Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Ogólnym celem tego protokołu trawienia wątroby jest ocena różnych podzbiorów progenitorów wątroby za pomocą cytometrii przepływowej i wyizolowanie tych komórek do wysokiej czystości przy użyciu nowego koktajlu markerów powierzchniowych do dalszej analizy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na różne pytania dotyczące biologii komórek progenitorowych wątroby, na przykład, jakie są ich specyficzne cechy podzbioru i jaka jest ich odległa przyczyna podczas uszkodzenia wątroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia izolację komórek progenitorowych w celu uzyskania wysokiej czystości i żywotności, co jest ważne dla analizy in vitro.

Chociaż ta technika trawienia zapewnia wgląd w biologię komórek progenitorowych, w rzeczywistości może być wykorzystana do izolacji populacji komórek krwiotwórczych i śródbłonka. Aby przygotować preparat jednokomórkowy z wątroby myszy, przenieś płaty na wysuszoną szalkę Petriego i za pomocą skalpela pokrój tkanki na około dwa milimetry sześcienne jednorodne kostki. Przenieś kawałki do dwóch stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów na wątrobę, zawierających 2,5 mililitra buforu wytrawiającego każda.

Próbki należy umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając po pięciu i dziesięciu minutach. Po 15 minutach trawienia użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów z odciętą końcówką, aby delikatnie miareczkować kawałki wątroby. Następnie włóż rurki z powrotem do kąpieli i pozwól kawałkom osiąść przez dwie minuty.

Następnie przefiltrować dwie porcje supernatantu o objętości około 700 mikrolitrów przez sitko o wielkości 100 mikronów, wstępnie zwilżone 800 mikrolitrami buforu zbiorczego. I zastąpić usunięty supernatant świeżym buforem wytrawiającym. Gdy tkanka wątroby nie jest już widoczna, przepuść cały supernatant z probówek wytrawiających przez filtr.

I zbierz wszystkie komórki przez odwirowanie. Zawiesić granulki w jednym mililitrze buforu do lizy chlorku amonu potasu w temperaturze pokojowej, zatrzymując lizę pięcioma mililitrami świeżego buforu zbiorczego po jednej minucie. Zebrać komórki za pomocą kolejnego wirowania.

Następnie ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając luźnego osadu. I ponownie zawieś komórki w czterech mililitrach świeżego buforu zbiorczego na lodzie. Aby określić liczbę komórek próbki wątroby za pomocą cytometrii przepływowej, najpierw wymieszaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek wątroby ze 174 mikrolitrami PBS w 1,5 mililitrowej probówce z polistyrenu i sześcioma mikrolitrami jodu propidynowego.

Dodaj kulki zliczające, które pozwalają na kwantyfikację komórek i załaduj mieszaninę kulek i komórek do cytometru przepływowego. Brama po stronie rozprasza się według parametrów rozproszenia do przodu, aby uniknąć gruzu. Z wyłączeniem dubletów poprzez bramkę obszaru rozproszenia do przodu w stosunku do bramki obszaru rozproszenia do przodu i martwe komórki dodatnie jodu propidyny.

Następnie załaduj próbkę o pojemności 30 mikrolitrów do cytometru przepływowego i zapisz zdarzenia. Aby zabarwić komórki wątroby do analizy cytometrii przepływowej podzbiorów progenitorów, przenieś 2x10^5 podwielokrotności komórek do 1,5 mililitrowych probówek reakcyjnych. I granulować komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić granulki w bloku Fc na pięć minut inkubacji na lodzie. Następnie dodać 50 mikrolitrów interesującego nas koktajlu przeciwciał barwiących powierzchnię komórek do odpowiednich probówek na 20-minutową inkubację na lodzie chronionym przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć próbki w 400 mikrolitrach buforu barwiącego na próbkę.

I ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach odpowiedniego wtórnego koktajlu przeciwciał na 20 minut na lodzie chronionym przed światłem. Następnie umyj komórki kolejnymi 400 mikrolitrami buforu barwiącego. I ponownie zawieś granulki w 300 mikrolitrach buforu barwiącego zawierającego jodek propidyny.

Zmierzyć próbkę za pomocą cytometru przepływowego. Aby wzbogacić populację komórek progenitorowych przez separację opartą na mikrokulkach magnetycznych, przenieś komórki 1,5-2x10^6 do odpowiedniej liczby 15-mililitrowych stożkowych probówek i zbierz komórki przez odwirowanie. Zawiesić granulki w 400 mikrolitrach HBSS uzupełnionego BSA.

I dodaj 40 mikrolitrów mikrogranulek anty-CD31 i 30 mikrolitrów mikrogranulek anty-CD45 na 15-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki w pięciu mililitrach HBSS plus BSA. I ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach kulek do usuwania martwych komórek na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Podczas inkubacji komórek należy zrównoważyć jedną kolumnę selekcji pozytywnej o odpowiedniej wielkości na wątrobę z trzema mililitrami HBSS i BSA. Następnie dodaj 900 mikrolitrów HBSS plus BSA do komórek i przefiltruj komórki przez 100-mikronową poliamidową siatkę filtracyjną. Załadować przefiltrowane komórki inkubowane z kulkami na kolumny zbierające eluat w probówce wirówkowej.

Gdy wszystkie komórki przepłyną przez kolumnę, umyj kolumny trzykrotnie trzema mililitrami HBSS plus BSA. Osadzać komórki przez wirowanie i ponownie zawieś osad komórkowy w 100 mikrolitrach buforu płuczącego i bloku Fc. Wyciągnij granulki komórek z czterech do sześciu wątrób lub do mniej niż 1x10^6 ujemnie wybranych komórek.

Po pięciu minutach oznacz komórki biotynylowanym przeciwciałem anty-GP38 przez 10 minut na lodzie. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie w celu ponownego zawieszenia w 400 mikrolitrach buforu płuczącego i pięciu mikrolitrach mikrogranulek antybiotyny. Po 15 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza natychmiast umyj komórki w pięciu mililitrach buforu płuczącego.

I ponownie zawieś granulat w jednym mililitrze świeżego buforu do płukania. Umieść zawieszone ogniwa na schłodzonym 15-stojaku i rozpocznij automatyczną separację magnetyczną. Następnie odwirować przepływowy przepływ i ponownie zawiesić granulki w odpowiednim roztworze do planowanej dalszej analizy eksperymentalnej.

Bramkowanie na komórkach, które są ujemne dla CD45, CD31 i receptora azjaloglykoproteiny, wybiera komórki progenitorowe wątroby, które można następnie pogrupować zgodnie z ekspresją glikoproteiny 38 i CD133. Dodatnie komórki CD133 dodatnie gp38 i dodatnie CD133 gp38 reprezentują najliczniejsze populacje komórek wśród komórek CD45 ujemnych CD31 ujemnych ASGPR1 w zdrowej wątrobie dorosłej myszy z widocznymi różnicami w ekspresji różnych markerów powierzchniowych wcześniej związanych z komórkami progenitorowymi. Izolacja tych komórek progenitorowych za pomocą mikrokulek magnetycznych, jak właśnie wykazano, skutkuje ponad 90% czystością komórek wątroby o wysokim stopniu żywotności.

Próbując wyizolować te rzadkie komórki, ważne jest, aby wziąć pod uwagę enzymy używane podczas etapów trawienia wątroby, ponieważ różne enzymy mogą preferencyjnie wytwarzać określone subpopulacje progenitorowe i znacznie zmniejszać poziom ekspresji CD133. Ważne jest, aby pamiętać, że czystość i wydajność komórek zależą od delikatnego przygotowania zawiesin jednokomórkowych wątroby. I że duża ilość szczątków komórkowych i zanieczyszczenie umierających komórek może negatywnie wpłynąć na sukces tego protokołu.