Name: Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę pomiaru alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej w immunologii transplantacyjnej. Technika ta umożliwia analizę interakcji komórek T z komórkami prezentującymi antygen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.C.J. był wspierany przez International Society for Heart and Lung Transplantation Research Fellowship oraz Royal College of Physicians and Surgeons of Canada Detweiler Travelling Fellowship.S.M. był częściowo wspierany przez International Society for Heart and Lung Transplantation Career Development Award (dla S.C.J.). S.S. był wspierany przez National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.J.H. jest laureatem Kidney Research U.K. Senior Stypendium niekliniczne. Praca ta została sfinansowana z następujących grantów dla A.B. i K.W.: Wellcome Trust Programme Grant (082519Z07Z), British Heart Foundation Programme Grant (PG/10/62.28504) oraz Programu Ramowego UE 7 (ONE Study; BioDRIM). Autorzy pragną podziękować Michaelowi Parsonsowi i Flow Cytometry Core Facility w Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, Toronto za zapewnienie dostępu i wsparcia z instrumentem ImageStream Mark X.

<ol><li>Cravedi, P., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+monitoring+in+transplantation+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Immunologic monitoring in transplantation revisited.</a> Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Pearson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assessment+of+transplantation+tolerance+induced+by+anti-CD4+monoclonal+antibody+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model.</a> Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).</li>
<li>Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+tolerance+twelve+years+after+prospective+withdrawal+of+immunosuppressive+drugs%3A+studies+of+chimerism+and+anti-donor+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity.</a> Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).</li>
<li>Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+precursor+frequency+does+not+correlate+with+either+the+incidence+or+severity+of+graft-versus-host+disease+after+matched+unrelated+donor+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation.</a> Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).</li>
<li>Roelen, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+cytotoxic+alloreactivity+under+different+immunosuppressive+regimens+in+clinical+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation.</a> Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).</li>
<li>VanBuskirk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+allograft+acceptance+is+associated+with+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human allograft acceptance is associated with immune regulation.</a> J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).</li>
<li>Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panel+of+reactive+T+cells+as+a+measurement+of+primed+cellular+alloimmunity+in+kidney+transplant+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).</li>
<li>Zitzner, J. R., Tambur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ELISPOT+Assays+in+Risk+Assessment+Pre-+and+Post-Kidney+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation.</a> Cells. 1 (2), 100-110 (2012).</li>
<li>Newell, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+B+cell+signature+associated+with+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).</li>
<li>Brouard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+peripheral+blood+transcriptional+biomarker+panel+associated+with+operational+renal+allograft+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).</li>
<li>Sagoo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cross-platform+biomarker+signature+to+detect+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).</li>
<li>Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assessment+of+disease+states+in+kidney+transplant+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples.</a> Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+blood+gene+signatures+for+the+diagnosis+of+renal+and+cardiac+acute+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection.</a> PLoS One. 8 (12), e82153(2013).</li>
<li>Khatri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+rejection+module+%28CRM%29+for+acute+rejection+across+multiple+organs+identifies+novel+therapeutics+for+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation.</a> J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).</li>
<li>Halloran, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+diagnosis+of+antibody-mediated+rejection+in+kidney+transplant+biopsies%3A+an+international+prospective+study+%28INTERCOM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM).</a> Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).</li>
<li>Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biomarkers+and+functional+assays+to+monitor+cell-therapy-induced+tolerance+in+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).</li>
<li>Miqueu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peripheral+T-cell+repertoire+in+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients.</a> Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).</li>
<li>Morris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+donor-reactive+T+cells%3A+Evidence+for+clonal+deletion+in+tolerant+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients.</a> Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210(2015).</li>
<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+engagement+delivers+a+stop+signal+to+migrating+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).</li>
<li>Goldsmith, M. A., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+signal+transduction+by+the+antigen+receptor+without+commitment+to+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation.</a> Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes.</a> Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).</li>
<li>Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+CD4%28%2B%29+T+Cell+Alloreactivity+and+Its+Control+by+Regulatory+T+Cells+Using+Time-Lapse+Microscopy+and+Immune+Synapse+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection.</a> Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).</li>
<li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+matter%3A+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).</li>
<li>Burbach, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regulation+of+integrin-dependent+T+cell+conjugate+formation+and+NF-kappa+B+activation+by+the+adapter+protein+ADAP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP.</a> J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).</li>
<li>Markey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-dressing+by+donor+dendritic+cells+after+allogeneic+bone+marrow+transplantation+contributes+to+formation+of+the+immunological+synapse+and+maximizes+responses+to+indirectly+presented+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen.</a> J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).</li>
<li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
<li>Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cellular+events+in+a+systemic+graft-vs.-host+reaction.+II.+Autoradiographic+estimates+of+the+frequency+of+donor+lymphocytes+which+respond+to+each+Ag-B-determined+antigenic+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex.</a> J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).</li>
<li>Macedo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+naive+and+memory+T-cell+populations+to+the+human+alloimmune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response.</a> Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).</li>
<li>Noorchashm, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+method+for+the+calculation+of+alloreactive+CD4%2B+T+cell+precursor+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency.</a> Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).</li>
<li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo%3A+new+answers+to+an+old+question%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li>
<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+recognition+of+allopeptides+promotes+the+development+of+cardiac+allograft+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).</li>
<li>Pickl, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characteristics+of+dendritic+cells+generated+from+highly+purified+CD14%2B+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes.</a> J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Francis, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transplantation+tolerance+converts+potential+effector+T+cells+into+graft-protective+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).</li>
<li>Faust, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T+cell+TGFbeta+signaling+and+IL-17+in+allograft+acceptance+and+fibrosis+associated+with+chronic+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection.</a> J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+CD4+Th17+cells+in+mediating+cardiac+allograft+rejection+and+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy.</a> J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).</li>
<li>Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+alloreactive+T+cell+repertoire+using+high-throughput+sequencing+of+mixed+lymphocyte+reaction+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture.</a> PLoS One. 9 (11), e111943(2014).</li>
<li>Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+indirect+allorecognition+in+lung+transplant+recipients+with+obliterative+bronchiolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis.</a> Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).</li>
<li>Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+direct+and+indirect+T+cell+alloreactivity+during+allograft+rejection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice.</a> J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+direct+and+indirect+recognition+pathways+to+T+cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity.</a> J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obrazowa cytometria przepływowa została wykorzystana do wykazania tworzenia synaps immunologicznych między monoklonalnymi limfocytami T a APC lub w obecności superantygenów 24,25,26,27,28. Metoda ta wykorzystuje fakt, że po produktywnym kontakcie limfocytów T z APC, limfocyty T przegrupowują swój cytoszkielet aktynowy, polaryzując go w kierunku miejsca kontaktu21. To przegrupowanie nie zachodzi bez sygnalizacji TCR, a zatem jest wczesnym korelatem aktywacji komórek T 19,20,21. Przedstawiona tutaj metoda dostosowuje to podejście do pomiaru częstości alloreaktywnych limfocytów T w populacjach poliklonalnych komórek T. W związku z tym może w przyszłości posłużyć jako podstawa do opracowania testów reaktywności dawcy w transplantacji klinicznej.
Chociaż nie dokonano jeszcze bezpośrednich porównań, wykrywanie alloreaktywnych synaps immunologicznych wydaje się mieć większą moc predykcyjną niż konwencjonalny MLR. Na przykład wcześniejsze prace wykazały, że w opisanym powyżej protokole tolerancji wyniki MLR nie są wiarygodnie skorelowane z wynikiem przeszczepu2.
Opracowano szereg testów dla stanu tolerancji operacyjnej u ludzi 9,10,11, chociaż nie mierzą one funkcji komórek efektorowych w odpowiedzi na alloantygen. W przeciwieństwie do tego, testy IFNγ ELISPOT8 mierzą funkcję efektorowych limfocytów T, ale nie mogą uchwycić pełnego spektrum wydzielania cytokin, które mogą być istotne dla ostrego i przewlekłego odrzucenia przeszczepu allogenicznego, takich jak IL-1738,39. Test rozcieńczeniaograniczającego 4, który jest pracochłonny, oraz test trans-vivo 6, który wymaga myszy, mają znaczne ograniczenia praktyczne, które utrudniałyby ich zastosowanie w warunkach klinicznych. Ostatnie ulepszenia w analizie proliferujących komórek za pomocą analizy sekwencji TCR limfocytów T reagujących w MLR mogą być cenne, ale podobnie jak przedstawiony tutaj test, będą wymagały dalszej walidacji w badaniach klinicznych18,40.
Dalszy rozwój testu wykrywania synaps immunologicznych będzie wymagał odpowiedzi na szereg ważnych pytań. Po pierwsze, opracowany test mierzy tylko bezpośrednią alloreaktywność. Bezpośrednia ścieżka polega na prezentacji allogenicznych kompleksów MHC/peptyd na APC pochodzących od dawcy. Te ostatnie są na ogół eliminowane szybko po przeszczepie, a dalsza prezentacja alloantygenu jest przeprowadzana przez APC biorcy prezentujące nienaruszone MHC dawcy (szlak półbezpośredni) lub przetworzone antygeny dawcy na własnym MHC (szlak pośredni). Szlak pośredni jest ważnym czynnikiem powodującym przewlekłe odrzucenie przeszczepu allogenicznego33,41.
Zasadniczo powinno być możliwe wykrycie pośrednich synaps immunologicznych za pomocą tego testu, ale pośrednio alloreaktywne limfocyty T mają znacznie niższą częstotliwość niż bezpośrednie42,43, co oznacza, że wymagana będzie analiza większej liczby zdarzeń. Drugą kwestią jest to, że przetestowaliśmy ten test tylko przy użyciu limfocytów T CD4 +, podczas gdy limfocyty T CD8 + są również ważnym elementem odpowiedzi anty-donorowej. Ponownie, powinno być możliwe wykrycie synaps CD8 + limfocytów T-APC za pomocą tej metody. Kolejnym ograniczeniem jest to, że metoda wymaga ręcznego przeglądu i analizy obrazów komórek w końcowej bramce kontaktowej błony, a obecnie pracujemy nad automatyzacją tego etapu.
Wreszcie, metoda wymaga testów i rozwoju na ludziach, a obecnie prowadzone są wstępne badania na próbkach ludzkich. Dalsza analiza fenotypowych podzbiorów limfocytów T (tj. efektorowych, pamięciowych, regulacyjnych itp.) w połączeniu z wykrywaniem synaps immunologicznych u biorców przeszczepów stanowiłaby skuteczne podejście do charakteryzowania repertuaru alloreaktywnych limfocytów T i będzie ważnym celem przyszłych prac.

Przeszczep narządów stałych zmienił sposób opieki nad pacjentami ze schyłkowymi chorobami nerek, wątroby, serca i płuc. Jednak ze względu na rozbieżności w głównych i drugorzędnych antygenach zgodności tkankowej, przeszczepy allogeniczne są szybko odrzucane przez limfocyty T biorcy, jeśli nie stosuje się leków immunosupresyjnych. Środki te mają liczne działania niepożądane, w tym ryzyko raka i dysfunkcji narządów. Głównym celem klinicznym jest zatem obniżenie dawki immunosupresji do minimalnego poziomu wymaganego do zapobieżenia odrzuceniu przeszczepu allogenicznego. Poziom ten może się różnić w zależności od stopnia aktywacji wrodzonego układu odpornościowego; stopień niezgodności alloantygenów między dawcą a biorcą; oraz różnice między pacjentami w funkcji immunologicznej, farmakokinetyce i farmakodynamice.
Niestety, klinicyści transplantacyjni nie dysponują żadnymi narzędziami do dokładnej oceny reaktywności dawców u poszczególnych pacjentów1. Mieszana reakcja leukocytów (MLR) może wykryć reaktywność dawcy, ale nie jest w stanie wiarygodnie przewidzieć wyniku przeszczepu2,3. Testy ograniczające rozcieńczanie, cytokiny ELISPOTs i test trans-vivo albo mierzą ograniczony zakres odpowiedzi, albo nie są praktyczne4,5,6,7,8. Profile ekspresji genów ujawniły sygnatury związane z tolerancją operacyjną9,10,11,12 i odrzucenie13,14,15, ale nie zawsze można je uogólnić na populacje16 i ostatecznie mogą mieć ograniczoną przydatność w pacjentów indywidualnych. Opracowano również analizy sekwencyjne receptora limfocytów T (TCR) limfocytów T w krwi obwodowej class17 lub proliferujących w MLR18, ale wymagają dalszej walidacji.
Koncepcyjnie, pożądane byłoby posiadanie testu, który wykrywa najwcześniejsze wymagane etapy aktywacji limfocytów T biorcy przez antygen dawcy. Ponieważ hodowla komórek w ciągu kilku dni (jak w MLR) może wprowadzać artefakty, taki test w idealnym przypadku nie wymagałby pomiaru dalszych zdarzeń, takich jak proliferacja lub funkcja efektorowa. Równie dobrze jednak pożądane byłoby, aby test zależał od jakiegoś elementu funkcji limfocytów T, ponieważ czysto opisowe oceny (np. sekwencjonowanie TCR) mogą nie być w stanie odróżnić limfocytów T anergicznych od funkcjonalnych.
Liczne badania wykazały, że długotrwały kontakt T-APC jest niezbędny do wytworzenia synapsy immunologicznej, co jest niezbędnym pierwszym krokiem w odpowiedzi komórek T19,20,21,22. Niedawno informowaliśmy, że podczas dynamicznego obrazowania poklatkowego in vitro około 5 - 10% mysich limfocytów T CD4 + tworzy długotrwałe kontakty z allogenicznymi komórkami dendrytycznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMDC)23. Częstość długotrwałego kontaktu była zwiększona u zwierząt, które odrzuciły przeszczep, podczas gdy u myszy, które wcześniej stały się tolerancyjne na te same antygeny, utrzymywała się na poziomie obserwowanym u myszy nieprzeszczepionych23. Przedłużone interakcje były zmniejszone w obecności limfocytów Treg biorcy i zwiększone pod ich nieobecność, a podobne zjawiska zaobserwowaliśmy przy użyciu ludzkich limfocytów T i allogenicznych DC pochodzących z monocytów (MoDCs)23.
Jednak liczenie długotrwałych kontaktów nawiązanych w populacji poliklonalnych komórek T jest czasochłonne i pracochłonne. Dlatego wykorzystaliśmy obrazową cytometrię przepływową do zbadania tworzenia się allogenicznych synaps immunologicznych. Obrazowa cytometria przepływowa łączy w sobie wieloparametryczne możliwości pozyskiwania i analizy danych konwencjonalnej cytometrii przepływowej z możliwościami obrazowania pojedynczych komórek mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta została wykorzystana przez innych badaczy do badania tworzenia synaps immunologicznych przez monoklonalne limfocyty T24,26,27lub w obecności superantygenów28. Jednak w takich warunkach częstotliwość odpowiedzi limfocytów T waha się od 30 do 100%, podczas gdy ogólnie szacuje się, że alloreaktywne limfocyty T stanowią 5-15% całkowitego repertuaru limfocytów T29,30,31,32. Co ważne, wykazaliśmy, że obrazowa cytometria przepływowa może dostarczyć bardzo porównywalnego pomiaru częstości alloreaktywnych limfocytów T23 oraz że zmiany częstości synaps w populacji poliklonalnych komórek T są predyktorem wyniku przeszczepu23. Obecnie podejście to zostało zoptymalizowane pod kątem pomiaru bezpośredniej alloreaktywności limfocytów T CD4 +, ale w zasadzie można je również opracować w celu zbadania limfocytów T CD8 + i szlaku pośredniego. Uważa się, że alloreaktywność pośrednia staje się coraz bardziej istotna w dłuższym okresie po przeszczepie33. Obecnie rozwijamy tę metodę z wykorzystaniem komórek ludzkich, co pozwoli na przeprowadzanie badań na pacjentach. W związku z tym w przyszłości ogólne podejście może być przydatne do funkcjonalnej oceny odpowiedzi limfocytów T u biorców przeszczepów przed przeszczepem; bezpośrednio po przeszczepie; i w dłuższej perspektywie, gdy minimalizacja leków staje się ważnym celem.

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Różne</td><td>odmiany</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodianotetraoctowy, roztwór 0,5 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Niejonowy detergent Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>składa się w 37% z formaldehydu, dlatego należy go rozcieńczyć 25 razy w celu uzyskania 1,5%</td></tr><tr><td>roztworu Sitka do komórek, 70 &mu; m wielkość porów</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian falloidyny-fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoaktynomycyna D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1310</td><td>Rekonstytucja w DMSO</td></tr><tr><td>Anty-mysia koniugacja allofikocyjaniny CD90.2</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>Pacyficzny niebieski sprzężony anty-mysz CD11b</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>Błękit pacyficzny został zastąpiony przez eFluor 450</td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-mysz CD3</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-mysz MHC klasy II</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-mysz B220</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-mysz CD8</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-mysz CD19</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki antybiotynowe</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny separator komórek MidiMACS</td><td>MIltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowana mysz GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki TGF i beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>Ludzki TGF&beta; 1 działa na komórki myszy</td></tr><tr><td>Amnis ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Obrazujący cytometr przepływowy; Szczegóły dostępne na stronie http://www.emdmillipore.com/</td></tr> <tr><td>IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Bezpłatne pobieranie (wymagana rejestracja): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Różne</td><td>Różni</td><td></td></tr> się <tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Różne</td><td>Różne Płytki</td><td></td></tr><tr><td>do hodowli komórkowych</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar alloreaktywności limfocytów t za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Pomiar reaktywności immunologicznej na antygeny dawcy u biorców przeszczepów prawdopodobnie będzie kluczowy dla skutecznego zmniejszenia lub wycofania immunosupresji. Mieszana reakcja leukocytowa (MLR), testy ograniczającego rozcieńczenia i test nadwrażliwości trans-vivo typu opóźnionego (DTH) zostały zastosowane do tego pytania, ale metody te mają ograniczoną zdolność przewidywania i / lub znaczące ograniczenia praktyczne, które zmniejszają ich przydatność. Obrazowa cytometria przepływowa to technika, która łączy wieloparametryczne ilościowe moce cytometrii przepływowej z możliwościami obrazowania mikroskopii fluorescencyjnej. Niedawno wykorzystaliśmy metodę obrazowania metodą cytometrii przepływowej, aby określić odsetek limfocytów T biorcy zdolnych do tworzenia dojrzałych synaps immunologicznych z komórkami prezentującymi antygen dawcy (APC). Korzystając z dobrze scharakteryzowanego modelu przeszczepu serca u myszy, wykazaliśmy, że częstość występowania synaps immunologicznych in vitro wśród zdarzeń kontaktu z błoną T-APC silnie przewidywała wynik przeszczepu allogenicznego w przypadku odrzucenia, tolerancji i sytuacji, w której przeżycie przeszczepu zależy od indukowanych limfocytów T regulatorowych. Częstość kontaktów T-APC zwiększała się z limfocytami T myszy podczas ostrego odrzucenia i zmniejszała się z limfocytami T od myszy, które przestały reagować na alloantygen. Dodanie regulatorowych limfocytów T do systemu in vitro zmniejszyło przedłużone kontakty T-APC. Co ważne, efekt ten zaobserwowano również w przypadku ludzkich poliklonalnie rozszerzonych, naturalnie występujących regulatorowych limfocytów T, o których wiadomo, że kontrolują odrzucanie tkanek ludzkich w humanizowanych modelach mysich. Dalszy rozwój tego podejścia może pozwolić na głębszą charakterystykę kompartmentu alloreaktywnych limfocytów T u biorców przeszczepów. W przyszłości dalszy rozwój i ocena tej metody z wykorzystaniem komórek ludzkich może stanowić podstawę testów stosowanych do selekcji pacjentów pod kątem minimalizacji immunosupresji, a także może być wykorzystana do pomiaru wpływu terapii tolerogennych w klinice.

Metodę tę zastosowano do zbadania CD4+ Alloreaktywność limfocytów T u myszy poddanych tolerancji na alloantygeny dawcy przed heterotopowym przeszczepieniem allograftu serca. myszy CBA (H-2k) zastosowano protokół toleryzujący obejmujący specyficzne dla dawcy (B6, H-2b) transfuzja krwi w połączeniu z niedeplecyjnym przeciwciałem anty-CD4 na miesiąc przed przeszczepieniem serca od dawcy B6. Protokół ten prowadzi do długoterminowego przeżycia allograftu zależnego od Foxp3+ limfocyty T regulatorowe36,37Siedem dni po transplantacji, CD4 śledzionowe+ Limfocyty T pobrano od biorców allograftów serca B6 ztolerowanych i nietolerowanych, a następnie inkubowano je wspólnie z komórkami dendrytycznymi pochodzącymi z szpiku kostnego myszy B6 zgodnie z niniejszym protokołem. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne dane z tego eksperymentu. Bramka kontaktu błony jest pokazana w Rycina 2A, z zielonymi celownikami umieszczonymi na zdarzeniu synaptycznym (lewy panel, 1) oraz na zdarzeniu niesynaptycznym (prawy panel). Rycina 2B przedstawia kanały w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym dla tego zdarzenia. Aby zminimalizować błąd systematyczny, dane zostały przeanalizowane przez obserwatora nieznającego przydziału do grup badawczych23Jak pokazano w kilku przykładach w Rysunek 3, obie z grup nietolerowanych (Rycina 3A-B) i utolerowane (Rycina 3C-D) u biorców szczepu CBA otrzymujących serca B6 synapsy można łatwo odróżnić od kontaktów niesynaptycznych dzięki obecności gęstego, FITC-dodatniego grzbietu na styku T-APC. Wyniki te pokazują, że wizualna detekcja synaps immunologicznych tworzonych przez limfocyty T biorcy koreluje ze stopniem alloreaktywności u biorcy.
<img alt="Analiza danych z cytometrii przepływowej, wykres rozrzutu CD1c/CD90 i mikroskopia fluorescencyjna, detekcja kontaktów błonowych." src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Identyfikacja dubletów T-APC z kontaktem błonowym i formowaniem synapsy immunologicznej. Zdarzenia w końcowym bramowaniu dubletów (Ryc. 1F) zostają poddane analizie. A. Fluorescencja markerów limfocytów T w masce obiektów APC jest wykreślona w funkcji fluorescencji markerów APC w masce obiektów DC. Niektóre zdarzenia typu doublet składają się z komórki APC i limfocytu T bez kontaktu międzykomórkowego i pojawiają się w lewym dolnym rogu wykresu (obrazy nie pokazane). Można zatem wyznaczyć bramkę kontaktu błonowego, która obejmuje tylko doublety, w których limfocyty T i komórki APC są w kontakcie. Obrazy każdego zdarzenia w tej bramce są analizowane pod kątem dowodów na reorganizację cytoszkieletu aktynowego w kanale phalloidin-FITC i mogą zostać oznaczone za pomocą oprogramowania analitycznego. Lewy panel wskazuje zdarzenie synapsy immunologicznej (oznaczone cyfrą 1 i zaznaczone zielonymym celownikiem), natomiast prawy panel wskazuje zdarzenie kontaktu błonowego bez formowania synapsy immunologicznej (oznaczone cyfrą 2 i zaznaczone zielonym celownikiem). Określenie, czy doszło do formowania synapsy, wymaga ręcznej analizy tych obrazów, przedstawionych w części B. B. Górny rząd przedstawia obrazy w polu jasnym oraz w kanałach fluorescencyjnych dla dubletu z synapsą immunologiczną (odpowiada zdarzeniu 1 w A); dolny rząd przedstawia dublet z kontaktem błonowym, ale bez formowania się synapsy (odpowiada zdarzeniu 2 w A). Dane zostały przeanalizowane w sposób ślepy w odniesieniu do przydziału do grupy badawczej i pochodzą z wcześniej opublikowanego eksperymentu.23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wyniki mikroskopii immunofluorescencyjnej; pokazano markery CD11c i CD90 w świetle przechodzącym oraz nałożenie obrazu z faloidyną." src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przykłady tworzenia synaps T-APC. Myszy CBA otrzymały alloprzeszczepy serca od dawców B6 po braku wstępnego przygotowania (A-B) lub po indukcji tolerancji przy użyciu krwi pełnej myszy B6 w obecności niedepletującego przeciwciała anty-CD4 (C-D). Po 7 dniach, CD4 śledzionowe+ Przeprowadzono testy tworzenia synaps przez limfocyty T z komórkami dendrytycznymi B6. A. Trzy przykłady dubletów niesynaptycznych z kontaktem błonowym u zwierzęcia nietoleryzowanego. B. Trzy przykłady synaps immunologicznych z nieuodpornionego zwierzęcia. C. Trzy przykłady niesynaptycznych dubletów z kontaktem błonowym u zwierzęcia toleryzowanego. D. Trzy przykłady synaps immunologicznych z zwierzęcia toleroplastowanego. Formowanie się synapsy jest wskazane przez obecność jasnego, FITC-dodatniego obrzeża na styku limfocytu T i APC (Ch03). Dane zostały przeanalizowane w sposób zaślepiony pod względem przydziału do grup terapeutycznych i pochodzą z uprzednio opublikowanego eksperymentu.23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Przeciwciało/Barwnik</td>
			<td>Fluorochrom</td>
			<td>Kanał</td>
			<td>Stężenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1c</td>
			<td>eF450</td>
			<td>Rozdział 02</td>
			<td>5 µg/mL, miareczkować empirycznie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2</td>
			<td>APC</td>
			<td>Rozdział 06</td>
			<td>5 µg/mL, miareczkować empirycznie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faloidyna</td>
			<td>FITC</td>
			<td>Rozdział 03</td>
			<td>0.05 - 0.5 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>-</td>
			<td>Rozdział 05</td>
			<td>25 µg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Przeciwciała i barwniki użyte w niniejszym badaniu.W tabeli przedstawiono przeciwciała koniugowane z fluorochromami, barwniki, dostawców oraz zalecane stężenia. W tabeli wskazano również kanał cytometru przepływowego z obrazowaniem, który został wykorzystany do detekcji każdego fluorochromu.

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar alloreaktywności limfocytów T przy użyciu obrazującej cytometrii przepływowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w immunologii transplantacyjnej, takie jak ustalenie, jaka część limfocytów T biorcy wykazuje reaktywność wobec alloantygenów dawcy. Technika ta łączy multiparametryczne możliwości ilościowe cytometrii przepływowej z możliwościami obrazowania mikroskopii fluorescencyjnej, co pozwala na wysokoprzepustową analizę pojedynczych synaps między limfocytem T a komórką prezentującą antygen.Procedurę zademonstruje Sajad Moshkelgosha, postdoc z mojego laboratorium. Należy rozpocząć od wysiania 0,5 × 10⁶ komórek dendrytycznych do każdego dołka płytki hodowlanej z 96 dołkami, a następnie dodać 1 × 10⁶ limfocytów T, dopełniając objętość do 50 µL pożywki hodowlanej na każdy dołek.Inkubuj schłodzone hodowle przez cztery godziny w temperaturze 37°C i przy pięciu procentach dwutlenku węgla. Następnie do każdej studzienki dodaj trzykrotną objętość hodowli 1,5% formaldehydu w PBS i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu fiksacji przenieś komórki z każdej studzienki do odpowiadającej im probówki polistyrenowej o pojemności pięciu mililitrów.Barw komórki za pomocą odpowiednich przeciwciał sprzężonych z fluorochromem w 100 µL buforu do płukania przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem. Następnie przemyj komórki w 1 mL buforu do płukania i resuspenduj osady w buforze perm/wash zawierającym faloidynę FITC. Po kolejnych 30 minutach w temperaturze pokojowej, w ciemności, przemyj komórki w 1 mL świeżego buforu perm/wash.Resuspenduj osady w odpowiednim barwniku jądrowym w buforze do permeabilizacji/płukania (perm/wash buffer) i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem. Przemyj komórki w 1 ml buforu do permeabilizacji/płukania, a następnie przemyj je raz samym buforem do płukania (wash buffer). Następnie resuspenduj komórki w 50–100 µL świeżego buforu do płukania.Przenieś komórki do małych zakręcanych probówek do mikrowirowania. Aby przeanalizować oddziaływania międzykomórkowe, zarezerwuj najpierw jeden kanał do akwizycji obrazów w jasnym polu i wprowadź pierwszą probówkę kontrolną. Przy wyłączonym kanale jasnego pola utwórz w oknie obszaru roboczego nowy wykres rozrzutu dla każdego użytego kanału, przedstawiający stosunek szerokości do wysokości (aspect ratio) w funkcji powierzchni.Wyznacz bramkę (gate) dla singletów, w których stosunek stron (aspect ratio) jest bliski jedności. Dla każdego fluorochromu sprawdź populację pozytywną i w razie potrzeby dostosuj napięcie lasera w polu oświetlenia. W polu kanałów wybierz odpowiednie kanały dla fluorochromów zastosowanych podczas barwienia.Następnie kliknij przycisk record. Gdy liczba zdarzeń osiągnie określony próg, akwizycja zostanie automatycznie zatrzymana. Po zarejestrowaniu wszystkich kontroli z pojedynczym barwieniem, załaduj pierwszą probówkę z próbką eksperymentalną i zarejestruj od kilku do kilkudziesięciu tysięcy zdarzeń w odpowiednich kanałach analizy, w tym w kanale brightfield.Aby wygenerować macierz kompensacyjną, wczytaj pliki danych z kontroli pojedynczego barwienia do kreatora kompensacji i wybierz odpowiednie kanały fluorescencyjne dla danego eksperymentu. Po potwierdzeniu wyboru prawidłowych populacji pozytywnych, dwukrotnie kliknij wartość w macierzy i dodaj wykres do obszaru analizy dla każdego kanału. Kliknij przycisk zakończenia, aby zapisać macierz kompensacyjną jako plik CTM.Wczytaj plik RIF do odpowiedniego oprogramowania analitycznego. Konwertuj plik RIF do pliku analizy danych DAF. Otwórz plik pierwszej próbki.Narysuj wykres pierwiastka średniokwadratowego szybkości zmian intensywności obrazowania w kanale jasnego pola. Następnie narysuj wykres stosunku boków w funkcji powierzchni dla markera komórek prezentujących antygen. Wyodrębnij dublety zawierające pojedynczą komórkę prezentującą antygen.Wykreśl stosunek szerokości do wysokości (aspect ratio) w funkcji pola powierzchni dla markera limfocytów T. Wyznacz bramkę dla dubletów zawierających pojedynczy limfocyt T. Aby zidentyfikować komórki pozostające w kontakcie ze sobą, w menu analizy wybierz opcję masek, aby otworzyć menedżer masek, a nową maskę nazwij maską obiektów limfocytów T.Kliknij przycisk funkcji i w oknie dialogowym wybierz obiekt. Wybierz kanał, w którym wykrywany jest marker limfocytów T, i kliknij OK. W ten sam sposób utwórz maskę dla markera komórek prezentujących antygen w odpowiednim kanale. Przedstaw zależność natężenia fluorescencji markera limfocytów T w masce obiektów komórek prezentujących antygen od natężenia fluorescencji komórek prezentujących antygen w masce obiektów limfocytów T.Następnie wyznaczyć bramkę obejmującą wyłącznie komórki będące w kontakcie ze sobą. Na koniec, ręcznie przejrzeć obrazy faloidyny FITC zdarzeń wewnątrz tej bramki, aby odróżnić dojrzałe synapsy immunologiczne od prostych kontaktów międzykomórkowych, korzystając z funkcji obrazów tagowanych do oznaczenia tych zdjęć. Przedstawiono tutaj bramkę kontaktu błonowego dla CD4-dodatnich limfocytów T śledzionowych pobranych od toleryzowanych i nietoleryzowanych biorców allograftów serca B6 siedem dni po transplantacji, które inkubowano wspólnie z komórkami dendrytycznymi pochodzącymi z szpiku kostnego myszy B6, zgodnie z demonstracją.Z zaznaczonymi zielonymi krzyżami zdarzeniami synaptycznymi i niesynaptycznymi. Analizy w kanałach jasnego pola i fluorescencji umożliwiają również wizualizację poszczególnych zdarzeń synaptycznych i niesynaptycznych. Rzeczywiście, synapsy od biorców CDA serc od myszy B6, zarówno nietoleryzowanych, jak i toleryzowanych, są łatwo odróżnialne od kontaktów niesynaptycznych dzięki obecności gęstych, FITC-dodatnich grzbietów na styku limfocytu T i komórki prezentującej antygen.Po dalszym rozwoju technika ta może znaleźć zastosowanie w warunkach klinicznych, na przykład w celu redukcji lub odstawienia immunosupresji lub w przewidywaniu wyników przeszczepienia u ludzi.

measurement-of-t-cell-alloreactivity-using-imaging-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Skuteczne zastosowanie barwników do śledzenia komórek w celu monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka krytycznych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania barwnikami błonowymi; 2) wyboru fluorochromów i warunków akwizycji danych; oraz 3) wyboru modelu do ilościowego określania proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Ten film demonstruje metodę oceny alloreaktywności w mieszanych populacjach limfocytów T poprzez obserwację interakcji z komórkami dendrytycznymi przenoszącymi alloantygen, prowadzących do powstania synaps immunologicznych. Barwienie różnicowe i kwantyfikacja dubletów zawierających synapsy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia alloreaktywność limfocytów T.

Pomiar alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T

Film demonstruje immunologiczną metodę monitorowania in vivo indukowanej adiuwantem produkcji cytotoksycznych limfocytów T lub CTL. Myszowi wstępnie wstrzykuje się genetycznie zmodyfikowane, proliferacyjne, barwione barwnikiem limfocyty T CD8 + dawcy. Podskórne wstrzyknięcie albuminy jaja kurzego z adiuwantami generuje cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, które są identyfikowane po zbiorze za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Immunologiczna technika monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T za pośrednictwem adiuwantów

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

Makrofagi to plastyczne komórki układu krwiotwórczego, które odgrywają kluczową rolę w ochronnej odporności i homeostazie. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowane techniki in vitro do fenotypowego i funkcjonalnego charakteryzowania makrofagów regulatorowych naciekających przeszczepy, które gromadzą się w przeszczepionym narządzie w warunkach tolerogennych.

Charakterystyka funkcjonalna makrofagów regulatorowych, które hamują odporność reaktywną przeszczepu

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Tutaj prezentujemy protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu tylko dwóch fluorochromów zamiast siedmiu. Dzięki takiemu podejściu na większości cytometrów przepływowych można zarejestrować pięć dodatkowych markerów.

Dyskryminacja siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą dwufluorochromowej cytometrii przepływowej

Napływ wapnia, miara sygnalizacji limfocytów T, jest skutecznym sposobem analizy reakcji na stymulację receptorów limfocytów T. Ten protokół multipleksowania Indo-1 z panelami przeciwciał skierowanymi na cząsteczki powierzchniowe komórki wykorzystuje wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum.

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Poznaj metodę pomiaru alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej w immunologii transplantacyjnej. Technika ta umożliwia analizę interakcji komórek T z komórkami prezentującymi antygen.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów