Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju
24 stycznia 2017
Gigantyczne pęcherzyki zawierające wysoko upakowane składniki o rozmiarach mikrometrów są użytecznymi modelami komórek. Metoda wirowania emulsji typu woda w oleju jest prostym, ale potężnym narzędziem do przygotowywania gigantycznych pęcherzyków z zamkniętymi materiałami.
Ogólnym celem tej metody wirowania emulsji typu woda w oleju jest łatwe przygotowanie cienkiej warstwy gigantycznego pęcherzyka. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii syntetycznej, takie jak stworzenie sztucznej komórki opartej na gigantycznym pęcherzyku. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj 25-milimolowy roztwór podstawowy DOPC i dwumilimolowy roztwór podstawowy Texas Red DHPE w chloroformie w punkcie zerowym.
Następnie utwórz film lipidowy na wewnętrznej powierzchni pięciomililitrowej szklanej fiolki, odparowując mieszaninę roztworów podstawowych DOPC i Texas Red DHPE pod przepływającym gazem azotowym. Po inkubacji filmu pod zmniejszonym ciśnieniem przez noc, dodać jeden mililitr płynnej parafiny do fiolki. Zawiń fiolkę w folię aluminiową i inkubuj mieszaninę w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez noc.
W jednopunktowej pięciomililitrowej mikroprobówce z pokrywką wymieszaj 237 punktów, pięć mikrolitrów mikrosfer niefluorescencyjnych o jednym mikrometrze i 12 mikrolitrów z jednym mikrometrem fluorescencyjnym. Teraz dodaj 64 miligramy sacharozy, a następnie 125 mikrolitrów jednego molowego roztworu buforowego Tris i 875 mikrolitrów wody dejonizowanej do mikroprobówki. Wiruj mieszaninę przez 30 sekund, a następnie sonikuj przez 10 minut.
Po przygotowaniu 10 mililitrów buforowanego roztworu Tris, umieść jeden mililitr w jednopunktowej pięciomililitrowej mikroprobówce z pokrywką. Po zawirowaniu roztworu i poddaniu go sonikacji, wymieszaj jeden mililitr roztworu oleju z 300 mikrolitrami wewnętrznego roztworu wodnego w jednopunktowej pięciomililitrowej mikroprobówce. Emulgować dwa składniki w mikroprobówce za pomocą homoginizatora mechanicznego pracującego z prędkością 10 000 obr./min przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.
Następnie delikatnie nałóż 300 mikrolitrów emulsji typu woda w oleju na górną powierzchnię jednego mililitra zewnętrznego roztworu wodnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza w jednopunktowej mikroprobówce z pięciomililitrową pokrywką. Natychmiast po schłodzeniu mikroprobówki przez 10 minut odwirować mieszaninę pod ciśnieniem 18 000 razy G przez 30 minut. Po zakończeniu uzyskaj wytrącone gigantyczne pęcherzyki lub GV, przekłuwając dno mikroprobówki szpilką i zbierając jedną kroplę do wysterylizowanej jednopunktowej pięciomililitrowej mikroprobówki.
Umieść komorę inkubacyjną z klejem do reakcji łańcuchowej polimerazy NC 2 i hybrydyzacji na szkle nakrywkowym mikroskopu. Za pomocą mikropipety nanieść 25 mikrolitrów rozcieńczonych wytrąconych GV na powierzchnię próbki i natychmiast umieścić szkiełko nakrywkowe o grubości jednego i pięciu milimetrów na wierzchu komory inkubacyjnej. Po zarejestrowaniu obrazów mikroskopowych pęcherzyków należy przeprowadzić mikroskopię fluorescencyjną, najpierw wprowadzając do mikroskopu lustrzane jednostki luster fluorescencyjnych UFBNA i UFMCHE.
Następnie zamontuj jednostki z filtrami wzbudzenia i filtrami emisji do analizy. Najważniejszym wyznacznikiem powodzenia metody woda w oleju jest to, że ciężar właściwy wewnętrznego roztworu wodnego musi być większy niż ciężar właściwy zewnętrznego roztworu wodnego, aby GV wytrąciły się podczas wirowania. Różnicowa mikroskopia interferencyjna i mikroskopia fluorescencyjna GV bez mikrosfer i z mikrosferami potwierdziły, że powstały GV o niskiej blaszkowatości.
Spośród 160 uzyskanych GV, 55 zamkniętych mikrosfer i 105 było pustych, co daje 34% współczynnik enkapsulacji. Udział objętościowy mikrosfer w GV oszacowano na około 11 plus minus trzy procent objętości, a precyzja obliczonego ułamka objętościowego wynosiła od 10 do 30% Enkapsulacja innych materiałów w 100 procentach molowych DOPC GV przy użyciu tego samego zewnętrznego roztworu wodnego i ten sam protokół zakończył się sukcesem, jak wykazano za pomocą mikroskopii interferencyjnej różnicowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wyjaśnienie modelowanej komórki.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować gigantyczne pęcherzyki z zamkniętych materiałów.
Przegląd
W niniejszym artykule omówiono przygotowanie pęcherzyków olbrzymich z wykorzystaniem metody wirowania emulsji woda w oleju. Pęcherzyki te stanowią przydatne modele w badaniach nad biologią syntetyczną, w szczególności w procesie tworzenia sztucznych komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia syntetyczna
- Przygotowanie pęcherzyków
- Modele komórkowe
Wstęp
- Gigantyczne pęcherzyki mogą enkapsulować materiały, co czyni je cennymi w badaniach.
- Metoda emulsji woda w oleju upraszcza proces przygotowania.
- Zrozumienie procesu tworzenia pęcherzyków jest kluczowe dla rozwoju biologii syntetycznej.
- Efektywność enkapsulacji jest kluczowym parametrem w ocenie tej metody.
Cel badania
- Opracowanie prostego sposobu przygotowywania gigantycznych pęcherzyków.
- Zbadanie potencjału tych pęcherzyków w zastosowaniach biologii syntetycznej.
- Ocena enkapsulacji różnych materiałów wewnątrz pęcherzyków.
Zastosowane metody
- Przygotowanie filmów lipidowych z DOPC i Texas Red DHPE.
- Tworzenie emulsji woda w oleju za pomocą homogenizacji mechanicznej.
- Wirowanie w celu wyizolowania pęcherzyków olbrzymich.
- Techniki mikroskopowe do analizy właściwości pęcherzyków.
Główne wyniki
- Pomyślne utworzenie gigantycznych pęcherzyków o różnym stopniu enkapsulacji.
- 34% pęcherzyków zawierało enkapsulowane mikrosfery.
- Udowolniona frakcja objętości mikrosfer została oszacowana na około 11%.
- Przy użyciu tego samego protokołu pomyślnie enkapsulowano inne materiały.
Wnioski
- Metoda woda-w-oleju jest skuteczna w przygotowywaniu olbrzymich pęcherzyków.
- Wydajność enkapsulacji może być optymalizowana dla różnych zastosowań.
- Technika ta otwiera nowe możliwości dla dalszych badań w dziedzinie biologii syntetycznej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna enkapsulacja mikrosfer wewnątrz gigantycznych pęcherzyków (GVs) umożliwia konstruowanie modeli sztucznych komórek, co wspiera wczesne etapy biologii syntetycznej i odkrywania leków biofarmaceutycznych. Metoda ta zapewnia powtarzalną platformę do badania kompartymentacji, tłoczenia molekularnego oraz wydajności enkapsulacji, które są kluczowe dla wiarygodności predykcyjnej w systemach naśladujących komórki. Podejście to ma bezpośrednie zastosowanie w procesach walidacji celów oraz opracowywania testów, w których modele sztucznych komórek służą do mechanistycznego ograniczania ryzyka i zapewnienia ciągłości translacyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia montaż modeli sztucznych komórek metodą oddolną (bottom-up) w celu weryfikacji hipotez.
- Pozwala na enkapsulację różnorodnych biomolekuł lub cząstek w celu naśladowania środowisk komórkowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie zatłoczenia molekularnego oraz kompartymentacji.
- Zapewnia platformę do funkcjonalnej walidacji celów w systemach syntetycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zestandaryzowane systemy oparte na pęcherzykach do dalszych etapów analizy przesiewowej.
- Dostarcza ilościowe wskaźniki enkapsulacji w celu zapewnienia powtarzalności testów.
- Umożliwia skalowalną produkcję pęcherzyków do zastosowań w wysokoprzepustowych analizach przesiewowych (high-content screening).
- Wspiera wiarygodną ocenę oddziaływań związków lub biomolekuł w obrębie określonych przedziałów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modeluje istotne w kontekście chorób cechy komórkowe, takie jak zatłoczenie molekularne i kompartymentacja.
- Umożliwia dostosowanie systemów sztucznych komórek do translacyjnych badań biomarkerów podczas enkapsulacji odpowiednich cząsteczek.
- Zapewnia ciągłość od walidacji syntetycznego modelu po opracowanie testów przedklinicznych.
- Minimalizuje ryzyko związane z wczesnymi wynikami badań dzięki możliwości kontrolowanej, ilościowej manipulacji systemem.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda wirowania emulsji typu woda w oleju łączy w sobie etapy wczesnego odkrywania oraz opracowywania testów, umożliwiając tworzenie sztucznych modeli komórkowych do badań opartych na hipotezach oraz do celów screeningowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących kompartymentacji i wydajności enkapsulacji w systemach syntetycznych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe preparaty pęcherzyków do standaryzacji testów.
- Analityka: Umożliwia pomiar stosunków enkapsulacji i ułamków objętościowych do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki z modeli syntetycznych z projektowaniem testów przedklinicznych podczas enkapsulacji cząsteczek istotnych dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje reużywalny protokół, który można dostosować do różnych substancji enkapsulowanych i składów pęcherzyków.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w testach opartych na sztucznych komórkach oraz w walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, skalowalne przygotowanie pęcherzyków z mierzalnymi wynikami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej we wczesnej fazie odkryć.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację projektów z zakresu biologii syntetycznej i mimetyki komórkowej z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu chemii lipidów, postępowania z emulsjami oraz analizy mikroskopowej.
- Wymaga dostępu do homogenizatorów, wirówek oraz infrastruktury do mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga standaryzacji protokołów enkapsulacji i analizy pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych substancji enkapsulowanych i rozmiarów pęcherzyków poprzez optymalizację protokołu.
- Wydajność enkapsulacji oraz lamellarność pęcherzyków mogą być zmienne i mogą wymagać walidacji empirycznej.
