Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju

Gigantyczne pęcherzyki zawierające wysoko upakowane składniki o rozmiarach mikrometrów są użytecznymi modelami komórek. Metoda wirowania emulsji typu woda w oleju jest prostym, ale potężnym narzędziem do przygotowywania gigantycznych pęcherzyków z zamkniętymi materiałami.

Ogólnym celem tej metody wirowania emulsji typu woda w oleju jest łatwe przygotowanie cienkiej warstwy gigantycznego pęcherzyka. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii syntetycznej, takie jak stworzenie sztucznej komórki opartej na gigantycznym pęcherzyku. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj 25-milimolowy roztwór podstawowy DOPC i dwumilimolowy roztwór podstawowy Texas Red DHPE w chloroformie w punkcie zerowym.

Następnie utwórz film lipidowy na wewnętrznej powierzchni pięciomililitrowej szklanej fiolki, odparowując mieszaninę roztworów podstawowych DOPC i Texas Red DHPE pod przepływającym gazem azotowym. Po inkubacji filmu pod zmniejszonym ciśnieniem przez noc, dodać jeden mililitr płynnej parafiny do fiolki. Zawiń fiolkę w folię aluminiową i inkubuj mieszaninę w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez noc.

W jednopunktowej pięciomililitrowej mikroprobówce z pokrywką wymieszaj 237 punktów, pięć mikrolitrów mikrosfer niefluorescencyjnych o jednym mikrometrze i 12 mikrolitrów z jednym mikrometrem fluorescencyjnym. Teraz dodaj 64 miligramy sacharozy, a następnie 125 mikrolitrów jednego molowego roztworu buforowego Tris i 875 mikrolitrów wody dejonizowanej do mikroprobówki. Wiruj mieszaninę przez 30 sekund, a następnie sonikuj przez 10 minut.

Po przygotowaniu 10 mililitrów buforowanego roztworu Tris, umieść jeden mililitr w jednopunktowej pięciomililitrowej mikroprobówce z pokrywką. Po zawirowaniu roztworu i poddaniu go sonikacji, wymieszaj jeden mililitr roztworu oleju z 300 mikrolitrami wewnętrznego roztworu wodnego w jednopunktowej pięciomililitrowej mikroprobówce. Emulgować dwa składniki w mikroprobówce za pomocą homoginizatora mechanicznego pracującego z prędkością 10 000 obr./min przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie delikatnie nałóż 300 mikrolitrów emulsji typu woda w oleju na górną powierzchnię jednego mililitra zewnętrznego roztworu wodnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza w jednopunktowej mikroprobówce z pięciomililitrową pokrywką. Natychmiast po schłodzeniu mikroprobówki przez 10 minut odwirować mieszaninę pod ciśnieniem 18 000 razy G przez 30 minut. Po zakończeniu uzyskaj wytrącone gigantyczne pęcherzyki lub GV, przekłuwając dno mikroprobówki szpilką i zbierając jedną kroplę do wysterylizowanej jednopunktowej pięciomililitrowej mikroprobówki.

Umieść komorę inkubacyjną z klejem do reakcji łańcuchowej polimerazy NC 2 i hybrydyzacji na szkle nakrywkowym mikroskopu. Za pomocą mikropipety nanieść 25 mikrolitrów rozcieńczonych wytrąconych GV na powierzchnię próbki i natychmiast umieścić szkiełko nakrywkowe o grubości jednego i pięciu milimetrów na wierzchu komory inkubacyjnej. Po zarejestrowaniu obrazów mikroskopowych pęcherzyków należy przeprowadzić mikroskopię fluorescencyjną, najpierw wprowadzając do mikroskopu lustrzane jednostki luster fluorescencyjnych UFBNA i UFMCHE.

Następnie zamontuj jednostki z filtrami wzbudzenia i filtrami emisji do analizy. Najważniejszym wyznacznikiem powodzenia metody woda w oleju jest to, że ciężar właściwy wewnętrznego roztworu wodnego musi być większy niż ciężar właściwy zewnętrznego roztworu wodnego, aby GV wytrąciły się podczas wirowania. Różnicowa mikroskopia interferencyjna i mikroskopia fluorescencyjna GV bez mikrosfer i z mikrosferami potwierdziły, że powstały GV o niskiej blaszkowatości.

Spośród 160 uzyskanych GV, 55 zamkniętych mikrosfer i 105 było pustych, co daje 34% współczynnik enkapsulacji. Udział objętościowy mikrosfer w GV oszacowano na około 11 plus minus trzy procent objętości, a precyzja obliczonego ułamka objętościowego wynosiła od 10 do 30% Enkapsulacja innych materiałów w 100 procentach molowych DOPC GV przy użyciu tego samego zewnętrznego roztworu wodnego i ten sam protokół zakończył się sukcesem, jak wykazano za pomocą mikroskopii interferencyjnej różnicowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wyjaśnienie modelowanej komórki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować gigantyczne pęcherzyki z zamkniętych materiałów.