In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

Ogólnym celem tego protokołu jest różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ludzkie komórki trofoblastyczne przy użyciu morfogennej kości 4 oraz inhibitorów aktywnych i węzłowych szlaków sygnałowych w celu zbadania wczesnych zdarzeń powstawania i funkcjonowania ludzkiego łożyska. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu funkcji komórek trofoblastycznych i sposobu ich powstawania. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona wytwarzać liczne komórki trofoblastyczne do szerokiej gamy zastosowań, w tym genetyki, i umożliwia testowanie funkcji komórek.

Aby rozpocząć eksperyment, rozmrażaj porcję macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie przez trzy do czterech godzin. Używając lodowatych końcówek, jednej zimnej 50-mililitrowej rurki stożkowej i zmodyfikowanego równego podłoża Dulbecco lub pożywki DMEM F12, przenieś dwa miligramy macierzy zewnątrzkomórkowej do 24 mililitrów lodowatego DMEM F12. Natychmiast przenieś 50-mililitrową stożkową rurkę do lodu i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby pokryć płytki do hodowli tkankowych, dodaj jeden mililitr rozcieńczonej macierzy zewnątrzkomórkowej na dołek płytki sześciodołkowej. Zakręć płytką, aby pokryć studzienki i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę. Odessać macierz zewnątrzkomórkową z nowej płytki i dodać mysią pożywkę kondycjonowaną fibroblastami embrionalnymi lub MEFCM zawierającą bFGF.

Za pomocą pipety przenieś zeskrobane klamry komórkowe z płytki MEF i podziel je na płytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową. Następnie inkubuj płytkę. Zeskrob zróżnicowane komórki pipetą Pasteura przed zastąpieniem MEFCM pożywką bFGF dziennie, używając dwóch mililitrów pożywki na jedną studzienkę.

Kiedy kolonie wydają się duże i jasne pod mikroskopem, pasażują hESC co sześć do siedmiu dni. Gdy komórki bez podawania są gotowe do przejścia, usuń pożywkę i umyj komórki, dodając jeden mililitr PBS za pomocą pipety. Odessać PBS i zastąpić go 0,5 miligrama na mililitr wstępnie podgrzanej papy za pomocą pipety.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji przemyć komórki PBS, dodając dwa mililitry PBS na studzienkę i odessać PBS. Dodaj jeden mililitr CM na studzienkę i ręcznie zeskrob komórki w małe grudki za pomocą końcówki pięciomililitrowej pipety.

Następnie płytkuj zawieszoną komórkę w nowe płytki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową. Przygotować pożywkę różnicującą. Stosować CM bez bFGF i dodać świeże inhibitory przed użyciem.

Stosować niezależne, niekarmione hESC rosnące na płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową do jednego pasażu, hodowane w inkubatorze nastawionym na 5% tlenu. Po pierwszym przejściu na płytki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową, pozwól komórkom przyczepić się na 24 godziny. Następnego dnia rozpocznij różnicowanie, usuwając CM zawierający bFGF i zastępując go CM zawierającym BMP4/A/P z dwoma mililitrami na studzienkę w płytce sześciodołkowej.

Kontynuuj hodowlę komórek przy użyciu 4% poziomu tlenu. Wymieniaj CM zawierającą BMP4/A/P co dwa dni, odsysając starą pożywkę i dodając nową pożywkę zawierającą BMP4/A/P. Zbierz komórki w żądanych punktach czasowych.

Hodowla hESC dla dwóch pasaży na macierzy zewnątrzkomórkowej po przeniesieniu ich z MEF z pożywką hESC zawierającą bFGF. Ważna jest wysoka konfluencja komórkowa, dlatego należy podzielić hESC jeden do jednego na nową płytkę, która zapewni co najmniej 50% konfluencję następnego dnia. Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu.

Następnego dnia zastąp pożywkę dwoma mililitrami na studzienkę pożywki różnicującej. Umieść komórki w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu na noc. Przed transfekcją żelatyna pokryć naczynie, dodając do potrawy 0,1% żelatyny.

Zakręć naczyniem, aby pokryć talerz, a następnie pozostaw talerz w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach usuń żelatynę. Różnicuj komórki aż do żądanego punktu czasowego.

Dzień przed transfekcją trypsynizuj komórki za pomocą 0,05% trypsyny przez pięć minut. Umieść komórki do pożądanego zbiegu na płytce pokrytej żelatyną. Dodać CM zawierający BMP4/A/P pozbawiony bFGF i inkubować kulturę przez noc.

Następnego dnia dodaj do komórek świeżą pożywkę różnicującą. Transfekcja siRNA za pomocą odczynnika do transfekcji siRNA. W przypadku DNA osocza należy użyć odpowiedniego odczynnika lipofektaminowego.

Postępuj zgodnie z protokołem produktu opisanym dla każdego odczynnika do transfekcji. Przenieś kompleksy lipofektamaminy siRNA do każdej studzienki lub płytki komórek i delikatnie wymieszaj. Następnie hoduj komórki przez noc w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu.

Następnego dnia zastąp pożywkę nową pożywką różnicującą. Zbierz komórki w żądanych punktach czasowych, aby sprawdzić skuteczność rozerwania genów za pomocą ilościowego RT-PCR. Na koniec, aby zebrać komórki, dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny na dołek i inkubuj komórki.

Dodaj pięć mililitrów pożywki MEF na studzienkę, aby zneutralizować trypsynę. Wiruj komórki z prędkością 200 razy g przez pięć minut i użyj osadu komórkowego do izolacji RNA. Dzięki tej technice zmiany morfologiczne są wyraźnie widoczne.

Komórki w pierwszym dniu różnicowania są większe niż komórki z dnia zero. W miarę różnicowania komórki dzielą się i rozszerzają od środka kolonii, rosnąc w kierunku zewnętrznym. Poszczególne kolonie łączą się ze sobą przez różnicowanie w piątym dniu, a komórki rosną jedna na drugiej.

Analiza QRT-PCR ujawnia, że względne poziomy ekspresji pluripotencjalnego markera C NANOG są zmniejszone o 75% po jednym dniu różnicowania, gdy komórki są hodowane z BMP4 i zmniejszone o 90% w obecności BMP4 / A / P. W drugim dniu różnicowania poziomy NANOG są bardzo niskie dla komórek hodowanych w samym BMP4 lub w BMP4/A/P w porównaniu z tymi w pożywce hESC CM zawierającej beta FGF. Transfekcje wykonane przy użyciu plazmidu GFP i wprowadzone do komórek traktowanych BMP4/A/P w pierwszym i trzecim dniu różnicowania uzyskały od 30 do 50% skuteczności transfekcji w ciągu 24 godzin po transfekcji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak różnicować ludzkie komórki pluripotencjalne w komórki trofoblastyczne in vitro i jak wprowadzić konstrukty DNA do manipulowania ekspresją genów.