Barwienie wewnątrzkomórkowe i cytometria przepływowa w celu identyfikacji podzbiorów limfocytów w obrębie mysiej aorty, nerek i węzłów chłonnych w modelu nadciśnienia tętniczego

Ogólnym celem tego protokołu jest uzyskanie zawiesin jednokomórkowych z mysiej aorty, nerek i węzłów chłonnych w celu ilościowego określenia i scharakteryzowania komórek odpornościowych w modelu nadciśnienia indukowanego angiotensyną II. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób sercowo-naczyniowych, takie jak to, które dwa podzbiory limfocytów sprzyjają rozwojowi nadciśnienia tętniczego. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia identyfikację i kwantyfikację podzbiorów komórek odpornościowych w narządach litych na poziomie pojedynczej komórki.

Przed rozpoczęciem zabiegu należy zdezynfekować klatkę piersiową myszy 70% etanolem. Następnie użyj nożyczek, aby ostrożnie otworzyć skórę i ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić serce. Aby wykonać perfuzję naczyń krwionośnych, wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku i stopniowo wstrzykuj co najmniej 10 mililitrów zimnego PBS w tempie około jednego mililitra na sekundę do wierzchołka lewej komory.

Gdy wszystkie narządy zbledną, użyj drobno preparowanych kleszczy, aby usunąć węzły chłonne drenujące aortę brzuszną, uważając, aby nie pęknąć torebki. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń dwie nerki cienkimi nożyczkami. Następnie za pomocą cienkich, zakrzywionych nożyczek przeciąć całą aortę piersiową i brzuszną, zaczynając od serca, a kończąc na rozwidleniu biodrowym, uważając, aby otaczający tłuszcz okołonaczyniowy był przyczepiony do aorty.

Następnie przenieś nerki do probówki dysocjacyjnej zawierającej 10 mililitrów roztworu do trawienia nerek i użyj półautomatycznego dysocjatora do mechanicznej dezagregacji tkanki nerkowej zgodnie z instrukcjami producenta. Pod koniec dysocjacji inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciągłej rotacji. Po 20 minutach natychmiast przerwij trawienie enzymatyczne zimną pożywką RPMI 1640 uzupełnioną 5% FBS i przefiltruj powstałą zawiesinę tkankową przez sitko o średnicy 40 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Użyj tłoka z jednomililitrowej strzykawki, aby rozdzielić pozostałą tkankę. Następnie granuluj komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach pożywki o gradiencie gęstości 36% i przenieść komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Delikatnie ułóż trzy mililitry pożywki o gradiencie gęstości 72% pod komórkami, uważając, aby nie naruszyć warstw, i oddziel komórki przez odwirowanie. Komórki odpornościowe będą zlokalizowane na granicy faz. Usuń najwyższą żółtawą warstwę zawierającą zanieczyszczenia komórkowe, a następnie zwiększ objętość do 15 mililitrów za pomocą zimnego PBS.

Dobrze wstrząśnij, aby rozbić gradient, a następnie umyj komórki przez odwirowanie. Aby wyizolować komórki odpornościowe aorty, przenieś aortę do dwumililitrowej rurki zawierającej jeden mililitr świeżo przygotowanego roztworu do trawienia aorty na lodzie i użyj cienkich nożyczek, aby zmielić całą aortę na drobne kawałki. Następnie inkubuj fragmenty w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut ciągłego obrotu.

Pod koniec trawienia dodaj zimny RPMI uzupełniony 5% FBS o pięciokrotnej objętości roztworu trawiącego i przefiltruj powstałą zawiesinę tkanek przez sitko o średnicy 40 mikronów. Następnie zebrać zawiesinę jednokomórkową przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w świeżym RPMI za pomocą FBS. Aby wygenerować zawiesinę jednokomórkową z węzłów chłonnych drenujących aortę, przenieś węzły chłonne na sitko o średnicy 40 mikronów w naczyniu do hodowli tkankowej o wymiarach 60 na 15 milimetrów i użyj jednomililitrowego tłoka strzykawki do dezagregacji tkanki.

Następnie przepłucz sitko dwoma mililitrami RPMI plus FBS i przenieś uwolnione komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Aby stymulować komórki, najpierw dostosuj zawiesinę każdej komórki do stężenia od jednego do 10 do szóstego mililitra komórek w pożywce do hodowli komórkowych. Następnie dodaj dwa mikrolitry koktajlu aktywacji komórek do każdej grupy komórek na każdy mililitr pożywki.

Następnie przenieś od jednego do dwóch razy 10 do szóstych komórek aorty lub nerki na dołek do płytki 12-dołkowej i od jednego do dwóch razy 10 do szóstych komórek węzła chłonnego na studzienkę do płytki 24-dołkowej. Umieść płytki w inkubatorze z nawilżanym dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy godziny. Następnie przenieś komórki do odpowiednich probówek polistyrenowych FACS i zagnieźdź komórki przez odwirowanie.

Po dwukrotnym umyciu komórek świeżym buforem FACS w tych samych warunkach wirówki, zablokuj i niespecyficzne wiązanie powierzchni blokiem FC i umyj komórki w PBS. Ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze świeżego PBS i zabarwić komórki jednym mikrolitrem barwnika żywotności reagującego z aminami przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronionej przed światłem. Pod koniec inkubacji umyj komórki jeszcze dwa razy w jednym do dwóch mililitrów buforu FACS i ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach odpowiedniego koktajlu przeciwciał barwiących powierzchnię komórki.

Po 30 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ochronie przed światłem, umyj komórki jeszcze dwa razy w dwóch mililitrach świeżego buforu FACS, a następnie utrwal i przepuszczaln komórki za pomocą zestawu do utrwalania i przepuszczalności zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie oznacz komórki interesującym Cię wewnątrzkomórkowym koktajlem przeciwciał i ponownie umyj komórki w buforze FACS. W przypadku analizy cytometrycznej przepływu stymulowanej produkcji cytokin wewnątrzkomórkowych, najpierw uruchom niebarwione i pojedynczo barwione probówki kontrolne, aby dostosować się do nakładania się widma, a następnie kontrole fluorescencji minus jeden dla każdego fluoroforu w panelu.

Po ustawieniu podstawowych parametrów analizy fluorescencji należy użyć wykresu obszaru rozproszenia obok siebie, aby ustawić główną bramkę do wykrywania populacji leukocytów, a następnie bramkować, aby wykluczyć martwe komórki zgodnie z ich brakiem ekspresji barwienia żywotnością. Wykreśl przedni obszar punktowy względem przedniej wysokości rozproszenia i bramy, aby wykluczyć dublety. Leukocyty można następnie zidentyfikować na podstawie ich ekspresji CD45.

Aby określić obecność limfocytów T wytwarzających IL-17A lub IL-17F za pomocą mysiej nerki lub aorty, można przygotować zawiesiny jednokomórkowe, jak właśnie wykazano, do analizy kontrolnej fluorescencji minus jeden każdej cytokiny. Zgodnie z oczekiwaniami, bardzo niewiele komórek jest dodatnich dla IL-17A lub IL-17F w kontrolach fluorescencji minus-jeden, co pozwala na dokładne rozróżnienie sygnałów dodatnich i ujemnych w celu prawidłowego dostosowania bramek do identyfikacji komórek dodatnich IL-17A lub IL-17F w próbkach eksperymentalnych. Reprezentatywne barwienie wewnątrzkomórkowe limfocytów T wyizolowanych z nerki i aorty myszy typu dzikiego, którym podawano nośnik lub angiotensynę II, ujawnia obecność podzbioru limfocytów T wykazujących ekspresję IL-17A lub IL-17F w obu tkankach.

Co więcej, wewnątrzkomórkowe barwienie limfocytów T z węzłów chłonnych drenujących aortę pokazuje, że limfocyty T CD8-dodatnie eksprymują interferon gamma i T-bet po stymulacji angiotensyny II. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu sześciu do dziewięciu godzin, w zależności od liczby przetwarzanych tkanek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko i wydajnie, aby zminimalizować śmierć komórki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować zawiesinę jednokomórkową z mysiej nerki, aorty i węzłów chłonnych oraz jak scharakteryzować i określić ilościowo podzbiory komórek odpornościowych z tych narządów. Technika ta pozwala fizjologii układu krążenia i nerek na zbadanie zmian w populacjach komórek odpornościowych, które mogą przyczyniać się do nadciśnienia i innych chorób prozapalnych.