Name: Analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem MARCM w bliźniaczej plamce (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Poznaj protokół twin-spot MARCM do analizy linii komórkowych i badań funkcji genów w neuronach. Technika ta umożliwia śledzenie rozwoju neuronów z oznaczeniem dwoma kolorami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST 104-2311-B-001-034) oraz Instytut Biologii Komórkowej i Organizmów, Academia Sinica, Tajwan.

1. Zbuduj muchy gotowe do tsMARCM przy użyciu wymaganych Transgenes11,13
<ol>
	<li>Wygeneruj oryginalną wersję much gotowych do tsMARCM z transgenów, które są przenoszone przez poszczególne muchy11 (patrz Tabela 1). Przeprowadź standardowe schematy krzyżowania genetycznego much, które zostały opisane wcześniej, umieszczając wiele transgenów w tym samym stadzie much13.
	<ol>
		<li>W jednej linii rodzicielskiej złóż transgeny FRT40A, UAS-mCD8::GFP (pierwszy reporter, mCD8::GFP; ekspresja transgenu jest pod kontrolą promotora sekwencji aktywacji w górę, który wytwarza uwięziony błoną reporter mysiego klastra białka różnicowania 8 połączonego z białkiem zielonej fluorescencji) i UAS-rCD2RNAi (supresor, który hamuje ekspresję drugiego reportera; RNAi przeciwko ekspresji szczurzego klastra różnicowania 2, rcd2) na lewym ramieniudrugiego chromosomu. Jeśli to możliwe, umieść specyficzny tkankowo sterownik GAL4 na chromosomie X lub 3.</li>
		<li>W drugiej linii rodzicielskiej złóż transgeny FRT40A, UAS-rCD2::RFP (drugi reporter, rCD2::RFP; drugi reporter na uwięzi błonowej składający się z białka rCD2 połączonego z białkiem czerwonej fluorescencji) i UAS-GFPRNAi (supresor, który hamuje ekspresję mCD8::GFP; RNAi przeciwko ekspresji gfp) na lewym ramieniu drugiego chromosomu. Jeśli to możliwe, umieść FLP szoku cieplnego (hs)-FLP lub FLP specyficznego dla tkanki na chromosomie X lub 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj nową wersję much gotowych do tsMARCM z transgenów, które są przenoszone przez poszczególne muchy14 (patrz Tabela 1). Przeprowadź standardowe schematy krzyżowania genetycznego much, które zostały opisane wcześniej, umieszczając wiele transgenów w tym samym stadzie much13.
	<ol>
		<li>W jednej linii rodzicielskiej zbierz transgeny miejsca FRT i UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (połączony transgen mCD8::GFP i supresora, który hamuje ekspresję rCD2::RFP) razem w tym samym ramieniu 2. lub 3. chromosomu (odpowiednie pary transgenów FRT i UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i przedstawiono w Tabeli 1). Jeśli to możliwe, umieścić swoisty tkankowo sterownik GAL4 na chromosomach innych niż chromosom wybranego miejsca FRT.</li>
		<li>W drugiej linii rodzicielskiej zbierz transgeny miejsca FRT i UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (drugi połączony transgen rCD2::RFP i supresor, który hamuje ekspresję mCD8::GFP) w tym samym ramieniu 2. lub 3. chromosomu (odpowiednie pary transgenów FRT i UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi są wskazane w Tabeli 1). Jeśli to możliwe, umieść hs-FLP lub swoisty tkankowo FLP na chromosomach innych niż chromosom wybranego miejsca FRT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Muchy gotowe do krzyżowania tsMARCM w celu wygenerowania klonów tsMARCM w swoim potomstwie
<ol>
	<li>Skrzyżuj ze sobą muchy gotowe do użycia w tsMARCM (np. umieść razem 10-15 samców much z kroku 1.1.1 lub 1.2.1 i 20-30 dziewiczych samic much z kroku 1.1.2 lub 1.2.2) w fiolce z pokarmem dla much ze świeżo wygotowaną pastą drożdżową na ściance fiolki.</li>
	<li>Trzymaj skrzyżowane muchy gotowe do tsMARCM w temperaturze 25 °C przez 2 dni, aby zwiększyć szansę na krycie przed zebraniem zapłodnionych jaj.</li>
	<li>Często przenoś skrzyżowane muchy gotowe do tsMARCM do świeżo drożdżowych fiolek, aby uniknąć stłoczenia (opukaj muchy lub użyj dwutlenku węgla do znieczulenia much, aby ułatwić przenoszenie; trzymaj nie więcej niż 80-100 zapłodnionych jaj w fiolce z pokarmem dla much o pojemności 10 ml, aby uniknąć zbyt wielu wyklutych larw).</li>
	<li>Hodowla zwierząt tsMARCM (tj. zapłodnione jaja; przykładem genotypu zwierząt tsMARCM, użytego na rysunku 3, jest hs-FLP[22],w/w; UAS-mCD8::GFP,UAS-rCD2RNAi,FRT 40A,GAL4-GH146/UAS-rCD2::RFP,UAS-GFPRNAi,FRT40A; +; +), które zostały złożone w seryjnie przenoszonych fiolkach w temperaturze 25 °C do momentu osiągnięcia pożądanych etapów (np. zarodki, larwy lub poczwarki).</li>
	<li>Umieścić przeniesione fiolki zawierające zwierzęta tsMARCM w tym samym stadium rozwoju w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10, 20, 30, 40 i 50 minut, aby określić optymalny czas szoku cieplnego, który indukuje ekspresję FLP w celu wytworzenia interesujących klonów tsMARCM. Pomiń ten krok, jeśli w eksperymencie tsMARCM używany jest FLP specyficzny dla tkanek (hs-FLP jest preferowany do analiz linii neuronalnej; powody tej preferencji zostały opisane wcześniej15). 
	UWAGA: Powtórz krok 2.5, używając optymalnego czasu szoku cieplnego w przyszłych eksperymentach tsMARCM, jeśli chcesz uzyskać więcej interesujących klonów tsMARCM; ogólnie rzecz biorąc, w hs-FLP indukowana jest większa ekspresja FLP [22] w porównaniu z hs-FLP [1] przy tym samym czasie szoku cieplnego.</li>
	<li>Hodować zwierzęta z wytrząsanym przegrzaniem w temperaturze 25 °C, aż osiągną odpowiednie stadium rozwoju, a następnie przejść do etapu 3.</li>
</ol>
3. Przygotuj, zabarwij i zamontuj mózgi much zawierające klony tsMARCM
<ol>
	<li>Przygotuj naczynia chroniące przed kleszczami. Wymieszaj część A (30 g) i część B (3 g) zestawu elastomerów silikonowych z węglem aktywnym (0,25 g). Wlej mieszaninę do odpowiednich naczyń.</li>
	<li>Wypreparuj larwy, poczwarki lub dorosłe mózgi zwierząt tsMARCM w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą kleszczy na naczyniu ochronnym przed kleszczami, oglądanym przez mikroskop preparacyjny. UWAGA: Protokół sekcji mózgu muchy został opisany wcześniej16.</li>
	<li>Umieść mózgi much w szklanej płytce punktowej z 1x PBS zawierającym 4% formaldehydu w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Przetwarzaj mózgi much na tej szklanej płytce punktowej przez resztę kroków.</li>
	<li>Opłucz mózgi muchy trzykrotnie 1% PBT (1x PBS zawiera 1% Triton X-100) i umyj je trzy razy przez 30 minut każdy w 1% PBT (spłucz: usuń PBT i szybko dodaj nowy PBT; przemyj: usuń PBT, dodaj nowy PBT i inkubuj mózgi much w nowym PBT za pomocą wytrząsarki orbitalnej).</li>
	<li>Inkubować mózgi muszek z mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Przykładem mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych jest szczurze przeciwciało anty-CD8 (1:100), przeciwciało królika anty-DsRed (1:800) i mysie przeciwciało anty-Bruchpilot (Brp) (1:50) w 1% PBT zawierającym 5% normalnej surowicy koziej (NGS).</li>
	<li>Opłucz mózgi muchy trzykrotnie 1% PBT, a następnie umyj je trzy razy przez 30 minut każdy z 1% PBT.</li>
	<li>Mózgi much inkubować z mieszaniną przeciwciał drugorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Przykładem mieszaniny przeciwciał drugorzędowych jest kozie przeciwciało anty-szczurze IgG sprzężone z barwnikiem zielonofluorescencyjnym (1:800), kozie przeciwciało anty-królicze IgG sprzężone z barwnikiem żółtej fluorescencji (1:800) i kozie przeciwciało anty-mysie IgG sprzężone z barwnikiem dalekiej czerwonej fluorescencji (1:800) w 1% PBT zawierającym 5% NGS.</li>
	<li>Opłucz mózgi muchy trzykrotnie 1% PBT, a następnie umyj je trzy razy przez 30 minut każdy z 1% PBT. Zamontuj je na mikro szkiełku z odczynnikiem antyhartowniczym. Umieść mikro szkło nakrywkowe na mikro szkiełku, aby zakryć i chronić mózg muchy. Uszczelnij krawędzie mikro szkła nakrywkowego i mikroszkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci. Zmontowane i zapieczętowane próbki mózgu muchy należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Rób, przetwarzaj i analizuj obrazy fluorescencyjne klonów tsMARCM
<ol>
	<li>Uchwyć obrazy fluorescencyjne klonów tsMARCM z próbek utworzonych w kroku 3.8 za pomocą wybranego systemu mikroskopii konfokalnej.</li>
	<li>Projektuj stosy konfokalnych obrazów fluorescencyjnych tsMARCM w dwuwymiarowe, spłaszczone obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu dostarczonego z wybranym systemem mikroskopii konfokalnej (patrz rysunek 3B-3E, 3G-3J, 3L-3O i 3Q-3T dla przykładów spłaszczonych konfokalnych obrazów fluorescencyjnych).</li>
	<li>Policz liczbę komórek po stronie wielokomórkowej NB klonów tsMARCM za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu (np. funkcji "Cell Counter" w ImageJ17; patrz Rysunek 3E, 3J, 3O i 3T dla przykładów ciał komórkowych neuronów).</li>
</ol>

<ol><li>Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+neural+projections+reveals+clonal+composition+of+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).</li>
<li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+development+and+organization+of+the+adult+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).</li>
<li>Goodman, C. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodman%2C+CS+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li>
<li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+requirement+of+the+USP%2FEcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li>
<li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).</li>
<li>Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+neuron+prespecification+in+the+olfactory+map+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila.</a> Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).</li>
<li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+the+Drosophila+Chinmo+BTB-zinc+finger+protein+govern+neuronal+temporal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity.</a> Cell. 127 (2), 409-422 (2006).</li>
<li>Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin-spot+MARCM+to+reveal+the+developmental+origin+and+identity+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).</li>
<li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+developmental+sequence+of+a+Drosophila+neuronal+lineage+as+revealed+by+twin-spot+MARCM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM.</a> PLoS Biol. 8 (8), (2010).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing+%3A+the+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Awasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+Drosophila+lineage-restricted+drivers+via+patterned+recombination+in+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts.</a> Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).</li>
<li>Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mosaics+for+lineage+analysis+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generating mosaics for lineage analysis in flies.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+Drosophila+lateral+antennal+lobe+neurons+reveals+notch-dependent+binary+temporal+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions.</a> PLoS Biol. 10 (11), e1001425(2012).</li>
<li>Zhan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Dscam+diversity+in+regulating+axon+guidance+in+Drosophila+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).</li>
<li>Griffin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+twin+spot+generator+for+differential+Drosophila+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis.</a> Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deployment+of+factors+regulating+temporal+fate+in+a+diverse+neuronal+lineage+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain.</a> Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kluczowe kroki w ramach protokołu
Kroki 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 i 3.2 mają kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrych wyników tsMARCM. Specyficzne tkankowo sterowniki GAL4 , które nie wyrażają GAL4 w neuronalnych komórkach progenitorowych, są preferowane w krokach 1.1.1 i 1.2.1. Unikaj nadmiernego stłoczenia zwierząt hodowanych w fiolkach z pokarmem dla much w kroku 2.3. Ponieważ opóźnienie indukcji, poziom ekspresji FLP po szoku cieplnym i średni czas podziału neuronalnych komórek progenit...

Mózg, składający się z ogromnej liczby różnorodnych typów neuronów, wyposaża zwierzęta w zdolność postrzegania, przetwarzania i reagowania na wyzwania ze świata zewnętrznego. Neurony dorosłego Drosophila centralnego mózgu pochodzą z ograniczonej liczby nerwowych komórek macierzystych, zwanych neuroblastami (NB), podczas rozwoju1,2. Większość NB biorących udział w neurogenezie mózgu u Drosophila przechodzi asymetryczny podział w celu wytworzenia samoodnawiających się NB i komórek macierzystych zwojów (GMC), a GMC przechodzą następnie przez kolejną rundę podziału, aby wytworzyć dwie komórki potomne, które różnicują się w neurony3 (Figura 1A). Ze względu na złożoność morfologii neuronów i wyzwania związane z identyfikacją konkretnych neuronów, wynaleziono technologię pozytywnego znakowania mozaiki, analizę mozaiki z represyjnym markerem komórkowym (MARCM), aby umożliwić wizualizację pojedynczego neuronu lub małego podzbioru neuronów z populacji otaczających, nieoznakowanych neuronów4.
MARCM wykorzystuje system rozpoznawania flippazy (FLP)/celu rozpoznawania FLP (FRT) do pośredniczenia w specyficznej dla miejsca rekombinacji między homologicznymi chromosomami w obrębie dzielącej się komórki prekursorowej niosącej heterozygotyczny allel genu represorowego, którego ekspresja normalnie hamuje ekspresję genu reporterowego4. Po podziale mitotycznym rekombinowane chromosomy są segregowane na bliźniacze komórki, tak że jedna komórka zawiera homozygotyczne allele genu represorowego, a druga komórka nie ma genu represorowego - ekspresja reportera w tej komórce (i jej potomkach) nie jest już zablokowana4. W eksperymencie MARCM zwykle znajdują się trzy wzorce klonalne, gdy FLP jest indukowany stochastycznie w NB lub GMC: klony jednokomórkowe i dwukomórkowe GMC, które przedstawiają morfologię neuronów w rozdzielczości pojedynczej komórki, oraz wielokomórkowe klony NB, które ujawniają całe wzorce morfologiczne neuronów pochodzących ze wspólnego NB (Figura 1B). Technika MARCM jest szeroko stosowana w badaniach neurobiologicznych Drosophila, w tym w identyfikacji typów neuronów w celu rekonstrukcji sieci przewodowych w całym mózgu, analizach linii neuronalnych w celu ujawnienia historii rozwoju neuronów, charakterystyce fenotypowej funkcji genów zaangażowanych w specyfikację losu komórki oraz badaniach morfogenezy i różnicowania neuronów5,6,7,8,9,10. Ponieważ konwencjonalny MARCM znakuje tylko jedną z dwóch komórek potomnych (i linii) po indukowanym zdarzeniu rekombinacji mitotycznej, potencjalnie użyteczne informacje ze strony nieoznaczonej są tracone. To ograniczenie wyklucza zastosowanie podstawowego systemu MARCM do wysokorozdzielczych analiz wielu linii neuronalnych, które zmieniają losy komórek w szybkim tempie lub do precyzyjnych analiz funkcji genów w identycznych neuronach różnych zwierząt11,12.
Twin-spot MARCM (tsMARCM) to zaawansowany system, który oznacza neurony pochodzące od wspólnego przodka dwoma różnymi kolorami, co umożliwia odzyskanie użytecznych informacji z obu stron bliźniaczych komórek, pokonując w ten sposób ograniczenia oryginalnego systemu MARCM11 (Rysunek 2A-2C). W systemie tsMARCM dwa supresory oparte na interferencji RNA (RNAi) znajdują się w miejscach trans chromosomów homologicznych w komórce prekursorowej, a ekspresja tych supresorów niezależnie hamuje ekspresję ich odpowiednich reporterów (Figura 2B). Po specyficznej dla miejsca rekombinacji mitotycznej za pośrednictwem systemu FLP / FRT, dwa supresory oparte na RNAi ulegają segregacji w komórkach bliźniaczych, aby umożliwić ekspresję odrębnych reporterów (Figura 2B). Dwa wzorce klonalne, pojedyncza komórka związana z klonami pojedynczych komórek i dwukomórkowa GMC związana z wielokomórkowymi klonami NB, są zwykle obserwowane w eksperymencie tsMARCM (Figura 2C). Informacje pochodzące z jednej strony bliźniaczych komórek mogą być wykorzystane jako odniesienie dla drugiej strony, umożliwiając analizy linii neuronalnej o wysokiej rozdzielczości, takie jak datowanie urodzeń znakowanych neuronów oraz analizy fenotypowe identycznych neuronów u różnych zwierząt w celu dokładnego zbadania funkcji genów neuronalnych11,12. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku protokół opisujący, jak przeprowadzić eksperyment tsMARCM, który może być wykorzystany przez inne laboratoria do poszerzenia swoich badań nad rozwojem neuronalnym (a także rozwojem innych tkanek, jeśli dotyczy) u Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Dwutlenek węgla (CO2)</td><td>Lokalny sprzedawca</td><td>nie dotyczy.Znieczulenie</td> <td>muchy</td></tr><tr><td>CO2 Lokalny</td><td>sprzedawca</td><td>nie dotyczy.Sortowanie</td><td>, krzyżowanie i przenoszenie much</td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Uniregion Bio-Tech (lub inni dostawcy)</td><td>PBS001</td><td>Preparacja, płukanie, mycie i barwienie immunologiczne mózgów muchy</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Napraw mózgi much</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Płukanie, mycie i barwienie immunologiczne mózgów much</td></tr><tr><td>Normalna koza</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>005-000-121</td><td>Surowica mózgów muchy immunostainowej</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciw myszom CD8</td><td>Invitrogen</td><td>MCD0800</td><td>Immunostainowe mózgi much</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-DsRed</td><td>Clonetech</td><td>632496</td><td>Immunostainowe mózgi muchy</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-Brp</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Immunostain Mózgi much</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG sprzężone z Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Immunostainowe mózgi muchy</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG skoniugowane z Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Immunostainowe mózgi muchy</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG sprzężone z Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Immunostainowe mózgi muchy</td></tr><tr><td>Odczynnik przeciw blaknięciu złota SlowFade</td><td>Sondy molekularne</td><td>S36936</td><td>Zamontuj mózgi much i chroń wygaszanie fluorescencji&nbsp;</td></tr><tr><td>PYREX 9 szklana płyta depresyjna</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>Preparowanie, płukanie, mycie i barwienie immunologiczne mózgów much</td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Zrób czarne naczynia Sylgard, aby chronić kleszcze podczas sekcji mózgu</td></tr><tr><td>Węgiel aktywny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-250G</td><td>Zrób czarne naczynia Sylgard</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Fine Science Narzędzia</td><td>11252-30</td><td>Wypreparuj i zamontuj mózgi much</td></tr><tr><td>Mikro zjeżdżalnia</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td>Zamontuj mózgi much Mikro</td></tr><tr><td>szkło osłonowe nr 1.5</td><td>VWR International</td><td>48366-205</td><td>Zamontuj móżdżki much</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Lokalny sprzedawca</td><td>niedostępny</td><td>Uszczelnij mikro szkło nakrywkowe na mikroszkiełkach</td></tr><tr><td>Inkubator&nbsp;</td><td>Kultura Kansin Instruments</td><td>LTI603</td><td>leci w temperaturze 25 & stopni; C</td></tr> <tr><td>(lub inni sprzedawcy)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Kansin Instruments</td><td>WB212-B2</td><td>Wywołaj szok cieplny u much w temperaturze 37 & stopni; C</td></tr> <tr><td>(lub inni dostawcy)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Kansin Instruments</td><td>OS701</td><td>Mycie i barwienie immunologiczne mózgów much(</td></tr><tr><td>lub innych dostawców)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>EZ4</td><td>Sortuj, krzyżuj i przenoś muchy; Preparować, płukać, myć i barwieć immunologicznie mózgi much</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss (lub inni dostawcy</td><td>)LSM 700 (lub inne modele)</td><td>Obraz tsMARCM klonuje</td></tr><tr><td>oprogramowanie do przetwarzania obrazu 1 (np. , przeglądarka obrazów Zeiss LSM)&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>niedostępny</td><td>Stosy projektów obrazów konfokalnych</td></tr><tr><td>oprogramowanie do przetwarzania obrazów 2 (np. , ImageJ)&nbsp;</td><td>niedostępne niedostępne</td><td></td><td>Policz liczbę komórek klonów tsMARCM</td></tr></tbody></table>

analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem marcm w bliźniaczej plamce

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Mosaic a nalysis with a repressible cell marker (MARCM) to system pozytywnego etykietowania mozaikowego, który jest szeroko stosowany w badaniach neurobiologicznych Drosophila do przedstawiania skomplikowanych morfologii i manipulowania funkcją genów w podzbiorach neuronów w organizmach inaczej nieoznaczonych i niezaburzonych. Mozaiki genetyczne generowane w systemie MARCM są mediowane przez specyficzną dla miejsca rekombinację między homologicznymi chromosomami w dzielących się komórkach prekursorowych w celu wytworzenia zarówno oznaczonych (klony MARCM), jak i nieoznaczonych komórek potomnych podczas mitozy. Rozszerzenie metody MARCM, zwane twin-spot MARCM (tsMARCM), oznacza obie bliźniacze komórki pochodzące od wspólnego przodka dwoma różnymi kolorami. Technika ta została opracowana, aby umożliwić uzyskanie użytecznych informacji z obu półlinii. Dzięki kompleksowej analizie różnych par klonów tsMARCM, system tsMARCM umożliwia mapowanie linii neuronowych w wysokiej rozdzielczości, aby ujawnić dokładną kolejność narodzin znakowanych neuronów wytworzonych ze wspólnych komórek progenitorowych. Co więcej, system tsMARCM rozszerza również badania nad funkcjami genów, umożliwiając analizę fenotypową identycznych neuronów różnych zwierząt. W tym miejscu opisujemy, jak zastosować system tsMARCM, aby ułatwić badania nad rozwojem neuronalnym u Drosophila.

System tsMARCM jest wykorzystywany do ułatwienia analiz linii neuralnych oraz badań nad funkcjami genów poprzez odzyskiwanie istotnych informacji o neuronach pochodzących ze wspólnych neuroblastów (NB). System ten posłużył do zidentyfikowania większości (jeśli nie wszystkich) typów neuronów, określenia liczby komórek każdego typu neuronalnego oraz ustalenia kolejności powstawania tych neuronów11,12,18<...

Tutaj prezentujemy protokół techniki etykietowania mozaiki, który pozwala na wizualizację neuronów pochodzących ze wspólnej komórki progenitorowej w dwóch różnych kolorach. Ułatwia to analizę linii neuronalnej z możliwością datowania pojedynczych neuronów na narodziny i badania funkcji genów w tych samych neuronach różnych osób.

Analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem MARCM w bliźniaczej plamce

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu twin-spot MARCM jest przeprowadzenie analiz linii komórkowych o wysokiej rozdzielczości oraz dokładniejszych badań nad funkcjami genów. Tkanka mózgowa składa się z ogromnej liczby zróżnicowanych neuronów, co utrudnia badanie mechanizmów leżących u podstaw sposobu, w jaki neurony łączą się ze sobą podczas rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest możliwość znakowania neuronów pochodzących od wspólnych progenitorów neuronalnych za pomocą dwóch różnych kolorów.Umożliwiają one odzyskanie informacji o czasie powstania poszczególnych neuronów. Dzięki temu technika ta może pomóc badaczom w zgłębianiu komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. Procedurę zaprezentuje dziś Pei-Chi Chung.Technik z laboratorium profesora Yu. Rozpocznij od połączenia gotowych do twin-spot MARCM samców i samic w fiolce z pożywką dla muszek z dodatkiem świeżych drożdży. Utrzymuj skrzyżowane muchy gotowe do twin-spot MARCM w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwa dni, aby zwiększyć szansę na kopulację przed zebraniem zapłodnionych jaj.Aby uniknąć przeludnienia po wykluciu się larw, przybij skrzyżowane muchy przygotowane do analizy twin-spot MARCM i przenieś je do nowych probówek z pożywką drożdżową. Hoduj potomstwo twin-spot MARCM, aż osiągną one pożądany stopień rozwoju. W tym przypadku muchy w stadium larwalnym zostaną poddane szokowi termicznemu w celu indukcji ekspresji flippazy.Przenieś fiolki z muchami do kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 10, 20, 30, 40 i 50 minut, aby określić optymalny szok termiczny dla ekspresji flippazy. Pozwoli to na wygenerowanie interesujących klonów twin-spot MARCM. Czas rozpoczęcia szoku termicznego determinuje etap generacji oczyszczania, natomiast czas trwania szoku termicznego określa liczbę wygenerowanych oczyszczeń.Hodować zwierzęta MARCM z podwójnymi plamkami (twin-spot) po szoku termicznym w temperaturze 25°C aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwojowego. Następnie przystąpić do barwienia i montowania. Do naczyń ochronnych na pęsety dodać PBS.Następnie przenieś zwierzęta MARCM z podwójnymi plamkami (twin-spot) do szalek. Korzystając z mikroskopu sekcyjnego, wypreparuj pęsetą mózgi z zwierząt MARCM z podwójnymi plamkami. Najpierw oddziel głowę od ciała muchy.Następnie delikatnie usuń kutykulę, uważając, aby nie uszkodzić mózgu. Potem ostrożnie usuń tchawki, które wyglądają jak białe włókna. Przenieś mózgi na szklaną płytkę z wgłębnikami zawierającą 4% formaldehyde oraz PBS.Następnie utrwalić w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Rozpocząć procedurę barwienia, płukąc mózgi much trzykrotnie w 1% PBT. Następnie przemyć 1% PBT trzykrotnie.Każdorazowo przy potrząsaniu przez 30 minut. Inkubować mózgi much z mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Płukać i myć mózgi much trzykrotnie w 1%PBT, przy potrząsaniu jak wcześniej.Następnie inkubować mózgi much w mieszaninie przeciwciał wtórnych przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Po wypłukaniu i przemyciu mózgów w sposób opisany wcześniej, zamontować je na szkiełku mikroskopowym z użyciem odczynnika zapobiegającego wygasaniu sygnału (anti-quenching). Następnie nałożyć szkiełko nakrywkowe, aby przykryć i zabezpieczyć mózgi much.Krawędzie mikropokrywka i mikropreparatu należy uszczelnić bezbarwnym lakierem do paznokci. Na koniec, przy użyciu wybranego systemu mikroskopii konfokalnej, należy wykonać obrazy fluorescencyjne klonów twin-spot MARCM z próbek. Rysunek ten przedstawia wyniki dla klonu twin-spot MARCM, czyli neuronów projekcyjnych węcha VL2p z części przednio-grzbietowej, powstałych w wyniku indukcji flippazy.Aby pośredniczyć w rekombinacji mitotycznej w neuroblastach adPN na etapie embrionalnym. Ten pierwszy schemat przedstawia wzorzec neurogenezy. Na tym obrazie mózgu wykonanym za pomocą mikroskopu konfokalnego, adPN VL2p są pokazane na zielono i są powiązane z wielokomórkowymi neuroblastami adPN zaznaczonymi na magentowo.Na tym obrazie widoczne są komórki w rogu bocznym. Przedstawiono tutaj morfologię neuronalną płata czułkowego. Obraz ten pokazuje dane dla DL1 adPNs.Jak widać tutaj, adPN DL1 pojawiają się w rozwoju później niż adPN VL2p. Indukcja klonów twin-spot MARCM w przypadku adPN DC3 wykazuje, że ten typ neuronów pojawia się później w rozwoju. Obraz ten pokazuje, że zdarzenie twin-spot MARCM zachodzi w neuronie GAL4-ujemnym w obrębie linii adPN.Po opanowaniu technika ta może pomóc badaczom w analizie linii neuronalnych i dostarczyć różnych markerów pozwalających odróżnić neurony od klonów neuroblastów. Ponadto twin-spot MARCM pozwala na otrzymanie homozygotycznych klonów mutantów w celu zbadania mechanizmów molekularnych w heterozygotycznym tle genetycznym.

cell-lineage-analyses-and-gene-function-studies-using-twin-spot-marcm

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Galaxy i DAVID stały się popularnymi narzędziami, które pozwalają badaczom bez wykształcenia bioinformatycznego analizować i interpretować dane RNA-Seq. Opisujemy protokół dla badaczy C. elegans do przeprowadzania eksperymentów RNA-Seq, uzyskiwania dostępu i przetwarzania zestawu danych za pomocą Galaxy oraz uzyskiwania znaczących informacji biologicznych z list genów za pomocą DAVID.

Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Przedstawiono protokół do śledzenia linii i funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki za pomocą analizy mozaikowej z podwójnymi markerami (MADM). Analiza klonalna MADM zapewnia ilościowe ramy do pomiaru zachowania proliferacyjnego, produkcji komórkowej i pokrewieństwa liniowego poszczególnych komórek progenitorowych i ich komórek potomnych.

Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

CUT&amp;RUN i jego warianty mogą być używane do określania obecności białek na chromatynie. Protokół ten opisuje, w jaki sposób określić lokalizację białka na chromatynie za pomocą jednokomórkowego uliCUT&amp;RUN.

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Dokładna analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej wymaga złożonych procesów pracy. Ten artykuł pokazuje, jak korzystać z oprogramowania Cell-ACDC. Wykorzystuje nowoczesne modele oparte na AI do segmentacji, śledzenia, analizy genetyki komórek oraz ilościowej analizy danych mikroskopowych. Co istotne, uzupełnia te modele innowacyjnym ramowym systemem półautomatycznej korekty wyników modeli.

Analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej z wykorzystaniem Cell-ACDC

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj protokół twin-spot MARCM do analizy linii komórkowych i badań funkcji genów w neuronach. Technika ta umożliwia śledzenie rozwoju neuronów z oznaczeniem dwoma kolorami.

Analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem MARCM w bliźniaczej plamce

Przeglądaj więcej filmów