Name: Barwienie wewnątrzkomórkowe i cytometria przepływowa w celu identyfikacji podzbiorów limfocytów w obrębie mysiej aorty, nerek i węzłów chłonnych w modelu nadciśnienia tętniczego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę barwienia wewnątrzkomórkowego i cytometrii przepływowej do identyfikacji podzbiorów limfocytów T w aorcie, nerkach i węzłach chłonnych myszy w modelu nadciśnienia tętniczego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez American Heart Association Fellowship Award (16POST29950007) dla FL, grant szkoleniowy od National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) dla BLD, American Heart Association Fellowship Award (14POST20420025) dla MA Saleh oraz nagrodę NIH K08 (HL121671) dla MSM. MSM jest również wspierany przez grant badawczy od Gilead Sciences, Inc.

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Vanderbilt zatwierdził procedury opisane w niniejszym dokumencie. Myszy są trzymane i opiekowane zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych (National Academies Press. Revised 2010).
1. Izolacja węzłów chłonnych drenujących aortę, nerki i aorty od myszy
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez wdychanie CO2 . Spryskaj klatkę piersiową 70% etanolem i ostrożnie otwórz skórę i ścianę klatki piersiowej nożyczkami, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Aby wykonać perfuzję naczyń krwionośnych, należy wykonać małe nacięcie w prawym przedsionku i równomiernie wstrzykiwać co najmniej 10 ml zimnego PBS (około 1 ml / s) w wierzchołek lewej komory za pomocą igły 21 lub 23 G. Wykonuj fuzję, aż wszystkie narządy zbledną. Najpierw blednie serce. Blanszowanie wątroby wskazuje, że perfuzja została dobrze przeprowadzona.</li>
	<li>Za pomocą małych kleszczy i cienkich nożyczek delikatnie odetnij i wyciągnij jelita, żołądek, śledzionę, trzustkę i wątrobę, aby lepiej uwidocznić aortę. 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać bardzo precyzyjnie, ponieważ uszkodzenie przewodu pokarmowego może wywołać zanieczyszczenie.</li>
	<li>Wytnij i usuń każde płuco nożyczkami. Przepłukać klatkę piersiową solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) za pomocą strzykawki bezigłowej. Usuń nadmiar krwi i płynów za pomocą sterylnej gazy.</li>
	<li>Usuń węzły chłonne drenujące aortę brzuszną za pomocą drobnych kleszczy preparacyjnych. Należy uważać, aby nie rozerwać kapsułki. Usuń pozostały tłuszcz z powierzchni każdego węzła chłonnego za pomocą kleszczy preparacyjnych. Wytnij dwie nerki cienkimi nożyczkami.</li>
	<li>Wypreparuj całą aortę (aortę piersiową i brzuszną) cienkimi, zakrzywionymi nożyczkami. Zacznij od poziomu serca i ostrożnie rozwiń od przełyku i kręgów aż do poziomu rozwidlenia biodrowego, upewniając się, że otaczający tłuszcz okołonaczyniowy jest przyczepiony do aorty. 
	UWAGA: Dalsza sekcja aorty w celu usunięcia otaczających struktur może być wykonana pod mikroskopem. W szczególności usuń gałęzie tętnicze (tętnice szyjne, tętnice podobojczykowe, tętnice trzewne, krezkowe i nerkowe) i węzły chłonne. Utrzymuj stałą warstwę tłuszczu okołonaczyniowego wokół każdej aorty, ponieważ jest to miejsce, w którym znajduje się wiele komórek zapalnych w przypadku nadciśnienia. Umieść każdą tkankę w oddzielnych probówkach zawierających zimny PBS.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie zawiesin jednokomórkowych z każdej tkanki
<ol>
	<li>Nerki 
	UWAGA: Nerka może zostać zdysocjowana do zawiesiny pojedynczej komórki poprzez połączenie dysocjacji mechanicznej i trawienia enzymatycznego.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór do trawienia nerek, dodając kolagenazę D (2 mg/ml) i DNazę I (100 μg/ml) do pożywki RPMI 1640 (uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS)). Przygotować 10 ml na próbkę nerki.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy przenieś dwie nerki do probówki dysocjacyjnej zawierającej 10 ml roztworu do trawienia nerek.</li>
		<li>Przeprowadzić dysocjację mechaniczną za pomocą półautomatycznego urządzenia dysocjującego zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Po dysocjacji mechanicznej należy odłączyć rurkę od urządzenia i przeprowadzić trawienie enzymatyczne. Inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 37 °C w ciągłej rotacji. Natychmiast przerwij trawienie enzymatyczne, dodając zimną pożywkę RPMI 1640 uzupełnioną 5% FBS.</li>
		<li>Przenieść roztwór pipetując do stożkowej probówki o pojemności 50 ml po przefiltrowaniu przez sitko o średnicy 40 μm. Rozdzielić pozostałą tkankę, naciskając tłokiem strzykawki o pojemności 1 ml. Granulować komórki (500 x g, 8 min, 4 ºC).</li>
		<li>Zawiesić osad w 3 ml pożywki wirowej o gradientowym natężeniu gęstości 36%. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie dodaj 3 ml pożywki wirowej o gradientowym gradiencie gęstości 72% pod 3 ml zawiesiny komórek 36% bez żadnych zakłóceń. Wirówka (1.000 x g bez hamulca, 20 min, 4 °C).</li>
		<li>Komórki odpornościowe będą zlokalizowane na granicy faz. Usuń najwyższą żółtawą warstwę zawierającą zanieczyszczenia komórkowe, a następnie zwiększ objętość do 15 ml za pomocą zimnego PBS. Dobrze wstrząśnij, aby rozbić gradient. Odwirować komórki (300 x g, 8 min, 4 °C) i ponownie zawiesić osad w 3 ml RPMI z 5% FBS. Policz liczbę żywych komórek na hemocytometrze przy użyciu wykluczenia błękitu trypana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aorta
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór do trawienia aorty, dodając kolagenazę A (1 mg/ml), kolagenazę B (1 mg/ml) i DNazę I (100 μg/ml) do pożywki RPMI 1640 (uzupełnionej 5% FBS).</li>
		<li>Za pomocą cienkich kleszczyków przenieś aortę do probówki o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml roztworu do trawienia aorty. Zmielić całą aortę na bardzo małe kawałki cienkimi nożyczkami w 1 ml roztworu trawiącego. Trzymaj na lodzie. Próbki inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciągłej rotacji.</li>
		<li>Przenieś roztwór do naczynia do hodowli tkankowej i zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając 5-krotność objętości zimnego RPMI z 5% FBS.</li>
		<li>Przenieść roztwór pipetując do stożkowej probówki o pojemności 50 ml po przefiltrowaniu przez sitko o średnicy 40 μm. Pozostałą tkankę rozdzielić na zawiesinę jednokomórkową, naciskając tłokiem strzykawki o pojemności 1 ml. Przepłukać sitko i otoczce (300 x g, 8 min, 4 ºC).</li>
		<li>Umyj granulkę, dodając 10 ml RPMI z 5% FBS. Odwirować komórki (300 x g, 8 min, 4 °C) i ponownie zawiesić osad w 3 ml RPMI z 5% FBS. Policz liczbę żywych komórek na hemocytometrze przy użyciu wykluczenia błękitu trypana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Węzły chłonne drenujące aortę
	<ol>
		<li>Umieścić sitko o średnicy 40 μm w naczyniu do hodowli tkankowych (60 mm x 15 mm). Umieścić węzły chłonne na sitku i rozdzielić je na zawiesinę jednokomórkową, naciskając tłokiem strzykawki o pojemności 1 ml. Przepłucz sitko 2 ml RPMI z 5% FBS. Zbierz komórki w naczyniu.</li>
		<li>Przenieść komórki do probówki sokoła o pojemności 15 ml i zagnieździć komórki (300 x g, 8 min, 4 °C). Ponownie zawiesić pelety w 500 μl RPMI z 5% FBS. Policz liczbę żywych komórek na hemocytometrze przy użyciu wykluczenia błękitu trypana.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Stymulacja ex vivo do wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych: RPMI z 5% FBS, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 50 μM β-merkaptoetanolu i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Odwirować każdą zawiesinę komórkową uzyskaną z nerki, aorty i węzłów chłonnych (300 x g, 8 min, 4 °C). Zawiesić każdy osad z pożywką do hodowli komórkowych w stężeniu 1 x 106 komórek na ml.</li>
	<li>Stymuluj komórki, dodając 2 μl koktajlu aktywacji komórek (zawierającego 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA), jonomycynę jonoforu wapnia i inhibitor Golgiego Brefeldin A) na każdy 1 ml hodowli komórkowej. 
	UWAGA: Końcowe stężenia każdego składnika to: 81 nM PMA, 1,33 μM jonomycyny i 5 μg/ml Brefeldiny A. Leczenie PMA i jonomycyną aktywuje komórki do produkcji cytokin. Cytokiny to wydzielane białka, które muszą zostać uwięzione w komórkach, aby mogły zostać wykryte. Brefeldyna A powoduje akumulację normalnie wydzielanych białek w retikulum endoplazmatycznym i aparacie Golgiego. W ten sposób opisana tutaj technika zwiększa wykrywalność limfocytów wytwarzających cytokiny za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Płytka od 1 do 2 milionów komórek w 12-dołkowej (aorta lub nerka) lub 24-dołkowej (węzeł chłonny) płytce o niskiej przyczepności. Umieść płytkę w inkubatorze CO2 z wilgotnością 37 °C na 3 godziny. 
	UWAGA: Liczba posianych komórek może być mniejsza w węzłach chłonnych u myszy kontrolnych. Należy również empirycznie określić czas stymulacji dla każdej badanej populacji komórek i cytokin. W przypadku limfocytów T wyizolowanych z aorty, nerek lub węzłów chłonnych zalecamy stymulację przez 3 do 4 godzin. Dłuższa stymulacja nie zwiększy wydzielania cytokin i wywoła dalszą regulację w dół kilku markerów powierzchniowych limfocytów T, takich jak CD3, CD4 i CD8. (Zauważ, że nawet 3-4 godzinna stymulacja wywoła pewną regulację w dół tych markerów.)</li>
</ol>
4. Barwienie powierzchni
<ol>
	<li>Przenieść komórki do probówki z polistyrenu FACS i odwirować (300 x g, 8 min, 4 °C). Przemyć komórki dwukrotnie buforem FACS (PBS wolny od Ca2+ i Mg+ zawierający 4% FBS i 2 mM EDTA) i równo podzielić zawiesinę komórek na różne probówki FACS w zależności od liczby pożądanych paneli przeciwciał i liczby potrzebnych probówek kontrolnych (patrz poniżej).</li>
	<li>Aby wykonać kompensację dla każdego panelu, należy przygotować niebarwione probówki kontrolne i pojedyncze barwione probówki dla każdego typu tkanki i panelu przeciwciał. Ponadto należy przygotować probówkę kontrolną fluorescencji minus jedną (FMO) dla każdego panelu przeciwciał, dodając wszystkie przeciwciała z wyjątkiem jednego.</li>
	<li>Dostosuj objętość każdej probówki do 2 ml za pomocą buforu FACS. Odwirować zawiesinę komórkową (300 x g, 8 min, 4 °C), usunąć supernatant i zablokować receptory Fc, inkubując komórki z 0,5 μg przeciwciał anty-CD16/CD32 na milion komórek przez 10 minut na lodzie. 
	UWAGA: CD16 to receptor IgG Fc III o niskim powinowactwie (FcR III), a CD32 to FcR II. CD16 / CD32 ulegają ekspresji na granulocytach, komórkach tucznych, monocytach / makrofagach, komórkach NK, komórkach B, komórkach dendrytycznych i niektórych aktywowanych dojrzałych limfocytach T.</li>
	<li>Barwienie żywotności: Umyć komórki 1x PBS, odwirować (300 x g, 8 min, 4 °C) i ponownie zawiesić w 1 000 μl 1x PBS. Dodać 1 μl barwnika obojętnego na aminy nieprzepuszczalnego dla komórek (barwienie żywotności). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Podczas inkubacji należy przygotować koktajl przeciwciał (do barwienia powierzchniowego) w odpowiedniej objętości buforu FACS. Przemyć komórki dwukrotnie 1-2 ml buforu FACS, odwirować (300 x g, 8 min, 4 °C) i ponownie zawiesić każdą osadkę 100 μl mieszaniny przeciwciał. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. 
	UWAGA: Dla każdego przeciwciała cytometrii przepływowej przydatne jest określenie optymalnej ilości potrzebnego przeciwciała poprzez wykonanie krzywej miareczkowania dawki.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 2 ml buforu FACS i rozsypać komórki (300 x g, 8 min, 4 °C).</li>
</ol>
5. Utrwalanie, przepuszczalność i barwienie wewnątrzkomórkowe
<ol>
	<li>Barwienie wewnątrzkomórkowe należy wykonać za pomocą zestawu do utrwalania i przepuszczalności zawierającego odpowiednie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Napraw i przepuszczalność komórek, umieszczając je ponownie w odpowiednim buforze. Próbki inkubować przez 40 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Dodać 1 ml 1x buforu do permeabilizacji i przemywania bezpośrednio do utrwalonych i przepuszczalnych komórek. Odwirować (500 x g, 8 min, 4 °C) i usunąć supernatant. Zawiesić osad za pomocą 2 ml 1x buforu do płukania.</li>
	<li>Przygotować mieszaniny przeciwciał (tylko do barwienia wewnątrzkomórkowego) w odpowiedniej objętości 1x buforu do przemywania (zwykle 100 μl na probówkę). 
	UWAGA: Jak opisano powyżej, optymalne stężenie przeciwciał należy określić dla każdego przeciwciała w panelu. Na przykład dla przeciwciał przeciwko IL-17A lub IL-17F stosujemy współczynnik rozcieńczenia 1:30, ale dla przeciwciał przeciwko IFNγ i T-bet stosujemy współczynnik rozcieńczenia 1:100.</li>
	<li>Odwirować komórki (500 x g, 8 min, 4 °C) i ponownie zawiesić każdą osadkę 100 μl mieszaniny przeciwciał. Inkubować przez 40 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 2 ml 1x buforu do przemywania i zagnieździć komórki (500 x g, 8 min, 4 °C). Zawiesić osad z 300 μl 1x buforu do płukania i przeanalizować na cytometrze przepływowym z odpowiednimi filtrami.</li>
	<li>Do ilościowego określenia całkowitej liczby komórek w próbce tkanki należy użyć kulek do liczenia. Przed akwizycją dodaj zalecaną objętość/liczbę kulek do liczenia do każdej probówki.</li>
</ol>
6. Kompensacja, bramkowanie, normalizacja i napiwki
<ol>
	<li>Kompensacja i bramkowanie
	<ol>
		<li>Uruchom niebarwione i pojedynczo barwione probówki kontrolne w celu kompensacji, aby dostosować się do nakładania się widma. 
		UWAGA: Stosowanie kulek kompensacyjnych zamiast kontroli kompensacyjnych opartych na komórkach jest konieczne w przypadkach, gdy antygen będący przedmiotem zainteresowania lub populacja komórek w próbce jest obecny na tak niskich poziomach, że kompensacja przy użyciu komórek będzie trudna. Warto również zauważyć, że w przypadku stosowania barwników tandemowych zaleca się przygotowanie kompensacji dla każdego eksperymentu, ponieważ barwniki tandemowe różnią się w zależności od partii i każdego dnia.</li>
		<li>Uruchom fluorescencję minus jedną kontrolę (FMO) dla wszystkich fluoroforów w panelu podczas rozpoczynania nowego eksperymentu wielokolorowego. 
		UWAGA: Kontrole FMO to próbki, które zawierają wszystkie przeciwciała w panelu z wyjątkiem jednego. Te kontrole pozwalają na dokładne rozróżnienie sygnałów dodatnich i ujemnych dla pominiętego przeciwciała, aby prawidłowo dostosować bramki. Te kontrole są szczególnie ważne, gdy poziomy ekspresji są niskie lub gdy separacja populacji docelowej jest słaba (na przykład, gdy celem jest cytokina lub czynnik transkrypcyjny). Chociaż nie zawsze jest to konieczne, w niektórych przypadkach kontrole izotypów mogą być preferowane zamiast kontroli FMO, ponieważ zapewniają one odpowiednią kompensację koniugatu izotypu przeciwciała i fluoroforu bez specyficzności antygenu.</li>
		<li>Skonfiguruj bramkę główną: dostosuj napięcie obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) i obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A) w celu wykrycia populacji leukocytów.</li>
		<li>Wyklucz martwe komórki. 
		UWAGA: Barwienie żywotności reaguje z wolnymi aminami obecnymi zarówno na powierzchni, jak i we wnętrzu komórek. W przeciwieństwie do żywych komórek, martwe komórki (z uszkodzonymi błonami) pozwalają barwnikowi wejść do cytoplazmy, zwiększając ilość znakowania białka. W ten sposób martwe komórki będą jaśniejsze niż żywe komórki, co pozwoli na łatwą dyskryminację. Bramka na aktywnych komórkach. 
		UWAGA: Żywotność zawiesin komórkowych z aorty i nerki może być niższa niż żywotność zawiesin komórkowych z węzłów chłonnych ze względu na dodatkowy etap trawienia.</li>
		<li>Wykreśl obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) [oś y] i wysokość rozproszenia do przodu (FSC-H) [oś x]. Podkoszulki pojawiają się jako przekątna na tym wykresie kropkowym. Bramka na tej przekątnej, aby wykluczyć dublety. Następnie wykreśl SSC-A [oś y] i CD45 [oś x].</li>
		<li>Populację leukocytów CD45+ można łatwo zidentyfikować. Brama na tę populację. Na podstawie tej populacji można zidentyfikować kolejne populacje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Normalizacja liczby komórek
	<ol>
		<li>Kulki do liczenia mają cechy, które skutkują niskim FSC i wysokim SSC. Na przykład, jeśli 50 000 kulek zostanie dodanych do 300 μl zawiesiny jednokomórkowej, równanie do obliczenia liczby bezwzględnej dowolnego typu komórki na probówkę jest następujące: 
		Liczba komórek w probówce = (50 000 / liczba kulek zliczonych przez cytometr przepływowy) x liczba zliczonych komórek. 
		Za pomocą tego obliczenia można określić liczbę bezwzględną dowolnego typu ogniwa na probówkę. Na podstawie liczby jajowodówek wytworzonych z każdego narządu można obliczyć liczbę komórek w każdym narządzie. 
		UWAGA: Podczas trwania protokołu wszystkie komórki i odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Unikaj energicznego wirowania, ponieważ może to uszkodzić komórki. Użyj minimalnych sił do granulowania komórek. Unikaj tworzenia pęcherzyków w probówce FACS, ponieważ może to przyspieszyć śmierć komórki. W żadnym momencie nie pozwól, aby granulki wyschły.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+adaptor+protein+LNK+deficiency+exacerbates+hypertension+and+end-organ+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).</li>
<li>Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+17+promotes+angiotensin+II-induced+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction.</a> Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).</li>
<li>Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cells+Promote+the+Transition+From+Hypertrophy+to+Heart+Failure+During+Chronic+Pressure+Overload%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload.</a> Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).</li>
<li>Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).</li>
<li>Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+Response+of+T+and+B+Cells+in+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis.</a> Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).</li>
<li>McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+Immunity%2C+and+Hypertensive+End-Organ+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage.</a> Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).</li>
<li>Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+Cells%3A+Differentiation+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+T Cells: Differentiation and Functions.</a> Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).</li>
<li>Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+differentiation+and+function+of+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Microbiol+Immunol+%28Bp%29%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).</li>
<li>Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+Flow+Cytometry+Immunophenotyping+Analysis+from+the+Human+ImmunoPhenotyping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium.</a> Sci Rep. 6, 20686(2016).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+the+fluorescence+activated+cell+sorter+and+flow+cytometry%3A+a+view+from+Stanford%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford.</a> Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).</li>
<li>Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARIS%3A+method+for+analyzing+RNA+following+intracellular+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting.</a> PLoS One. 9 (3), 89459(2014).</li>
<li>Kalisky, T., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics.</a> Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%3A+Today%27s+technology+and+tomorrow%27s+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons.</a> Methods. 57 (3), 251-258 (2012).</li>
<li>Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).</li>
<li>Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dectin-1+activation+unlocks+IL12A+expression+and+reveals+the+TH1+potency+of+neonatal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).</li>
<li>Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Genomics+Unveils+Critical+Regulators+of+Th17+Cell+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity.</a> Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).</li>
</ol>

MSM jest wspierany przez grant z Gilead Cardiovascular Sciences.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół został zoptymalizowany w celu prawidłowej identyfikacji podzbiorów limfocytów T obecnych w mysich nerkach, aorcie i węzłach chłonnych. Protokół ten można łatwo dostosować do badania innych podzbiorów komórek odpornościowych, takich jak limfocyty B i wrodzone komórki odpornościowe, i można go zmodyfikować w celu uwzględnienia innych typów tkanek. Etap trawienia ma kluczowe znaczenie i musi być modyfikowany i optymalizowany dla każdej tkanki9. Przedłużony etap trawienia l...

Ostatnie dowody pokazują, że adaptacyjny układ odpornościowy, szczególnie limfocyty T, odgrywają kluczową rolę w rozwoju wielu chorób sercowo-naczyniowych1,2,3,4,5. Na przykład w modelu nadciśnienia indukowanego angiotensyną II opisano nagromadzenie limfocytów T w naczyniach i nerkach myszy6. Nagromadzenie naczyniowe występuje głównie w przydankach i tłuszczu okołonaczyniowym. W nerce limfocyty T gromadzą się zarówno w rdzeniu, jak i korze nerkowej. W zależności od tego, która podgrupa jest zaangażowana, te limfocyty T powodują wytwarzanie różnych cytokin, które mogą wpływać na czynność naczyń krwionośnych i nerek oraz prowadzić do rozwoju patologii (przegląd McMaster i wsp.6).
Limfocyty pomocnicze T CD4+ można podzielić na kilka podzbiorów: T pomocnik 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, komórki regulatorowe T (Treg) i komórki pomocnicze pęcherzyków T (Tfh) w oparciu o ich funkcje i cytokiny charakterystyczne7. Podobnie cytotoksyczne limfocyty T CD8 + można sklasyfikować jako Tc1, Tc2, Tc17 lub Tc98. Istnieją również podwójnie ujemne limfocyty T (tj. Komórki, które nie wyrażają markerów limfocytów T CD4 lub CD8). Podzbiór tych komórek posiada alternatywny receptor limfocytów T gamma delta (zamiast klasycznych receptorów alfa i beta) i dlatego są określane jako limfocyty T gamma delta. Wieloparametrowa analiza markera powierzchniowego, cytokiny i czynnika transkrypcyjnego za pomocą cytometrii przepływowej stanowi najlepsze podejście do identyfikacji tych komórek. Chociaż metoda ta jest szeroko stosowana w dziedzinie immunologii, jest mniej szczegółowo opisana w narządach litych i w warunkach chorób sercowo-naczyniowych.
Historycznie rzecz biorąc, identyfikacja limfocytów w tkankach ograniczała się do metod immunohistochemicznych lub RT-PCR. Chociaż immunohistochemia i immunofluorescencja są potężnymi metodami określania rozmieszczenia w tkankach antygenu będącego przedmiotem zainteresowania, są one niewystarczające do fenotypowej identyfikacji zaangażowanych podzbiorów. Ponadto, chociaż analiza RT-PCR jest przydatna do wykrywania ekspresji mRNA antygenów, cytokin lub czynników transkrypcyjnych, nie pozwala na wykrycie wielu białek jednocześnie na poziomie pojedynczych komórek.
Pojawienie się cytometrii przepływowej, zwłaszcza w połączeniu z barwieniem wewnątrzkomórkowym w celu wykrywania cytokin i czynników transkrypcyjnych, dostarcza badaczom potężnej techniki, która umożliwia identyfikację i kwantyfikację na poziomie pojedynczej komórki podzbiorów komórek odpornościowych w organach stałych. Zoptymalizowaliśmy test barwienia wewnątrzkomórkowego w celu identyfikacji za pomocą cytometrii przepływowej głównych podzbiorów limfocytów T obecnych w mysich nerkach, aorcie i węzłach chłonnych drenujących aortę w modelu nadciśnienia indukowanego angiotensyną II. Optymalizacja każdego etapu: trawienie tkanek, aktywacja ex vivo, przepuszczalność oraz barwienie powierzchniowe i wewnątrzkomórkowe daje wysoce powtarzalny test, który można zastosować do innych modeli chorób sercowo-naczyniowych i nerkowych.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza D</td><td>ROCHE</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>ROCHE</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza B</td><td>ROCHE</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>1x Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1614 1x</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia i magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5445-02</td><td>Do wirowania w gradionym gradicynie</td></tr><tr><td>gęstości GentleMACS&trade; Rurka C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>Dysocjator GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Użyj programu SPLEEN_04</td></tr><tr><td>Koktajl aktywacji komórek (z Brefeldin A)</td><td>Biolegend</td><td>423303</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td>rozcieńczony 1:100</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD zestaw do naprawy fioletowych barwników martwych komórek</td><td>Technologie życia</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw czynników transkrypcyjnych</td><td>BD Pharmingen</td><td>562725</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>123 sztuk eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45 AmCyan (klon 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5 (klon 17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100218</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A FITC (klon TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506910</td><td></td></tr><tr><td>IL-17F APC (klon 9D3.1C8)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>517004</tr><tr><td>CD4 APC-Cy7 (klon GK1.5)</td><td>BD Biosciences</td><td>560181</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC (klon 53-67)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>T-bet PE-Cy7 (klon 4B10)</td><td>BioLegend</td><td>644823</td><td></td></tr><tr><td>IFN&gamma; FITC (klon XMG1.2)</td><td>BD Biosciences</td><td>557724</td><td></td></tr></tbody></table>

barwienie wewnątrzkomórkowe i cytometria przepływowa w celu identyfikacji podzbiorów limfocytów w obrębie mysiej aorty, nerek i węzłów chłonnych w modelu nadciśnienia tętniczego

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Obecnie dobrze wiadomo, że limfocyty T odgrywają kluczową rolę w rozwoju wielu chorób sercowo-naczyniowych1,2,3,4,5. Na przykład badania naszej grupy wykazały, że nadciśnienie tętnicze wiąże się z nadmiernym gromadzeniem się limfocytów T w naczyniach i nerkach podczas rozwoju eksperymentalnego nadciśnieniatętniczego 6. Po dostaniu się do tych tkanek limfocyty T wytwarzają kilka cytokin, które wpływają zarówno na czynność naczyń krwionośnych, jak i nerek, prowadząc do zwężenia naczyń krwionośnych oraz zatrzymywania sodu i wody1,2. Aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób limfocyty T powodują choroby układu krążenia i nerek, ważne jest, aby móc zidentyfikować i określić ilościowo określone podzbiory limfocytów T obecne w tych tkankach. Podzbiory limfocytów T są definiowane przez kombinację markerów powierzchniowych, wydzielanych przez nie cytokin i czynników transkrypcyjnych, które wyrażają. Złożoność populacji limfocytów T sprawia, że cytometria przepływowa i barwienie wewnątrzkomórkowe są nieocenioną techniką analizy fenotypów limfocytów obecnych w tkankach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół identyfikacji markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych (cytokin i czynników transkrypcyjnych) w limfocytach T wyizolowanych z mysich nerek, aorty i węzłów chłonnych drenujących aortę w modelu nadciśnienia indukowanego angiotensyną II. Szczegółowo opisano następujące etapy: izolacja tkanek, wytwarzanie zawiesin pojedynczych komórek, stymulacja ex vivo, utrwalanie, przepuszczalność i barwienie. Ponadto omówiono kilka podstawowych zasad analiz cytometrii przepływowej, w tym wybór odpowiednich kontroli i odpowiednich strategii bramkowania.

Opisany protokół umożliwia identyfikację markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych w limfocytach T wyizolowanych z nerki, aorty i drenujących aortę węzłów chłonnych myszy w modelu nadciśnienia indukowanego angiotensyną II. Reprezentatywne wyniki przedstawiono poniżej.
Rycina 1 przedstawia strategię bramkowania wykorzystaną do identyfikacji populacji limfocytów T w zawiesinie pojedynczych komórek przygotowa...

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię identyfikacji i ilościowego określania funkcjonalnych podzbiorów limfocytów T obecnych w mysich nerkach, aorcie i węzłach chłonnych za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego i cytometrii przepływowej. Model nadciśnienia indukowanego angiotensyną II został wybrany, aby krok po kroku wyjaśnić procedury i podstawowe zasady cytometrii przepływowej i barwienia wewnątrzkomórkowego.

Barwienie wewnątrzkomórkowe i cytometria przepływowa w celu identyfikacji podzbiorów limfocytów w obrębie mysiej aorty, nerek i węzłów chłonnych w modelu nadciśnienia tętniczego

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest uzyskanie zawiesin pojedynczych komórek z aorty, nerek i węzłów chłonnych myszy w celu ilościowego oznaczenia i charakterystyki komórek odpornościowych w modelu nadciśnienia indukowanego angiotensyną II. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu chorób sercowo-naczyniowych, takie jak określenie, które dwie subpopulacje limfocytów sprzyjają rozwojowi nadciśnienia. Główną zaletą tej techniki jest możliwość identyfikacji i kwantyfikacji subpopulacji komórek odpornościowych w narządach litej tkance na poziomie pojedynczych komórek.Przed rozpoczęciem procedury należy zdezynfekować klatkę piersiową myszy 70% etanolem. Następnie za pomocą nożyczek ostrożnie rozciąć skórę i ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić serce. W celu przepłukania naczyń krwionośnych należy wykonać niewielkie nacięcie w prawym przedsionku i jednostajnie wstrzyknąć co najmniej 10 ml zimnego PBS z prędkością około 1 ml/s do wierzchołka lewej komory.Gdy wszystkie organy zostaną odbarwione, należy użyć precyzyjnej pęsety anatomicznej, aby usunąć węzły chłonne drenujące aortę brzuszną, uważając, by nie przerwać torebek. Pod mikroskopem stereoskopowym należy

intracellular-staining-flow-cytometry-to-identify-lymphocyte-subsets

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy artykuł przedstawia metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania składu immunologicznego aorty. W pracy zaprezentowano również dodatkową technikę, która umożliwia oddzielne badanie otaczającej osłonki zewnętrznej oraz ściany naczynia. Metoda ta otwiera możliwości przeprowadzania analiz fenotypowych leukocytów aortalnych oraz zastosowania wielu testów immunologicznych w badaniach nad miażdżycą.

Analiza cytometryczna komórek odpornościowych w aortach mysich

Opisujemy procedury ilościowego określania i charakteryzowania zmian miażdżycowych w modelach mysich, wykorzystując precyzyjne przekroje zatoki aortalnej aorty i aorty wstępującej w połączeniu z analizą histochemiczną i immunohistochemiczną.

Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej

Funkcja komórek naczyniowych zależy od aktywności przekaźników wewnątrzkomórkowych.  Opisana jest metoda obrazowania dwufotonowego ex vivo, która umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia i tlenku azotu w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne w poszczególnych komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty.

Obrazowanie dwufotonowe wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca2+ i produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty szczurzej

Monocyty są ważnymi mediatorami arteriogenezy w kontekście choroby tętnic obwodowych. Wykorzystując macierz przypominającą błonę podstawną i mikroskopię przyżyciową, protokół ten bada naprowadzanie monocytów i angiogenezę związaną z nowotworem po wstrzyknięciu monocytów w mysim modelu podwiązania tętnicy udowej.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Ten manuskrypt opisuje zastosowanie transgenicznych myszy reporterowych i różnych dróg podawania barwników fluorescencyjnych w nadciśnieniu wywołanym angiotensyną II za pomocą przyżyciowej mikroskopii wideo naczyń krwionośnych do oceny aktywacji komórek odpornościowych i ich zdolności do zwijania się i przylegania do śródbłonka.

Wizualizacja wałowania i adhezji leukocytów u myszy z infuzją angiotensyny II: techniki i pułapki

Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.

Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Proponujemy ustandaryzowany protokół do scharakteryzowania składu komórkowego późnych zmian miażdżycowych u myszy, w tym systematyczne metody preparacji zwierząt, osadzania tkanek, cięcia, barwienia i analizy tętnic ramienno-głowowych od myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich w atheroprone.

Analiza ilościowa składu komórkowego w zaawansowanych zmianach miażdżycowych myszy śledzących linię komórek mięśni gładkich

Tutaj opisujemy szczegółowy i powtarzalny protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji podzbiorów monocytów/makrofagów i limfocytów T za pomocą testów barwienia zarówno zewnątrzkomórkowego, jak i wewnątrzkomórkowego w obrębie śledziony myszy, szpiku kostnego, węzłów chłonnych i tkanki maziowej, wykorzystując sprawdzony model chirurgiczny mysiego zapalenia stawów.

Analiza cytometrii przepływowej podzbiorów komórek odpornościowych w mysiej śledzionie, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów

Po infekcji wirusowej, nerka zawiera stosunkowo dużą liczbę limfocytów T CD8+ i daje możliwość badania nieśluzówkowych komórekT RM. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji limfocytów nerkowych myszy do analizy cytometrii przepływowej.

Izolacja mysich limfocytów T CD8 + rezydujących w nerkach do analizy cytometrii przepływowej

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Tutaj prezentujemy zoptymalizowane protokoły oczyszczania tkanek do obrazowania mysiej aorty w trzech wymiarach (3D). Opisujemy najnowocześniejsze procedury barwienia immunologicznego, oczyszczania optycznego i obrazowania z zamiarem określenia anatomicznej bliskości obwodowego układu nerwowego z blaszkami miażdżycowymi i przydanką w miażdżycy.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy

Poznaj metodę barwienia wewnątrzkomórkowego i cytometrii przepływowej do identyfikacji podzbiorów limfocytów T w aorcie, nerkach i węzłach chłonnych myszy w modelu nadciśnienia tętniczego.

Barwienie wewnątrzkomórkowe i cytometria przepływowa w celu identyfikacji podzbiorów limfocytów w obrębie mysiej aorty, nerek i węzłów chłonnych w modelu nadciśnienia tętniczego (Wideo) | JoVE Journal

Barwienie wewnątrzkomórkowe i cytometria przepływowa w celu identyfikacji podzbiorów limfocytów w obrębie mysiej aorty, nerek i węzłów chłonnych w modelu nadciśnienia tętniczego

Przeglądaj więcej filmów