Name: Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Poznaj metodę odwirowania emulsji woda-w-olej do otrzymywania gigantycznych pęcherzyków z mikrosferami. Technika ta umożliwia tworzenie modeli sztucznych komórek w biologii syntetycznej z efektywnością enkapsulacji około 34%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Tomoko Yamaguchi za narysowanie schematycznego obrazu na rysunku 1. Badanie to było wspierane przez projekt Okazaki ORION Instytutu Integracyjnej Nauk Biologicznych Okazaki Narodowych Instytutów Nauk Przyrodniczych (NINS); w ramach projektu Centrum Astrobiologii (nr AB281010) numerów NINS; w ramach grantu Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Dynamiczne porządkowanie układów biomolekularnych w celu tworzenia zintegrowanych funkcji) (nr 25102008) przyznanego przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS); w ramach grantu dla młodych naukowców (B) (dla K.K., nr 15K17850) z JSPS; oraz dotację na rozpoczęcie działalności badawczej (dla Y.N., nr 15H06653) od JSPS. Dodatkowego wsparcia udzielił grant z Instytutu Noguchi, grant z Kao Foundation for Arts and Sciences oraz grant z Kurita Water and Environment Foundation.

1. Przygotowanie GV metodą wirowania emulsji bez użycia
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC, 25 mM) i roztworu podstawowego 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-fosfoetanoloaminy, sól trietyloamoniową Texas Red (Texas Red DHPE, 0,20 mM) w chloroformie i przechowywać roztwory podstawowe w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj roztwór oleju.
	<ol>
		<li>Utworzyć film lipidowy na wewnętrznej powierzchni szklanej fiolki o pojemności 5 ml poprzez odparowanie mieszaniny roztworu podstawowego DOPC (51,0 μl i roztworu podstawowego Texas Red DHPE (19,2 μl) pod przepływającym azotem.</li>
		<li>Inkubować film pod zmniejszonym ciśnieniem przez noc, a następnie dodać 1,0 ml płynnej parafiny (0,86-0,89 g/cm3) do fiolki. Owinąć fiolkę w folię aluminiową i inkubować w temperaturze 80 °C O/N w spoczynku. Końcowe stężenia DOPC i Texas Red DHPE wynoszą odpowiednio 1,3 i 3,8 x 10−3 mM, a stosunek molowy DOPC:Texas Red DHPE wynosi 100:0,3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wewnętrzną dyspersję wodną.
	<ol>
		<li>W mikroprobówce z pokrywką o pojemności 1,5 ml wymieszać 237,5 μl dyspersji mikrosfer niefluorescencyjnych 1,0 μm (2,5% obj.) i 12,5 μl dyspersji mikrosfer fluorescencyjnych 1,0 μm (2,5 obj.); odpowiada to stosunkowi 95:5 (v/v) mikrosfer niefluorescencyjnych do fluorescencyjnych.</li>
		<li>Dodać 64 mg sacharozy, a następnie 125 μl roztworu buforowanego trisem (TBS, 1 M) i 875 μl wody dejonizowanej. Końcowy udział objętościowy mikrosfer wynosi 0,5% obj., a końcowe stężenia Tris-HCl (pH 7,5) i sacharozy wynoszą odpowiednio 0,1 i 0,15 M.</li>
		<li>Wirować mikroprobówkę przez 30 sekund, a następnie poddawać ją sonifikacji przez 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować zewnętrzny roztwór wodny.
	<ol>
		<li>Po przygotowaniu 10 ml roztworu buforowanego Tris (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M glukozy) w tej samej procedurze, co wewnętrzne podłoże wodne, umieścić 1 ml roztworu w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml z pokrywką. Wirować mikroprobówkę przez 30 sekund, a następnie poddawać ją sonifikacji przez 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować emulsję bez mikrosfer.
	<ol>
		<li>Zmieszać 1 ml roztworu oleju (ciekła parafina zawierająca DOPC i Texas Red DHPE) z 300 μl wewnętrznego roztworu wodnego w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Emulgować dwa składniki w mikroprobówce za pomocą homogenizatora mechanicznego (mieszadła z łopatkami, które obracają się z dużą prędkością) pracującego z prędkością 10 000 obr./min przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącić GV.
	<ol>
		<li>Delikatnie nałożyć 300 μl emulsji bez użycia na górną powierzchnię 1 ml zewnętrznego roztworu wodnego w temperaturze 4 °C w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml z pokrywką. Schłodzić mikroprobówkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz GV.
	<ol>
		<li>Natychmiast po schłodzeniu mikroprobówki należy ją odwirować przy 18 000 x g przez 30 minut. Wytrącone GV należy uzyskać, przekłuwając dno mikroprobówki pinezką i zbierając jedną kroplę do wysterylizowanej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć wytrąconą kroplę GV 10-100 razy objętościowo zewnętrznym roztworem wodnym, jeśli otrzymane GV są otrzymywane w ilościach wystarczająco dużych, aby utrudnić obserwację.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obserwacja mikroskopowa GV
<ol>
	<li>Przygotuj próbkę mikroskopową.
	<ol>
		<li>Umieść adhezyjną komorę inkubacyjną do łańcuchowej reakcji polimerazy in situ i hybrydyzacji (rozmiar komory 9 mm x 9 mm x 0,3 mm grubości) na wierzchu szkła nakrywkowego mikroskopu.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety nanieść 25 μl rozcieńczonych, wytrąconych GV na powierzchnię próbki i natychmiast umieścić kolejne szkło nakrywkowe (o grubości około 0,15 mm) na wierzchu komory inkubacyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestruj obrazy z mikroskopii kontrastowej interferencji różnicowej GV.
	<ol>
		<li>Rejestruj obrazy mikroskopowe pęcherzyków za pomocą mikroskopu (obiektywy 10X, 20X i 40X) wyposażonego w lampę halogenową 12V100WHAL-L.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie obserwacji mikroskopią fluorescencyjną.
	<ol>
		<li>Włóż lustrzane zwierciadła fluorescencyjne U-FBNA i U-FMCHE do mikroskopu. Wyposaż jednostki odpowiednio w filtry wzbudzenia 470-495 nm i 565-585 nm oraz w filtry emisyjne, które przepuszczają światło odpowiednio 510-550 nm i 600-690 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuisi%2C+PL+%22The+emergence+of+life%3A+from+chemical+origins+to+synthetic+biology%22">The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology</a>. , Cambridge University Press. (2006).</li>
<li>Luisi, P. L., Stano, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuisi%2C+PL+%22The+minimal+cell%3A+the+biophysics+of+cell+compartment+and+the+origin+of+cell%22">The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasmussen%2C+S+%22Protocells%3A+Bridging+nonliving+and+living+matter%22">Protocells: Bridging nonliving and living matter</a>. , The MIT Press. (2008).</li>
<li>Luisi, P. L., Walde, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuisi%2C+PL+%22Giant+vesicles%3A+perspectives+in+supramolecular+chemistry%22">Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry</a>. , Wiley-Interscience. (2000).</li>
<li>Kita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+genetic+information+with+self-encoded+replicase+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes.</a> Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).</li>
<li>Nomura, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+within+cell-sized+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene expression within cell-sized lipid vesicles.</a> Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).</li>
<li>Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+in+liposome%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction in liposome.</a> Chem Biol. 2 (10), 677-682 (1995).</li>
<li>Shohda, K., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/sm/c0sm01463j#!divAbstract">Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle.</a> Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).</li>
<li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).</li>
<li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recursive+vesicle-based+model+protocell+with+a+primitive+model+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle.</a> Nat Comm. 6, 8352(2015).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles%3A+preparations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles: preparations and applications.</a> Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Reeves, J. P., Dowben, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+properties+of+thin-walled+phospholipid+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles.</a> J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).</li>
<li>Needham, D., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanical+properties+of+giant+lipid+%28DMPC%29+vesicle+bilayers+from+20+%C2%B0C+below+to+10+%C2%B0C+above+the+liquid+crystal-crystalline+phase+transition+at+24+%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C.</a> Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).</li>
<li>Oku, N., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alkali+metal+chlorides+on+formation+of+giant+liposomes+by+freezing+and+thawing+and+by+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis.</a> Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/1986/DC/dc9868100303#!divAbstract">Liposome electroformation.</a> Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F3-798-50724-4_62">Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields.</a> New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).</li>
<li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja074029f">Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow.</a> J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).</li>
<li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li>
<li>Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding%3A+obvious+but+underappreciated%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding: obvious but underappreciated.</a> Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).</li>
<li>Ellis, R. J., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v425/n6953/full/425027a.html">Cell biology: join the crowd.</a> Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la026100v">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/100/19/10718.abstract">Engineering asymmetric vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+analysis+of+structural+properties+of+giant+liposomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry.</a> Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).</li>
<li>Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+lamellarity+of+giant+liposomes+prepared+by+the+inverted+emulsion+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method.</a> Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).</li>
<li>Cabré, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+division+proteins+FtsZ+and+ZipA+induce+vesicle+shrinkage+and+cell+membrane+invagination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination.</a> J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).</li>
<li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li>
<li>Hayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+morphological+control+of+tubulin-encapsulating+giant+liposomes+by+hydrostatic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure.</a> Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).</li>
<li>Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+fusion+and+budding+of+giant+phospholipid+vesicles+containing+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).</li>
<li>Natsume, Y., Toyota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetrical+polyhedral+configuration+of+giant+vesicles+induced+by+orderly+array+of+encapsulated+colloidal+particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles.</a> PLOS ONE. 11 (1), e0146683(2016).</li>
<li>Natsume, Y., Toyota, T. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/303780392_Appearance_of_Crystalline_Pattern_for_Colloidal_Particles_Encapsulated_in_Giant_Vesicles_-Direct_Cross-sectional_Observation_of_Ordered_and_Disordered_Phases-">Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases.</a> Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
<li>Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evolution+of+%CE%B1-hemolysin+using+a+liposome+display%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).</li>
<li>Whittenton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+asymmetric+liposomal+nanoparticles+for+encapsulation+of+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides.</a> Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).</li>
<li>Natsume, Y., Toyota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles+containing+microspheres+with+high+volume+fraction+prepared+by+water-in-oil+emulsion+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation.</a> Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).</li>
<li>Pontani, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+inside+giant+unilamellar+vesicles+analyzed+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry.</a> Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).</li>
<li>Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+display+for+in+vitro+selection+and+evolution+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoco%22%5BJournal%5D)">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).</li>
<li>Hamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+asymmetric+cell-sized+lipid+vesicles+from+lipid-coated+water-in-oil+microdroplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets.</a> J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).</li>
<li>Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+liposome-encapsulated+plasmid+DNA+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery.</a> Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+tracking+of+a+minimum+gene+expression+system+reconstituted+in+giant+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes.</a> ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).</li>
<li>Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+reconstitution+of+a+membrane+protein+in+a+giant+unilamellar+vesicle%3A+experimental+verification+with+the+potassium+channel+KcsA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA.</a> J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).</li>
<li>Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+micrometer-sized+artificial+objects+into+live+cells%3A+a+method+for+cell-giant+unilamellar+vesicle+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion.</a> PLOS ONE. 9 (9), e106853(2014).</li>
<li>Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s00354-012-0121-z">Molecular robotics: a new paradigm for artifacts.</a> New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).</li>
<li>Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+robots+with+sensors+and+intelligence%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular robots with sensors and intelligence.</a> Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ciężar właściwy wewnętrznego wodnego podłoża dyspersyjnego i zewnętrznego roztworu wodnego musi być starannie dobrany. Aby emulsja bez o mogła wytrącić się do zewnętrznego roztworu wodnego podczas wirowania, ciężar właściwy wewnętrznego wodnego ośrodka dyspersyjnego musi być większy niż ciężar właściwy zewnętrznego roztworu wodnego. Próbowaliśmy przygotować GV przy użyciu roztworów wewnętrznych i zewnętrznych bez cukrów, ale nie uzyskaliśmy GV w tych warunkach, ponieważ wewnętrzny roztwór wodny nie miał wystarczającej masy, aby przejść przez interferencję między dwiema fazami. Jeśli między tymi dwoma roztworami występuje duża różnica ciśnień osmotycznych, GV, które wytrącają się w zewnętrznym roztworze wodnym, mogą się skurczyć lub pęknąć. Dlatego ciśnienie osmotyczne wewnątrz i na zewnątrz GV musi być równe. Aby to osiągnąć, użyliśmy sacharozy jako substancji rozpuszczonej w wewnętrznej dyspersji wodnej i glukozy jako substancji rozpuszczonej w zewnętrznym roztworze wodnym; Oba cukry były w tym samym stężeniu. Do takich celów używano zarówno soli22, jak i cukru 23,35,38, ale zwykle stosuje się cukier, ponieważ jest mniej toksyczny i lepiej rozpuszczalny niż sól. Jeśli jednak doda się zbyt dużo cukru, GV mogą zetknąć się z dnem szkła nakrywkowego i zapaść się. Istnieje kilka strategii, aby tego uniknąć. Jedną ze strategii jest zmniejszenie różnicy ciężaru właściwego między wewnętrznymi i zewnętrznymi roztworami wodnymi, tak aby GV wytrącały się w łagodnych warunkach; w szczególności supernatant wytrąconej dyspersji GV może być wymieniony na roztwór, który jest identyczny z wewnętrznym roztworem wodnym, aby zmniejszyć możliwość pęknięcia pęcherzyków przez przyleganie do szkła nakrywkowego w wyniku wyporu. Inną strategią jest wstępne pokrycie obu szkieł nakrywkowych cienką warstwą lipidową29.
Ważne jest odpowiednie przygotowanie i inkubacja emulsji. Do przygotowania roztworu olejowego użyliśmy ciekłej parafiny. Olej mineralny26,31, dodekan21,33 i skwalan33,39 są również często stosowane jako oleje rozpuszczalnikowe. Ponieważ materiały te różnią się ciężarem właściwym, lepkością i napięciem powierzchniowym, tworzy się różna liczba pęcherzyków, nawet gdy stosuje się te same warunki wirowania33. Aby uzyskać pęcherzyki o docelowych właściwościach, konieczne jest zoptymalizowanie ciężaru właściwego i lepkości wewnętrznych i zewnętrznych roztworów wodnych, a także przyspieszenia odśrodkowego. W celu przygotowania fazy olejowej inkubacja musi odbywać się w wysokiej temperaturze i w suchym środowisku, takim jak inkubator lub odwadniacz. W tym badaniu podgrzaliśmy ciekłą parafinę do 80 °C, aby całkowicie rozpuścić cząsteczki lipidów. Ponadto emulsja powinna być przygotowywana tylko w razie potrzeby i powinna być natychmiast poddana wirowaniu, ponieważ jest niestabilna zaraz po przygotowaniu, a kropelki bez kropelek łatwo łączą się ze sobą. Emulsję można przygotować w dużych ilościach przez sonikację, wirowanie lub stukanie. Jednak zastosowanie homogenizatora pozwala na szybkie przygotowanie dużych ilości emulsji i łatwiejszą emulgację w oleju o dużej lepkości. Ważne jest również, aby emulsja była delikatnie i szybko nakładana warstwami na zewnętrzny roztwór wodny, a następnie schładzana w temperaturze 4 °C. Aby skrócić czas między emulgacją a wirowaniem, system zewnętrznego roztworu wodnego oleju może być wstępnie schładzony przed nałożeniem na niego warstwy emulsji, a następnie cały system można natychmiast odwirować. Jeśli białe zmętnienie pojawia się szybciej lub wolniej niż zwykle, homogenizator mechaniczny należy dokładnie wypłukać w celu usunięcia detergentów czyszczących. Ponadto przed emulgacją roztwór oleju, wewnętrzny roztwór wodny i emulgator należy przywrócić do temperatury pokojowej.
Ważne jest również odpowiednie przyspieszenie odśrodkowe. Wirując przy 18 000 x g, byliśmy w stanie przygotować GV z pojedynczym materiałem wewnętrznym zamkniętym w kapsułkach w wysokim stężeniu. Gdy wymagana jest hermetyzacja wielu materiałów, lepiej jest zmniejszyć przyspieszenie odśrodkowe. Na przykład system składania aktyny zawierający siedem związków uzyskano przy odwirowaniu przy stężeniach poniżej 350 x g35. W przypadkach, w których odwirowanie jest niepożądane, GV można uzyskać poprzez dostosowanie stężenia cukru lub wytrącanie emulsji pod wpływem jej własnej masy 38,40,41.
Opisana w niniejszym dokumencie metoda ma dwa główne ograniczenia. Jednym z nich jest to, że cząsteczki oleju (w tym przypadku parafiny) mogą być rozpuszczane w błonie GV, jak wskazała grupaWeitza 21. Gdy pożądane jest wprowadzenie białka błonowego do błony GV, należy wziąć pod uwagę wpływ współistniejących cząsteczek oleju na białko. Drugim ograniczeniem jest zmienność ułamka objętościowego. W tym badaniu oszacowaliśmy, że frakcje objętościowe mikrosfer w GV wahały się od 4 do 30% obj.; frakcje objętościowe nie były identyczne z frakcją objętościową wewnętrznego roztworu wodnego użytego do przygotowania GV. Chociaż udało nam się zamknąć mikrosfery w GV przy ułamku objętościowym wystarczająco wysokim do obserwacji mikroskopowej, metoda ta nie nadaje się do przygotowania GV o jednolitym rozkładzie frakcji objętościowej. Doniesiono, że rozkład frakcji objętościowych mikrosfery zmienia się podczas wirowania34.
Metoda wirowania emulsyjnego bez użycia emulsji jest powszechnie stosowana do tworzenia GV zawierających materiały zamknięte. Jednak niewiele doniesień opisywało przygotowanie GV zawierających materiały w mikroskali34,42. Ostatnio skonstruowano roboty molekularne zawierające zamknięte w kapsułkach urządzenie DNA lub urządzenie molekularne 43,44. GV z komorami są pierwszym wyborem do tego rodzaju zastosowań; W związku z tym można się spodziewać, że techniki takie jak nasza, które mogą być wykorzystane do hermetyzacji mikrosfer magnetycznych i mikrosfer o zróżnicowanej funkcjonalizacji powierzchni, okażą się użyteczne44.

Konstruktywne lub syntetyczne podejście biologiczne jest fascynującą drogą do odkrywania granicy między materią ożywioną i nieożywioną. Ponieważ komórka jest minimalną jednostką wymaganą do życia, tak jak je obecnie rozumiemy, różni badacze próbowali skonstruować sztuczne komórki z prostych, dobrze znanych substancji chemicznych, aby można było badać zjawiska zachodzące w takich sztucznych komórkach, z ostatecznym celem wyjaśnienia początków życia i zbadania podstawowych funkcji żywych komórek1, 2,3. W szczególności pęcherzyki4, które są sferycznymi mikrokompartmentami zbudowanymi z cząsteczek amfifilowych i mogą otaczać cząsteczki biologiczne, takie jak białka5,6 i DNA7,8,9,10, były często używane jako modele błon biologicznych.
Pęcherzyki można sklasyfikować jako małe (zdefiniowane jako mające średnicę <100 nm), duże (średnica <1 μm) lub gigantyczne (średnica >1 μm). Gigantyczne pęcherzyki (GV) były szeroko badane, ponieważ są podobne do żywych komórek pod względem wielkości, kształtu i struktury. Ze względu na wielkość GV, zmiany morfologiczne w błonach GV można łatwo obserwować w czasie rzeczywistym pod mikroskopem optycznym.
Zgłoszono kilka metod przygotowania GV11, w tym metoda hydracji12,13, metoda zamrażania i rozmrażania14, metoda elektroformacji15,16, oraz metoda urządzenia fluidycznego17,18. Jednak kapsułkowanie białek i innych makrocząsteczek w GV w wysokich stężeniach za pomocą tych metod jest trudne. W szczególności niezwykle trudne jest zamknięcie materiału biologicznego w wystarczającej ilości (20-30 obj.), aby naśladować zatłoczone środowisko wewnątrz komórek19,20. Aby natychmiast utworzyć GV, Weitz i jego współpracownicy opracowali metodę wirowania emulsji metodą wody w oleju (bez o)21,22. Ta metoda ma pięć ważnych cech. Po pierwsze, ponieważ GV przygotowane tą metodą mają niską blaszkowatość23,24, ich membrany są tak cienkie, że łatwo ulegają deformacji. Badano deformację błony GV indukowaną przez FtsZ (białko podziału komórek bakteryjnych), tubulinę i inne makrocząsteczki25,26,27,28, i zaobserwowaliśmy wielościenną deformację membran GV wywołaną enkapsulacją mikrosfer29,30. Po drugie, białka błonowe mogą być wstawione do błony pęcherzykowej za pomocą tej metody, aczkolwiek z trudnością31. Na przykład grupa Yomo wykorzystała tę metodę do zbadania syntezy in vitro i aktywności porotwórczej białka błonowego α-hemolizyna32. Po trzecie, możliwe jest wygenerowanie asymetrycznych GV, w których składniki lipidowe wewnętrznych i zewnętrznych listków są różne22. Na przykład Whittenton i in. wygenerowali asymetryczne GV z lipidami kationowymi w wewnętrznej ulotce w celu enkapsulacji ujemnie naładowanych polinukleotydów oraz z neutralnymi lipidami na zewnętrznej ulotce w celu zmniejszenia toksyczności i nieswoistego wychwytu komórkowego33. Po czwarte, stężenie i udział objętościowy substancji wewnątrz GV mogą być stosunkowo wysokie28,34. Po piąte, można obudować wiele rodzajów materiałów35. Na przykład Nishimura i in. zamknęli system transkrypcji i translacji in vitro w GV i wykorzystali system do ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) w GVs36. Te pięć cech sprawia, że wirowanie emulsyjne bez emulsji jest nieodzowną metodą generowania GV naśladujących komórki.
W poprzedniej pracy, GV generowane przez wirowanie były zbierane za pomocą strzykawki wyposażonej w długą igłę ze stali nierdzewnej 16 G, zawierającą część końcowego roztworu wodnego22. W rękach niedoświadczonych techników ta metoda zbierania może łatwo doprowadzić do zanieczyszczenia GV częścią oleju. W tym badaniu wykorzystaliśmy protokół wirowania emulsji bez użycia emulsji opracowany przez grupę Yomo23,37, w którym wytrącone GV są zbierane przez otwór otwarty na dnie probówki wirówkowej, w której są przygotowywane. Przygotowaliśmy GV zamykające mikrosfery 1,0 μm, które wielkością są zbliżone do organelli wewnątrzkomórkowych. Zastosowanie mikrosfer pozwoliło nam oszacować ich stężenie poprzez obliczenie ich ułamka objętościowego. Ustalenie metody przygotowania GV, w której materiały są gęsto upakowane, jest ważnym krokiem w tworzeniu sztucznych komórek. Aby potwierdzić użyteczność naszego protokołu dla różnych rodzajów materiałów wewnętrznych, wykazaliśmy również, że GFP i mała rozpuszczalna w wodzie cząsteczka fluorescencyjna (uranina) mogą być zamknięte w GV.

<table><tbody><tr><td>< SILNE>ODCZYNNIKI:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Cząsteczka błony pęcherzykowej</td></tr><tr><td>Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-fosphoethanolamine, sól trietyloamonowa (Texas Red DHPE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7,5)</td> <td>Nippon Gene Co.</td><td>318-90225</td><td>Roztwór buforowy</td></tr><tr><td>D(+)-glukoza</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>049-31165</td><td>Do zewnętrznego roztworu wodnego</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>196-00015</td><td>Do wewnętrznego roztworu wodnego</td></tr><tr><td>Mikrosfery karboksylowe Polybead 1,0 i mikro; m</td><td>Polysciences</td><td>08226-15</td><td>Niefluorescencyjny, 2R = 1,0 &mikro; m</td></tr><tr><td>Mikrosfery karboksylowe Fluoresbrite YG 1,0 i mikro; m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td>Fluorescencyjny, 2R = 1,0 &mikro; m</td></tr><tr><td>Mikrosfery karboksylowe Fluoresbrite YG 0,10 i mikro; m</td><td>Polysciences</td><td>16662-10</td><td>Fluorescencyjny, 2R = 0,10 &mikro; m</td></tr><tr><td>Sól sodowa fluoresceiny (uranina)</td><td>Sigma Aldrich Japan</td><td>F6377-100G</td><td></td></tr><tr><td>GFP standard (rekombinowany)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MB-0752</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>SPRZĘT: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5427R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5409000233</td><td>Wirnik wirówki: FA-45-48-11</td></tr><tr><td>Physcotron</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-310EIII</td><td>Poręczny mikrohomogenizator</td></tr><tr><td>Wał generatora Microtec</td><td>Co.</td><td>Przystawka do homogenizatora</td> <td>NS-4</td></tr><tr><td>Komory inkubacyjne Frame-Seal do in situ PCR i hybrydyzacji</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>SLF0201</td><td>Objętość komory hybrydyzacyjnej: 25 i mikro; L Wielkość komory: 9 i razy; 9 i razy; Komory</td></tr><tr><td>inkubacyjne 0,3 mm Frame-Seal do in situ PCR i hybrydyzacji</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>SLF0601</td><td>Objętość komory hybrydyzacyjnej: 65 &mikro; L&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Wielkość komory: 15 i razy; 15 i razy; </td></tr><tr><td>Pipeta Microman E</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td>0,3 mm do lepkiej cieczy. Za pomocą tego zmierzyliśmy ciekłą parafinę.</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus Co.</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Lusterko</td><td>Olympus Co.</td>Filtr wzbudzenia <td>U-FBNA</td><td>: 470 - 495 nm Filtr emisyjny: 510 - 550 nm</td></tr><tr><td>Jednostka lustrzana</td><td>Olympus Co.</td>Filtr wzbudzenia <td>U-FMCHE</td><td>: 565 - 585 nm Filtr emisyjny: 600 - 690 nm</td></tr></tbody></table>

otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Podejście biologii konstruktywnej i biologii syntetycznej do tworzenia sztucznego życia polega na oddolnym składaniu materiałów biologicznych lub niebiologicznych. Takie podejścia spotkały się z dużym zainteresowaniem w badaniach nad granicą między materią ożywioną i nieożywioną i zostały wykorzystane do budowy sztucznych komórek w ciągu ostatnich dwóch dekad. W szczególności pęcherzyki olbrzymie (GV) były często używane jako sztuczne błony komórkowe. W artykule opisano sposób otrzymywania GV kapsułkujących wysoko upakowane mikrosfery jako model komórek zawierających wysoce skondensowane biomolekuły. GV przygotowano za pomocą prostej metody wirowania emulsji typu woda w oleju. W szczególności homogenizator użyto do emulgowania roztworu wodnego zawierającego materiały, które mają być kapsułkowane, oraz oleju zawierającego rozpuszczone fosfolipidy, a otrzymaną emulsję ostrożnie nałożono warstwami na powierzchnię innego roztworu wodnego. System warstwowy został następnie odwirowany w celu wygenerowania GV. Ta potężna metoda została wykorzystana do hermetyzacji materiałów, od małych cząsteczek po mikrosfery.

Metoda wirowania emulsji w/o została przedstawiona fotograficznie i schematycznie na Rysunku 1. Schemat na Rysunku 1 sugeruje, że najważniejszym czynnikiem warunkującym sukces tej metody jest to, aby gęstość względna wewnętrznego roztworu wodnego była większa niż gęstość względna zewnętrznego roztworu wodnego, tak aby pęcherzyki gigantyczne (GVs) osadzały się podczas wirowania. Ponadto utworzenie monowarstwy lipidowej na granicy w/o wymaga schłodzenia układu przez 10 min po naniesieniu emulsji na zewnętrzny roztwór wodny. Ponieważ GVs tworzą się poprzez transfer kropli emulsji przez granicę w/o, ciśnienia osmotyczne w wewnętrznej i zewnętrznej warstwie wodnej muszą być identyczne. W ramach eksperymentu kontrolnego przygotowaliśmy również GVs niezawierające mikrosfer przy użyciu procesu przedstawionego na Rysunku 1 oraz w kroku 1.3, z wyjątkiem tego, że wewnętrzny roztwór wodny przygotowano bez dodatku mikrosfer.
Zbiór osadzonych GV po wirowaniu przedstawiono na Rysunku 2. Oprócz półprzezroczystej fazy na samym dnie mikroprowetki, zaobserwowano również białą, mętną fazę pośrednią w zewnętrznym roztworze wodnym (Rysunek 2a). Faza pośrednia była bogata w agregaty mikrosfer i oleju, podczas gdy faza dolna zawierała GV. Dlatego po przebiciu dna mikroprowetki szpilką (Rysunek 2b), zebrano tylko pierwszą kroplę (Rysunek 2c), która zawierała duże ilości GV. Ważne jest, aby upewnić się, że zebrano nie więcej niż dwie krople; każda kolejna kropla może zawierać agregaty mikrosfer i lipidów, co doprowadzi do obniżenia gęstości GV. Uzyskana dyspersja pęcherzykowa często zawierała materiały enkapsulowane poza GV, ponieważ GV często pękają podczas wirowania. Aby uzyskać wyłącznie GV, ze względu na rozmiary materiałów enkapsulowanych, należy wybrać metodę sortowania, taką jak dializa, filtracja żelowa lub sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Jeśli jest to konieczne dla celu, w którym osadzone GV mają zostać wykorzystane, można je rozcieńczyć zewnętrznym roztworem wodnym. W niektórych przypadkach faza pośrednia rozciągała się aż do dna probówki, co sugeruje, że wszelkie powstałe pęcherzyki były utrzymywane razem przez olej.
Uzyskano obrazy z mikroskopii interferencyjnej różnicowej oraz mikroskopii fluorescencyjnej dla GV bez mikrosfer (Rycina 3a, 3b) i z mikrosferami (Rycina 3c-3f). Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami23,37, zastosowany protokół doprowadził do powstania GV o niskiej lamellarności. W celu bezpośredniego potwierdzenia formowania pęcherzyków poprzez wizualizację cienkiej błony wykorzystano lipidy sprzężone z Texas Red DHPE, który emituje czerwoną fluorescencję. Spośród 55 uzyskanych GV, 55 enkapsulowało mikrosfery, a 105 pozostało pustych, co dało współczynnik enkapsulacji na poziomie 34%.
Ułamkową zawartość objętościową (φ, vol %) mikrosfer w GV określono za pomocą następującej metody. Ponieważ każda GV zawiera od kilkudziesięciu do kilkuset mikrosfer, policzenie wszystkich mikrosfer pod mikroskopem optycznym jest trudne. Dlatego zmieszaliśmy niefluorescencyjne mikrosfery o rozmiarze 1,0 µm z niewielką ilością mikrosfer fluorescencyjnych, które policzono ręcznie pod mikroskopem fluorescencyjnym. Całkowitą liczbę (N) enkapsulowanych mikrosfer obliczono, mnożąc liczbę (n) ręcznie policzonych mikrosfer fluorescencyjnych przez 20 (na podstawie pierwotnego stosunku objętościowego 95:5 [v/v] mikrosfer niefluorescencyjnych do fluorescencyjnych). Wartość φ oszacowano następnie jako Nv100/V, gdzie v to objętość mikrosfer, a V to objętość pojedynczej GV. Należy zauważyć, że szacowanie N na podstawie n prowadzi do błędów w liczeniu, które należy uwzględnić przy obliczaniu φ. Wartość φ oszacowano z N, które obliczono bezpośrednio jako 20n, co z kolei doprowadziło do prawdopodobieństwa, że φ dokładnie odzwierciedla prawdziwą wartość, na poziomie &lt;50%. W rzeczywistości N w pewnym stopniu fluktuuje wokół wartości 20n, dlatego należy przyjąć ją jako 20(n ±i), gdzie i jest błędem w n. Oszacowaliśmy i w taki sposób, aby prawdopodobieństwo wystąpienia n ±i mogło wynieść ponad 50%, w oparciu o rozkład Poissona. Oszacowanie i pozwoliło nam obliczyć 20(n ± i) oraz wartości φ uwzględniające błędy liczenia dla GV o średnicach 10 i 15 µm (Tabela 1). Zgodnie z tą procedurą, ułamkową zawartość objętościową mikrosfer w GV pokazanej na Rysunku 3c oszacowano na 11 ±3 vol %. Precyzja obliczonej zawartości objętościowej wyniosła 10-30%.
Nasze wyniki wskazują, że z powodzeniem enkapsulowano mikrosfery o średnicy 1 μm w GVs przy wysokiej frakcji objętościowej. Byliśmy również w stanie enkapsulować inne materiały w GVs z 100 mol % DOPC, stosując ten sam zewnętrzny roztwór wodny i ten sam protokół (Rycina 4). W szczególności, GVs zawierające mikrosfery o średnicy 0,1 µm przygotowano z roztworu buforowanego Trisem, zawierającego 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M sacharozę oraz 0,5 vol % fluorescencyjnych mikrosfer, zgodnie z protokołem opisanym dla GVs zawierających mikrosfery o średnicy 1,0 µm (Rycina 4a). Postępując zgodnie z powyższym protokołem, przygotowano również GVs z DOPC zawierające GFP (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sacharozy i 100 µg/mL GFP; Rycina 4b) oraz GVs zawierające uraninę (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sacharozy i 30 µM uraniny; Rycina 4c).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>n</td>
			<td>N</td>
			<td>φ (10-µm średnica)</td>
			<td>φ (15-µm średnica)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>60 ± 20</td>
			<td>6.0 ± 2.0</td>
			<td>1.8 ± 0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>80 ± 20</td>
			<td>8.0 ± 2.0</td>
			<td>2.4 ± 0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>100 ± 20</td>
			<td>10 ± 2</td>
			<td>3.0 ± 0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>120 ± 30</td>
			<td>12 ± 4</td>
			<td>3.6 ± 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>200 ± 32</td>
			<td>20 ± 3</td>
			<td>5.9 ± 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>400 ± 45</td>
			<td>40 ± 5</td>
			<td>12 ± 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>600 ± 55</td>
			<td>-</td>
			<td>18 ± 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">a Błędy określono zgodnie z opisem w tekście; n = liczba przeliczonych ręcznie mikrosfer; N = całkowita liczba enkapsulowanych mikrosfer.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Liczby i ułamki objętościowe (φ, vol%) mikrosfera. a Błędy określono zgodnie z opisem w tekście; n = liczba ręcznie przeliczonych mikrosfer; N = całkowita liczba enkapsulowanych mikrosfer.
<img alt="Schemat procesu emulsji olej-woda z wirowaniem, pokazujący tworzenie się dyspersji pęcherzykowej." src="/files/ftp_upload/55282/55282fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat blokowy i przedstawienie schematyczne metody wirowania emulsji W/O. (a) Roztwór olejowy składający się z DOPC i Texas Red DHPE (stosunek molowy 100:0,3) w parafini ciekłej. (b) Wewnętrzna dyspersja wodna składająca się z sacharozy i mikrosfer w buforze Tris-HCl. (c) Zewnętrzny roztwór wodny składający się z glukozy w buforze Tris-HCl. (d) Mieszanina 1 ml roztworu olejowego i 300 µl wewnętrznej dyspersji wodnej. (e) Emulsyfikacja za pomocą homogenizatora (10 000 rpm, 2 min). (f) Emulsja w/o. (g) Nakładanie 300 µl emulsji na 1 ml zewnętrznego roztworu wodnego. (h) Osadzone GVs bezpośrednio po wirowaniu. (i) Schematyczne przedstawienie zasady metody wirowania emulsji w/o. Czarna strzałka wskazuje kierunek przyspieszenia odśrodkowego. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces wytrącania białek; probówki do mikrocentryfugi; metoda laboratoryjna; przygotowanie próbki." src="/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przebijanie mikroprobówki. (a) Wytrącone GVs bezpośrednio po wirowaniu (przedstawione również na Rysunku 1h). Czerwona elipsa wskazuje kroplę zawiesiny wytrąconych GV. (b) Przebijanie mikroprobówki szpilką. Osad zawierający GVs uzyskano poprzez przebicie mikroprobówki szpilką w pobliżu dna i zebranie kropli z otworu. (c) Kropla zawiesiny wytrąconych GVs (wskazana żółtą strzałką) rozcieńczona zewnętrznym roztworem wodnym. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie komórek: obrazy mikroskopowe stanów komórkowych, markery fluorescencyjne; analiza morfologii komórek." src="/files/ftp_upload/55282/55282fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obrazy mikroskopowe GV. (a) Obraz z mikroskopii kontrastowej różnicowej (DIC) GV bez mikrosfer. Średnica GV wynosiła około 10 µm. Pasek skali = 10 µm. (b) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej GV bez mikrosfer. Czerwona fluorescencja była emitowana przez Texas Red DHPE. (c) Obraz z mikroskopii kontrastowej różnicowej (DIC) GV zawierającej mikrosfery. (d) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej mikrosfer o rozmiarze 1,0 µm (karboksylowane mikrosfery YG) wewnątrz GV. Liczba policzonych mikrosfer fluorescencyjnych (n) wynosiła 6. Błędy zostały oszacowane (i = 2) na podstawie rozkładu Poissona. Następnie oszacowano całkowitą liczbę mikrosfer wewnętrznych (N = 20 (n ±i)), która wyniosła 120 ±40. Obliczono, że GV zawierały mikrosfery 1,0 µm przy ułamku objętościowym (φ = Nv100/V) wynoszącym około 11 ± 3 vol%, gdzie v to objętość mikrosfer, a V to objętość GV. (e) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej błony GV. Czerwona fluorescencja była emitowana przez Texas Red DHPE. (f) Nałożony obraz z paneli d i e. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii komórkowej; analiza fluorescencyjna; wyniki eksperymentalne; porównanie struktur komórkowych." src="/files/ftp_upload/55282/55282fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obrazy z mikroskopii kontrastowo-fazowej (DIC) i fluorescencyjnej pęcherzyków GV z różnymi enkapsulowanymi materiałami. Obrazy z mikroskopii kontrastowo-fazowej (góra) i mikroskopii fluorescencyjnej (dół) pęcherzyków GV zawierających (a) mikrosfery 0.1 µm, (b) GFP oraz (c) uraninę. Paski skali = 10 µm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Gigantyczne pęcherzyki zawierające wysoko upakowane składniki o rozmiarach mikrometrów są użytecznymi modelami komórek. Metoda wirowania emulsji typu woda w oleju jest prostym, ale potężnym narzędziem do przygotowywania gigantycznych pęcherzyków z zamkniętymi materiałami.

Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Ogólnym celem tej metody wirowania emulsji woda w oleju jest łatwe przygotowanie warstwy cienkiej pęcherzyków olbrzymich. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii syntetycznej, takie jak stworzenie sztucznej komórki opartej na pęcherzyku olbrzymim. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 25 mM roztwór zapasowy DOPC oraz 0,2 mM roztwór zapasowy Texas Red DHPE w chloroformie.Następnie, poprzez odparowanie mieszaniny roztworów stokowych DOPC oraz Texas Red DHPE w strumieniu gazowego azotu, wytwórz film lipidowy na wewnętrznej powierzchni szklanej fiolki o pojemności pięciu mililitrów. Po inkubowaniu filmu pod zmniejszonym ciśnieniem przez noc, dodaj do fiolki jeden mililitr parafiny ciekłej. Owiń fiolkę folią aluminiową i inkubuj mieszaninę w temperaturze 80 °C przez noc.W probówce mikroskalowej z zakrętką o pojemności 1,5 ml wymieszać 237,5 µl niefluorescencyjnych mikrosfer o średnicy 1 µm oraz 12,5 µl fluorescencyjnych mikrosfer o średnicy 1 µm. Następnie do probówki dodać 64 mg sacharozy, a potem 125 µl 1 M buforu Tris oraz 875 µl wody dejonizowanej. Mieszaninę mieszać w wirówce vortex przez 30 sekund, a następnie poddać sonikacji przez 10 minut.Po przygotowaniu 10 mililitrów roztworu buforowego Tris, przelej jeden mililitr do probówki mikrotubowej z zakrętką o pojemności 1,5 mililitra. Po wymieszaniu roztworu w wirówce typu vortex i poddaniu go sonikacji, zmieszaj jeden mililitr roztworu olejowego z 300 mikrolitrami wewnętrznego roztworu wodnego w probówce mikrotubowej o pojemności 1,5 mililitra. Z乳yfyj oba składniki w probówce mikrotubowej, używając homogenizatora mechanicznego pracującego z prędkością 10 000 rpm przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Następnie ostrożnie nanieś 300 µL emulsji woda-w-oleju na górną powierzchnię 1 mL zewnętrznego roztworu wodnego w temperaturze 4 °C w zakręcanej mikroporce o pojemności 1,5 mL. Bezpośrednio po schłodzeniu mikroporce przez 10 minut odwiruj mieszaninę z prędkością 18 000 ×g przez 30 minut. Po zakończeniu procesu odzyskaj osadzone pęcherzyki olbrzymie (GVs), przebijając dno mikroporce pinezką i zbierając jedną kroplę do sterylnej mikroporce o pojemności 1,5 mL.Umieść przylepną komorę inkubacyjną do NC two reakcji łańcuchowej polimerazy i hybrydyzacji na szkiełku podstawowym do mikroskopu. Za pomocą mikropipety nanieś 25 µL rozcieńczonych wytrąconych GVs na obszar preparatu i natychmiast nałóż na komorę inkubacyjną szkiełko nakrywkowe o grubości 0,15 mm. Po zarejestrowaniu obrazów mikroskopowych pęcherzyków, przeprowadź mikroskopię fluorescencyjną, wkładając najpierw do mikroskopu jednostki luster fluorescencyjnych UFBNA oraz UFMCHE.Następnie wyposaż jednostki w filtry wzbudzenia i filtry emisji do analizy. Najważniejszym czynnikiem warunkującym sukces metody woda-w-oleju jest to, że gęstość względna wewnętrznego roztworu wodnego musi być większa niż gęstość względna zewnętrznego roztworu wodnego, aby pęcherzyki GVs osadzały się podczas wirowania. Mikroskopia interferencyjna różnicowa oraz mikroskopia fluorescencyjna pęcherzyków GVs bez mikrosfer oraz z mikrosferami potwierdziły powstanie GVs o niskiej lamellarności.Z 160 uzyskanych GV, 55 zawierało enkapsulowane mikrosfery, a 105 było pustych, co dało stosunek enkapsulacji na poziomie 34%. Ułamek objętości mikrosfer w GV oszacowano na około 11 ± 3% objętości, a precyzja obliczonego ułamka objętości wynosiła 10–30%. Enkapsulacja innych materiałów w GV składających się w 100% molowych z DOPC, z wykorzystaniem tego samego zewnętrznego roztworu wodnego i tego samego protokołu, zakończyła się sukcesem, co potwierdzono za pomocą mikroskopii interferencyjnej różnicowej oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak cytometria przepływowa, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. w celu wyjaśnienia charakterystyki modelowanej komórki.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować gigantyczne pęcherzyki z enkapsulowanymi materiałami.

preparation-giant-vesicles-encapsulating-microspheres-centrifugation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Łącząc generowanie monodyspersyjnych kropli z inercyjnym porządkowaniem komórek i cząsteczek, opisujemy metodę enkapsulacji pożądanej liczby komórek lub cząsteczek w pojedynczej kropli z częstotliwością rzędu kHz. Wykazujemy wydajność dwukrotnie przekraczającą wydajność enkapsulacji nieuporządkowanej w przypadku kropli z jedną lub dwiema cząsteczkami.

Wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek

Niniejszy protokół opisuje metodę ekstruzji służącą do przygotowania pęcherzyków lipidowych o rozmiarach submikronowych i wysokim stopniu jednorodności. Metoda ta wykorzystuje system z kontrolą ciśnienia i regulowanym przepływem azotu do przygotowania liposomów. W opracowaniu przedstawiono przygotowanie lipidów1,2, ekstruzję liposomów oraz charakterystykę ich rozmiaru.

Metoda ekstruzji z kontrolowanym stałym ciśnieniem do przygotowania nano-rozmiarowych pęcherzyków lipidowych

Tutaj prezentujemy dwa ultraszybkie protokoły do rekonstytucji białek błonowych w fuzogenne proteoliposomy oraz fuzji takich proteoliposomów z docelowymi dwuwarstwami lipidowymi w celu bezdetergentowego dostarczania tych białek błonowych do dwuwarstwy pofuzyjnej. Połączenie tych podejść umożliwia szybki i łatwy w obsłudze montaż złożonych, wieloskładnikowych systemów membranowych.

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Prezentujemy technikę bezdotykowej mikromanipulacji pęcherzykami, wykorzystując zlokalizowane gradienty jonów wapnia. Mikroiniekcja roztworu jonów wapnia w pobliżu gigantycznego pęcherzyka lipidowego jest wykorzystywana do przebudowy błony lipidowej, w wyniku czego powstają wypukłości rurki błonowe.

Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Celem protokołu jest wiarygodny pomiar właściwości mechanicznych membrany gigantycznych pęcherzyków za pomocą aspiracji mikropipet.

Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami

Ten artykuł przedstawia prostą metodę szybkiego wytwarzania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych z zamkniętymi białkami cytoszkieletu. Metoda ta okazuje się przydatna do oddolnego odtwarzania struktur cytoszkieletu w zamknięciu i interakcjach cytoszkielet-błona.

Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Przedstawiamy protokół do odtwarzania białek błonowych i enkapsulacji enzymów oraz innych rozpuszczalnych w wodzie składników w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach sub-mikrometrowych i mikrometrowych.

Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

Ten przewodnik dla początkujących przedstawia ogólny protokół przygotowania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) metodą przenoszenia kropel, omawiając krytyczne etapy i dostarczając informacji, które pomogą w możliwych korektach wymaganych dla różnych zastosowań, w tym biologii syntetycznej i mikrorobotyki.

Wykorzystanie metody przenoszenia kropelek w celu niezawodnego przygotowania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Ten artykuł przedstawia prostą jednoetapową rekonstrukcję sieci cytoszkieletu wewnątrz oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzyków. Metodę tę można uogólnić i zastosować do enkapsulacji lub uwięzienia szerokiego zakresu biomolekuł.

Metody in vitro Rekonstrukcja sieci cytoszkieletu w oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV)

Poznaj metodę odwirowania emulsji woda-w-olej do otrzymywania gigantycznych pęcherzyków z mikrosferami. Technika ta umożliwia tworzenie modeli sztucznych komórek w biologii syntetycznej z efektywnością enkapsulacji około 34%.

Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju

Przeglądaj więcej filmów