Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Ogólnym celem niniejszego protokołu trawienia wątroby jest ocena różnych subpopulacji progenitorów wątroby za pomocą cytometrii przepływowej oraz izolacja tych komórek z wysoką czystością przy użyciu nowatorskiego koktajlu markerów powierzchniowych do dalszych analiz. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na różne pytania dotyczące biologii komórek progenitorowych wątroby, na przykład: jakie są specyficzne cechy ich subpopulacji oraz co jest ich odległą przyczyną podczas uszkodzenia wątroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona izolację komórek progenitorowych o wysokiej czystości i żywotności, co jest istotne dla analiz in vitro.

Chociaż ta technika trawienia pozwala na zgłębienie biologii komórek progenitorowych, może być ona w rzeczywistości wykorzystana do izolacji populacji komórek krwiotwórczych i śródbłonkowych. Aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z wątroby mysiej, należy przenieść płaty na suchą szalkę Petriego i za pomocą skalpela pociąć tkankę na jednorodne kostki o boku około 2 mm. Kawałki tkanki należy przenieść do dwóch 15 ml stożkowych probówek wirówkowych na każdą wątrobę, zawierających po 2,5 ml buforu do trawienia.

Następnie umieść próbki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przy delikatnym wstrząsaniu przez 5 i 10 minut. Po 15 minutach trawienia użyj pipety 1 000 µL z odciętym końcem, aby delikatnie rozdrobić kawałki wątroby. Następnie zwróć probówki do kąpieli i odstaw je na dwie minuty, aby fragmenty osiadły.

Następnie przefiltruj dwie porcje naddatku o objętości około 700 µL przez sito o oczkach 100 µm, uprzednio zwilżone 800 µL buforu do zbierania. Usunięty naddatek zastąp świeżym buforem do trawienia. Gdy tkanka wątroby przestanie być widoczna, przefiltruj cały naddatek z probówek do trawienia.

Następnie należy zebrać wszystkie komórki poprzez wirowanie. Osady resuspendować w 1 mL buforu do lizy z chlorkiem amonu i potasem w temperaturze pokojowej, a po jednej minucie przerwać lizę, dodając 5 mL świeżego buforu do zbierania. Komórki zebrać za pomocą ponownego wirowania.

Następnie ostrożnie odessać nadsącz, aby nie naruszyć luźnego osadu. Komórki zawiesić ponownie w 4 mL świeżego buforu do zbierania na lodzie. Aby określić liczbę komórek w próbce wątroby za pomocą cytometrii przepływowej, należy najpierw wymieszać 20 µL zawiesiny komórek wątroby z 174 µL PBS w polistyrenowej probówce o pojemności 1,5 mL oraz dodać 6 µL jodku propidyny.

Dodać koraliki liczące umożliwiające kwantyfikację komórek, a następnie nanieść mieszaninę koralików i komórek na cytometr przepływowy. Wyznaczyć bramkę na parametrach rozproszenia bocznego i przedniego, aby wyeliminować zanieczyszczenia. Wykluczyć dublety za pomocą bramki wysokości rozproszenia przedniego względem powierzchni rozproszenia przedniego oraz martwe komórki wykazujące pozytywny sygnał z jodku propidyny.

Następnie nanieś próbkę o objętości 30 µL na cytometr przepływowy i zarejestruj zdarzenia. Aby przeprowadzić barwienie komórek wątroby do analizy cytometrycznej subpopulacji progenitorów, przenieś aliquoty zawierające 2x10^5 komórek do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml. Następnie odwirowuj komórki w celu uzyskania osadu.

Resuspenduj osady w bloku Fc i inkubuj przez pięć minut na lodzie. Następnie dodaj 50 µL odpowiedniego koktajlu przeciwciał do barwienia powierzchni komórek do właściwych probówek i inkubuj przez 20 minut na lodzie, chroniąc przed światłem. Po zakończeniu inkubacji przemyj próbki w 400 µL buforu do barwienia na każdą próbkę.

Następnie osady resuspenduje w 100 µl odpowiedniego koktajlu przeciwciał wtórnych na 20 minut w lodzie, chroniąc próbki przed światłem. Potem komórki przemywa się kolejnymi 400 µl buforu do barwienia. Na koniec osady resuspenduje w 300 µl buforu do barwienia zawierającego jodek propidyny.

Zmierz próbkę za pomocą cytometru przepływowego. Aby wzbogacić populację komórek progenitorowych poprzez separację opartą na magnetycznych mikrokuleczkach, przenieś 1,5-2x10^6 komórek do odpowiedniej liczby probówek stożkowych o pojemności 15 ml i odwiruj komórki w celu ich zebrania. Resuspenduj osady w 400 µl HBSS uzupełnionego o BSA.

Następnie należy dodać 40 µL mikrokuleczek anty-CD31 oraz 30 µL mikrokuleczek anty-CD45 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie komórki należy przemyć w 5 mL HBSS z dodatkiem BSA. Osady należy resuspendować w 100 µL kuleczek do usuwania martwych komórek i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Podczas inkubacji komórek należy zrównoważyć jedną kolumnę do selekcji pozytywnej o odpowiednim rozmiarze na każdą wątrobę, używając trzech mililitrów HBSS z dodatkiem BSA. Następnie do komórek dodaje się 900 µL HBSS z dodatkiem BSA i filtruje je przez poliamidową siatkę filtracyjną o wielkości oczek 100 µm. Przefiltrowane komórki inkubowane z kuleczkami nanosi się na kolumny, zbierając eluat do probówki wirówkowej.

Po przepłynięciu wszystkich komórek przez kolumnę, przemyj kolumny trzykrotnie trzema mililitrami HBSS z dodatkiem BSA. Odwirowanie komórek w celu uzyskania osadu, a następnie zawieszenie osadu komórkowego w 100 µL buforu płuczącego i Fc block. Pobierz osady komórkowe z czterech do sześciu wątrób lub do mniej niż 1x10^6 komórek wyselekcjonowanych negatywnie.

Po pięciu minutach należy znakować komórki przeciwciałem anty-GP38 biotynilowanym przez 10 minut w lodzie. Po zakończeniu inkubacji komórki należy zebrać poprzez wirowanie, a następnie zawiesić w 400 µL buforu płuczącego i 5 µL mikro kulek Anti-Biotin. Po 15 minutach w temperaturze 4 °C komórki należy niezwłocznie przemyć w 5 mL buforu płuczącego.

Następnie osad resuspensuje się w 1 mL świeżego buforu płuczącego. Resuspensowane komórki umieszcza się w schłodzonym statywie na 15 probówek i uruchamia automatyczną separację magnetyczną. Następnie frakcję przepływową wiruje się w wirówce, a otrzymane osady resuspensuje się w odpowiednim roztworze do planowanej dalszej analizy eksperymentalnej.

Bramkowanie komórek wykazujących brak ekspresji CD45, CD31 oraz receptora asialoglikoproteinowego 1 pozwala na wyselekcjonowanie komórek progenitorowych wątroby, które następnie można pogrupować zgodnie z ekspresją glikoproteiny 38 i CD133. Komórki gp38-dodatnie CD133-dodatnie oraz gp38-ujemne CD133-dodatnie stanowią najliczniejsze populacje komórkowe wśród komórek CD45-ujemnych, CD31-ujemnych i ASGPR1-ujemnych w wątrobie zdrowej dorosłej myszy, wykazując wyraźne różnice w ekspresji różnych markerów powierzchniowych, które wcześniej wiązano z komórkami progenitorowymi. Izolacja tych komórek progenitorowych z wykorzystaniem magnetycznych mikrokulek, zgodnie z powyższą demonstracją, pozwala na uzyskanie ponad 90% czystości komórek wątroby przy wysokim stopniu żywotności.

Podczas próby izolacji tych rzadkich komórek należy wziąć pod uwagę enzymy stosowane podczas etapów trawienia wątroby, ponieważ różne enzymy mogą preferencyjnie uzyskiwać konkretne subpopulacje progenitorów i znacznie obniżać poziom ekspresji CD133. Należy pamiętać, że czystość i wydajność uzyskania komórek zależą od delikatnego przygotowania zawiesin pojedynczych komórek wątroby. Ponadto duża ilość debris komórkowego oraz zanieczyszczenie obumierającymi komórkami może negatywnie wpłynąć na powodzenie tego protokołu.