Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest stworzenie mikrofluidycznego urządzenia z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badania migracji komórek ssaków w różnych kombinacjach prostopadłych gradientów chemicznych i tlenowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad migracją komórek ssaków, w tym w kwestii wpływu tych gradientów na migrację różnych typów komórek lub komórek z innymi genami. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że cały układ eksperymentalny może być prowadzony w konwencjonalnym inkubatorze, zapewniając optymalne warunki hodowli komórkowej bez uciążliwego przygotowania i stosowania rozbudowanej aparatury.

Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę zdolności do przerzutowania komórek nowotworowych, ponieważ za pomocą urządzenia mikrofluidycznego można scharakteryzować ruchliwość komórek oraz różne gradienty fizjologiczne. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat migracji komórek ssaków. Może być ona również stosowana w innych badaniach komórkowych, takich jak in vitro testy leków z wykorzystaniem komórek przy różnych kombinacjach stężeń leków i ciśnień tlenu.

Przenieś dwa gramy polidimetylosiloksanu, czyli prepolimeru PDMS, na formę z wzorami kanałów mikrofluidycznych górnej warstwy, aby utworzyć cienką warstwę PDMS. Następnie umieść formę w eksykanecie w celu odgazowania PDMS przez 60 minut. Po odgazowaniu umieść formę na noc w piecu w temperaturze 60°C w celu utwardzenia PDMS.

Upewnij się, że forma znajduje się w płaszczyźnie poziomej. Po ochłodzeniu formy do temperatury pokojowej wlej na nią dodatkowe 13 gramów prepolimeru PDMS, a następnie odgazuj PDMS w układzie z deskrykatorem przez 60 minut. Powoli zanurz folię poliwęglanową (PC) o grubości 1 mm w świeżej warstwie PDMS, aby stworzyć barierę dla dyfuzji gazów.

Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie umieść formę w piecu o temperaturze 60°C na całą noc. Upewnij się, że forma znajduje się w płaszczyźnie poziomej.

Po ochłodzeniu utwardzonego PDMS do temperatury pokojowej, wyciąć skalpelem obszar urządzenia o wymiarach około 5,5 na 5 cm², który obejmie wszystkie wzory kanałów. Następnie oddzielić warstwę PDMS od formy. W kolejnym kroku wykonać otwory dla wlotów i wylotów, używając biopsyjnego wycinaka o średnicy 2 mm.

Przechowywać wykonaną górną warstwę PDMS-PC w miejscu chronionym przed kurzem z otoczenia do momentu montażu. Aby złożyć urządzenie, najpierw umieścić wykonaną górną warstwę PDMS-PC oraz wafele z naniesioną metodą spin-coatingu membraną PDMS w urządzeniu do powierzchniowej obróbki plazmą tlenową, tak aby powierzchnie wiążące były skierowane do góry. Poddać powierzchnie PDMS działaniu plazmy tlenowej o mocy 90 W przez 40 s.

Przymocuj górną warstwę do membrany PDMS niezwłocznie po powierzchniowej obróbce plazmą tlenową. Połóż obciążenie na wierzchu sklejonych warstw i umieść je w piekarniku w temperaturze 60-degree Celsius na całą noc, aby wzmocnić wiązanie. Po ostygnięciu sklejonych warstw do temperatury pokojowej, wytnij skalpelem membranę przymocowaną do górnej warstwy do obszaru o wymiarach około 5.5 na pięć centymetrów kwadratowych.

Oddziel strukturę wiązaną od wafla krzemowego i wykonaj otwory w wlotach i wylotach kanału gradientu chemicznego, używając wycinaka do biopsji o średnicy 2 mm. Następnie umieść górną warstwę z przywiązaną membraną oraz wykonaną dolną warstwę PDMS w urządzeniu do plazmowej obróbki powierzchni tlenowej, tak aby powierzchnie wiązania były skierowane ku górze. Aby aktywować powierzchnie PDMS, zastosuj plazmę o mocy 90 W przez 40 s.

Natychmiast po obróbce powierzchni połącz górną i dolną warstwę w celu ich związania. Umieść obciążenie na wierzchu całego połączonego urządzenia i pozostaw je na noc w piekarniku w temperaturze 60-degree Celsius. Następnego dnia wyjmij całe wykonane urządzenie z piekarnika i schłodź je do temperatury pokojowej.

Rozpocznij analizę migracji komórek w układzie mikrofluidycznym od przygotowania komórek w urządzeniu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Drugiego dnia odessij medium z komórek hodowanych od dnia zerowego i przemyj komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami DPBS. Odessij DPBS i dodaj dwa mililitry Trypsyny-EDTA, następnie inkubuj komórki w inkubatorze przez pięć minut, aby odlepić je od powierzchni kolby.

Po odklejeniu komórek i zawieszeniu ich w roztworze, do kolby należy dodać osiem mililitrów medium bezsurowiczego. Wszystkie ciecze przenosi się do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwiruje przy 140 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu należy odessać supernatant i dodać odpowiednią ilość medium bezsurowiczego, aby uzyskać końcową gęstość komórek wynoszącą jeden milion komórek na mililitr.

Następnie należy wyjęć urządzenie mikroprzepływowe przygotowane pierwszego dnia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z tępą igłą 14G należy wstrzyknąć pożywkę bezsurowiczą przez wylot kanału gradientu chemicznego, aż do momentu, gdy pożywka zacznie wypływać z obu igieł w wlotach. Następnie przez wylot kanału gradientu chemicznego należy wstrzyknąć 200 µL zawiesiny komórkowej.

Obserwuj komorę hodowli komórkowej w urządzeniu pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki zostały wprowadzone do kanału mikroprzepływowego. Następnie umieść urządzenie w wilgotnym pojemniku i pozostaw je w inkubatorze do hodowli komórkowej na pięć godzin, aby wspomóc adhezję komórek do powierzchni urządzenia. W tym czasie przygotuj związek chemiczny o pożądanym stężeniu w medium bezsurowiczym.

Naboruj pożywkę bezsurowiczą z dodatkiem i bez dodatku związku chemicznego do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 3 ml podłączonych do rurek wysokiej czystości. Następnie umieść strzykawki w pompie strzykawkowej, ustawiając szybkość przepływu na 1 µL/min do późniejszego użycia. Następnie przygotuj 15 ml 1 M roztworu wodorotlenku sodu oraz 15 ml roztworu pirogallolu o stężeniu 200 mg/ml.

Naciągnij roztwór wodorotlenku sodu do strzykawki o pojemności 15 ml połączonej z rurką PTFE o wysokiej czystości, a roztwór pirogalolu naciągnij do strzykawki o pojemności 15 ml połączonej z rurką o wysokiej czystości. Zamocuj strzykawki w pompie strzykawkowej, ustawiając szybkość przepływu na 5 µL/min do późniejszego użycia. Po pięciogodzinnej inkubacji wyjmij całe urządzenie i umieść je na szalce Petriego o średnicy 15 cm.

Przymocuj urządzenie w szalce Petriego za pomocą masy mocującej, a następnie przenieś szalkę Petriego do mikroskopu do obrazowania żywych komórek znajdującego się w inkubatorze. Podłącz rurki z strzykawek do wlotów kanału gradientu chemicznego w celu wytworzenia gradientu chemicznego. Następnie podłącz wylot do rurki prowadzącej do zbiornika na odpady.

Włącz pompę strzykawkową z zestawem strzykawek do generowania gradientu chemicznego. Następnie podłącz wysokiej czystości przewody z strzykawek zawierających chlorek sodu i pirogallol do wlotów kanału gradientu tlenowego. Podłącz przewód do wylotu w celu zbierania odpadów i włącz pompę strzykawkową z zestawem strzykawek do generowania gradientu tlenowego.

Do szalki Petriego należy dodać około 15 mililitrów wody dwukrotnie destylowanej, aby utrzymać nawilżenie urządzenia. Następnie należy przygotować mikroskop do obrazowania żywych komórek do rejestracji obrazów w odstępach czasowych i wykonywać zdjęcie co 15 minut. Gromadzenie i analizę danych oraz charakterystykę gradientów należy przeprowadzić zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki gradientów chemicznych wygenerowanych w urządzeniu mikroprzepływowym do migracji komórek. Wynik symulacji numerycznej jest zgodny z charakterystyką eksperymentalną z wykorzystaniem roztworu fluoresceiny jako substancji chemicznej. Gradienty innych substancji, takich jak chemokina SDF-1 alpha, mogą być również wcześniej oszacowane za pomocą symulacji.

Gradienty tlenu generowane w urządzeniu można scharakteryzować eksperymentalnie przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na tlen. Zazwyczaj w urządzeniu można stabilnie ustanowić gradienty tlenu od 1% w górnym strumieniu do 16% w dolnym strumieniu. Przedstawiono tutaj typowe obrazy poklatkowe zebrane podczas eksperymentów z wykorzystaniem mikroskopu do obrazowania żywych komórek.

Po analizie obrazów można obliczyć trajektorie migracji komórek A549 oraz ich średnie przemieszczenie. W warunkach braku gradientów komórki wykazują migrację losową, a średnie przemieszczenie jest bliskie zeru. W obecności wyłącznie gradientu chemokiny SDF-1 alpha komórki wykazują zachowanie chemotaktyczne i, zgodnie z oczekiwaniami, migrują w kierunku wysokiego gradientu chemokiny.

Przy obecności wyłącznie gradientu tlenu komórki przemieszczają się w kierunku niskiego stężenia tlenu, wykazując zachowanie aerotaktyczne, które nie zostało dotychczas szczegółowo przebadane w odniesieniu do komórek ssaków. Co ciekawe, w obecności gradientów zarówno chemokin, jak i tlenu, komórki przemieszczają się w stronę niskiego stężenia tlenu, co wskazuje na dominujący wpływ gradientu tlenu. Obserwacja ta wymaga dalszych badań.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym wypoziomowaniu urządzenia podczas procesu wytwarzania oraz o usunięciu pęcherzyków powietrza z układu urządzenia mikroprzepływowego podczas eksperymentu z migracją komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować mikroprzepływowe urządzenie PDMS-PC oraz jak zaplanować eksperymenty w celu badania migracji komórek ssaków pod wpływem kombinacji gradientów chemicznych i tlenowych.