Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ustanowienie mikroprzepływowego urządzenia z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do migracji komórek ssaków w różnych kombinacjach prostopadłych gradientów chemicznych i tlenu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach migracji komórek ssaków, w tym wpływ tych gradientów na migrację różnych typów komórek lub komórek z genami ote. Główną zaletą tej techniki jest to, że całą konfigurację eksperymentalną można przeprowadzić w konwencjonalnym inkubatorze w celu uzyskania optymalnych warunków hodowli komórek bez żmudnej konfiguracji i nieporęcznego oprzyrządowania.

Implikacje tej techniki rozszerzyły się na diagnostykę zdolności do przerzutów komórek nowotworowych, ponieważ ruchliwość komórek i różne gradienty fizjologicznie związane można scharakteryzować za pomocą urządzenia mikroprzepływowego. Ta metoda może dostarczyć informacji na temat migracji komórek ssaków. Może być również stosowany w innych badaniach komórkowych, takich jak testy in vitro na komórkach dotyczące kombinacji stężeń leków i napięć tlenowych.

Przenieś dwa gramy polidimetylosiloksanu lub prepolimeru PDMS na formę z wzorami kanałów płynnych górnej warstwy, aby uzyskać cienką warstwę PDMS. Następnie umieść formę w eksykatorze, aby odgazować PDMS przez 60 minut. Po odgazowaniu umieść formę na noc w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza w celu utwardzenia PDMS.

Upewnij się, że forma znajduje się w płaszczyźnie poziomej. Po schłodzeniu formy do temperatury pokojowej należy wlać dodatkowe 13 gramów prepolimeru PDMS na formę, a następnie odgazować PDMS w konfiguracji eksykatora przez 60 minut. Powoli zanurzaj poliwęglan o grubości jednego milimetra lub folię PC w świeżej warstwie PDMS jako barierę dyfuzyjną gazu.

Usuń wszystkie obecne bąbelki. Następnie umieść formę w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza na noc. Upewnij się, że forma znajduje się w płaszczyźnie poziomej.

Po schłodzeniu utwardzonego PDMS do temperatury pokojowej, przytnij urządzenie skalpelem do powierzchni około 5,5 na pięć centymetrów kwadratowych, która może pokryć wszystkie wzory kanałów. Następnie usuń laboratorium PDMS z formy. Następnie przebij otwory na wloty i wyloty za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy dwóch milimetrów.

Spreparowaną górną warstwę PDMS-PC należy przechowywać z dala od kurzu otoczenia do późniejszego montażu. Aby zmontować urządzenie, najpierw umieść wyprodukowaną górną warstwę PDMS-PC i płytkę z zakodowaną spinowo membraną PDMS w maszynie do obróbki powierzchni tlenowo-plazmowej, z powierzchniami łączącymi skierowanymi do góry. Traktuj powierzchnie PDMS 90-watową plazmą tlenową przez 40 sekund.

Przyklej górną warstwę do membrany PDMS natychmiast po obróbce powierzchni plazmą tlenową. Umieść ciężarek na wierzchu połączonych warstw i włóż je na noc do piekarnika o temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby ułatwić wiązanie. Gdy połączone warstwy ostygną do temperatury pokojowej, przytnij membranę przyklejoną do górnej warstwy za pomocą skalpela na powierzchnię około 5,5 na pięć centymetrów kwadratowych.

Oderwij połączoną strukturę od płytki krzemowej i przebij otwory na wlotach i wylotach kanału gradientu chemicznego za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy dwóch milimetrów. Następnie umieść górną warstwę klejoną membraną i wyprodukowaną dolną warstwę PDMS w maszynie do obróbki powierzchni plazmą tlenową powierzchniami klejącymi skierowanymi do góry. Aby aktywować powierzchnie PDMS, użyj plazmy o mocy 90 watów przez 40 sekund.

Połącz ze sobą górną i dolną warstwę w celu sklejenia natychmiast po obróbce powierzchni. Umieść ciężarek na całym połączonym urządzeniu i pozostaw je na noc w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnego dnia wyjmij całe wyprodukowane urządzenie z piekarnika i ostudź je do temperatury pokojowej.

Rozpocznij test migracji komórek mikroprzepływowych od przygotowania komórek w urządzeniu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Drugiego dnia odessać pożywkę z komórek, które były hodowane od dnia zero i umyć komórki pięcioma mililitrami DPBS dwa razy. Odessać DPBS i dodać dwa mililitry trypsyny-EDTA, a następnie inkubować komórki w inkubatorze przez pięć minut, aby oderwać komórki od powierzchni kolby.

Po odłączeniu komórek i zawieszeniu ich w roztworze, dodać do kolby osiem mililitrów pożywki bez surowicy. Przenieś wszystkie płyny do 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj ją w temperaturze 140 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odessać supernatant i dodać odpowiednią ilość pożywki bez surowicy, aby uzyskać końcową gęstość komórek wynoszącą milion komórek na mililitr.

Następnie wyjmij urządzenie mikroprzepływowe przygotowane pierwszego dnia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 14, aby wstrzyknąć pożywkę bez surowicy przez wylot kanału gradientu chemicznego, aż pożywka wypłynie z obu igieł na wlotach. Następnie wstrzyknąć 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej z wylotu kanału gradientu chemicznego.

Obserwuj komorę hodowli komórkowej w urządzeniu pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki zostały wprowadzone do kanału mikroprzepływowego. Następnie umieść urządzenie w wilgotnym pojemniku i trzymaj je w inkubatorze do hodowli komórkowych przez pięć godzin, aby przyspieszyć przyleganie komórek do powierzchni urządzenia. W międzyczasie przygotuj substancję chemiczną w pożądanym stężeniu w podłożu bez surowicy.

Pobrać pożywkę bez surowicy z substancją chemiczną i bez niej do dwóch oddzielnych trzymililitrowych strzykawek podłączonych do rurki o wysokiej czystości. Następnie ustawić strzykawki na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu jednego mikrolitra na minutę do późniejszego użycia. Następnie przygotuj 15 mililitrów jednomolowego roztworu wodorotlenku sodu i 15 mililitrów 200 miligramów na mililitr roztworu pirogalolu.

Pobrać roztwór wodorotlenku sodu do 15-mililitrowej strzykawki podłączonej do rurki PFTE o wysokiej czystości i pobrać roztwór pirogalolu do 15-mililitrowej strzykawki podłączonej do rurki o wysokiej czystości. Ustawić strzykawki na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu pięciu mikrolitrów na minutę do późniejszego użycia. Po pięciogodzinnej inkubacji wyjmij całe urządzenie i umieść je na szalce Petriego o średnicy 15 centymetrów.

Zamocuj urządzenie na szalce Petriego za pomocą szpachli adhezyjnej, a następnie przenieś szalkę Petriego do mikroskopu obrazowania żywych komórek w inkubatorze. Podłączyć rurki ze strzykawek do wlotów kanału gradientu chemicznego w celu wytworzenia gradientu chemicznego. Następnie podłącz wylot do rurki prowadzącej do zbiornika na odpady.

Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu chemicznego. Następnie podłącz rurkę o wysokiej czystości ze strzykawek zawierających chlorek sodu i pirogalol do wlotów kanału gradientu tlenu. Podłącz rurkę do wylotu, aby zebrać odpady i włącz pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu generowania gradientu tlenu.

Dodaj około 15 mililitrów podwójnie destylowanej wody do szalki Petriego, aby utrzymać nawilżenie urządzenia. Następnie skonfiguruj mikroskop do obrazowania żywych komórek do przechwytywania obrazu poklatkowego i rób zdjęcie co 15 minut. Gromadzenie i analiza danych oraz charakteryzacja gradientów zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki gradientów chemicznych generowanych w urządzeniu mikroprzepływowym do migracji komórek. Wynik symulacji numerycznej dobrze zgadza się z charakterystyką eksperymentalną przy użyciu roztworu fluoresceiny jako substancji chemicznej. Gradienty innych substancji chemicznych, takich jak chemokina SDF-1 alfa, można również oszacować z wyprzedzeniem za pomocą symulacji.

Gradienty tlenu generowane w urządzeniu można eksperymentalnie scharakteryzować za pomocą wrażliwego na tlen barwnika fluorescencyjnego. Zazwyczaj gradienty tlenu od 1% na górze do 16% na dole można stabilnie ustalić w urządzeniu. Pokazano tu typowe obrazy poklatkowe zebrane podczas eksperymentów przy użyciu mikroskopu obrazowania żywych komórek.

Po analizie obrazu można obliczyć trajektorie migracji komórek A549 i ich średnie ruchy. Bez gradientów komórki pokazują losową migrację, a średni ruch jest bliski zeru. Przy tylko gradiencie chemokiny alfa SDF-1 komórki wykazują zachowanie chemotaktyczne i migrują w kierunku wysokiego gradientu chemokiny zgodnie z oczekiwaniami.

Mając tylko gradient tlenu, komórki poruszają się w kierunku niskiego poziomu tlenu, wykazując zachowanie aerotaktyczne, które nie zostało dobrze zbadane dla komórek ssaków. Co ciekawe, zarówno w przypadku gradientów chemokin, jak i tlenu, komórki poruszają się w kierunku gradientu o niskiej zawartości tlenu, co pokazuje, że gradient tlenu ma dominujące skutki. Ta obserwacja wymaga dalszych badań.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dobrym wypoziomowaniu urządzenia podczas produkcji i wyeliminowaniu pęcherzyków powietrza w konfiguracji urządzenia mikroprzepływowego podczas eksperymentu migracji komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować urządzenie mikroprzepływowe PDMS-PC i skonfigurować eksperymenty do badania migracji komórek ssaków w kombinacjach gradientów chemicznych i tlenu.