Name: In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek pluripotencjalnych w trofoblastyczne przy użyciu białka BMP4 i inhibitorów szlaków sygnałowych. Ta technika umożliwia efektywną produkcję komórek do badań nad wczesnym rozwojem łożyska.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Pennsylvania Health Research Formula Fund.

UWAGA: W celu różnicowania hESC lub hiPSC w progenitory trofoblastu, hPSC hodowane na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) są przenoszone do warunków wolnych od karmienia przez dwa pasaże przed rozpoczęciem różnicowania za pomocą BMP4/A/P. Proces ten eliminuje zanieczyszczenie MEF zróżnicowanych komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół różnicowania hESC i ten sam protokół można zastosować do hiPSC.
1. Hodowla i odzyskiwanie hESC na napromieniowanych mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) (Przygotowania)
<ol>
	<li>Napromieniowanie promieniowaniem gamma MEF
	<ol>
		<li>Przygotuj 500 ml pożywki do hodowli MEF: DMEM z 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1x penicylina / streptomycyna (Pen / Strep) i 0,1 mM aminokwasów endogennych (NEAA).</li>
		<li>Rozmrozić jedną fiolkę z pierwotnymi MEF-ami i użyć pożywki MEF do hodowli komórek. Rozwiń podstawowe MEF do 30 płytek za pomocą pożywki hodowlanej MEF. 
		UWAGA: Stężenia tlenu nie są krytyczne na tym etapie, więc można wykorzystać warunki fizjologiczne (4%) lub warunki otoczenia (20%) w inkubatorze.</li>
		<li>Zbierz MEFS. Użyj 0,25% trypsyny, aby usunąć MEF z płytek i przenieś komórki do stożkowej probówki. Umieść MEF w instrumencie do napromieniania i wystaw komórki na działanie 3,500 grays. 
		UWAGA: Czas będzie zależał od aktywności źródła wewnątrz promiennika.</li>
		<li>Ponownie zawiesić napromieniowane MEF-y pożywką hodowlaną MEF i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Osadzać MEF-y za pomocą wirówki i dodawać 50% pożywki hodowlanej MEF i 50% pożywki do zamrażania komórek (80% pożywki FBS i 20% pożywki hodowlanej MEF). Podwielokrotność 1 x 106 komórek w fiolce.</li>
		<li>Napromieniowane fiolki MEF należy umieścić na noc w zamrażarce w temperaturze -80 °C, a następnie przenieść je do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrażanie zamrożonych MEF-ów i ludzkich komórek macierzystych do hodowli
	<ol>
		<li>Przygotuj 500 ml pożywki hESC: DMEM / F-12 z 20% zamiennikiem surowicy, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-glutaminy, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-merkaptoetanolu i 1x Pen / Strep.</li>
		<li>Rozmrozić jedną fiolkę MEF na dzień przed rozmrożeniem hESC. Pokryj 6-dołkową płytkę 0,1% żelatyną, używając 1 ml na każdą studzienkę. Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć żelatynę.</li>
		<li>Wyjąć fiolkę z MEF z magazynu w ciekłym azocie i zanurzyć fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Obserwuj fiolkę z przerwami, aż pozostaną tylko małe kryształki lodu. Szybko przenieść zawartość fiolki do 9 ml pożywki MEF w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Osadzać komórki przez odwirowywanie przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce MEF. Równomiernie rozdzielić MEF-y na płytkę 6-dołkową. Umieścić płytkę w inkubatorze o niskiej temperaturze 37 °C i niskiej temperaturze tlenu (4%) na noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rutynowa hodowla komórek macierzystych w obrębie komórek macierzystych na MEF
	<ol>
		<li>Wyjąć fiolkę z hESC z ciekłego azotu i szybko rozmrozić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Delikatnie odpipetować hESC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml pożywki z hESC i odwirowywać w dół przy 200 x g przez 5 minut. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić komórki 1 ml pożywki z hESC.</li>
		<li>Odessać pożywkę MEF z płytki przygotowanej w kroku 1.2.4 i dodać 1 ml pożywki hESC. Dodać inhibitor skał Y-27632 (10 μM) do pożywki hESC. Przenieś hESC do MEF.</li>
		<li>Umieść komórki w inkubatorze o niskiej temperaturze 37 °C i niskiej zawartości tlenu (4%) na noc. Pożywkę z implantem hESC należy wymieniać codziennie. Zeskrob zróżnicowane komórki za pomocą pipety Pasteura, uwidocznionej pod pionowym mikroskopem z 4-krotną prędkością.</li>
		<li>Pasaż komórek macierzystych ESC należy przeprowadzać co 4-6 dni, w zależności od konfluencji komórek i wielkości kolonii komórek macierzystych. Przygotuj talerz MEF-ów na dzień przed pasażem. Gdy komórki są gotowe do przejścia, należy usunąć pożywkę z hESC i przemyć studzienkę 1 ml PBS.</li>
		<li>Dodać 1 mg/ml kolagenazy (wstępnie podgrzanej do 37 °C), inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut i usunąć kolagenazę. Umyj komórki PBS, dodaj 1 ml pożywki hESC do dołka i ręcznie zeskrob komórki w małe grudki za pomocą końcówki pipety o pojemności 5 ml. Przenieść zawieszone grudki komórek do nowej studzienki (studzienek) pokrytej MEF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przejście hESC z MEF do warunków bezobciążeniowych na płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę kondycjonowaną MEF (CM)
	<ol>
		<li>Napromieniowane MEF-y należy umieścić na płytce w kolbie T75 przy 90-100% zbieżności; ważne jest, aby MEF-y były gęsto pokryte. Obserwować komórki za pomocą mikroskopu, aby określić, czy przyczepiły się do dna kolby (MEF-y przyczepiają się około 6 godzin po posiewie lub następnego dnia). 
		UWAGA: Nieprzyłączone komórki unoszą się w pożywce podczas obserwacji pod mikroskopem. Następnego dnia należy usunąć pożywkę MEF i dodać 25 ml pożywki hESC pozbawionej B-FGF.</li>
		<li>Zebrać kondycjonowaną pożywkę po 24 godzinach inkubacji. Wymieniać na świeżą pożywkę codziennie przez maksymalnie 12 dni.</li>
		<li>Przefiltruj pobrany CM za pomocą filtra 0,22 μM. Przed użyciem dodaj świeży B-FGF do CM. 
		UWAGA: CM można zamrażać w temperaturze -80 °C i przechowywać do 1 roku. Alternatywnie, CM można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś hESC z hodowli na MEF do bezkomórkowych płytek pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową.
	<ol>
		<li>Przygotowanie macierzy zewnątrzkomórkowej do powlekania płytek do kultur tkankowych
		<ol>
			<li>Rozmrozić porcję macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie (około 3-4 godzin). Używając lodowatych końcówek, jednej zimnej, stożkowej probówki o pojemności 50 ml i pożywki DMEM/F12, przenieś 2 mg macierzy zewnątrzkomórkowej do 24 ml lodowatego DMEM/F-12 (rozcieńczenie zależy od stężenia w macierzy zewnątrzkomórkowej od dostawcy).</li>
			<li>Natychmiast przenieść stożkową probówkę o pojemności 50 ml do lodu i przechowywać w temperaturze 4 °C. W celu pokrycia płytek do hodowli tkankowych należy dodać odpowiednią ilość rozcieńczonej macierzy zewnątrzkomórkowej do dołka (np. 1 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej). Obracać, aby pokryć płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pasaż hESC z MEF (jak w kroku 1.3) przy użyciu CM zawierającego B-FGF (10 ng/ml).
		<ol>
			<li>Odessać, aby usunąć macierz zewnątrzkomórkową z nowej płytki i dodać CM zawierający B-FGF. Przenieść zeskrobane grudki komórkowe z płytki MEF za pomocą pipety i podzielić je na płytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową. Inkubować przez noc w inkubatorze o niskiej temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Codziennie zastępować CM pożywką B-FGF; ilość pożywki będzie zależeć od wielkości kolby hodowlanej. Użyj 2 ml pożywki na jeden 6-dołkowy dołek. Zeskrob zróżnicowane komórki pipetą Pasteura.</li>
			<li>Pasaż hESC co 6-7 dni, kiedy kolonie są jasne podczas oglądania pod mikroskopem. 
			UWAGA: Kolonie hESC wyhodowane na płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową rosną większe niż komórki hodowane w MEF.</li>
			<li>Gdy komórki wolne od podawania są gotowe do przejścia, usunąć pożywkę, przemyć przez dodanie 1 ml PBS za pomocą pipety, odessać w celu usunięcia PBS, dodać 0,5 mg/ml dypazy (wstępnie podgrzanej do 37 °C) za pomocą pipety i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
			<li>Przemyć komórki PBS, dodając 2 ml PBS na studzienkę, a następnie odsysając. Dodać 1 ml CM do dołka i ręcznie zeskrobać komórki w małe grudki za pomocą końcówki pipety o pojemności 5 ml.</li>
			<li>Umieść zawieszoną komórkę w nowych płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową; komórki powinny przylegać po 24 godzinach.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Różnicowanie komórek macierzystych za pomocą BMP4/A/P
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę różnicującą. Użyj CM (brak B-FGF) i dodaj (świeży) BMP4 (50 ng/ml), A83-01 (1 μM) i PD173074 (0,1 μM). Dodaj te inhibitory do CM przed użyciem.</li>
	<li>Użyj niezależnych od karmów hESC rosnących na płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową przez 1 pasaż, hodowanych w inkubatorze nastawionym na 4% tlenu. Po pierwszym przejściu na płytki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową, pozwól komórkom przyczepić się na 24 godziny. Następnego dnia zainicjuj różnicowanie. Usunąć CM (zawierający B-FGF) i zastąpić go CM zawierającym BMP4/A/P (2 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej). Kontynuuj hodowlę komórek przy użyciu 4% poziomu tlenu.</li>
	<li>Wymieniać CM zawierający BMP4/A/P (2 ml/basenik dla płytki 6-dołkowej) co 2 dni. Zassać, aby usunąć stare podłoże i dodać nowy CM za pomocą pipety. Na drugi dzień po dodaniu BMP4 i usunięciu B-FGF (uważany za dzień różnicowania 2), morfologia komórek zmieni się, wydając się większa, gdy będzie obserwowana pod mikroskopem. 
	UWAGA: Niezróżnicowane komórki, które mają jasne, zaokrąglone krawędzie, nie będą obecne.</li>
	<li>Zbierz komórki w żądanych punktach czasowych. Zróżnicowane komórki przestaną się dzielić po około 2 tygodniach. Komórki transfekcyjne w tym okresie (patrz następna sekcja).</li>
</ol>
4. Transfekcja komórek trofoblastycznych za pomocą siRNA lub plazmidowego DNA
<ol>
	<li>Przygotuj komórki trofoblastyczne do transfekcji
	<ol>
		<li>Hodowla hESC dla dwóch pasaży na macierzy zewnątrzkomórkowej po przeniesieniu ich z MEF (patrz krok 2.2). Należy użyć pożywki hESC zawierającej B-FGF.</li>
		<li>Podziel hESC na nową płytkę macierzy zewnątrzkomórkowej na dzień przed różnicowaniem. Ważna jest wysoka konfluencja komórkowa, więc podziel komórki 1:1 na nową płytkę/studzienkę, która zapewni co najmniej 50% konfluencję następnego dnia. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu. 
		UWAGA: na tym etapie nie trzeba zliczać komórek macierzystych.</li>
		<li>Następnego dnia zastąp pożywkę pożywką różnicującą (CM zawierającą BMP4/A/P i pozbawioną B-FGF, używając 2 ml/dołek na płytkę 6-dołkową). Usunąć starą pożywkę przez aspirację i przenieść nową pożywkę (2 ml) za pomocą pipety. Umieść komórki w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu (4% tlenu) na noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcje z użyciem siRNA do rozerwania genów lub z użyciem plazmidowego DNA
	<ol>
		<li>Różnicuj komórki do pożądanego punktu czasowego (między 1 a 14 dniem). Dzień przed transfekcją trypsynuj komórki za pomocą 0,05% trypsyny przez 5 minut. Płytkować je do pożądanego zbiegu (w zależności od protokołu odczynnika do transfekcji) na płytce pokrytej żelatyną (dodać 0,1% żelatyny do płytki do hodowli tkankowej na 20 minut i aspirować do usunięcia). Dodać CM zawierający BMP4/A/P (bez B-FGF) i inkubować przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia dodaj do komórek świeżą pożywkę różnicującą. Transfekcja siRNA za pomocą odczynnika do transfekcji siRNA. W przypadku plazmidowego DNA należy użyć odpowiedniego odczynnika lipofektaminowego.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem produktu opisanym dla każdego odczynnika do transfekcji. Przenieś kompleksy siRNA-lipofektamina do każdego dołka/płytki komórek, delikatnie wymieszaj i hoduj komórki przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu. 
		UWAGA: Niektóre odczynniki do transfekcji są hamowane przez antybiotyki, które wymagają CM bez Pen/Strep.</li>
		<li>Następnego dnia zastąp je świeżymi pożywkami różnicującymi.</li>
		<li>Zbierz komórki w żądanych punktach czasowych (np. 24 godziny, 48 godzin i 72 godzinach), aby sprawdzić skuteczność rozerwania genów za pomocą ilościowego RT-PCR. Do pobierania komórek należy użyć 0,05% trypsyny, dodając 1 ml na studzienkę i inkubując przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml pożywki MEF na studzienkę, aby zneutralizować trypsynę. Wiruj komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut i użyj osadu komórkowego do izolacji RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Zakażenie patogenem komórek trofoblastycznych: Zakażenie wirusem Sendai
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek macierzystych wątroby (hESC) do różnicowania
	<ol>
		<li>Hodowla hESC dla dwóch pasaży w macierzy zewnątrzkomórkowej po przeniesieniu z MEF (patrz krok 2.2). Należy użyć pożywki hESC zawierającej B-FGF.</li>
		<li>Podziel hESC na nową płytkę macierzy zewnątrzkomórkowej na dzień przed różnicowaniem. Ważna jest wysoka konfluencja komórkowa, więc podziel komórki 1:1 na nową płytkę/studzienkę, która zapewni co najmniej 50% konfluencję następnego dnia. Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu (4% tlenu). 
		UWAGA: na tym etapie nie trzeba zliczać komórek macierzystych.</li>
		<li>Następnego dnia zastąp pożywkę pożywką różnicującą (CM zawierającą BMP4/A/P i pozbawioną B-FGF) i hoduj przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu (4% tlenu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie wirusowe komórek trofoblastycznych Sendai
	<ol>
		<li>Na dzień przed pożądanym dniem różnicowania trypsynuj komórki różnicujące (do pojedynczych komórek) za pomocą 0,05% trypsyny przez 5 minut i przenieś je na płytkę pokrytą żelatyną. Dodać pożywkę różnicującą i inkubować przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu.</li>
		<li>Następnego dnia dodaj pożywkę do infekcji (będzie się to różnić w zależności od wirusa). Użyć CM bez wstrzykiwacza/paciorkowca zawierającego BMP4/A/P, używając 0,5 ml na jeden dołek płytki 6-dołkowej. Dodaj wirusa Sendai dla MOI = 1. Inkubować przez 8 godzin w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu.</li>
		<li>Jeśli konieczne są dodatkowe punkty czasowe, po 4 godzinach usuń pożywkę zawierającą wirusa i zastąp ją BMP4/A/P CM. Zebrać komórki do izolacji RNA za pomocą skrobaka do komórek.</li>
		<li>Określ skuteczność infekcji wirusowej, wykonując qRT-PCR dla genów zaangażowanych w odpowiedź wirusową18.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rugg-Gunn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+features+of+the+mouse+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+biomedicine+online%22%5BJournal%5D)">Epigenetic features of the mouse trophoblast.</a> Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).</li>
<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-four+fertilized+human+ova%2C+good%2C+bad+and+indifferent%2C+recovered+from+210+women+of+known+fertility%3B+a+study+of+biologic+wastage+in+early+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy.</a> Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).</li>
<li>Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v229/n5280/abs/229132a0.html">Human blastocysts grown in culture.</a> Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).</li>
<li>Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+as+a+barrier+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The placenta as a barrier to viral infections.</a> Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).</li>
<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+aspects+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Bilban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+trophoblast+invasion-related+genes%3A+heme+oxygenase-1+controls+motility+via+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP4+initiates+human+embryonic+stem+cell+differentiation+to+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast.</a> Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).</li>
<li>Amita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+and+unidirectional+conversion+of+human+embryonic+stem+cells+to+trophoblast+by+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).</li>
<li>Genbacev, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+trophoblast+progenitor+cell+lines+from+the+chorion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion.</a> Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).</li>
<li>Marchand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+trophoblast+differentiation+in+a+human+embryonic+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model.</a> Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).</li>
<li>Hyslop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+NANOG+induces+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages.</a> Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).</li>
<li>Harun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotrophoblast+stem+cell+lines+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+their+capacity+to+mimic+invasive+implantation+events%5BTitle%5D)+AND+%22Human+reproduction%22%5BJournal%5D)">Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events.</a> Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).</li>
<li>Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP10+as+a+potent+inducer+of+trophoblast+differentiation+in+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+lineage+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2013).</li>
<li>Roberts, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+trophoblast+cells+from+human+embryonic+stem+cells%3A+to+be+or+not+to+be%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?</a> Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).</li>
<li>Sarkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2Fnodal+signaling+switches+the+terminal+fate+of+human+embryonic+stem+cell-derived+trophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Bernardo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRACHYURY+and+CDX2+mediate+BMP-induced+differentiation+of+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells+into+embryonic+and+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages.</a> Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+BMP-4+treatment+initiates+mesoderm+induction+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).</li>
<li>Vallier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+of+human+embryonic+stem+cells+and+mouse+epiblast+stem+cells+are+controlled+by+the+same+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways.</a> PloS one. 4 (6), e6082(2009).</li>
<li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li>
<li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li>
<li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li>
<li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cytotrophoblastic+cell%2C+a+mononuclear+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li>
<li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycosylated+hCG%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leucocyte+antigen+%28HLA%29+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%2C+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiono podstawowe etapy różnicowania hESC w progenitory trofoblastu. Protokół ten został ostatnio zoptymalizowany w celu szybkiego różnicowania hESC poprzez dodanie aktywiny/inhibitorów sygnalizacji węzłowej, zwiększając różnicowanie do komórek trofoblastycznych i unikając generowania progenitorów mezodermy, które są zwykle obserwowane w przypadku samego leczenia BMP4. System modelowy BMP4 pozwala na badanie najwcześniejszych etapów specyfikacji i ekspansji linii trofoblastu człowieka. Ponadto ten system modelowy ...

Łożysko jest niezbędne do wzrostu i przetrwania płodu podczas ciąży i ułatwia wymianę gazów, składników odżywczych, produktów przemiany materii i hormonów między krążeniem matki i płodu. Pierwszym narządem powstającym podczas embriogenezy ssaków jest łożysko, które zaczyna się rozwijać 6-7 dni po zapłodnieniu u ludzi i 3,5-4,5 dnia u myszy1,2,3,4. Komórki trofoblastyczne są najważniejszymi komórkami łożyska, a komórki te reprezentują jedno z najwcześniejszych zdarzeń różnicowania linii zarodka ssaków. Powstają one z zewnętrznych pozazarodkowych komórek trofektodermy blastocysty preimplantacyjnej. Nasza wiedza na temat wczesnych etapów rozwoju łożyska jest ograniczona przez etyczne i logistyczne ograniczenia w modelowaniu wczesnego rozwoju człowieka.
Podczas implantacji embrionalnej, trofoblasty atakują nabłonek matki i różnicują się w wyspecjalizowane komórki progenitorowe5. Cytotrofoblasty (CTB) to jednojądrzaste, niezróżnicowane komórki progenitorowe, które łączą się i różnicują w syncytiotrofoblasty (SYN) i zewnątrzkosmkowe inwazyjne trofoblasty (EVT), które zakotwiczają łożysko w macicy. SYN to wielojądrowe, kończnie zróżnicowane komórki, które syntetyzują hormony niezbędne do utrzymania ciąży. Wczesne zdarzenia różnicowania, które generują EVT i SYN, są niezbędne do tworzenia łożyska, ponieważ upośledzenie komórek trofoblastycznych powoduje poronienie, stan przedrzucawkowy i wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu1. Typy ludzkich linii komórkowych trofoblastu, które zostały opracowane, obejmują unieśmiertelnione CTB i raki kosmówki, które wytwarzają hormony łożyskowe i wykazują właściwości inwazyjne6. Pierwotne komórki trofoblastyczne z ludzkich łożysk w pierwszym trymestrze ciąży można wyizolować, ale komórki szybko różnicują się i przestają się namnażać in vitro. Co ważne, transformowane i pierwotne linie komórkowe mają różne profile ekspresji genów, co wskazuje, że rakotwórcze i unieśmiertelnione linie komórkowe trofoblastów mogą nie reprezentować dokładnie pierwotnych trofoblastów7. Ponadto jest mało prawdopodobne, aby linie te przypominały przodków komórek macierzystych trofoblastu łożyskowego, ponieważ pochodzą z późniejszych etapów od pierwszego do trzeciego trymestru.
Istnieje potrzeba solidnego systemu hodowli in vitro ludzkich trofoblastów we wczesnym stadium w celu zbadania wczesnych etapów powstawania i funkcjonowania łożyska. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC), które mają wspólne właściwości z wewnętrzną masą komórkową zarodka preimplantacyjnego, są często wykorzystywane do modelowania wczesnego rozwoju człowieka, w tym tworzenia wczesnego łożyska. Zarówno ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), jak i hESC mogą być różnicowane w trofoblasty in vitro przy użyciu Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4)8,9,10,11,12,13,14,15. Ta konwersja komórek pluripotencjalnych do komórek trofoblastycznych przy użyciu BMP4 jest specyficzna dla komórek ludzkich i jest szeroko stosowana do badania rozwoju wczesnego ludzkiego łożyska, ponieważ nie wymaga dostępu do wczesnych ludzkich embrionów9,16. Niedawno odkryto, że dodanie inhibitorów A83-01 (A) i PD173074 (P), które blokują szlaki sygnałowe SMAD2/3 i MEK1/2, zwiększa efektywność różnicowania hPSC do progenitorów podobnych do trofektodermy, głównie SYN i EVT, bez ekstensywnego generowania komórek mezodermy, endodermy lub ektodermy9,17. Korzystając z tych warunków pożywki, hESC różnicowane przez 12 dni mają podobne profile ekspresji genów jak komórki trofektodermy wyizolowane z ludzkich zarodków w stadium blastocysty i wydzielają różne hormony wzrostu specyficzne dla łożyska, co potwierdza trafność tego systemu modelowego in vitro9,11. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół różnicowania in vitro hPSC do ludzkich progenitorów trofoblastu przy użyciu pożywki hodowlanej BMP4/A/P. Warunki te wytwarzają obfitą liczbę komórek do szerokiej gamy zastosowań, w tym sekwencjonowania RNA, rozrywania genów za pomocą siRNA, infekcji patogenami i modyfikacji genetycznej za pomocą transfekcji za pośrednictwem lipofekcji.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Wymiana surowicy do nokautu</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>W niniejszym protokole nazywa się to "wymianą surowicy".</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Millipore</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor skał Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>Napromieniowane CF1 MEF</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>MEF mogą być generowane od 13,5 dnia embyos embrionalnego i napromieniane.</td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator niskotlenowy Heracell 150i</td><td>Heracell/VWR</td><td>89187-192</td><td>Wystarczy dowolny inkubator do hodowli tkankowych o zdolności regulacji stężenia tlenu.</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>R& D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>R& D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol służy do izolacji całkowitego RNA.</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>W tym protokole nazywa się to "macierzą zewnątrzkomórkową".</td></tr></tbody></table>

in vitro różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Łożysko jest pierwszym organem, który rozwija się podczas embriogenezy i jest niezbędne do przetrwania rozwijającego się zarodka. Łożysko składa się z różnych komórek trofoblastycznych, które różnicują się od pozazarodkowych komórek trofektodermy blastocysty preimplantacyjnej. W związku z tym nasza wiedza na temat wczesnych zdarzeń różnicowania ludzkiego łożyska jest ograniczona z powodu etycznych i prawnych ograniczeń dotyczących izolacji i manipulacji ludzką embriogenezą. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) są solidnym systemem modelowym do badania rozwoju człowieka i mogą być również różnicowane in vitro w komórki trofoblastyczne, które wyrażają markery różnych typów komórek trofoblastu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół różnicowania hPSC w komórki trofoblastyczne z wykorzystaniem białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków sygnałowych Activina/Nodal. Protokół ten generuje różne typy komórek trofoblastu, które mogą być transfekowane siRNA w celu zbadania fenotypów utraty funkcji lub mogą być zakażone patogenami. Ponadto hPSC mogą być modyfikowane genetycznie, a następnie różnicowane w progenitory trofoblastu w celu przeprowadzenia analiz wzmocnienia funkcji. Ta metoda różnicowania in vitro do generowania ludzkich trofoblastów, począwszy od hPSC, pokonuje etyczne i prawne ograniczenia pracy z wczesnymi ludzkimi embrionami, a system ten może być wykorzystywany do różnych zastosowań, w tym do odkrywania leków i badań nad komórkami macierzystymi.

Przegląd różnicowania hPSCs in vitro
Niniejszy protokół różnicowania in vitro rozpoczyna się od niezróżnicowanych hESC hodowanych na MEF, które są przenoszone do warunków bez fibroblastów w jednym pasażu (Rycina 1A). Chociaż w tym protokole opisano różnicowanie hESC, wykorzystano go również do skutecznego różnicowania hiPSC w komórki trofoblastyczne. Przejście na macierz zewnątrzkomórkową usuwa wi...

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego generowania ludzkich komórek trofoblastycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków aktywinowych/węzłowych. Metoda ta jest odpowiednia do skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i może generować duże ilości komórek do manipulacji genetycznej.

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ludzkie komórki trofoblastyczne przy użyciu białka morfogenetycznego kości 4 oraz inhibitorów aktywnych szlaków sygnałowych aktywniny i nodal w celu zbadania wczesnych etapów formowania się i funkcjonowania ludzkiego łożyska. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji komórek trofoblastycznych oraz sposobu ich powstawania. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania dużej liczby komórek trofoblastycznych do szerokiej gamy zastosowań, w tym w badaniach genetycznych, a także możliwość przeprowadzania analiz funkcji komórkowych.Aby rozpocząć eksperyment, rozmrozić alikwot macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie przez trzy do czterech godzin. Używając lodowatych końcówek, jednej lodowatej probówki stożkowej o pojemności 50 ml oraz pożywki DMEM F12 (Dulbecco's modified equal medium), przenieść 2 mg macierzy zewnątrzkomórkowej do 24 ml lodowatego DMEM F12. Natychmiast przenieść probówkę stożkową 50 ml na lód i przechowywać w temperaturze 4 °C.Aby pokryć płytki do hodowli tkanek, dodaj jeden mililitr rozcieńczonej macierzy zewnątrzkomórkowej do każdej studni płytki sześcio-studzienkowej. Delikatnie zakręć płytką, aby pokryć studnie, a następnie inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę. Odessaj macierz zewnątrzkomórkową z nowej płytki i dodaj pożywkę warunkowaną fibroblastami embrionalnymi myszy (MEFCM) zawierającą bFGF.Za pomocą pipety przenieść zeskrobione kępki komórkowe z płytki z MEF i rozdzielić je na płytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową. Następnie inkubować płytkę. Codziennie usuwać zróżnicowane komórki za pomocą pipety Pasteura przed zastąpieniem MEFCM medium z bFGF, używając dwóch mililitrów medium na jedną studzienkę.Gdy kolonie wydają się duże i jasne pod mikroskopem, należy pasażować hESC co sześć do siedmiu dni. Po przygotowaniu komórek w warunkach bez warstwy pożywkowej do pasażowania, należy usunąć medium i przemyć komórki, dodając za pomocą pipety 1 ml PBS. Następnie należy odessać PBS i zastąpić go za pomocą pipety podgrzaną wcześniej dyspazą o stężeniu 0,5 mg/ml.Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Po inkubacji przemyj komórki PBS, dodając 2 ml PBS na dołek, a następnie odessaj PBS. Dodaj 1 ml CM na dołek i ręcznie zeskrob komórki w małe skupiska, używając końcówki pipety 5 ml.Następnie przenieś zawiesinę skupisk komórkowych na nowe płytki powlekone macierzą zewnątrzkomórkową. Przygotuj podłoże do różnicowania. Użyj CM bez bFGF i dodaj świeże inhibitory przed użyciem.Użyj ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) w hodowli bez komórek karmnych, rosnących na płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, po jednym pasażu w inkubatorze z ustawioną zawartością tlenu 5%oxygen. Po pierwszym pasażu na płytki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową pozostaw komórki do przyczepienia na 24 godziny. Następnego dnia rozpocznij różnicowanie, usuwając pożywkę CM zawierającą bFGF i zastępując ją pożywką CM zawierającą BMP4/A/P w ilości dwóch mililitrów na studzienkę w płytce sześcio-studzienkowej.Kontynuuj hodowlę komórek przy poziomie tlenu 4%. Wymieniaj CM zawierający BMP4/A/P co dwa dni, odsysając stare podłoże i dodając nowe podłoże zawierające BMP4/A/P. Zbierz komórki w wybranych punktach czasowych.Hoduj hESC przez dwa pasaże na macierzy zewnątrzkomórkowej po przeniesieniu ich z MEF przy użyciu medium hESC zawierającego bFGF. Wysoka konfluencja komórek jest istotna, dlatego podziel hESC w stosunku jeden do jednego na nową płytkę, co zapewni co najmniej 50% konfluencji następnego dnia. Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze z niską zawartością tlenu.Następnego dnia należy wymienić pożywkę na 2 mL pożywki różnicującej na każdą studzienkę. Komórki należy inkubować przez noc w inkubatorze z niską zawartością tlenu. Przed transfekcją należy pokryć szalkę żelatyną, dodając do niej 0,1% żelatyny. Obróć naczynie, aby pokryć powierzchnię płytki, a następnie pozostaw ją w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach usuń żelatynę. Prowadź różnicowanie komórek aż do pożądanego punktu czasowego.Dzień przed transfekcją przeprowadź trypsynizację komórek, używając 0,05% trypsyny przez pięć minut. Wysiej komórki na płytkę pokrytą żelatyną, aby uzyskać pożądany stopień konfluencji. Dodaj CM zawierający BMP4/A/P bez bFGF i inkubuj kulturę przez noc.Następnego dnia do komórek należy dodać świeże pożywkę do różnicowania. siRNA należy przetransfekować przy użyciu odczynnika do transfekcji siRNA. W przypadku DNA plazmidowego należy użyć odpowiedniego odczynnika lipofektaminowego.Postępuj zgodnie z protokołem produktu opisanym dla każdego odczynnika do transfekcji. Przenieś kompleksy siRNA-lipofektamina do każdej studni lub płytki z komórkami i delikatnie wymieszaj. Następnie inkubuj komórki przez noc w inkubatorze z niską zawartością tlenu.Następnego dnia wymienić medium na świeże medium różnicujące. Zebrać komórki w wybranych punktach czasowych, aby sprawdzić wydajność przerwania genu za pomocą ilościowej RT-PCR. Na koniec, w celu zebrania komórek, dodać jeden mililitr 0,05% trypsyny na każdą studzienkę i inkubować komórki.Do każdej studni dodaj pięć mililitrów pożywki MEF, aby zneutralizować trypsynę. Wirować komórki przy 200 ×g przez pięć minut, a otrzymany osad komórkowy wykorzystać do izolacji RNA. Zastosowanie tej techniki pozwala na wyraźne zaobserwowanie zmian morfologicznych.Komórki w pierwszym dniu różnicowania są większe niż komórki z dnia zerowego. W miarę postępu różnicowania komórki dzielą się i rozszerzają od centrum kolonii, rosnąc w kierunku zewnętrznym. Poszczególne kolonie zlewają się ze sobą do piątego dnia różnicowania, a komórki narastają jedna na drugiej.Analiza qRT-PCR wykazuje, że względne poziomy ekspresji pluripotentnego markera C, NANOG, uległy obniżeniu o 75% po jednym dniu różnicowania w przypadku hodowli komórek z BMP4 oraz o 90% w obecności BMP4/A/P. W drugim dniu różnicowania poziomy NANOG są bardzo niskie w komórkach hodowanych w samym BMP4 lub w BMP4/A/P w porównaniu do komórek w pożywce hESC CM zawierającej beta FGF. Transfekcje wykonane przy użyciu plazmidu GFP i wprowadzone do komórek traktowanych BMP4/A/P w pierwszym i trzecim dniu różnicowania pozwoliły uzyskać wydajność transfekcji od 30 do 50% w 24 godzinach po transfekcji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak różnicować ludzkie komórki pluripotencjalne w komórki trofoblastyczne in vitro oraz jak wprowadzać konstrukty DNA w celu manipulacji ekspresją genów.

in-vitro-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie prezentujemy izolację blastocyst myszy oraz wyprowadzenie komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst. Opisujemy również warunki utrzymania właściwości macierzystych komórek, a także indukcję ich różnicowania w hodowli.

Wytwarzanie mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst

W niniejszym protokole opisujemy sekcję łożysk myszy w 10,5 dniu ciąży, a następnie izolację komórek trofoblastycznych z wykorzystaniem gradientu Percoll. Następnie demonstrujemy zastosowanie wyizolowanych komórek w teście inwazji na Matrigelu.

Izolacja pierwotnych komórek trofoblastów myszy oraz test inwazji trofoblastów

Tradycyjne, dwuwymiarowe techniki hodowli komórkowej często prowadzą do zmian w charakterystyce markerów różnicowania, cytokin i czynników wzrostu. Trójwymiarowa hodowla komórkowa w rotacyjnym systemie hodowli komórkowej (RCCS) przywraca ekspresję wielu z tych czynników, co zaprezentowano tutaj na przykładzie linii komórkowej trofoblastu pozawillousowego.

Rotacyjne systemy hodowli komórkowych dla hodowli ludzkich komórek: ludzkie komórki trofoblastyczne jako model

Ten manuskrypt przedstawia unikalny model in vitro immunooczyszczanych ludzkich komórek cytopifoblastu kosmkowego hodowanych w warunkach hipoksji/reoksygenacji. Model ten jest odpowiedni do badania ochronnego wpływu obiecujących metod leczenia, takich jak melatonina, na powikłania ciąży związane ze zwiększonym stresem oksydacyjnym i zmienioną funkcją łożyska.

Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Olbrzymie komórki trofoblastu (TGC) odgrywają kluczową rolę w łożysku, zapewniając zdrową ciążę. Przedstawiamy protokół oceny statusu transkrypcyjnego genów w TGC poprzez powstającą fluorescencyjną hybrydyzację in situ na skriostatach zarodków poimplantacyjnych lub krótkoterminowych hodowlach embrionalnych czopków ektołożyskowych dnia 7.

Analiza transkrypcyjna za pomocą powstającego RNA FISH gigantycznych komórek trofoblastu in vivo lub krótkoterminowe hodowle in vitro eksplantatów czopków ektołożyskowych

Tutaj prezentujemy wysoce przystępny protokół oceny ruchu komórek w ludzkich komórkach trofoblastu za pomocą trzech testów in vitro: testu zadrapania, testu inwazji transwell i testu proliferacji komórek.

Testy in vitro w celu oceny migracji, inwazji i proliferacji unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych trofoblastu w pierwszym trymestrze ciąży

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Protokół opisujący tworzenie ludzkich blastoidów, które efektywnie, w odpowiednim czasie i sekwencyjnie generują komórki podobne do blastocyst.

Protokół modelowania rozwoju i implantacji blastocyst u ludzi

Obecny protokół pozwala na odzyskanie struktur przypominających rurki powstałych w klasycznym teście angiogenezy in vitro, gdzie komórki, takie jak komórki trofoblastu, organizują się w struktury podobne do naczyń włosowatych na warstwie zewnątrzkomórkowej macierzy błony podstawnej. Odzyskane struktury są wykorzystywane do izolacji RNA i białek do różnych analiz biochemicznych.

Odzyskiwanie komórek trofoblastu z testu tworzenia rurki angiogenezy do analizy ekspresji markerów różnicowania

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek pluripotencjalnych w trofoblastyczne przy użyciu białka BMP4 i inhibitorów szlaków sygnałowych. Ta technika umożliwia efektywną produkcję komórek do badań nad wczesnym rozwojem łożyska.

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

Przeglądaj więcej filmów