Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar alloreaktywności limfocytów T przy użyciu obrazującej cytometrii przepływowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w immunologii transplantacyjnej, takie jak ustalenie, jaka część limfocytów T biorcy wykazuje reaktywność wobec alloantygenów dawcy. Technika ta łączy multiparametryczne możliwości ilościowe cytometrii przepływowej z możliwościami obrazowania mikroskopii fluorescencyjnej, co pozwala na wysokoprzepustową analizę pojedynczych synaps między limfocytem T a komórką prezentującą antygen.

Procedurę zademonstruje Sajad Moshkelgosha, postdoc z mojego laboratorium. Należy rozpocząć od wysiania 0,5 × 10⁶ komórek dendrytycznych do każdego dołka płytki hodowlanej z 96 dołkami, a następnie dodać 1 × 10⁶ limfocytów T, dopełniając objętość do 50 µL pożywki hodowlanej na każdy dołek.

Inkubuj schłodzone hodowle przez cztery godziny w temperaturze 37°C i przy pięciu procentach dwutlenku węgla. Następnie do każdej studzienki dodaj trzykrotną objętość hodowli 1,5% formaldehydu w PBS i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu fiksacji przenieś komórki z każdej studzienki do odpowiadającej im probówki polistyrenowej o pojemności pięciu mililitrów.

Barw komórki za pomocą odpowiednich przeciwciał sprzężonych z fluorochromem w 100 µL buforu do płukania przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem. Następnie przemyj komórki w 1 mL buforu do płukania i resuspenduj osady w buforze perm/wash zawierającym faloidynę FITC. Po kolejnych 30 minutach w temperaturze pokojowej, w ciemności, przemyj komórki w 1 mL świeżego buforu perm/wash.

Resuspenduj osady w odpowiednim barwniku jądrowym w buforze do permeabilizacji/płukania (perm/wash buffer) i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem. Przemyj komórki w 1 ml buforu do permeabilizacji/płukania, a następnie przemyj je raz samym buforem do płukania (wash buffer). Następnie resuspenduj komórki w 50–100 µL świeżego buforu do płukania.

Przenieś komórki do małych zakręcanych probówek do mikrowirowania. Aby przeanalizować oddziaływania międzykomórkowe, zarezerwuj najpierw jeden kanał do akwizycji obrazów w jasnym polu i wprowadź pierwszą probówkę kontrolną. Przy wyłączonym kanale jasnego pola utwórz w oknie obszaru roboczego nowy wykres rozrzutu dla każdego użytego kanału, przedstawiający stosunek szerokości do wysokości (aspect ratio) w funkcji powierzchni.

Wyznacz bramkę (gate) dla singletów, w których stosunek stron (aspect ratio) jest bliski jedności. Dla każdego fluorochromu sprawdź populację pozytywną i w razie potrzeby dostosuj napięcie lasera w polu oświetlenia. W polu kanałów wybierz odpowiednie kanały dla fluorochromów zastosowanych podczas barwienia.

Następnie kliknij przycisk record. Gdy liczba zdarzeń osiągnie określony próg, akwizycja zostanie automatycznie zatrzymana. Po zarejestrowaniu wszystkich kontroli z pojedynczym barwieniem, załaduj pierwszą probówkę z próbką eksperymentalną i zarejestruj od kilku do kilkudziesięciu tysięcy zdarzeń w odpowiednich kanałach analizy, w tym w kanale brightfield.

Aby wygenerować macierz kompensacyjną, wczytaj pliki danych z kontroli pojedynczego barwienia do kreatora kompensacji i wybierz odpowiednie kanały fluorescencyjne dla danego eksperymentu. Po potwierdzeniu wyboru prawidłowych populacji pozytywnych, dwukrotnie kliknij wartość w macierzy i dodaj wykres do obszaru analizy dla każdego kanału. Kliknij przycisk zakończenia, aby zapisać macierz kompensacyjną jako plik CTM.

Wczytaj plik RIF do odpowiedniego oprogramowania analitycznego. Konwertuj plik RIF do pliku analizy danych DAF. Otwórz plik pierwszej próbki.

Narysuj wykres pierwiastka średniokwadratowego szybkości zmian intensywności obrazowania w kanale jasnego pola. Następnie narysuj wykres stosunku boków w funkcji powierzchni dla markera komórek prezentujących antygen. Wyodrębnij dublety zawierające pojedynczą komórkę prezentującą antygen.

Wykreśl stosunek szerokości do wysokości (aspect ratio) w funkcji pola powierzchni dla markera limfocytów T. Wyznacz bramkę dla dubletów zawierających pojedynczy limfocyt T. Aby zidentyfikować komórki pozostające w kontakcie ze sobą, w menu analizy wybierz opcję masek, aby otworzyć menedżer masek, a nową maskę nazwij maską obiektów limfocytów T.

Kliknij przycisk funkcji i w oknie dialogowym wybierz obiekt. Wybierz kanał, w którym wykrywany jest marker limfocytów T, i kliknij OK. W ten sam sposób utwórz maskę dla markera komórek prezentujących antygen w odpowiednim kanale. Przedstaw zależność natężenia fluorescencji markera limfocytów T w masce obiektów komórek prezentujących antygen od natężenia fluorescencji komórek prezentujących antygen w masce obiektów limfocytów T.

Następnie wyznaczyć bramkę obejmującą wyłącznie komórki będące w kontakcie ze sobą. Na koniec, ręcznie przejrzeć obrazy faloidyny FITC zdarzeń wewnątrz tej bramki, aby odróżnić dojrzałe synapsy immunologiczne od prostych kontaktów międzykomórkowych, korzystając z funkcji obrazów tagowanych do oznaczenia tych zdjęć. Przedstawiono tutaj bramkę kontaktu błonowego dla CD4-dodatnich limfocytów T śledzionowych pobranych od toleryzowanych i nietoleryzowanych biorców allograftów serca B6 siedem dni po transplantacji, które inkubowano wspólnie z komórkami dendrytycznymi pochodzącymi z szpiku kostnego myszy B6, zgodnie z demonstracją.

Z zaznaczonymi zielonymi krzyżami zdarzeniami synaptycznymi i niesynaptycznymi. Analizy w kanałach jasnego pola i fluorescencji umożliwiają również wizualizację poszczególnych zdarzeń synaptycznych i niesynaptycznych. Rzeczywiście, synapsy od biorców CDA serc od myszy B6, zarówno nietoleryzowanych, jak i toleryzowanych, są łatwo odróżnialne od kontaktów niesynaptycznych dzięki obecności gęstych, FITC-dodatnich grzbietów na styku limfocytu T i komórki prezentującej antygen.

Po dalszym rozwoju technika ta może znaleźć zastosowanie w warunkach klinicznych, na przykład w celu redukcji lub odstawienia immunosupresji lub w przewidywaniu wyników przeszczepienia u ludzi.