Name: Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę izolacji podzbiorów progenitorów wątroby z myszy z wysoką czystością przy użyciu cytometrii przepływowej i nowej kombinacji markerów powierzchniowych. Technika ta umożliwia badanie biologii komórek progenitorowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Alexandra von Humboldta Sofja Kovalevskaja Award dla VLK.

<ol><li>Dolle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+isolation+of+liver+progenitor+cells+by+aldehyde+dehydrogenase+activity+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice.</a> Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).</li>
<li>Dolle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+for+liver+progenitor+cells%3A+a+practical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The quest for liver progenitor cells: a practical point of view.</a> J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+markers+for+the+murine+oval+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Surface markers for the murine oval cell response.</a> Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).</li>
<li>Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductular+reactions+in+human+liver%3A+diversity+at+the+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Ductular reactions in human liver: diversity at the interface.</a> Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).</li>
<li>Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+tracing+of+Sox9%2B+liver+progenitors+in+mouse+oval+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury.</a> Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxl1-Cre-marked+adult+hepatic+progenitors+have+clonogenic+and+bilineage+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential.</a> Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).</li>
<li>Furuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver%2C+exocrine+pancreas+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).</li>
<li>Font-Burgada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+Periportal+Hepatocytes+Regenerate+the+Injured+Liver+without+Giving+Rise+to+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer.</a> Cell. 162 (4), 766-779 (2015).</li>
<li>Kuramitsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+fibrotic+liver+regeneration+in+mice+is+linked+to+a+severe+fibrogenic+response+driven+by+hepatic+progenitor+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation.</a> Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).</li>
<li>Pritchard, M. T., Nagy, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis+is+enhanced+and+accompanied+by+robust+oval+cell+activation+after+chronic+carbon+tetrachloride+administration+to+Egr-1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice.</a> Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).</li>
<li>Spee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+liver+progenitor+cell+niche+in+liver+diseases%3A+potential+involvement+of+Wnt+and+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling.</a> Gut. 59 (2), 247-257 (2010).</li>
<li>Eckert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podoplanin+discriminates+distinct+stromal+cell+populations+and+a+novel+progenitor+subset+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).</li>
<li>Epting, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+antigen-1+is+necessary+for+cell-cycle+withdrawal+and+myoblast+differentiation+in+C2C12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).</li>
<li>Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+immortalisation+of+hepatic+oval+cells+from+adult+mice+fed+a+choline-deficient%2C+ethionine-supplemented+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).</li>
<li>Rountree, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).</li>
<li>Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD133%2B+liver+stem+cells+for+clonal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li>
<li>Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Change+and+Induction+of+Cytokeratin+Expression+During+In+Vitro+Culture+of+Corneal+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).</li>
<li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+%28MSC%29%3A+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Commun Signal. 9, 12(2011).</li>
<li>Schmelzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cells+from+fetal+and+postnatal+donors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors.</a> J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zapalenie wątroby i urazy różnego pochodzenia uruchamiają procesy regeneracyjne w wątrobie, którym towarzyszy ekspansja i aktywacja komórek progenitorowych 2,3. Te komórki progenitorowe wątroby posiadają cechy komórek macierzystych i prawdopodobnie odgrywają znaczącą rolę w patomechanizmie różnych chorób wątroby.
Od dawna sugerowano niejednorodność komórek progenitorowych wątroby. Ponowna ocena podzbiorów progenitorów wątroby przy użyc...

Regeneracja wątroby jest głównie związana ze zdolnością hepatocytów do samoodnawiania. Niemniej jednak przewlekłe uszkodzenia wątroby występują z aktywacją i ekspansją komórek progenitorowych, co jest związane z ich zdolnością do różnicowania się w hepatocyty i cholangiocyty1,2,3,4. Jest to szczególnie istotne, ponieważ podczas przewlekłych urazów proliferacja hepatocytów nie jest skuteczna. Pomimo wielu badań genetycznych ukierunkowanych na komórki progenitorowe, ich rola w regeneracji wątroby pozostaje kontrowersyjna5,6,7,8. Co więcej, aktywacja komórek progenitorowych została powiązana ze zwiększoną odpowiedzią zwłóknieniową w wątrobie, co rodzi pytania o ich dokładną rolę podczas urazów9,10.
Heterogeniczność przedziału komórek progenitorowych od dawna była sugerowana przez badania ekspresji genów, które izolowały komórki progenitorowe wyrażające pojedynczy marker powierzchniowy za pomocą mikrodysekcji lub metod opartych na sortowaniu komórek1,11. Rzeczywiście, niedawno, nowa kombinacja markerów powierzchniowych przy użyciu gp38 (podoplaniny) jednoznacznie powiązała poprzednie pojedyncze markery komórek progenitorowych z różnymi podzbiorami12. Co ważne, podzbiory te nie tylko różniły się wyrażeniem znaczników powierzchniowych, ale także wykazywały zmiany funkcjonalne podczas urazów12.
Wiele modeli zwierzęcych zostało wykorzystanych do zbadania aktywacji komórek progenitorowych i regeneracji wątroby. Wydaje się, że różne rodzaje urazów sprzyjają aktywacji różnych podzbiorów komórek progenitorowych12. To może wyjaśniać fenotypową rozbieżność reakcji przewodowej obserwowaną u ludzi4. W związku z tym złożone analizy fenotypowe i funkcjonalne komórek progenitorowych mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w urazach i prawdziwego znaczenia reakcji przewodowej w chorobach wątroby.
Oprócz kombinacji markerów powierzchniowych, kluczowe różnice w protokołach izolacji komórek dodatkowo komplikują wnioski oparte na poprzednich badaniach2. Znaczna liczba badań dotyczyła roli komórek progenitorowych, które znacznie różnią się protokołem izolacji (np. dysocjacja wątroby (kombinacja enzymów i czas trwania procesu), pożywka o gęstości i szybkość wirowania)2. Zoptymalizowana technika izolacji, zapewniająca lepszą żywotność rzadkich populacji komórek i odzwierciedlająca skład podzbiorów, została niedawno opracowana i opublikowana12. Celem tego artykułu jest przedstawienie bardziej szczegółowego protokołu tej procedury izolacji komórek wątroby oraz analizy podzbiorów, aby umożliwić prawidłowe odtworzenie tej techniki. Dodatkowo protokół zawiera porównanie z poprzednią metodą izolacji, aby pokazać różnice w porównaniu z nowym protokołem.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>bez czerwieni fenolowej DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza P</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11249002001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>17105041</tr><tr><td>ACK Lysing</td><td>Buffer Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Przygotuj 1% roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>10% BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Roztwór do płukania</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>dodać 0,5% (v/v) BSA i przechowywać na lodzie</td></tr><tr><td>Bez czerwieni fenolowej DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1145</td><td></td></tr><tr><td>liczenie Koraliki Liczba koralików Bright</td><td>Life Technologies</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>PI</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD31 Mikrokulki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki anty-CD45</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania martwych komórek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki antybiotynowe</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>CD64 Oczyszczony</td><td>BioLegend</td><td>139302</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>CD16/32 Oczyszczony</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>CD45 APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>Rozcieńczenie: 1:200, zaznacza komórki krwiotwórcze</td></tr><tr><td>CD31</td><td>Biotyna BioLegend</td><td>102504</td><td>Rozcieńczenie: 1:200, oznacza komórki śródbłonka</td></tr><tr><td>ASGPR1 Oczyszczone</td><td>Bio-Techne</td><td>AF2755-SP</td><td>Rozcieńczenie: 1:100, oznacza hepatocyty</td></tr><tr><td>Podoplanina APC</td><td>BioLegend</td><td>127410</td><td>Rozcieńczenie: 1:1,400, oznacza komórki progeniorowe</td></tr><tr><td>Podoplanina Biotyna</td><td>BioLegend</td><td>127404</td><td>Rozcieńczenie: 1:1,400</td></tr><tr><td>CD133 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-210</td><td>zastosowanie 3 &mikro; L, oznacza komórki progenitorowe</td></tr><tr><td>CD133 Biotyna</td><td>BioLegend</td><td>141206</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>CD34 Biotyna</td><td>eBioScience</td><td>13-0341-81</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>CD90.2 Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>140306</td><td>Rozcieńczenie: 1:800</td></tr><tr><td>CD157 PE</td><td>BioLegend</td><td>140203</td><td>Rozcieńczenie: 1:600</td></tr><tr><td>EpCAM Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>118225</td><td>Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Sca-1 Biotyna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-885</td><td>zastosowanie 10 &mikro; L</td></tr><tr><td>Mysz IgG2b, &kappa; PE</td><td>BioLegend</td><td>400311</td><td></td></tr><tr><td>Szczur IgG1 PE</td><td>BioLegend</td><td>400407</td><td></td></tr><tr><td>Szczur IgG2b, &kappa; APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>400624</td><td></td></tr><tr><td>Szczur IgG2a, &kappa; Biotyna</td><td>BioLegend</td><td>400504</td><td></td></tr><tr><td>Szczur IgG2a, &kappa; Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>400535</td><td></td></tr><tr><td>Chomik syryjski IgG APC</td><td>BioLegend</td><td>402012</td><td></td></tr><tr><td>Chomik syryjski IgG Biotyna</td><td>BioLegend</td><td>402004</td><td></td></tr><tr><td>Normalna kontrola IgG kóz Oczyszczona</td><td>Bio-Techne</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-kozi IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td>Rozcieńczenie: 1:800</td></tr><tr><td>Streptawidyna Alexa Fluor 405</td><td>Life Technologies</td><td>S32351</td><td>Rozcieńczenie: 1:400</td></tr><tr><td>100 &mikro; m Siatka filtracyjna</td><td>A. Hartenstein</td><td>PAS3</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaTMIII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva sofware</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polipropylen Okrągła rura denna</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy plus mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RLT bufor do lizy jest w zestawie</td></tr></tbody></table>

izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

Podczas przewlekłych uszkodzeń wątroby, komórki progenitorowe rozwijają się w procesie zwanym reakcją przewodową, co również pociąga za sobą pojawienie się zapalnego nacieku komórkowego i aktywację komórek nabłonkowych. Populacja komórek progenitorowych podczas takich reakcji zapalnych była w większości badana przy użyciu markerów jednopowierzchniowych, albo za pomocą analizy histologicznej, albo technik opartych na cytometrii przepływowej. Jednak w ramach nowych markerów powierzchniowych zidentyfikowano różne funkcjonalnie odrębne podzbiory w obrębie przedziału komórek progenitorowych/macierzystych wątroby. Przedstawiona tutaj metoda opisuje izolację i szczegółową analizę cytometrii przepływowej podzbiorów progenitorów przy użyciu nowych kombinacji markerów powierzchniowych. Ponadto pokazano, w jaki sposób można wyizolować różne podzbiory komórek progenitorowych z wysoką czystością przy użyciu zautomatyzowanych metod sortowania magnetycznego i opartego na FACS. Co ważne, nowatorska i uproszczona dysocjacja enzymatyczna wątroby pozwala na izolację tych rzadkich populacji komórek o wysokiej żywotności, która jest lepsza w porównaniu z innymi istniejącymi metodami. Jest to szczególnie istotne dla dalszych badań komórek progenitorowych in vitro lub dla wyizolowania wysokiej jakości RNA w celu analizy profilu ekspresji genów.

Przedstawiona tutaj procedura trawienia wątroby z użyciem nowej mieszaniny enzymów pozwala na uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek zawierającej komórki miąższowe i niemiąższowe wątroby (Rycina 1 oraz 2a). Po lizie erytrocytów za pomocą buforu ACK możliwa jest bezpośrednia analiza zawiesiny pojedynczych komórek metodą cytometrii przepływowej (Rycina 1 i 2). Strategia bramkowania obejmuje wykluczenie dubletów i martwych...

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu trawienia wątroby jest ocena różnych subpopulacji progenitorów wątroby za pomocą cytometrii przepływowej oraz izolacja tych komórek z wysoką czystością przy użyciu nowatorskiego koktajlu markerów powierzchniowych do dalszych analiz. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na różne pytania dotyczące biologii komórek progenitorowych wątroby, na przykład: jakie są specyficzne cechy ich subpopulacji oraz co jest ich odległą przyczyną podczas uszkodzenia wątroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona izolację komórek progenitorowych o wysokiej czystości i żywotności, co jest istotne dla analiz in vitro.Chociaż ta technika trawienia pozwala na zgłębienie biologii komórek progenitorowych, może być ona w rzeczywistości wykorzystana do izolacji populacji komórek krwiotwórczych i śródbłonkowych. Aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z wątroby mysiej, należy przenieść płaty na suchą szalkę Petriego i za pomocą skalpela pociąć tkankę na jednorodne kostki o boku około 2 mm. Kawałki tkanki należy przenieść do dwóch 15 ml stożkowych probówek wirówkowych na każdą wątrobę, zawierających po 2,5 ml buforu do trawienia.Następnie umieść próbki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przy delikatnym wstrząsaniu przez 5 i 10 minut. Po 15 minutach trawienia użyj pipety 1 000 µL z odciętym końcem, aby delikatnie rozdrobić kawałki wątroby. Następnie zwróć probówki do kąpieli i odstaw je na dwie minuty, aby fragmenty osiadły.Następnie przefiltruj dwie porcje naddatku o objętości około 700 µL przez sito o oczkach 100 µm, uprzednio zwilżone 800 µL buforu do zbierania. Usunięty naddatek zastąp świeżym buforem do trawienia. Gdy tkanka wątroby przestanie być widoczna, przefiltruj cały naddatek z probówek do trawienia.Następnie należy zebrać wszystkie komórki poprzez wirowanie. Osady resuspendować w 1 mL buforu do lizy z chlorkiem amonu i potasem w temperaturze pokojowej, a po jednej minucie przerwać lizę, dodając 5 mL świeżego buforu do zbierania. Komórki zebrać za pomocą ponownego wirowania.Następnie ostrożnie odessać nadsącz, aby nie naruszyć luźnego osadu. Komórki zawiesić ponownie w 4 mL świeżego buforu do zbierania na lodzie. Aby określić liczbę komórek w próbce wątroby za pomocą cytometrii przepływowej, należy najpierw wymieszać 20 µL zawiesiny komórek wątroby z 174 µL PBS w polistyrenowej probówce o pojemności 1,5 mL oraz dodać 6 µL jodku propidyny.Dodać koraliki liczące umożliwiające kwantyfikację komórek, a następnie nanieść mieszaninę koralików i komórek na cytometr przepływowy. Wyznaczyć bramkę na parametrach rozproszenia bocznego i przedniego, aby wyeliminować zanieczyszczenia. Wykluczyć dublety za pomocą bramki wysokości rozproszenia przedniego względem powierzchni rozproszenia przedniego oraz martwe komórki wykazujące pozytywny sygnał z jodku propidyny.Następnie nanieś próbkę o objętości 30 µL na cytometr przepływowy i zarejestruj zdarzenia. Aby przeprowadzić barwienie komórek wątroby do analizy cytometrycznej subpopulacji progenitorów, przenieś aliquoty zawierające 2x10^5 komórek do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml. Następnie odwirowuj komórki w celu uzyskania osadu.Resuspenduj osady w bloku Fc i inkubuj przez pięć minut na lodzie. Następnie dodaj 50 µL odpowiedniego koktajlu przeciwciał do barwienia powierzchni komórek do właściwych probówek i inkubuj przez 20 minut na lodzie, chroniąc przed światłem. Po zakończeniu inkubacji przemyj próbki w 400 µL buforu do barwienia na każdą próbkę.Następnie osady resuspenduje w 100 µl odpowiedniego koktajlu przeciwciał wtórnych na 20 minut w lodzie, chroniąc próbki przed światłem. Potem komórki przemywa się kolejnymi 400 µl buforu do barwienia. Na koniec osady resuspenduje w 300 µl buforu do barwienia zawierającego jodek propidyny.Zmierz próbkę za pomocą cytometru przepływowego. Aby wzbogacić populację komórek progenitorowych poprzez separację opartą na magnetycznych mikrokuleczkach, przenieś 1,5-2x10^6 komórek do odpowiedniej liczby probówek stożkowych o pojemności 15 ml i odwiruj komórki w celu ich zebrania. Resuspenduj osady w 400 µl HBSS uzupełnionego o BSA.Następnie należy dodać 40 µL mikrokuleczek anty-CD31 oraz 30 µL mikrokuleczek anty-CD45 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie komórki należy przemyć w 5 mL HBSS z dodatkiem BSA. Osady należy resuspendować w 100 µL kuleczek do usuwania martwych komórek i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Podczas inkubacji komórek należy zrównoważyć jedną kolumnę do selekcji pozytywnej o odpowiednim rozmiarze na każdą wątrobę, używając trzech mililitrów HBSS z dodatkiem BSA. Następnie do komórek dodaje się 900 µL HBSS z dodatkiem BSA i filtruje je przez poliamidową siatkę filtracyjną o wielkości oczek 100 µm. Przefiltrowane komórki inkubowane z kuleczkami nanosi się na kolumny, zbierając eluat do probówki wirówkowej.Po przepłynięciu wszystkich komórek przez kolumnę, przemyj kolumny trzykrotnie trzema mililitrami HBSS z dodatkiem BSA. Odwirowanie komórek w celu uzyskania osadu, a następnie zawieszenie osadu komórkowego w 100 µL buforu płuczącego i Fc block. Pobierz osady komórkowe z czterech do sześciu wątrób lub do mniej niż 1x10^6 komórek wyselekcjonowanych negatywnie.Po pięciu minutach należy znakować komórki przeciwciałem anty-GP38 biotynilowanym przez 10 minut w lodzie. Po zakończeniu inkubacji komórki należy zebrać poprzez wirowanie, a następnie zawiesić w 400 µL buforu płuczącego i 5 µL mikro kulek Anti-Biotin. Po 15 minutach w temperaturze 4 °C komórki należy niezwłocznie przemyć w 5 mL buforu płuczącego.Następnie osad resuspensuje się w 1 mL świeżego buforu płuczącego. Resuspensowane komórki umieszcza się w schłodzonym statywie na 15 probówek i uruchamia automatyczną separację magnetyczną. Następnie frakcję przepływową wiruje się w wirówce, a otrzymane osady resuspensuje się w odpowiednim roztworze do planowanej dalszej analizy eksperymentalnej.Bramkowanie komórek wykazujących brak ekspresji CD45, CD31 oraz receptora asialoglikoproteinowego 1 pozwala na wyselekcjonowanie komórek progenitorowych wątroby, które następnie można pogrupować zgodnie z ekspresją glikoproteiny 38 i CD133. Komórki gp38-dodatnie CD133-dodatnie oraz gp38-ujemne CD133-dodatnie stanowią najliczniejsze populacje komórkowe wśród komórek CD45-ujemnych, CD31-ujemnych i ASGPR1-ujemnych w wątrobie zdrowej dorosłej myszy, wykazując wyraźne różnice w ekspresji różnych markerów powierzchniowych, które wcześniej wiązano z komórkami progenitorowymi. Izolacja tych komórek progenitorowych z wykorzystaniem magnetycznych mikrokulek, zgodnie z powyższą demonstracją, pozwala na uzyskanie ponad 90% czystości komórek wątroby przy wysokim stopniu żywotności.Podczas próby izolacji tych rzadkich komórek należy wziąć pod uwagę enzymy stosowane podczas etapów trawienia wątroby, ponieważ różne enzymy mogą preferencyjnie uzyskiwać konkretne subpopulacje progenitorów i znacznie obniżać poziom ekspresji CD133. Należy pamiętać, że czystość i wydajność uzyskania komórek zależą od delikatnego przygotowania zawiesin pojedynczych komórek wątroby. Ponadto duża ilość debris komórkowego oraz zanieczyszczenie obumierającymi komórkami może negatywnie wpłynąć na powodzenie tego protokołu.

isolation-enrichment-liver-progenitor-subsets-identified-novel

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy tutaj izolację wykazujących ekspresję CD133 komórek macierzystych wątroby oraz nowotworowych komórek macierzystych z całej wątroby mysiej, co jest procesem wymagającym trawienia tkanki, wzbogacania frakcji komórkowej oraz izolacji metodą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy metody zaawansowanej izolacji pojedynczych komórek oraz ekspansji klonalnej.

Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ do ekspansji klonalnej

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Ten protokół opisuje monowarstwową, pozbawioną surowicy metodę efektywnego generowania komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w ciągu 18 dni. Obejmuje to sześć etapów, w których hPSC sekwencyjnie różnicują się w pośrednie typy komórek, takie jak prymitywna smuga, ostateczna endoderma, tylne jelito przednie i progenitorzy zawiązków wątroby, zanim utworzą komórki podobne do hepatocytów.

Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

Celem tego artykułu jest dostarczenie ustandaryzowanego podejścia do indukowania różnicowania ludzkich komórek progenitorowych wątroby od pluripotencjalnych komórek macierzystych. Opracowanie tej procedury z gotowymi do użycia preparatami pożywek oferuje użytkownikowi łatwy system do generowania ludzkich komórek wątroby do badań biomedycznych i translacji.

Specyfikacja progenitorów wątroby z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu różnicowania

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Hepatocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą być oczyszczane poprzez sortowanie komórek, przy użyciu kombinacji barwienia mitochondriów i aktywowanej cząsteczki adhezyjnej komórek leukocytów (ALCAM, znanej również jako CD166).

Zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę izolacji podzbiorów progenitorów wątroby z myszy z wysoką czystością przy użyciu cytometrii przepływowej i nowej kombinacji markerów powierzchniowych. Technika ta umożliwia badanie biologii komórek progenitorowych.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Przeglądaj więcej filmów