Name: Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Poznaj metodę mikroprzepływową z urządzeniem PDMS-PC do badania migracji komórek ssaków w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu. Technika umożliwia badania metastazy nowotworowej w warunkach inkubatora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten artykuł jest oparty na pracy wspieranej przez National Health Research Institutes (NHRI) na Tajwanie w ramach Innovative Research Grant (IRG) (EX105-10523EI), Tajwańskie Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), Projekt Tematyczny Academia Sinica (AS-105-TP-A06) oraz Program Badawczy w Nanonauce i Nanotechnologii. Autorzy pragną podziękować Pani Rachel A. Lucas za korektę manuskryptu.

1. Produkcja urządzenia mikroprzepływowego
UWAGA: Całe urządzenie mikroprzepływowe jest wytwarzane przy użyciu procesu formowania replik miękkiej litografii13.
<ol>
	<li>Wykonanie form do warstw PDMS w urządzeniu mikroprzepływowym
	<ol>
		<li>Zaprojektuj wzorce kanałów mikroprzepływowych za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do ilustracji lub rysowania. Prześlij plik do firmy w celu wydrukowania przezroczystej maski fotograficznej w wysokiej rozdzielczości14.</li>
		<li>Czyste płytki krzemowe należy oczyścić acetonem (≥99,5%), alkoholem izopropylowym (IPA; ≥99,9%) i buforowanym wytrawianiem tlenkowym (BOE; 6:1 NH4F.HF). Spłucz wodą dejonizowaną (DI) i odwodnij wafel za pomocą pistoletu do azotu.</li>
		<li>Przędzić warstwę około 20 g fotorezystu o odcieniu negatywu, SU-8 2050, na płytkach z prędkością 500 obr./min przez 15 sekund, a następnie 2,000 obr./min przez 30 sek. 
		UWAGA: W warunkach powlekania wirowego po litografii optycznej powinny powstać warstwy fotorezystu SU-8 2050 o grubości około 75 μm na płytkach.</li>
		<li>Wafle pieczemy na miękko na płycie grzewczej o temperaturze 65 °C przez 3 minuty, a następnie w temperaturze 95 °C przez 9 minut. Po miękkim upieczeniu naświetl wafle za pomocą wyrównywacza maski z zaprojektowanymi przezroczystymi maskami w świetle UV; całkowita energia ekspozycji powinna wynosić około 300 mJ/cm2. Pieczenie wafli po ekspozycji (PEB) w temperaturze 65 °C przez 2 min, a następnie w temperaturze 95 °C przez 7 min.</li>
		<li>Po PEB zanurzyć płytki w wywoływaczu SU-8 z silnym mieszaniem lub w kąpieli ultradźwiękowej (37 kHz i 180 W efektywnej mocy ultradźwiękowej) na 7 minut. Przepłukać wafel acetonem i IPA w celu usunięcia pozostałości SU-8.</li>
		<li>Umieścić wafel i 100 μl silanu (1H,1H,2H,2H-perfluorooktyltrichlorosilan) na szalce Petriego o średnicy 6 cm w eksykatorze połączonym z membranową pompą próżniową do silanizacji powierzchni płytki, aby zapobiec niepożądanemu wiązaniu. Włączyć pompę na 15 minut, wyłączyć ją i uszczelnić eksykator próżnią na 30 minut.</li>
		<li>Wyjąć silanizowane płytki z eksykatora i przykleić je taśmą do szalek Petriego o średnicy 15 cm w celu przeprowadzenia następującego procesu miękkiej litografii:</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja i montaż warstw PDMS
	<ol>
		<li>Przygotowanie prepolimeru PDMS
		<ol>
			<li>Wymieszaj monomer PDMS (zasada) i utwardzacz w stosunku 10:1 (v/v). Odgazowuje mieszaninę w eksykatorze przez 60 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonanie warstwy wierzchniej wbudowanej w komputer PC
		<ol>
			<li>Przenieś 2 g prepolimeru PDMS na formę z wzorami kanałów płynnych górnej warstwy, aby uzyskać cienką warstwę PDMS. Umieść formę w ustawieniu eksykatora, aby odgazować PDMS przez 60 minut.</li>
			<li>Umieść formę na noc w piekarniku o temperaturze 60 °C do utwardzenia PDMS. Upewnij się, że forma znajduje się w płaszczyźnie poziomej.</li>
			<li>Ostudzić formę do temperatury pokojowej. Wlać dodatkowe 13 g prepolimeru PDMS na formę i odgazować PDMS w konfiguracji eksykatora przez 60 minut.</li>
			<li>Powoli zanurz folię PC o grubości 1 mm w świeżej warstwie PDMS jako barierę dyfuzyjną gazu; w razie potrzeby usuń wszelkie pęcherzyki.</li>
			<li>Wstaw formę na noc do piekarnika o temperaturze 60 °C i upewnij się, że jest w płaszczyźnie poziomej.</li>
			<li>Schłodzić utwardzony PDMS do temperatury pokojowej. Przytnij urządzenie skalpelem na powierzchnię około 5,5 x 5 cm2, która może pokryć wszystkie wzory kanałów, i oderwij płytę PDMS od formy.</li>
			<li>Przebij otwory na wloty i wyloty za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 2 mm. Spreparowaną górną warstwę PDMS-PC należy przechowywać z dala od kurzu otoczenia do późniejszego montażu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonanie dolnej warstwy PDMS
		<ol>
			<li>Wlej 11 g prepolimeru PDMS na formę na dolną warstwę. Umieść formę w eksykatorze, aby odgazować PDMS na 60 minut. Przechowuj formę przez noc w piekarniku o temperaturze 60 °C, aby utwardzić PDMS. Upewnij się, że leży na płaszczyźnie poziomej.</li>
			<li>Schłodzić PDMS do temperatury pokojowej. Przytnij urządzenie do obszaru o wymiarach około 5,5 x 5 cm2, który może pokryć wszystkie wzory kanałów, i oderwij je od formy. Spreparowaną dolną warstwę PDMS należy przechowywać z dala od kurzu otoczenia w celu późniejszego montażu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonanie membrany PDMS
		<ol>
			<li>Przędzić około 4 g prepolimeru PDMS na silanizowaną pustą płytkę z prędkością 100 obr./min przez 90 sekund, a następnie 3 000 obr./min przez 4 sekundy. Piecz wirową wafel w piekarniku o temperaturze 60 °C przez noc.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Montaż urządzenia
		<ol>
			<li>Umieść wyprodukowaną wierzchnią warstwę PDMS-PC i płytkę z membraną PDMS powlekaną spinowo w maszynie do plazmowej obróbki powierzchniO2 powierzchniami klejenia skierowanymi do góry. Powierzchnie PDMS należy traktować plazmą O2 o mocy 90 W przez 40 sekund.</li>
			<li>Przyklej górną warstwę do membrany PDMS zaraz po obróbce powierzchni plazmąO2. Umieść ciężarek (około 600 g) na łączonych warstwach i wstaw go na noc do piekarnika o temperaturze 60 °C, aby ułatwić wiązanie.</li>
			<li>Schłodzić połączone warstwy do temperatury pokojowej i przyciąć membranę przyklejoną do wierzchniej warstwy za pomocą skalpela na powierzchnię około 5,5 x 5 cm2, która może pokryć wszystkie wzory kanałów. Oderwij połączoną strukturę od płytki krzemowej i przebij otwory na wlotach i wylotach kanału gradientu chemicznego za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy 2 mm.</li>
			<li>Umieść górną warstwę klejoną membraną i wyprodukowaną dolną warstwę PDMS w maszynie do plazmowej obróbki powierzchni O2, powierzchniami łączącymi skierowanymi do góry, aby aktywować powierzchnie PDMS za pomocą plazmy o mocy 90 W przez 40 sekund.</li>
			<li>Połącz ze sobą górną i dolną warstwę w celu sklejenia natychmiast po obróbce powierzchni. Umieść ciężarek (około 600 g) na wierzchu całego urządzenia i wstaw na noc do piekarnika o temperaturze 60 °C.</li>
			<li>Wyjmij całe wyprodukowane urządzenie z piekarnika i ostudź je do temperatury pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test migracji komórek mikroprzepływowych
UWAGA: W tym artykule używamy powszechnie używanej linii komórkowej, adenocykoraksynomicznej ludzkiej komórki podstawnego nabłonka pęcherzyków płucnych (A549) oraz chemokiny, czynnika pochodzącego z komórek zrębu (SDF-1α), jako przykładów. Badacze pracujący nad innymi komórkami i chemokinami proszeni są o odpowiednie dostosowanie procesów eksperymentalnych.
<ol>
	<li>Dzień 0: Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Hoduj zapas komórek A549 w kompletnej pożywce wzrostowej zawierającej substytut L-glutaminy DMEM F12, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) przeciwbakteryjny roztwór przeciwgrzybiczy. Subkultura przez dysocjację z 0,25% trypsyną-EDTA.</li>
		<li>Przygotować zawiesiny komórek do doświadczeń, odwirowując zdysocjowane komórki w temperaturze 140 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. W eksperymentach z urządzeniem mikroprzepływowym należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru i zasiać co najmniej 1 x 106 komórek w kolbie T75 z 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej. 
		UWAGA: Wszystkie procesy hodowli komórkowej przeprowadza się w inkubatorze o temperaturze 37 °C i atmosferze 5%CO2</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 1: Przygotowanie urządzenia
	<ol>
		<li>Umieść urządzenie w maszynie plazmowejO2 i potraktuj je plazmąO2 o mocy 90 W przez 40 sekund, aby powierzchnie kanałów mikroprzepływowych stały się hydrofilowe.</li>
		<li>Natychmiast po obróbce powierzchni zainstaluj dwie igły 14 G, bezpośrednio wkładając igły do otworów o średnicy 2 mm wybitych w warstwie PDMS na wlotach kanałów gradientu chemicznego. Upewnij się, że igły nie blokują kanałów mikroprzepływowych. Pobrać 0,8 ml ddH2O za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 14 G. Wstrzyknąć ddH2O do kanału gradientu chemicznego od wylotu, aż woda wypłynie z obu igieł na wlotach.</li>
		<li>Przygotować 1 ml roztworu fibronektyny o stężeniu 50 μg/ml, rozcieńczając bulion fibronektyny solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.</li>
		<li>Roztwor fibronektyny należy wlać w infuzji z wylotu kanału gradientu chemicznego za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 14 G, aż roztwór wypłynie z obu igieł na wlotach.</li>
		<li>Inkubuj całe urządzenie przez noc w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2: Wysiewanie komórek i obrazowanie mikroskopowe
	<ol>
		<li>Wysiewanie komórek
		<ol>
			<li>Odessać pożywkę z komórek, które były hodowane od dnia 0 i przemyć komórki 5 ml DPBS 2 razy. Odessać DPBS, dodać 2 ml trypsyny-EDTA i inkubować komórki w inkubatorze przez 5 minut, aby oderwać komórki od powierzchni kolby.</li>
			<li>Poczekać, aż komórki zostaną odłączone i zawieszone w roztworze, a następnie dodać 8 ml pożywki niezawierającej surowicy (DMEM F12 + 1% (v/v) przeciwbakteryjny roztwór przeciwgrzybiczy) do kolby. Przenieść cały płyn do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować ją przy 140 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Po odwirowaniu odessać supernatant i dodać odpowiednią ilość pożywki wolnej od surowicy, aby uzyskać końcową gęstość komórek 1 x 106 komórek/ml. Wyjmij urządzenie mikroprzepływowe przygotowane w dniu 1. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub innego automatycznego przyrządu do liczenia komórek.</li>
			<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą igłą o sile 14 G wstrzyknąć pożywkę pozbawioną surowicy z ujścia kanału gradientu chemicznego, aż pożywka wypłynie z obu igieł na wlotach. Wstrzyknąć 200 μl zawiesiny komórek z wylotu kanału gradientu chemicznego.</li>
			<li>Obserwuj komorę hodowli komórkowej w urządzeniu pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki zostały wprowadzone do kanału mikroprzepływowego. Umieść urządzenie w wilgotnym pojemniku (np. plastikowym pudełku z ddH2O w środku) i przechowuj je w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 5 godzin, aby ułatwić przyleganie komórek do powierzchni urządzenia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie odczynników do generowania gradientów chemicznych
		<ol>
			<li>Przygotować substancję chemiczną (SDF-1α) o pożądanym stężeniu (100 ng/ml) w podłożu bez surowicy. Narysuj pożywkę bez surowicy z substancją chemiczną i bez niej do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 3 ml podłączonych do rurki o wysokiej czystości. Ustawić strzykawki na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu 1 μl/min do późniejszego użycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie odczynników do generowania gradientu tlenu
		<ol>
			<li>Przygotować 15 ml 1 M roztworu NaOH i 15 ml 200 mg/ml roztworu pirogalolu. Pobrać roztwory NaOH i pirogalolu do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 15 ml połączonych odpowiednio z rurką PTFE o wysokiej czystości i rurką o wysokiej czystości. Ustawić strzykawki na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu 5 μl/min do późniejszego użycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Konfiguracja urządzenia mikroprzepływowego
		<ol>
			<li>Po 5 godzinnej inkubacji wyjmij całe urządzenie i umieść je na szalce Petriego o średnicy 15 cm. Zamocuj urządzenie na szalce Petriego za pomocą szpachli klejącej. Przenieść szalkę Petriego do mikroskopu do obrazowania żywych komórek w inkubatorze.</li>
			<li>Podłącz rurki ze strzykawek w celu generowania gradientu chemicznego do wlotów kanału gradientu chemicznego. Podłącz wylot do rurki prowadzącej do zbiornika na odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu chemicznego.</li>
			<li>Podłączyć rurki o wysokiej czystości ze strzykawek zawierających NaOH i pirogalol do wlotów kanału gradientu tlenu. Podłącz rurkę do wylotu, aby zebrać odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu tlenu.</li>
			<li>Dodaj około 15 ml ddH2O do szalki Petriego, aby utrzymać nawilżenie urządzenia. Skonfiguruj mikroskop do obrazowania żywych komórek do przechwytywania obrazu poklatkowego i rób zdjęcie co 15 minut.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3: Gromadzenie i analiza danych
	<ol>
		<li>Przenieś przechwycone pliki obrazów do komputera. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym, ImageJ, z wtyczką open source do ręcznego śledzenia (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) i bezpłatnym oprogramowaniem Chemotaxis Tool (http://ibidi.com/xtproducts/en/Software-and-Image-Analysis/Manual-Image-Analysis/Chemotaxis-and-Migration-Tool)15,16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka gradientów
UWAGA: Gradienty chemiczne i tlenowe można scharakteryzować przed lub po eksperymentach na komórkach.
<ol>
	<li>Symulacja numeryczna gradientu chemicznego
	<ol>
		<li>Oszacuj naturę przepływu laminarnego w mikrofluidyce za pomocą symulacji obliczeniowej dynamiki płynów (CFD).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperymentalna charakterystyka gradientu tlenu
	<ol>
		<li>Przygotować wrażliwy na tlen barwnik fluorescencyjny, sześciowodny chlorek tris(2,2′-bipirydylo)rutenu(III), roztwór w wodzie o stężeniu 5 mg/ml.</li>
		<li>Pobrać wrażliwy na tlen roztwór barwnika do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 3 ml podłączonych do rurki o wysokiej czystości. Ustawić strzykawki na pompie strzykawkowej o natężeniu przepływu 1 μl/min (identycznym z natężeniem przepływu używanym do generowania gradientu chemicznego).</li>
		<li>Podłączyć rurkę ze strzykawek do wlotów kanału gradientu chemicznego. Podłącz wylot do rurki prowadzącej do zbiornika na odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu chemicznego.</li>
		<li>Zmierz intensywność fluorescencji za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, w którym światło wzbudzenia przechodzi przez filtr optyczny 470 ± 20 nm. Zbieraj światło emisyjne przez długoprzepustowy filtr emisyjny 515 nm za pomocą chłodnej kamery CCD.</li>
		<li>Podłączyć rurki o wysokiej czystości ze strzykawek zawierających NaOH i pirogalol do wlotów kanału gradientu tlenu. Podłącz rurkę do wylotu, aby zebrać odpady. Włączyć pompę strzykawkową ze strzykawkami w celu wytworzenia gradientu tlenu.</li>
		<li>Zbierz obrazy fluorescencyjne wrażliwego na tlen barwnika przepływającego w komorze hodowli komórkowej.</li>
		<li>Zatrzymaj przepływ w celu wytworzenia gradientu tlenu i odłącz wszystkie rurki od kanału wytwarzania tlenu. Podłącz rurki o wysokiej czystości z butli gazowych do wylotu kanału gradientu tlenu.</li>
		<li>Zbierz obrazy fluorescencyjne wrażliwego na tlen barwnika przepływającego w komorze hodowli komórkowej, gdy przepływa powietrze, czysty azot i czysty tlen do rurki podłączonej do kanału gradientu tlenu.</li>
		<li>Oszacuj gradienty tlenu, analizując obrazy fluorescencji przy użyciu równania Sterna-Volmera zgodnie z odniesieniami 10 i 11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., García, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+graded+tissue+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Engineering graded tissue interfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (34), 12170-12175 (2008).</li>
<li>Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+mechanisms+underlying+polarity+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis.</a> Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).</li>
<li>Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19019425">Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival.</a> Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).</li>
<li>Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+oxygen+microenvironment+on+the+proangiogenic+potential+of+human+endothelial+colony+forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells.</a> Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).</li>
<li>Chung, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+growth+and+differentiation+in+a+gradient-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device.</a> Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).</li>
<li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11902584">Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth.</a> Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).</li>
<li>Allen, J. W., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+steady-state+oxygen+gradients+in+vitro%3A+application+to+liver+zonation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation.</a> Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).</li>
<li>McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+oxygen+concentration+enhances+the+stem-like+properties+of+CD133%2B+human+glioblastoma+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro.</a> Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).</li>
<li>Chang, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polydimethylsiloxane-polycarbonate+hybrid+microfluidic+device+capable+of+generating+perpendicular+chemical+and+oxygen+gradients+for+cell+culture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies.</a> Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).</li>
<li>Chen, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).</li>
<li>Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+cell+culture+array+with+various+oxygen+tensions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions.</a> Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.28.1.153">Soft Lithography.</a> Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).</li>
<li>Friend, J., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+devices+using+polydimethylsiloxane%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane.</a> Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).</li>
<li>Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCordeli%C3%A8res%2C+FP+%22Manual+Tracking%22">Manual Tracking</a>. , Institute Curie. Orsay, France. 
 <a target="_blank" href=" https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf"> https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf</a> (2005).</li>
<li>Asano, Y., Horn, E. <a target="_blank" href="http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf">Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0</a>. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. 
 <a target="_blank" href=" http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf"> http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf</a> (2013).</li>
<li>Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nitric+oxide+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+controlled+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions.</a> Biomicrofluidics. 7 (6), 064104(2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najbardziej krytycznymi krokami do wytworzenia urządzenia mikroprzepływowego PDMS z wbudowaną cienką folią PC są: (1) usunięcie wszystkich pęcherzyków podczas wkładania folii PC do prepolimeru PDMS podczas wytwarzania górnej warstwy PDMS-PC oraz (2) upewnienie się, że wszystkie procesy utwardzania PDMS są wykonywane na dobrze wypoziomowanej płaszczyźnie poziomej. W przypadku eksperymentów z migracją komórek najbardziej krytycznymi krokami są: (1) eliminacja pęcherzyków w urządzeniu mikroprzepływowym, rurkach i pompach strzykawkowych podczas eksperymentów; (2) zapewnienie, że urządzenie mikroprzepływowe jest umieszczone na dobrze wypoziomowanej płaszczyźnie poziomej podczas obrazowania żywych komórek w celu obserwacji migracji komórek; oraz (3) utrzymywanie urządzenia w stanie nawilżenia poprzez dodawanie ddH2O do szalki Petriego podczas eksperymentów i upewnianie się, że woda nie jest wysuszona.
Aby skutecznie wytworzyć hybrydowe urządzenie mikroprzepływowe PDMS-PC bez rozwarstwiania, konieczne jest usunięcie wszystkich pęcherzyków podczas wkładania folii PC. Folię PC można powoli wkładać pod kątem (około 15 do 30 stopni od powierzchni prepolimeru PDMS), aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków podczas wkładania folii PC do prepolimeru PDMS. W razie potrzeby cały prepolimer PDMS z wbudowaną folią PC można umieścić w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej na 10 minut w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków. Jeśli folia PC unosi się w górę po procesie próżniowym, można użyć końcówki pipety, aby docisnąć folię PC do utwardzonej warstwy PDMS. W razie potrzeby powtórz procesy odkurzania i prasowania.
W przypadku eksperymentów komórkowych brak pęcherzyków powietrza ma kluczowe znaczenie dla mikroprzepływowej hodowli komórek. Upewnij się, że żadne pęcherzyki powietrza nie są wprowadzane do całego zestawu mikroprzepływowego (w tym pomp strzykawkowych, przewodów i urządzenia mikroprzepływowego) podczas wykonywania połączeń. Jeśli pęcherzyki powietrza powstają w układzie mikroprzepływowym z powodu spadku rozpuszczalności gazów w podwyższonej temperaturze eksperymentów wewnątrz inkubatora, wszystkie składniki eksperymentalne (w tym strzykawki i rurki) i odczynniki (w tym pożywkę wzrostową, pirogalol i NaOH) można wcześniej umieścić w inkubatorze (co najmniej 20 minut przed użyciem), aby zminimalizować zmiany temperatury. Pompy strzykawkowe często wytwarzają ciepło w wyniku działania silników w pompach. Zazwyczaj dopuszczalne jest używanie pomp strzykawkowych wewnątrz inkubatorów; Należy jednak sprawdzić temperaturę inkubatora podczas eksperymentów. Jeśli temperatura wzrośnie podczas eksperymentów, należy przeprowadzić dodatkowe procedury chłodzenia. Można zastosować kilka możliwych metod chłodzenia, takich jak umieszczenie pudełka z lodem w inkubatorze, zmniejszenie liczby pomp strzykawkowych umieszczonych wewnątrz inkubatora lub użycie inkubatora z systemem chłodzenia siłowego.
Opracowane w tym artykule mikroprzepływowe urządzenie do hodowli komórek PDMS-PC jest w stanie niezawodnie generować prostopadłe gradienty chemiczne i tlenowe do badań migracji komórek. Ograniczeniem opracowanego urządzenia jest to, że generowane profile gradientu tlenu zależą od równowagi między strumieniem tlenu, napędzanym przez oczyszczanie reakcji chemicznych, a dyfuzją tlenu z atmosfery otoczenia, przez urządzenie i do medium. W rezultacie profile gradientu tlenu nie mogą być dowolnie kontrolowane wewnątrz urządzenia. W porównaniu z istniejącymi mikroprzepływowymi platformami do hodowli komórek, urządzenie opracowane w tym artykule jest pierwszym zdolnym do przeprowadzania badań hodowli komórkowych w połączeniu z gradientami chemicznymi i tlenowymi. Całe urządzenie można wytworzyć przy użyciu konwencjonalnego procesu formowania replik miękkiej litografii, bez żmudnego wyrównywania i kosztownego oprzyrządowania. Gradienty mogą być symulowane numerycznie i charakteryzowane eksperymentalnie, aby zapewnić bardziej fizjologiczne warunki podobne do mikrośrodowiska do badań komórkowych in vitro . Dzięki zastosowaniu ograniczonej przestrzennie metody reakcji chemicznej z folią PC jako barierą dyfuzyjną gazu, gradient tlenu można wygenerować bez użycia butli z gazem pod ciśnieniem i zaawansowanych jednostek kontroli przepływu gazu. Ponadto konfiguracja wymaga tylko niewielkich ilości chemikaliów (mniej niż 10 ml dziennie), aby utrzymać gradienty tlenu. Ponieważ kontrola napięcia tlenu jest ograniczona lokalnie wokół kanału mikroprzepływowego i nie zakłóca stężenia tlenu w otoczeniu, cały zestaw można umieścić w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych bez dodatkowego oprzyrządowania do kontroli temperatury, wilgotności iCO2 . W związku z tym opracowane urządzenie ma ogromny potencjał do praktycznego zastosowania w laboratoriach biologicznych.
Ze względu na ograniczenia techniczne, zachowania komórek pod ciśnieniem tlenu rzadko były badane w istniejącej literaturze. Za pomocą urządzenia opracowanego w tym artykule, hodowla komórkowa w gradientach tlenu może być przeprowadzana w łatwy sposób, który znacznie sprzyja badaniom komórek w gradientach tlenu. Co więcej, podobną zasadę działania można zastosować do generowania innych fizjologicznie istotnych gradientów gazowych, takich jak dwutlenek węgla i tlenek azotu, w badaniach hodowli komórkowych in vitro 17. Możliwości te pokazują, że urządzenie mikroprzepływowe PDMS-PC wykazuje ogromny potencjał w różnych zastosowaniach w hodowlach komórkowych, w tym w testowaniu leków oraz testach proliferacji i migracji komórek, w celu przyspieszenia badań nad hodowlami komórkowymi in vitro.

Przestrzenny rozkład czynników rozpuszczalnych i napięcia tlenu może regulować wiele ważnych funkcji komórkowych in vivo1,2,3,4. Aby lepiej zbadać ich wpływ na komórki, bardzo pożądana jest platforma do hodowli komórkowych in vitro, która będzie w stanie stabilnie generować gradienty chemiczne i tlenowe. Różne rozpuszczalne czynniki odgrywają kluczową rolę w aktywności biologicznej i wpływają na zachowanie komórek. Ostatnio, ze względu na postęp technik mikroprzepływowych, opracowano szereg urządzeń mikroprzepływowych zdolnych do stabilnego generowania gradientów chemicznych do badania migracji komórek5. Co więcej, kilka badań wykazało również konieczność stosowania tlenu w hodowlach komórkowych in vitro6,7,8. Jednak kontrola napięcia tlenu w hodowli komórkowej opiera się głównie na bezpośrednim dodawaniu substancji chemicznych do usuwania tlenu lub inkubatorach komórkowych z butlami z gazem pod ciśnieniem. Bezpośrednie dodawanie substancji chemicznych zmienia pożywkę do hodowli komórkowej i wpływa na odpowiedzi komórkowe. Inkubatory z kontrolą tlenu wymagają specjalnej konstrukcji inkubatora, precyzyjnej kontroli przepływu gazu i dużej ilości azotu w celu osiągnięcia warunków niedotlenienia. Co więcej, niemożliwe jest kontrolowanie przestrzennego rozkładu tlenu za pomocą tego układu, który opóźnia badanie zachowania komórkowego przy różnych napięciach i gradientach tlenu. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano szereg urządzeń mikroprzepływowych do generowania gradientów tlenu do zastosowań w hodowlach komórkowych9. Jednak większość z nich jest zasilana gazami pod ciśnieniem, co może powodować problemy z parowaniem i tworzeniem pęcherzyków. W związku z tym często wymagają one wyrafinowanego oprzyrządowania i mogą nie być wiarygodne w przypadku długoterminowych badań nad hodowlami komórkowymi.
Aby sprostać wyzwaniom i dalej badać interakcje między gradientami chemicznymi i tlenowymi dla migracji komórek, opracowaliśmy mikroprzepływowe urządzenie do hodowli komórek wykonane z polidimetylosiloksanu (PDMS) z wbudowaną cienką warstwą poliwęglanu (PC)10. Urządzenie składa się z dwóch warstw kanałów mikroprzepływowych oddzielonych membraną PDMS. Górna warstwa to warstwa PDMS-PC do generowania gradientu tlenu; dolna warstwa wykonana jest z PDMS do generowania gradientu chemicznego i hodowli komórkowej. Urządzenie może jednocześnie generować prostopadłe gradienty chemiczne i tlenu bez użycia butli gazowych i zaawansowanych systemów kontroli przepływu. W urządzeniu PDMS zapewnia doskonałą przezroczystość optyczną, przepuszczalność gazów i kompatybilność biologiczną z hodowlą komórkową i obrazowaniem. Wbudowana folia PC służy jako bariera dyfuzyjna dla efektywnej kontroli napięcia tlenu. W kanale mikroprzepływowym użyliśmy szeregu kanałów w kształcie serpentyny do generowania gradientów chemicznych. Konstrukcja została szeroko wykorzystana do generowania gradientów chemicznych w urządzeniach mikroprzepływowych do różnych zastosowań ze względu na swoją niezawodność i łatwą konfigurację eksperymentalną. Co więcej, profile gradientu chemicznego można zaprojektować, zmieniając wcześniej geometrię kanału za pomocą symulacji numerycznej. Do generowania gradientu tlenu wykorzystaliśmy metodę reakcji chemicznej ograniczonej przestrzennie, która została wcześniej opracowana w naszym lab10,11,12. Tlen może być pobierany z wyznaczonych obszarów bez przedmuchiwania azotem. Do praktycznego zastosowania w laboratoriach biologicznych, cała konfiguracja eksperymentalna jest kompatybilna z konwencjonalnymi inkubatorami do hodowli komórkowych. Integrując te metody, możemy jednocześnie generować stabilne gradienty chemiczne i tlenowe bez dużych butli z gazem i zaawansowanego oprzyrządowania w celu zbadania migracji komórek.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302104</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka do mikrowirówek</td><td>Smartgene</td><td>6011-000</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302151</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka wirówkowa</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Falcon 352096</td><td></td></tr><tr><td>150 mm</td><td>szalka Petriego Dogger Science</td><td>DP-43151</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilan</td><td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr> 3 <tr><td>ml Strzykawka</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302118</td><td></td></tr><tr><td>4-calowy atrapa krzemu Wafel</td><td>Wollemi Technical, Taoyuan, Tajwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Tajwan</td><td>AH3102-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>AG Nakładka na maskę z podwójną ekspozycją</td><td>M& R Nano Technology, Taoyuan, Tajwan</td><td>AG500-4D-D-V-S-H</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-antymiotyczny</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji</td><td>Miltex, Plainsboro, NJ</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>igła</td><td>JensenGlobal, Santa Barbara, CA</td><td>Miernik 14</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr jasnej linii</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>Z359629</td><td>do zliczania komórek</td></tr><tr><td>Buffered Oxide Etch</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Tajwan</td><td>PH3101-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator kultur komórkowych</td><td>Caron, Marietta, OH</td><td>6016-1</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics</td><td>COMSOL, Burlington, MA</td><td>Ver. 4.3b</td><td>do numerycznej symulacji gradientów chemicznych w urządzeniu</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Desicattor</td><td>A-VAC Industries, Anaheim, CA</td><td>35.10001.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12+GlutaMax-1</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 10082</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiego osocza</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td><td>DMIL LED</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy (IPA)</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Tajwan</td><td>CMOS112-00000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>JuLi Smart Fluorescence Cell Imager</td><td>NanoEnTek, Seul, Korea</td><td>Mechaniczny piec konferencyjny DBJ01B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Lindberg Blue M MO1450C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Showa Chemical Industry, Tokio, Japonia</td><td>1943-0150</td><td></td></tr><tr><td>System pomiaru plazmy</td><td>Nordson MARCH, Concord CA</td><td>PX-250</td><td>do plazmowej obróbki powierzchni plazmą tlenową</td></tr><tr><td>Folia poliwęglanowa (PC)</td><td>Quantum Beam Technologies, Tainan Tajwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polidimehtylsiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning, Midland, MI</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>Pirogalol</td><td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td><td>A13405</td><td></td></tr><tr><td>Usuwalna szpachlówka samoprzylepna</td><td>3M</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa Sorvall Legend Mach 1.6R</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin</td><td>Coater ELS Technology, Hsinchu, Tajwan</td><td>ELS 306MA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem, Westborough, MA</td><td>SU-8 2050</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>MicroChem, Westborough, MA</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne</td><td>Feather, Osaka, Japonia</td><td>5005093</td><td>do cięcia PDMS</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Chemyx, Houston, TX</td><td>Termos do hodowli komórkowych Fusion 400</td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Nunc 156367</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 25200</td><td></td></tr><tr><td>Rurki PTFE Tygon</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki Tygon</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td><td>621</td><td></td></tr></tbody></table>

urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

Ten artykuł opisuje urządzenie mikroprzepływowe wykonane z polidimetylosiloksanu (PDMS) z wbudowaną cienką warstwą poliwęglanu (PC) do badania migracji komórek w kombinacjach gradientów chemicznych i tlenowych. Zarówno gradienty chemiczne, jak i tlenu mogą znacznie wpływać na migrację komórek in vivo; Jednak ze względu na ograniczenia techniczne przeprowadzono bardzo niewiele badań w celu zbadania ich skutków in vitro. Urządzenie opracowane w ramach tych badań wykorzystuje szereg kanałów w kształcie serpentyny do generowania pożądanych gradientów chemicznych i wykorzystuje przestrzennie ograniczoną metodę reakcji chemicznej do generowania gradientu tlenu. Kierunki gradientów chemicznych i tlenu są do siebie prostopadłe, co umożliwia prostą interpretację wyników migracji. Aby efektywnie generować gradienty tlenu przy minimalnym zużyciu środków chemicznych, wbudowana cienka folia PC jest wykorzystywana jako bariera dyfuzyjna gazu. Opracowane urządzenie mikroprzepływowe może być uruchamiane za pomocą pomp strzykawkowych i umieszczane w konwencjonalnym inkubatorze komórkowym podczas eksperymentów migracji komórek, co pozwala na uproszczenie konfiguracji i zoptymalizowanie warunków hodowli komórek. W eksperymentach komórkowych użyliśmy urządzenia do zbadania migracji adenocyrakinomicznych ludzkich komórek podstawnych nabłonka pęcherzyków płucnych, A549, w kombinacjach chemokiny (czynnik pochodzący z komórek zrębowych, SDF-1α) i gradientów tlenu. Wyniki eksperymentów pokazują, że urządzenie może stabilnie generować prostopadłe gradienty chemokin i tlenu oraz jest kompatybilne z komórkami. Wyniki badań migracji wskazują, że gradienty tlenu mogą odgrywać istotną rolę w kierowaniu migracją komórek, a zachowanie komórek w kombinacjach gradientów nie może być przewidziane na podstawie tych w pojedynczych gradientach. Urządzenie stanowi potężne i praktyczne narzędzie dla naukowców do badania interakcji między gradientami chemicznymi i tlenowymi w hodowli komórkowej, co może przyczynić się do lepszych badań migracji komórek w mikrośrodowiskach podobnych do in vivo.

Wytworzone hybrydowe urządzenie mikrofluidyczne do hodowli komórkowej z PDMS-PC. Rys. 1 przedstawia zdjęcie oraz ilustrację urządzenia mikrofluidycznego. Warstwa dolna zawiera cztery poziomy kanałów o kształcie serpentyny, które służą do wytwarzania roztworów z odczynników wprowadzanych przez dwa oddzielne wloty z sześcioma różnymi stosunkami mieszania. Teoretycznie sześć różnych stosunków mieszania między dwoma roztworami wprowadzanymi przez wloty wynosi 1:0, 4:1, 3:2, 2:3, 1:4 oraz 0:1 (lewy:prawy). Gradienty chemiczne tworzone przez sześć roztworów o różnych stosunkach mieszania mogą być generowane w komorze hodowli komórkowej, znajdującej się w części dolnej strumienia. Warstwy górna i dolna są oddzielone membraną z PDMS. W warstwie górnej odczynniki do chemicznej reakcji usuwania tlenu są wprowadzane do kanału mikrofluidycznego przez dwa oddzielne wloty. Odczynniki mieszają się ze sobą w celu przeprowadzenia reakcji bezpośrednio przed przepłynięciem nad komorą hodowli komórkowej, aby usunąć tlen z kanału dolnego bez bezpośredniego kontaktu chemicznego. Wbudowana folia z PC, o mniejszym współczynniku dyfuzji gazów w porównaniu z PDMS, działa jako bariera dyfuzyjna, która zwiększa efektywność usuwania tlenu. Tlen stopniowo dyfunduje z powrotem do komory hodowli komórkowej przez PDMS w obszarze dolnym strumienia, tworząc gradient tlenu wzdłuż kierunku przepływu. Ponieważ chemiczna reakcja usuwania tlenu jest ograniczona przestrzennie, wpływa ona jedynie na lokalne ciśnienia parcjalne tlenu. W rezultacie urządzenie może być wykorzystywane w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórek bez zmiany ogólnego ciśnienia parcjalnego tlenu. W eksperymentach z migracją komórki są wysiewane wewnątrz komory hodowli komórkowej w celu obserwacji. Pożywka wzrostowa i odczynniki chemiczne są wprowadzane do urządzenia za pomocą pomp strzykawkowych z precyzyjnie kontrolowanymi szybkościami przepływu.
Charakterystyka gradientów chemicznych i tlenowych generowanych wewnątrz urządzenia. Ze względu na laminarny charakter przepływu w mikrofluidyce, zachowanie przepływu można przewidzieć za pomocą symulacji komputerowej dynamiki płynów (CFD). W niniejszej pracy zbudowano model 3D i przeprowadzono symulację przy użyciu dostępnego komercyjnie oprogramowania do modelowania wielofizycznego. Rys. 2(a) przedstawia porównanie eksperymentalnie określonych profilów stężenia fluoresceiny w poprzek szerokości komory hodowli komórkowej, opartych na pomiarach intensywności fluorescencji, z wynikami symulacji numerycznej. Zgodność między wynikami eksperymentalnymi a symulacją sugeruje, że model CFD pozwala na dokładną estymację gradientów chemicznych generowanych wewnątrz urządzenia. Rys. 2(b) przedstawia symulowany gradient SDF-1α generowany w komorze hodowli komórkowej. Rys. 3 przedstawia wyniki charakterystyki gradientu tlenu uzyskane poprzez przepuszczenie tlenoczułego barwnika fluorescencyjnego przez komorę hodowli komórkowej przed eksperymentami z komórkami. Wynik wskazuje, że stosując opisany powyżej protokół, można utworzyć gradient tlenu w zakresie od około 1 do 16%.
Wyniki migracji komórek. W ramach demonstracji przeprowadzono badania migracji komórek A549 w czterech kombinacjach gradientów chemokiny (SDF-1α) i tlenu: (1) brak gradientu chemokiny i brak gradientu tlenu jako kontrola, (2) z gradientem chemokiny i bez gradientu tlenu, (3) z gradientem tlenu i bez gradientu chemokiny oraz (4) z gradientami zarówno chemokiny, jak i tlenu. Rys. 4 przedstawia zdjęcie całego układu eksperymentalnego. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórek, w którym umieszczono cały układ (w tym urządzenia mikrofluidyczne, pompy strzykawkowe i mikroskopy do obrazowania żywych komórek). Wyniki migracji komórek przedstawiono na Rys. 5. Rys. 5(a) pokazuje obrazy zebrane podczas eksperymentów przy użyciu analizatora obrazowania żywych komórek, a Rys. 5(b) i (c) przedstawiają trajektorie migracji komórek oraz średnie przemieszczenia w czterech analizowanych kombinacjach, wyznaczone za pomocą oprogramowania ImageJ z wtyczkami. Wyniki wskazują, że średni dystans migracji komórek w kontroli oscyluje wokół zera, co sugeruje losowy ruch komórek w eksperymencie. W przeciwieństwie do tego, przy zastosowaniu wyłącznie gradientu chemokiny, średni ruch komórek odbywa się w kierunku lewym, gdzie stężenie SDF-1α jest wyższe. Wyniki sugerują zachowanie chemotaktyczne komórek A549 względem SDF-1α, co było wcześniej raportowane. W eksperymencie z samymi gradientami tlenu średni ruch komórek odbywa się w górę, w stronę niższego ciśnienia tlenu. Co bardziej interesujące, w eksperymencie z prostopadłymi gradientami chemokiny i tlenu średni ruch komórek jest skierowany w górę, bez żadnego wyraźnego przemieszczenia w kierunku poziomym (kierunku gradientu chemokiny).
<img alt="Schemat chipa mikrofluidycznego z gradientami chemicznymi i tlenowymi do hodowli komórek; montaż warstw PDMS-PC." src="/files/ftp_upload/55292/55292fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 1: Wykonane mikrofluidyczne urządzenie do hodowli komórek z PDMS-PC. (a) Zdjęcie eksperymentalne wykonanego urządzenia zdolnego do niezawodnego generowania prostopadłych gradientów chemicznych i tlenowych do badań migracji komórek. Kanał gradientu chemicznego jest wypełniony niebieskim i żółtym barwnikiem spożywczym w celu zademonstrowania generowania gradientu wewnątrz komory hodowli komórek. Kanał gradientu tlenowego jest wypełniony czerwonym barwnikiem spożywczym. Pasek skali wynosi 1 cm. (b) Schemat urządzenia mikrofluidycznego. Warstwa górna jest wykonana z PDMS z wbudowaną warstwą PC jako barierą dyfuzji gazów dla wydajnej kontroli gradientu tlenu wewnątrz komory hodowli komórek. (c) Formy matrycowe do wykonania warstw górnej i dolnej. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres dyfuzji fluoresceiny; COMSOL vs dane eksperymentalne, układ komory mikrofluidycznej, gradient stężeń." src="/files/ftp_upload/55292/55292fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Gradient chemiczny wewnątrz mikrofluidycznego urządzenia do hodowli komórek. (a) Numerycznie symulowany i eksperymentalnie określony gradient stężenia fluoresceiny wewnątrz komory hodowlanej w poprzek szerokości komory (kierunek Y). Podobieństwo między gradientami symulowanymi a zmierzonymi eksperymentalnie wskazuje, że symulacja pozwala na dobrą predykcję gradientu chemicznego. Wstawka na rysunku przedstawia trójwymiarowy (3D) model opracowany na potrzeby symulacji. (b) Wynik symulacji numerycznej gradientu chemokiny SDF-1α w poprzek szerokości komory hodowlanej dla badań migracji komórek. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres napięcia tlenowego w zależności od pozycji; schemat przepływu w komorze hodowli komórkowej; charakterystyka eksperymentalna." src="/files/ftp_upload/55292/55292fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Gradient tlenowy wewnątrz mikrofluidycznego urządzenia do hodowli komórek. Eksperymentalnie zmierzone gradienty tlenowe wewnątrz komory hodowli komórkowej wzdłuż kierunku przepływu. Gradienty oszacowano przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na tlen oraz analizy obrazu. Przedstawiono charakterystykę gradientów od lewej do prawej strony komory, a wyniki wykazują spójne profile gradientu w całej szerokości komory.
<img alt="Układ inkubacji kultur komórkowych z pompami strzykawkowymi, urządzeniem mikroprzepływowym i mikroskopem do obrazowania żywych komórek." src="/files/ftp_upload/55292/55292fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Zdjęcia układu eksperymentalnego. Cały układ, obejmujący urządzenia mikroprzepływowe, pompy strzykawkowe oraz mikroskop do obrazowania żywych komórek, jest umieszczony w konwencjonalnym inkubatorze do kultur komórkowych w celu zapewnienia optymalnych warunków hodowli komórek podczas eksperymentów. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Migracja komórek w gradientach; schemat przedstawiający układ mikropilarów i analizę ruchu wraz z wykresami." src="/files/ftp_upload/55292/55292fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wyniki badania migracji komórek w prostopadłych gradientach SDF-1α oraz tlenu. (a) Obrazy zarejestrowane przed i po 12-godzinnym badaniu migracji komórek. Ścieżki migracji komórek można analizować na podstawie zarejestrowanych obrazów time-lapse przy użyciu mikroskopu do obrazowania żywych komórek. (b) Ścieżki migracji komórek oraz przeanalizowany średni ruch migracyjny z zarejestrowanych obrazów dla 4 różnych kombinacji gradientów: brak gradientu, tylko gradient chemokiny, tylko gradient tlenu oraz gradient chemokiny i tlenu jednocześnie. Obrazy rejestrowano co 15 min. Pasek skali wynosi 250 µm. (c) Wykresy średnich odległości migracji komórek w kierunku prostopadłym (gradient tlenu) i poziomym (gradient chemokiny) dla czterech różnych kombinacji gradientów. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, uzyskane z trzech niezależnych serii eksperymentalnych, przy analizie 10 komórek w każdym doświadczeniu. Wyniki istotnie statystycznie różne (nieparzysty test t Studenta, p &lt; 0,01) oznaczono różnymi literami (a i b). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Kontrola gradientów chemicznych i tlenu jest niezbędna dla hodowli komórkowych. W artykule opisano urządzenie mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu (PDMS-PC) zdolne do niezawodnego generowania kombinacji gradientów chemicznych i tlenowych do badań migracji komórek, które można praktycznie wykorzystać w laboratoriach biologicznych bez wyrafinowanego oprzyrządowania.

Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest stworzenie mikrofluidycznego urządzenia z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badania migracji komórek ssaków w różnych kombinacjach prostopadłych gradientów chemicznych i tlenowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad migracją komórek ssaków, w tym w kwestii wpływu tych gradientów na migrację różnych typów komórek lub komórek z innymi genami. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że cały układ eksperymentalny może być prowadzony w konwencjonalnym inkubatorze, zapewniając optymalne warunki hodowli komórkowej bez uciążliwego przygotowania i stosowania rozbudowanej aparatury.Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę zdolności do przerzutowania komórek nowotworowych, ponieważ za pomocą urządzenia mikrofluidycznego można scharakteryzować ruchliwość komórek oraz różne gradienty fizjologiczne. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat migracji komórek ssaków. Może być ona również stosowana w innych badaniach komórkowych, takich jak in vitro testy leków z wykorzystaniem komórek przy różnych kombinacjach stężeń leków i ciśnień tlenu.Przenieś dwa gramy polidimetylosiloksanu, czyli prepolimeru PDMS, na formę z wzorami kanałów mikrofluidycznych górnej warstwy, aby utworzyć cienką warstwę PDMS. Następnie umieść formę w eksykanecie w celu odgazowania PDMS przez 60 minut. Po odgazowaniu umieść formę na noc w piecu w temperaturze 60°C w celu utwardzenia PDMS.Upewnij się, że forma znajduje się w płaszczyźnie poziomej. Po ochłodzeniu formy do temperatury pokojowej wlej na nią dodatkowe 13 gramów prepolimeru PDMS, a następnie odgazuj PDMS w układzie z deskrykatorem przez 60 minut. Powoli zanurz folię poliwęglanową (PC) o grubości 1 mm w świeżej warstwie PDMS, aby stworzyć barierę dla dyfuzji gazów.Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie umieść formę w piecu o temperaturze 60°C na całą noc. Upewnij się, że forma znajduje się w płaszczyźnie poziomej.Po ochłodzeniu utwardzonego PDMS do temperatury pokojowej, wyciąć skalpelem obszar urządzenia o wymiarach około 5,5 na 5 cm², który obejmie wszystkie wzory kanałów. Następnie oddzielić warstwę PDMS od formy. W kolejnym kroku wykonać otwory dla wlotów i wylotów, używając biopsyjnego wycinaka o średnicy 2 mm.Przechowywać wykonaną górną warstwę PDMS-PC w miejscu chronionym przed kurzem z otoczenia do momentu montażu. Aby złożyć urządzenie, najpierw umieścić wykonaną górną warstwę PDMS-PC oraz wafele z naniesioną metodą spin-coatingu membraną PDMS w urządzeniu do powierzchniowej obróbki plazmą tlenową, tak aby powierzchnie wiążące były skierowane do góry. Poddać powierzchnie PDMS działaniu plazmy tlenowej o mocy 90 W przez 40 s.Przymocuj górną warstwę do membrany PDMS niezwłocznie po powierzchniowej obróbce plazmą tlenową. Połóż obciążenie na wierzchu sklejonych warstw i umieść je w piekarniku w temperaturze 60-degree Celsius na całą noc, aby wzmocnić wiązanie. Po ostygnięciu sklejonych warstw do temperatury pokojowej, wytnij skalpelem membranę przymocowaną do górnej warstwy do obszaru o wymiarach około 5.5 na pięć centymetrów kwadratowych.Oddziel strukturę wiązaną od wafla krzemowego i wykonaj otwory w wlotach i wylotach kanału gradientu chemicznego, używając wycinaka do biopsji o średnicy 2 mm. Następnie umieść górną warstwę z przywiązaną membraną oraz wykonaną dolną warstwę PDMS w urządzeniu do plazmowej obróbki powierzchni tlenowej, tak aby powierzchnie wiązania były skierowane ku górze. Aby aktywować powierzchnie PDMS, zastosuj plazmę o mocy 90 W przez 40 s.Natychmiast po obróbce powierzchni połącz górną i dolną warstwę w celu ich związania. Umieść obciążenie na wierzchu całego połączonego urządzenia i pozostaw je na noc w piekarniku w temperaturze 60-degree Celsius. Następnego dnia wyjmij całe wykonane urządzenie z piekarnika i schłodź je do temperatury pokojowej.Rozpocznij analizę migracji komórek w układzie mikrofluidycznym od przygotowania komórek w urządzeniu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Drugiego dnia odessij medium z komórek hodowanych od dnia zerowego i przemyj komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami DPBS. Odessij DPBS i dodaj dwa mililitry Trypsyny-EDTA, następnie inkubuj komórki w inkubatorze przez pięć minut, aby odlepić je od powierzchni kolby.Po odklejeniu komórek i zawieszeniu ich w roztworze, do kolby należy dodać osiem mililitrów medium bezsurowiczego. Wszystkie ciecze przenosi się do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwiruje przy 140 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu należy odessać supernatant i dodać odpowiednią ilość medium bezsurowiczego, aby uzyskać końcową gęstość komórek wynoszącą jeden milion komórek na mililitr.Następnie należy wyjęć urządzenie mikroprzepływowe przygotowane pierwszego dnia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z tępą igłą 14G należy wstrzyknąć pożywkę bezsurowiczą przez wylot kanału gradientu chemicznego, aż do momentu, gdy pożywka zacznie wypływać z obu igieł w wlotach. Następnie przez wylot kanału gradientu chemicznego należy wstrzyknąć 200 µL zawiesiny komórkowej.Obserwuj komorę hodowli komórkowej w urządzeniu pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki zostały wprowadzone do kanału mikroprzepływowego. Następnie umieść urządzenie w wilgotnym pojemniku i pozostaw je w inkubatorze do hodowli komórkowej na pięć godzin, aby wspomóc adhezję komórek do powierzchni urządzenia. W tym czasie przygotuj związek chemiczny o pożądanym stężeniu w medium bezsurowiczym.Naboruj pożywkę bezsurowiczą z dodatkiem i bez dodatku związku chemicznego do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 3 ml podłączonych do rurek wysokiej czystości. Następnie umieść strzykawki w pompie strzykawkowej, ustawiając szybkość przepływu na 1 µL/min do późniejszego użycia. Następnie przygotuj 15 ml 1 M roztworu wodorotlenku sodu oraz 15 ml roztworu pirogallolu o stężeniu 200 mg/ml.Naciągnij roztwór wodorotlenku sodu do strzykawki o pojemności 15 ml połączonej z rurką PTFE o wysokiej czystości, a roztwór pirogalolu naciągnij do strzykawki o pojemności 15 ml połączonej z rurką o wysokiej czystości. Zamocuj strzykawki w pompie strzykawkowej, ustawiając szybkość przepływu na 5 µL/min do późniejszego użycia. Po pięciogodzinnej inkubacji wyjmij całe urządzenie i umieść je na szalce Petriego o średnicy 15 cm.Przymocuj urządzenie w szalce Petriego za pomocą masy mocującej, a następnie przenieś szalkę Petriego do mikroskopu do obrazowania żywych komórek znajdującego się w inkubatorze. Podłącz rurki z strzykawek do wlotów kanału gradientu chemicznego w celu wytworzenia gradientu chemicznego. Następnie podłącz wylot do rurki prowadzącej do zbiornika na odpady.Włącz pompę strzykawkową z zestawem strzykawek do generowania gradientu chemicznego. Następnie podłącz wysokiej czystości przewody z strzykawek zawierających chlorek sodu i pirogallol do wlotów kanału gradientu tlenowego. Podłącz przewód do wylotu w celu zbierania odpadów i włącz pompę strzykawkową z zestawem strzykawek do generowania gradientu tlenowego.Do szalki Petriego należy dodać około 15 mililitrów wody dwukrotnie destylowanej, aby utrzymać nawilżenie urządzenia. Następnie należy przygotować mikroskop do obrazowania żywych komórek do rejestracji obrazów w odstępach czasowych i wykonywać zdjęcie co 15 minut. Gromadzenie i analizę danych oraz charakterystykę gradientów należy przeprowadzić zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki gradientów chemicznych wygenerowanych w urządzeniu mikroprzepływowym do migracji komórek. Wynik symulacji numerycznej jest zgodny z charakterystyką eksperymentalną z wykorzystaniem roztworu fluoresceiny jako substancji chemicznej. Gradienty innych substancji, takich jak chemokina SDF-1 alpha, mogą być również wcześniej oszacowane za pomocą symulacji.Gradienty tlenu generowane w urządzeniu można scharakteryzować eksperymentalnie przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na tlen. Zazwyczaj w urządzeniu można stabilnie ustanowić gradienty tlenu od 1% w górnym strumieniu do 16% w dolnym strumieniu. Przedstawiono tutaj typowe obrazy poklatkowe zebrane podczas eksperymentów z wykorzystaniem mikroskopu do obrazowania żywych komórek.Po analizie obrazów można obliczyć trajektorie migracji komórek A549 oraz ich średnie przemieszczenie. W warunkach braku gradientów komórki wykazują migrację losową, a średnie przemieszczenie jest bliskie zeru. W obecności wyłącznie gradientu chemokiny SDF-1 alpha komórki wykazują zachowanie chemotaktyczne i, zgodnie z oczekiwaniami, migrują w kierunku wysokiego gradientu chemokiny.Przy obecności wyłącznie gradientu tlenu komórki przemieszczają się w kierunku niskiego stężenia tlenu, wykazując zachowanie aerotaktyczne, które nie zostało dotychczas szczegółowo przebadane w odniesieniu do komórek ssaków. Co ciekawe, w obecności gradientów zarówno chemokin, jak i tlenu, komórki przemieszczają się w stronę niskiego stężenia tlenu, co wskazuje na dominujący wpływ gradientu tlenu. Obserwacja ta wymaga dalszych badań.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym wypoziomowaniu urządzenia podczas procesu wytwarzania oraz o usunięciu pęcherzyków powietrza z układu urządzenia mikroprzepływowego podczas eksperymentu z migracją komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować mikroprzepływowe urządzenie PDMS-PC oraz jak zaplanować eksperymenty w celu badania migracji komórek ssaków pod wpływem kombinacji gradientów chemicznych i tlenowych.

polydimethylsiloxane-polycarbonate-microfluidic-devices-for-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Opisujemy protokół mikrofabrykacji mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, które umożliwia tworzenie przestrzennych i czasowych gradientów w ściśle określonym mikrośrodowisku. W tym podejściu mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być wykorzystane do badania kierunkowej migracji komórek, embriogenezy, gojenia ran oraz przerzutów nowotworowych.

Mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Mikro-prefabrykowane urządzenia zintegrowane z komponentami fluidycznymi stanowią platformę in vitro do badań komórkowych naśladujących mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy mikroprzepływowe chipy na bazie polimetakrylanu metylu do badania reakcji komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających.

Projektowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania odpowiedzi komórkowych pod wpływem pojedynczych lub współistniejących bodźców naprężeń chemicznych/elektrycznych/ścinających

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Poznaj metodę mikroprzepływową z urządzeniem PDMS-PC do badania migracji komórek ssaków w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu. Technika umożliwia badania metastazy nowotworowej w warunkach inkubatora.

Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu (Wideo) | JoVE Journal

Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu i poliwęglanu do badań migracji komórek w prostopadłych gradientach chemicznych i tlenu

Przeglądaj więcej filmów