. Następnie ponownie zawiesić komórki w 1 000 µL buforu fax. Przenieść 200 µL do dwóch studzienek płytki 96-dołkowej dla próbek niebarwionych oraz barwionych.Następnie wirować płytkę przy 931 ×g przez dwie minuty, po czym usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki, zabarwić komórki pierwotnym przeciwciałem koniugowanym w końcowej objętości 100 µL przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem. Następnie wirować płytkę przy 931 ×g przez dwie minuty, po czym usunąć supernatant poprzez odwrócenie płytki. Na koniec resuspender próbki w 100 µL buforu FACS.Następnie odwiruj płytkę z prędkością 931 ×g przez dwie minuty. Usuń nadsącz poprzez odwrócenie płytki. Następnie resuspenduj próbki w 300 do 500 µL buforu fax, przenieś je do probówek mikrocentryfużowych o pojemności 1 ml lub probówek z okrągłym dnem o pojemności 5 ml i poddaj próbki analizie w cytometrze przepływowym.Jeśli próbek nie można poddać analizie natychmiast, należy przechowywać je w temperaturze 4°C i chronić przed światłem. W tej procedurze osad komórkowy resuspenduje się w komercyjnym roztworze do fiksacji i permeabilizacji przez 24 godziny w temperaturze 4°C. Po 24 godzinach próbkę wiruje się przy 455 ×g przez pięć minut, a następnie resuspenduje w 400 µL komercyjnego roztworu do przemywania po permeabilizacji.Następnie przenieś 200 µL próbki do dwóch studzienek płytki 96-dołkowej dla kontroli IgG oraz barwienia PDX1 i NKX6.1, a następnie wiruj płytkę przy 931 ×g przez dwie minuty. Po tym resuspenduj osady komórkowe w 100 µL komercyjnego roztworu do przemywania Perm, zawierającego przeciwciała pierwszorzędowe anty-PDX1 i anty-NKX61 lub przeciwciała kontrolne izotypowe. Inkubuj je przez noc w temperaturze 4 °C.Następnego dnia odwiruj płytkę przy 931 ×g przez dwie minuty, usuń nadsącz poprzez odwrócenie płytki i ponownie zawieś próbki w 100 µL komercyjnego roztworu Perm Wash. Następnie odwiruj płytkę przy 931 ×g przez dwie minuty. Usuń nadsącz poprzez odwrócenie płytki.Następnie resuspenduj próbki w 100 µL roztworu perm wash zawierającego przeciwciało wtórne w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, chroniąc je przed światłem. Po godzinie odwiruj płytkę z siłą 931 ×g przez dwie minuty, a następnie usuń nadosad odwracając płytkę; po tym resuspenduj próbki w 100 µL komercyjnego roztworu perm wash, odwiruj płytkę z siłą 931 ×g przez dwie minuty i usuń nadosad, odwracając płytkę. Następnie ponownie resuspenduj próbkę w 100 µL komercyjnego roztworu perm wash i ponownie odwiruj płytkę z siłą 931 ×g przez dwie minuty przed usunięciem nadosadu.Następnie resuspenduj próbki w 300 do 500 µL buforu fax i przenieś je do osobnych probówek testowych o pojemności 1 mL lub probówek z okrągłym dnem o pojemności 5 mL w celu przeprowadzenia cytometrii przepływowej. Przedstawiony tutaj schemat indukcji prekursorów trzustkowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych wskazuje dzień różnicowania, etap rozwoju, podłoże podstawowe oraz cytokiny dodawane na każdym etapie. Poniżej znajdują się obrazy w kontraście fazowym z kluczowych etapów różnicowania trzustki.Komórki H1 poddano różnicowaniu zgodnie z przedstawionym czteroetapowym protokołem różnicowania. W dniu zerowym uzyskano nieróżnicowane ludzkie embrionalne komórki macierzyste, w etapie pierwszym ostateczną endodermę, w etapie drugim tylną jelitową endodermę, w etapie trzecim endodermę trzustkową, a w etapie czwartym NKX6.1-dodatnie endodermalne progenitory trzustkowe.Oto próbka niebarwiona, a tutaj próbka barwiona. Ten rysunek przedstawia reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej z 13. dnia dla komórek progenitorowych trzustki pochodzących z etapu czwartego, wykazujących ekspresję NKX61 i PDX1. To jest kontrola IgG, a to jest próbka barwiona.Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu 13 dni. Czas ten może się jednak różnić w zależności od zastosowanej linii komórkowej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przetestowanie wszystkich odczynników ze względu na zmienność między partiami.Po przeprowadzeniu opisanej procedury komórki progenitorowe trzustki wykazujące ekspresję NKX6.1 mogą zostać dalej różnicowane w komórki podobne do beta produkujące insulinę, zgodnie z innymi opublikowanymi protokołami. Stanowi to platformę do badania dojrzewania i rozwoju komórek beta in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat efektywnego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w progenitory trzustki poprzez przeprowadzenie komórek przez cztery kluczowe etapy rozwoju.

efficient-differentiation-pluripotent-stem-cells-to-nkx6-1-pancreatic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film pokazuje generowanie nerwowych komórek progenitorowych z nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). hPSC są różnicowane w neuronalne komórki progenitorowe za pomocą neuronalnej pożywki różnicującej. Podczas gdy różnicowanie jest indukowane w komórkach nietransgenicznych za pomocą małych cząsteczek, transgeniczne hPSC są różnicowane przez dodanie antybiotyku, który indukuje promotor dla czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla...

Różnicowanie nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które są zaangażowane w ostateczną endodermę w celu poprawy dalszych zastosowań i dalszego różnicowania.

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

Ten protokół opisuje monowarstwową, pozbawioną surowicy metodę efektywnego generowania komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w ciągu 18 dni. Obejmuje to sześć etapów, w których hPSC sekwencyjnie różnicują się w pośrednie typy komórek, takie jak prymitywna smuga, ostateczna endoderma, tylne jelito przednie i progenitorzy zawiązków wątroby, zanim utworzą komórki podobne do hepatocytów.

Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

W tym protokole opisujemy stabilną, wysoce efektywną strategię różnicowania do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Model ten sprawi, że neurony będą dostępne do wykorzystania w badaniach nad wieloma zaburzeniami autonomicznymi.

Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

Celem tego artykułu jest dostarczenie ustandaryzowanego podejścia do indukowania różnicowania ludzkich komórek progenitorowych wątroby od pluripotencjalnych komórek macierzystych. Opracowanie tej procedury z gotowymi do użycia preparatami pożywek oferuje użytkownikowi łatwy system do generowania ludzkich komórek wątroby do badań biomedycznych i translacji.

Specyfikacja progenitorów wątroby z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu różnicowania

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Różnicowanie komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych stanowi alternatywne rozwiązanie dla konwencjonalnego leczenia cukrzycy i modelowania chorób. Opisujemy szczegółowy protokół hodowli komórek macierzystych, który łączy komercyjny zestaw różnicujący z wcześniej zwalidowaną metodą, aby pomóc w wytwarzaniu wysp trzustkowych wydzielających insulinę pochodzących z komórek macierzystych w naczyniu.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj czteroetapowy protokół różnicowania ludzkich komórek macierzystych w progenitory trzustki NKX6-1+. Ta metoda umożliwia generowanie wysokich stężeń komórek progenitorowych, dostarczając modelu do badania rozwoju trzustki i terapii cukrzycy.

Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1⁺

Przeglądaj więcej filmów