Analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem MARCM w bliźniaczej plamce
2 marca 2017
Tutaj prezentujemy protokół techniki etykietowania mozaiki, który pozwala na wizualizację neuronów pochodzących ze wspólnej komórki progenitorowej w dwóch różnych kolorach. Ułatwia to analizę linii neuronalnej z możliwością datowania pojedynczych neuronów na narodziny i badania funkcji genów w tych samych neuronach różnych osób.
Ogólnym celem tego protokołu MARCM dla dwóch plamek jest przeprowadzenie analiz linii komórkowych w wysokiej rozdzielczości i lepszych badań funkcji genów. Tkanka mózgowa składa się z ogromnej liczby różnych neuronów, dlatego trudno jest zbadać mechanizm leżący u podstaw tego, jak neurony łączą się ze sobą podczas rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest oznaczanie neuronów pochodzących od wspólnych przodków neuronów w dwóch różnych kolorach.
Które pozwalają na odzyskanie informacji o narodzinach poszczególnych neuronów. Dlatego ta technika może pomóc naukowcom w zbadaniu komórkowego i molekularnego mechanizmu leżącego u podstaw rozwoju neuronów. Dzisiejszą procedurę zademonstruje Pei-Chi Chung.
Technik z laboratorium profesora Yu. Zacznij od połączenia dwupunktowych samców i samic gotowych do MARCM w fiolce z pokarmem dla much ze świeżymi drożdżami w fiolce. Utrzymuj skrzyżowane muchy dwupunktowe w gotowości do MARCM w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwa dni, aby zwiększyć szansę na krycie przed zebraniem zapłodnionych jaj.
Aby uniknąć przepełnienia po wykluciu się larw, postukaj w skrzyżowane muchy gotowe do użycia w podwójnej plamce i przenieś do świeżo wysianych drożdży fiolek. Hoduj dwuplamkowe potomstwo MARCM, aż osiągnie pożądany etap rozwoju. W tym przypadku muchy w stadium larwalnym zostaną poddane szokowi cieplnemu w celu wywołania ekspresji flippazy.
Przenieś fiolki z muchami do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10, 20, 30, 40 i 50 minut, aby określić optymalny szok cieplny do ekspresji flippazy. Aby wygenerować interesujące nas klony MARCM z dwoma punktami. Czas wystąpienia szoku cieplnego określa etap generowania oczyszczania, podczas gdy okres szoku cieplnego określa, ile odśnieżeń zostanie wygenerowanych.
Hodowla zwierząt z podwójnym punktem MARCM w temperaturze 25 stopni Celsjusza wstrząsnęła ciepłem, aż do pożądanego etapu rozwojowego. Następnie przystąp do barwienia i montażu. Dodaj PBS do naczyń ochronnych kleszczy.
A następnie przenieś zwierzęta MARCM z dwoma punktami na naczynia. Patrząc przez mikroskop preparacyjny, użyj kleszczy, aby wypreparować mózgi zwierząt MARCM z podwójnym punktem. Najpierw usuń głowę z ciała muchy.
Następnie delikatnie usuń naskórek, nie uszkadzając mózgu. Następnie ostrożnie usuń tchawice, które wyglądają jak białe włókna. Przenieś mózgi na szklaną płytkę punktową, zawierającą 4% formaldehydu i PBS.
I napraw w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Rozpocznij procedurę barwienia od trzykrotnego przepłukania mózgów muchy 1% PBT. A następnie trzykrotne mycie z 1%PBT.
Za każdym razem wstrząsając przez 30 minut. Inkubować mózgi muchy z mieszaniną pierwszorzędowych przeciwciał przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Opłucz i umyj mózgi muchy trzy razy za pomocą 1% PBT, potrząsając jak poprzednio.
Następnie inkubuj mózgi muchy z mieszaniną przeciwciał drugorzędowych przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wypłukaniu i umyciu mózgów jak poprzednio, zamontuj mózgi na mikroszkiełku z odczynnikiem zapobiegającym wygaszaniu. A następnie umieść szkło nakrywkowe, aby przykryć i chronić mózgi much.
Uszczelnij krawędzie mikro szkła nakrywkowego i mikroszkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci. Na koniec uchwyć obrazy fluorescencyjne dwupunktowych klonów MARCM z próbek za pomocą wybranego systemu mikroskopii konfokalnej. Rysunek ten przedstawia wyniki z klonu MARCM z podwójną plamką, neuronów projekcyjnej VL2p przednio-grzbietowej wywodzącej się z indukcji flippazy.
Pośredniczyć w rekombinacji mitotycznej w neuroblastach adPN w stadium embrionalnym. Ten pierwszy diagram pokazuje wzorzec neurogenezy. Na tym konfokalnym obrazie mózgu mikroskopu adPN VL2p są pokazane na zielono i są związane z wielokomórkowymi adPN neuroblastów w kolorze magenta.
Ten obraz pokazuje komórki w rogu bocznym. Widoczna jest tutaj morfologia neuronalna płata czułkowego. Na tym obrazie przedstawiono dane dotyczące adPN DL1.
Jak widać tutaj, adPN DL1 pojawiają się później w rozwoju niż adPN VL2p. Indukcja dwupunktowych klonów MARCM adPN DC3 pokazuje, że ten typ neuronu pojawia się w późniejszym okresie rozwoju. Obraz ten pokazuje, że zdarzenie MARCM w bliźniaczej plamce występuje w nenenie ujemnym GAL4 w linii adPN.
Po opanowaniu, technika ta może pomóc naukowcom w analizie linii neuronalnej i dostarczyć różnych markerów do odróżnienia neuronów od klonu neuroblastów. Co więcej, MARCM z bliźniaczą plamką może wytwarzać homozygotyczne zmutowane klony w celu zbadania mechanizmu molekularnego. W heterozygotycznym tle genetycznym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół twin-spot MARCM zaprojektowany do przeprowadzania analiz linii komórkowych wysokiej rozdzielczości oraz badań funkcji genów w neuronach. Poprzez oznaczyć neurony pochodzące z wspólnych komórek progenitorowych dwoma różnymi kolorami, naukowcy mogą skutecznie śledzić rozwój i datowanie urodzenia pojedynczych neuronów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwojowa
Tło
- Tkanka mózgowa składa się z zróżnicowanej grupy neuronów.
- Zrozumienie zbierania neuronów w trakcie rozwoju jest złożone.
- Obecne techniki mogą nie zapewniać wystarczającej rozdzielczości do śledzenia linii.
- Ten protokół ma na celu rozwiązanie tych wyzwań.
Cel badania
- Przeprowadzenie szczegółowych analiz linii komórkowych.
- Poprawa badań nad funkcją genów w neuronach.
- Ułatwienie badań mechanizmów komórkowych i molekularnych w rozwoju neuronowym.
Stosowane metody
- Protokół twin-spot MARCM do oznakowania neuronów.
- Zastosowanie różnych kolorów markerów do śledzenia linii.
- Techniki wysokiej rozdzielczości do obrazowania.
- Analiza rozwoju neuronów i funkcji genów.
Główne wyniki
- Skuteczne oznakowanie neuronów pochodzących z wspólnych progenitorów.
- Możliwość odzyskania informacji o urodzeniu pojedynczych neuronów.
- Lepsze zrozumienie linii neuronowych i rozwoju.
- Potencjalne zastosowania w badaniach funkcji genów u różnych osobników.
Wnioski
- Protokół twin-spot MARCM jest cennym narzędziem w badaniach neuronaukowych.
- Umożliwia szczegółową analizę linii neuronowych i funkcji genów.
- Ta technika może znacząco poszerzyć nasze zrozumienie rozwoju neuronowego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding neural lineage and gene function in model organisms provides foundational insights for target validation in neurotherapeutic development. The twin-spot MARCM technique enables high-resolution mapping of neuronal birth order and phenotypic analysis of genetically identical neurons across individuals, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach enhances predictive confidence by linking developmental mechanisms to functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracing neuronal lineage from common progenitors to assess gene function in defined cell populations.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through phenotypic analysis of homozygous mutant clones in heterozygous backgrounds, reducing mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative lineage data that correlates with neurodevelopmental disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated, color-coded neuronal systems suitable for downstream compound screening in disease-relevant neural circuits.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via inducible, stage-specific clonal generation controlled by heat shock duration.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple neuronal subtypes (e.g., adPN lineages) for comparative phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling birth-order analysis of neurons implicated in neurodevelopmental disorders.
- Mechanistic De-risking: Allows phenotypic analysis of identical neurons across animals to distinguish genetic from stochastic variability in gene function studies.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and validation by providing lineage-resolved data for target engagement and pathway modulation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The twin-spot MARCM method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical mechanistic studies, particularly for neurodevelopmental indications where neuronal origin and connectivity are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene perturbation to lineage-specific neuronal phenotypes.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible neuronal preparations with quantitative outputs based on clonal birth timing and marker expression.
- Analytics: Enables comparative analysis of neuronal morphology and gene expression across developmental stages using dual-color readouts.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by providing lineage-aligned models for biomarker-aligned target modulation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for generating standardized neuronal cohorts across projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing lineage-related confounding in gene function studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled clonal induction and standardized staining/mounting protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of lineage-specific phenotypic effects, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing mechanistic clarity on neuronal targets in heterogeneous tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, clonal labeling techniques, and confocal microscopy for accurate lineage interpretation.
- Dependent on instrumentation including heat shock apparatus, dissection microscopes, and confocal imaging systems for clonal induction and visualization.
- Necessitates cross-team standardization of heat shock timing, staining protocols, and imaging parameters to ensure clonal consistency across users.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different neuronal lineages or developmental stages beyond the adPN model shown.
- Includes practical limitations such as clonal efficiency dependence on heat shock duration and the need for optimization per target lineage, as noted in the protocol.
