Name: Ocena wpływu chemikaliów środowiskowych na rozwój pszczół miodnych od poziomu osobnika do poziomu kolonii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj metodę oceny wpływu pozostałości pestycydów na pszczoły miodne i całe kolonie w warunkach naturalnych. Technika pozwala badać skutki chemikaliów na poziomie osobnika i populacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 z Biura Inspekcji i Kwarantanny Zdrowia Zwierząt i Roślin, Rady Rolnictwa, Executive Yuan oraz Grant 103-2313-B-197-002-MY3 z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST).

1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotuj 1 l syropu cukrowego o zawartości 50%. Rozpuścić 1 kg sacharozy w 1 l ddH2O.</li>
	<li>Przygotować roztwór piryproksyfenu (PPN) w BLD. Przygotować 1,1 l z 10 000 ppm roztworu podstawowego PPN i rozcieńczyć 100 ml roztworu PPN w 1 l wysterylizowanym ddH2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy PPN do końcowych stężeń 0,1, 1, 10 i 100 mg/kg (ppm) w BLD do następnego doświadczenia.</li>
	<li>Przygotuj syrop PPN (na poziom kolonii). Rozcieńczyć zapas PPN do końcowych stężeń 10 i 100 ppm w 50% syropie cukrowym do następnego doświadczenia.</li>
	<li>Hodowla pszczół miodnych. 
	Uwaga: Tutaj lokalizacją eksperymentalną jest pasieka National Ilan University (NIU) w mieście Yi-Lan na Tajwanie; (Współrzędne GPS: N24.747278, E121.746200).
	<ol>
		<li>Co tydzień sprawdzaj kolonie pszczół miodnych (Apis mellifera L.) pod kątem ilości pokarmu i w razie potrzeby nakarm je 1 litrem syropu cukrowego o stężeniu 50% (miejsce do przechowywania miodu jest puste). Zdefiniuj zdrową rodzinę jako 9 ramek plastrów pszczoły miodnej w każdej rodzinie, z królową składającą jaja normalnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 100 ml podstawowej diety dla larw (BLD). Rozpuść 6% D-glukozy, 6% fruktozy i 1% ekstraktu drożdżowego w sterylizowanej destylowanej wodzie dejonizowanej (ddH2O) i uzupełnij 50% mleczkiem pszczelim. Przechowywać w temperaturze 4 °C, ale nie dłużej niż 3 dni. 
	Uwaga: Przed eksperymentem podgrzej do 35 °C i zużyj w ciągu 3 dni.</li>
</ol>
2. Metoda karmienia in vivo
Uwaga: Metoda karmienia in vivo została zmodyfikowana przez Hanley et al.20
<ol>
	<li>Selekcja i etykietowanie larw pszczół miodnych.
	<ol>
		<li>Wstaw odstraszacz królowej, aby podzielić 9 ramek zdrowej kolonii na 4 ramki i 5 ramek, jednocześnie ograniczając królową do sekcji 4 ramek. Pozostaw co najmniej jedną pustą ramkę w sekcji 4 ramek do składania jaj.</li>
		<li>Po złożeniu jaj przez królową przez 1 dzień należy sprawdzić ramki pod kątem wyglądu jaj i trzymać jaja w ulach przez 72 godziny (4dzień) do momentu wyklucia się 1-dniowych larw. Ręcznie wyjąć z badanego ula jedną z ramek zawierających 1-dniowe larwy robotnic (wyklute w ciągu 24 godzin) i usunąć robotnice pszczół miodnych z ramki za pomocą szczotki pszczelej.</li>
		<li>Przykryj ramę przezroczystym szkiełkiem (rozmiar = długość x szerokość x grubość = 29,7 mm x 21 mm x 0,1 mm) i przybij przezroczysty szkiełko do krawędzi ramek za pomocą pinezek (Rysunek 1A).</li>
		<li>Do każdego zabiegu losowo wybierz 50 jednodniowych larw (4dzień) i oznacz każdą komórkę czerwiu za pomocą markerów permanentnych na przezroczystym szkiełku (ryc. 1A i 1B). 
		Uwaga: Zapisz informacje o każdym zabiegu na ramie i przezroczystym szkiełku, a także za pomocą markerów permanentnych, aby uniknąć pomyłek między różnymi zabiegami. Usunąć oznaczone szkiełka i zachować do karmienia i obserwacji in vivo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Karmienie in vivo.
	<ol>
		<li>Dodać różne stężenia PPN-BLD (0,1, 1, 10 i 100 ppm) do każdej znakowanej komórki czerwiowej, pipetując w dniu 1, 2 i 3 odpowiednio 10 μl, 10 μl i 20 μl, w zależności od ilości pobranej w wieku larw. Dodaj taką samą ilość BLD (bez PPN) do grupy kontrolnej. W ten sposób całkowita dawka PPN-BLD w każdej znakowanej komórce lęgowej kumuluje się do 4, 40, 400 i 4000 pg. 
		UWAGA: Rozpoznaj oznaczone komórki czerwiowe po zaznaczonych przezroczystych szkiełkach i usuń oznaczone przezroczyste szkiełka po karmieniu. Do karmienia używaj świeżego BLD, aby zapobiec czyszczeniu komórek czerwiu przez pszczoły robotnice.</li>
		<li>Zwróć ramki poddane działaniu PPN do pierwotnych kolonii w celu dalszych obserwacji. 
		UWAGA: Każdy zabieg składa się z czterech powtórzeń biologicznych w czterech koloniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja leczonych larw w 7 dniu.
	<ol>
		<li>Aby zaobserwować larwy poddane działaniu PPN, należy umieścić oznakowane przezroczyste szkiełka z powrotem w ramkach, aby zarejestrować śmiertelność i wskaźniki zamykania w oznakowanych komórkach lęgowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja leczonych poczwarek i częstości wykwitów w dniu 13.
	<ol>
		<li>Usuń wosk pszczeli z zasklepionych komórek czerwiu.</li>
		<li>Włóż pęsetę z miękką końcówką do komórki czerwiu i bardzo lekko zaciśnij poczwarki, a następnie delikatnie wyjmij poczwarki.</li>
		<li>Przenieść poczwarki na 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych z podwójną warstwą tkanek laboratoryjnych pod każdym dołkiem. Rejestruj uszkodzenia i śmiertelność podczas transferu poczwarki.</li>
		<li>Przechowywać 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowej w inkubatorze w temperaturze 34 °C i wilgotności względnej 70% do wschodu (ok. 8 dni).</li>
		<li>Obserwuj i rejestruj poczwarki i pojawiające się pszczoły miodne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>statystyka
	<ol>
		<li>Obliczyć zarejestrowane dane i przedstawić jako średnią ± S.D.</li>
		<li>Przeanalizuj dane za pomocą analizy wariancji (ANOVA) przez SAS i użyj testu najmniejszej istotnej różnicy (LSD), aby przeanalizować różnice między dwiema średnimi różnych terapii. Zdefiniuj wartość statystycznie istotną jako wartość P <0,05. Różne litery w tej samej kolumnie tabeli wykazały istotny wpływ analizy statystycznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Toksyczność PPN na poziomie kolonii w ulu
<ol>
	<li>Skonfiguruj grupy pszczół miodnych.
	<ol>
		<li>Włóż odstraszacz królowej pionowo, aby podzielić 9 ramek zdrowej kolonii na 4 ramki (część A) i 5 ramek (część B), jednocześnie ograniczając królową do sekcji 4 ramek . Pozostaw co najmniej jedną pustą ramkę w sekcji 4-ramkowej do składania jaj. 
		Uwaga: Umieść kolejny ogranicznik królowej na górze części królowej, aby zapobiec przemieszczaniu się królowej między częściami.</li>
		<li>Po złożeniu jaj przez królową przez 1 dzień sprawdź ramki pod kątem wyglądu jaj. Wyjmij ręcznie odpowiednie ramki zawierające jaja z części A i usuń robotnice pszczół miodnych z ramki za pomocą szczotki pszczelej</li>.
		<li>Przykryj ramę przezroczystym szkiełkiem i przybij przezroczysty suwak do krawędzi ramy za pomocą pinezek.</li>
		<li>Losowo wybierz 100 komórek czerwiowych zawierających jaja i zaznacz każdą komórkę czerwiu za pomocą trwałego markera na przezroczystym szkiełku. Przypisz te 100 komórek czerwiowych do grupy 1. Zapisz informacje o każdym zabiegu na ramie i przezroczystym szkiełku za pomocą markera permanentnego, aby uniknąć pomyłek między różnymi zabiegami.</li>
		<li>Umieść oznaczoną ramkę w części A na 3 dni, a następnie przenieś królową do części B, aby złożyć jaja.</li>
		<li>Po upływie 1 dnia należy sprawdzić ramki części B, wybrać jedną odpowiednią ramkę i oznaczyć 100 komórek czerwiowych zawierających jaja, jak opisano w kroku 3.1.4. Przypisz te 100 komórek czerwiu do grupy 2.</li>
		<li>Umieść oznaczoną ramkę z powrotem w części B na 3 dni, a następnie przenieś królową do części A, aby złożyć jaja.</li>
		<li>Powtórz wymianę królowej między częścią A a częścią B jeszcze 6 razy i przypisz grupy odpowiednio numerycznie (rysunek 2). Powinno być w sumie 9 grup.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Treat kolonia pszczół miodnych z syropem cukrowym PPN w dniu 13 (ryc. 2).
	<ol>
		<li>Dodaj 1 l syropu cukrowego 50% PPN zawierającego 10 lub 100 ppm do plastikowego pojemnika na karmnik dla pszczół (szer. x dł. x wys. = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) i umieść pudełko na ramkach w koloniach doświadczalnych. 
		Uwaga: Grupa 1 nie otrzymuje PPN po 13 dniach, ponieważ komórki czerwiowe zostały zapieczętowane.</li>
		<li>Nakarm grupę kontrolną 1 l syropu cukrowego 50% (bez PPN), jak opisano w kroku 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz 1-dniowe larwy i zapisz jako wskaźnik wylęgu się 100 znakowanych komórek lęgowych dla każdej grupy w 5 dniu (ryc. 2). Z jaj pszczół miodnych wykluwają się larwy 0-dniowe zwykle po 3 dniach; Dlatego należy sprawdzić i oznaczyć 100 komórek lęgowych zawierających jaja w dniu 1 i policzyć liczbę larw w wieku 1 dnia dla każdej grupy w dniu 5, aby uzyskać procentowy wskaźnik wylęgu.</li>
	<li>Policz zakryte komórki czerwiowe i zapisz jako wskaźnik zamykania larw 100 znakowanych komórek czerwiowych dla każdej grupy w dniu 11 (ryc. 2). 6 do 7 jednodniowych komórek larwalnych zostanie pokrytych woskiem pszczelim przez robotnice pszczół miodnych w celu przepoczwarzenia larw.</li>
	<li>Obserwuj dojrzewanie poczwarek i zapisz szybkość eklozji 100 znakowanych komórek czerwiowych dla każdej grupy w dniu 17 (ryc. 2).
	<ol>
		<li>Usuń wosk pszczeli z zasklepionych komórek czerwiu i delikatnie wyjmij poczwarki pęsetą z miękką końcówką. Przenieś poczwarki na 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowej z podwójną warstwą tkanek laboratoryjnych pod każdym dołkiem.</li>
		<li>Przechowywać 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych w inkubatorze w temperaturze 34 °C i wilgotności względnej 70% do momentu pojawienia się.</li>
		<li>Obserwuj i zapisuj poczwarki i wynurzone pszczoły miodne dla każdej grupy aż do grupy 9 (49 dni doświadczalnych). 
		Uwaga: Każdy zabieg składa się z czterech powtórzeń biologicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>statystyka
	<ol>
		<li>Oblicz zarejestrowane dane i przedstaw jako średnią ± SD.</li>
		<li>Przeanalizuj istotne różnice między parami zabiegów (np. 0 ppm/10 ppm, 10 ppm/100 ppm i 0 ppm/100 ppm) w każdej grupie, korzystając z dwustronnego testu t Studenta. Zdefiniuj jako statystycznie istotną, jeśli wartość P < 0,05.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ruffi nengo, S. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/287268867_Integrated_pest_management_to_control_Varroa_destructor_and_its_implications_to_Apis_mellifera_colonies">Integrated pest management to control Varroa destructor and its implications to Apis mellifera colonies.</a> Zootecnia Trop. 32 (2), 149-168 (2014).</li>
<li>Mullin, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+miticides+and+agrochemicals+in+North+American+apiaries%2C+implications+for+honey+bee+health%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries, implications for honey bee health.</a> PLoS One. 5, e9754(2010).</li>
<li>Lu, C. A., Chang, C. H., Tao, L., Chen, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282222257_Distributions_of_neonicotinoid_insecticides_in_the_Commonwealth_of_Massachusetts_A_temporal_and_spatial_variation_analysis_for_pollen_and_honey_samples">Distributions of neonicotinoid insecticides in the Commonwealth of Massachusetts, a temporal and spatial variation analysis for pollen and honey samples.</a> Environ. Chem. 13, 4-11 (2016).</li>
<li>Tsai, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ccsenet.org/journal/index.php/ep/article/view/25732">Analysis of coupling the pesticide use reduction with environmental policy for agricultural sustainability in Taiwan.</a> Environ. & Pollut. 2, 59-65 (2013).</li>
<li>Weng, Z. H. Pesticide market status and development trend (in Chinese). PRIDE. , 
 <a target="_blank" href="https://pride.stpi.narl.org.tw/">https://pride.stpi.narl.org.tw/</a> (2016).</li>
<li>Kevan, P. G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167880999000444">Pollinators as bioindicators of the state of the environment, species, activity and diversity.</a> Agric. Ecosys. Environ. 74 (1-3), 373-393 (1999).</li>
<li>Kevan, P. G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0006320775900452">Forest application of the insecticide fenitrothion and its effect on wild bee pollinators (Hymenoptera: Apoidea) of lowbush blueberries (Vaccinium SPP.) in Southern New Brunswick, Canada.</a> Biol. Conserv. 7, 301-309 (1975).</li>
<li>Crane, E., Walker, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrane%2C+E+%22The+impact+of+pest+management+on+bees+and+pollination%22">The impact of pest management on bees and pollination</a>. , IBRA. Cardiff, UK. (1983).</li>
<li>Haouar, M., Decormis, L., Rey, J. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19920232241">Fluvalinate applied to flowering apple trees-contamination of honey-gathering bees and hive products.</a> Agronomie. 10 (2), 133-137 (1990).</li>
<li>Chauzat, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+pesticide+residues+in+pollen+loads+collected+by+honey+bees+in+France%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Econ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">A survey of pesticide residues in pollen loads collected by honey bees in France.</a> J. Econ. Entomol. 99 (2), 253-262 (2006).</li>
<li>Bonzini, S., Tremolada, P., Bernardinelli, I., Colombo, M., Vighi, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13592-011-0011-2">Predicting pesticide fate in the hive (part 1), experimentally determined τ-fluvalinate residues in bees, honey and wax.</a> Apidologie. 42 (3), 378(2011).</li>
<li>Sanchez-Bayo, F., Goka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+residues+and+bees-a+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pesticide residues and bees-a risk assessment.</a> PLoS One. 9 (4), e94482(2014).</li>
<li>Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. <a target="_blank" href="http://www.apidologie.org/articles/apido/abs/2010/03/m09141/m09141.html">Pesticides and honey bee toxicity-USA.</a> Apidologie. 41, 312-331 (2010).</li>
<li>Yang, E. C., Chang, H. C., Wu, W. Y., Chen, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+olfactory+associative+behavior+of+honeybee+workers+due+to+contamination+of+imidacloprid+in+the+larval+stage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of imidacloprid in the larval stage.</a> PLoS One. 7, e49472(2012).</li>
<li>Urlacher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+chlorpyrifos+levels+in+forager+bees+and+comparison+with+levels+that+disrupt+honey+bee+odor-mediated+learning+under+laboratory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Measurements of chlorpyrifos levels in forager bees and comparison with levels that disrupt honey bee odor-mediated learning under laboratory conditions.</a> J. Chem. Ecol. 42 (2), 127-138 (2016).</li>
<li>Chen, Y. W., Wu, P. S., Yang, E. C., Nai, Y. S., Huang, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1226861516300012">The impact of pyriproxyfen on the development of honey bee (Apis mellifera L.) colony in field.</a> J. Asia Pac. Entomol. 19 (3), 589-594 (2016).</li>
<li>Dennehy, T. J., DrGain, B. A., Harpold, V. S., Brink, S. A., Nichols, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDennehy%2C+TJ+%22Whitefly+Resistance+to+Insecticides+in+Arizona%3A+2002+and+2003+Results%22">Whitefly Resistance to Insecticides in Arizona: 2002 and 2003 Results</a>. , San Antonio, TX, USA. 
 <a target="_blank" href="http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf">http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf</a> 1926-1938 (2004).</li>
<li>Yang, E. C., Wu, P. S., Chang, H. C., Chen, Y. W. Effect of sub-lethal dosages of insecticides on honey bee behavior and physiology. Proceedings of international seminar on enhancement of functional biodiversity relevant to sustainable food production, ASPAC, Tsukuba, Japan, , 
 <a target="_blank" href="http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf ">http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf </a> (2010).</li>
<li>Fourrier, J., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0132985">Larval exposure to the juvenile hormone analog pyriproxyfen disrupts acceptance of and social behavior performance in adult honey bees.</a> PLoS One. 10, e0132985(2015).</li>
<li>Hanley, A. V., Huang, Z. Y., Pett, W. L. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00218839.2003.11101097">Effects of dietary transgenic Bt corn pollen on larvae of Apis mellifera and Galleria mellonella.</a> J. Apicult.Res. 42 (4), 77-81 (2003).</li>
<li>Kaftanoglu, O., Linksvayer, T. A., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+honey+bees%2C+apis+mellifera%2C+in+vitro+1%2C+effects+of+sugar+concentrations+on+survival+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Rearing honey bees, apis mellifera, in vitro 1, effects of sugar concentrations on survival and development.</a> J. Insect Sci. 11 (96), 1-10 (2011).</li>
<li>Vandenberg, J. D., Shimanuki, H. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00218839.1987.11100743">Technique for rearing worker honey bees in the laboratory.</a> J. Apicult. Res. 26 (2), 90-97 (1987).</li>
<li>Peng, Y. S. C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M. A., Tyler, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/002220119290085I">Effects of chlortetracycline on honey bee worker larvae reared in vitro.</a> J. Invertebr.Pathol. 60 (2), 127-133 (1992).</li>
<li>Bitondi, M. M., Mora, I. M., Simoes, Z. L., Figueiredo, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Apis+mellifera+pupal+melanization+program+is+affected+by+treatment+with+a+juvenile+hormone+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Apis mellifera pupal melanization program is affected by treatment with a juvenile hormone analogue.</a> J. Insect Physiol. 44 (5-6), 499-507 (1998).</li>
<li>Zufelato, M. S., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+juvenile+hormone+analog+pyriproxyfen+affects+ecdysteroid-dependent+cuticle+melanization+and+shifts+the+pupal+ecdysteroid+peak+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct.+Dev%22%5BJournal%5D)">The juvenile hormone analog pyriproxyfen affects ecdysteroid-dependent cuticle melanization and shifts the pupal ecdysteroid peak in the honey bee (Apis mellifera).</a> Arthropod Struct. Dev. 29 (2), 111-119 (2000).</li>
<li>Santos, A. E., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-dependent+protein+patterns+in+integument+and+cuticular+pigmentation+in+Apis+mellifera+during+pharate+adult+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hormone-dependent protein patterns in integument and cuticular pigmentation in Apis mellifera during pharate adult development.</a> J. Insect Physiol. 47 (11), 1275-1282 (2001).</li>
<li>Brouwers, E. V. M. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00218839.1984.11100616">Glucose/Fructose ratio in the food of honeybee larvae during caste differentiation.</a> J. Apicult.Res. 23 (2), 94-101 (1984).</li>
<li>Howe, S. R., Dimick, P. S., Benton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00218839.1985.11100649">Composition of freshly harvested and commercial royal jelly.</a> J. Apicult. Res. 24 (1), 52-61 (1985).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Metoda składania jaj z ograniczoną liczbą królowych i metoda wymiany królowej są kluczowymi krokami w tworzeniu grup pszczół miodnych do testów terenowych w ramach tego protokołu. Metoda składania jaj z ograniczoną liczbą królowych pozwala na synchronizację cyklu życiowego pszczół miodnych. W związku z tym naukowcy mogą wybrać 1-dniowe larwy w tym samym wieku do leczenia różnymi dawkami pestycydów. W przypadku metody wymiany matki królowa została wymieniona między częścią A (4 ramki) a B (5 ramek) w celu uzyskania różnyc...

Obecność pestycydów w środowisku jest jednym z najpoważniejszych problemów wpływających na życie pszczoły miodnej1,2,3. Kilka badań wykazało powszechną obecność pozostałości pestycydów w koloniach pszczół miodnych i produktach pszczelich. Na Tajwanie średnie stosowanie pestycydów wynosiło 11-12 kg/ha rocznie (od 2005 do 2013 r.). Ilość pestycydów stosowanych na Tajwanie jest wyższa niż w krajach UE i krajach Ameryki Łacińskiej4,5. Innymi słowy, środowisko pszczelarskie cierpi z powodu poważnego stresu związanego z pestycydami, zwłaszcza na Tajwanie i być może w innych krajach.
Pszczoła miodna Apis mellifera jest jednym z głównych zapylaczy w systemach rolniczych6 i produkuje również cenne produkty, takie jak miód. Jednak pszczoły miodne są narażone na działanie różnych pestycydów, które mogą zostać przyniesione z powrotem do uli po żerowaniu na kwiatach, które zostały spryskane pestycydami podczas zbierania nektaru i pyłku7,8. Mogą być również narażone na działanie pestycydów przez samych pszczelarzy, mających na celu zwalczanie problemów ze szkodnikami wewnątrz uli9,10,11. Ponieważ larwy pszczół miodnych są karmione przez pszczoły pielęgniarki w celu ich rozwoju, larwy, trutnie, a nawet królowa mogą być narażone na te skażone pestycydami nektary i pyłki12. Należy zająć się toksycznością różnych pestycydów dla pszczół miodnych13.
Podjęto wiele wysiłków, aby ocenić kwestie pozostałości pestycydów w środowisku. Yang i wsp. przetestowali wpływ neurotoksycznego insektycydu imidachloprydu na rozwój larw pszczół miodnych w ulu i stwierdzili, że subletalna dawka imidakloprydu spowodowała węchowe zachowanie asocjacyjne dorosłych pszczół14. Ponadto Urlacher i in. zbadali subletalny wpływ pestycydu fosforoorganicznego, chloropiryfosu, na wyniki uczenia się robotnic pszczół miodnych w warunkach laboratoryjnych15. W naszym poprzednim badaniu oceniliśmy wpływ regulatora wzrostu owadów (IGR), piryproksyfenu (PPN), na larwy pszczół miodnych16.
W tym artykule prezentujemy metody oceny wpływu chemicznego na rozwój pszczół miodnych. Opisano metody żywienia pszczół miodnych i zastosowano je zarówno w odniesieniu do pojedynczych pszczół miodnych, jak i do kolonii. Na początku przetestowaliśmy różne stężenia skażonej pestycydami podstawowej diety larwalnej (BLD) na larwach w koloniach, aby ocenić wpływ pestycydu na poszczególne pszczoły miodne in vivo. Następnie przystąpiliśmy do symulacji naturalnych warunków pestycydu, używając skażonego pestycydami syropu w ulach. W tej metodzie PPN, który jest szeroko stosowany przeciwko szkodnikom17 i jest szkodliwy dla rozwoju larw i poczwarek pszczół miodnych16,18,19, będzie wskaźnikiem reprezentującym negatywny wpływ pestycydu na pole.

<table><tbody><tr><td>Skrzynka dla pszczół miodnych</td><td>SAN-YI Honey Factory</td><td>W1266</td><td>Odstraszacz królowej pszczół miodnych</td></tr><tr><td>(między ramkami)</td><td>SAN-YI Honey Factory</td><td>I1575</td><td>Ograniczenie królowej&nbsp;</td></tr><tr><td>Ogranicznik Queen (na górze)</td><td>SAN-YI Honey Factory</td><td>I1566</td><td>Ograniczenie Queen na górze&nbsp;</td></tr><tr><td>Szczotka pszczela</td><td>SAN-YI Fabryka miodu, Tajwan</td><td>W1414</td><td>delikatnie wyczyść pszczoły na ramie</td></tr><tr><td>Karmnik dla pszczół</td><td>SAN-YI Fabryka miodu, Tajwan</td><td>P0219</td><td>nakarm kolonię syropem cukrowym</td></tr><tr><td>Przezroczysta zjeżdżalnia</td><td>Wan-Shih-Chei, Tajwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40)</td><td>1139</td><td>Zaznacz obszar larwalny na ramkach (Materiał: politereftalan etylenu, PET) (Rozmiar = Długość*Szerokość*Grubość = 29,7 mm * 21 mm * 0,1 mm)</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka hodowlana tissu</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd</td><td>TCP011024</td><td>Hodowla poczwarek z autoklawu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td></td><td>Tomin medical equipmenco., LTD.</td><td>TM-321</td><td>Wytwarzaj sterylizowaną destylowaną wodę dejonizowaną (ddH2O)</td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>Dodaj PPN do puli pokarmu dla larw pszczół</td></tr><tr><td>Inkubator&nbsp;</td><td>Yihder Co., Sp. z o.o.</td><td>LE-550RD</td><td>Hodowla poczwarek z ekstrakcji</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD</td><td></td> KCS34155 <td>Hodowla poczwarek z</td></tr><tr><td>ekstrakcji Mleczko pszczele</td><td>Narodowy Uniwersytet Ilan (NIU)</td><td>NIU</td><td>Wykonaj podstawową dietę larwalną (BLD)</td></tr>D<tr><td>-(+)-Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Przygotuj podstawową dietę larwalną (BLD)</td></tr><tr><td>D-(-)-Fruktoza</td><td>Sigma</td><td>F0127</td><td>Przygotuj podstawową dietę larwalną ( BLD)</td></tr> <tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>CONDA, pronadisa</td><td>1702</td><td>Zrób podstawową dietę larwalną (BLD)</td></tr> <tr><td>Sacharoza</td><td>Tajwan Cukier koporację</td><td>E01071010</td><td>Zrób syrop cukrowy do pokarmu dla pszczół</td></tr><tr><td>Piryproksyfen (11%)</td> <td>LIH-NUNG CHEMICAL CO. LTD.</td><td>Nr rejestracyjny 1937</td><td>Regulator wzrostu owadów (IGR) użyty w eksperymencie</td></tr></tbody></table>

ocena wpływu chemikaliów środowiskowych na rozwój pszczół miodnych od poziomu osobnika do poziomu kolonii

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Obecność pestycydów w środowisku pszczelarskim jest jednym z najpoważniejszych problemów wpływających na życie pszczoły miodnej. Pestycydy można przywieźć z powrotem do ula po tym, jak pszczoły żerują na kwiatach, które zostały spryskane pestycydami. Żywność skażona pestycydami może być wymieniana między pracownikami, którzy następnie odżywiają larwy, a tym samym mogą potencjalnie wpływać na rozwój pszczół miodnych. W związku z tym pozostałości pestycydów w środowisku mogą stać się przewlekłym czynnikiem uszkadzającym populacje pszczół miodnych i stopniowo prowadzić do wyginięcia kolonii. W przedstawionym protokole opisano metody żywienia pszczół miodnych i zastosowano je zarówno w odniesieniu do pojedynczej pszczoły miodnej, jak i do rodziny miodnej. W tym przypadku jako pestycyd stosuje się regulator wzrostu owadów (IGR) piryproksyfen (PPN), który jest szeroko stosowany do zwalczania szkodników i jest szkodliwy dla rozwoju larw i poczwarek pszczół miodnych. Przedstawiona procedura może być zastosowana do innych potencjalnie szkodliwych substancji chemicznych lub patogenów pszczół miodnych w celu dalszych badań.

W przypadku testu polowego z pszczołą miodną, królowa została ograniczona do sekcji 4-ramkowej w celu składania jaj. Ten etap mógł zwiększyć zagęszczenie czerwiu w jednej ramce i ułatwić późniejsze obserwacje. Każda grupa badawcza została oznakowana, a rozwój pszczół miodnych był wyraźnie obserwowany przezroczystą szybkę. W celu precyzyjnej oceny wpływu PPN na rozwój pszczół miodnych w kolonii przeprowadzono podawanie PPN-BLD larwom pszczoły miodnej in vivo w ulu. Zastosowanie me...

Niniejszym przedstawiamy metodę karmienia skażoną pestycydami żywnością zarówno pojedynczej pszczoły miodnej, jak i kolonii ula. Procedura ocenia wpływ pestycydów na poszczególne pszczoły miodne poprzez dokarmianie in vivo podstawową dietą larw, a także na naturalny stan rodziny pszczelej.

Ocena wpływu chemikaliów środowiskowych na rozwój pszczół miodnych od poziomu osobnika do poziomu kolonii

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena wpływu pozostałości pestycydów w środowisku na poszczególne pszczoły miodne w naturalnych warunkach kolonii w ulu. Główną zaletą tej metody jest możliwość zbadania wpływu pestycydów lub innych interesujących badacza zanieczyszczeń zarówno na pojedyncze pszczoły, jak i na całe kolonie. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ manipulacja poczwarkami jest trudna ze względu na ich delikatność.Procedurę zaprezentuje Ko Chong-Yu, doktorant z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy podać każdej kolonii litr 50% syropu cukrowego. Zbiornik z pokarmem należy uzupełniać co tydzień; zdrowa kolonia powinna posiadać dziewięć ramek z plastrami miodu oraz jedną matkę składającą jaja.W pierwszej kolejności należy zlokalizować matkę w kolonii i zastąpić co najmniej jedną ramkę po jej stronie pustą ramką. Następnie należy wstawić przegrody dla matki, aby odizolować ją w sekcji czterech ramek zawierającej co najmniej jedną pustą ramkę. Następnego dnia należy sprawdzić ramki pod kątem świeżo zniesionych jaj i odseparować jaja od matki na 72 godziny.Następnie wyjmij te ramki, odpędzij pszczoły robotnice i przygotuj się do potraktowania czerwiu w komórkach. Dla każdego zabiegu przykryj 50 losowo wybranych jednodniowych larw w ramce szkiełkami podstawowymi. Zabezpiecz szkiełka pinezkami, a następnie nanieś na nie informacje identyfikacyjne za pomocą niezmywalnego markera.Następnie, używając BLD podgrzanego do 35 °C, przygotuj różne stężenia roztworu PPN w zakresie od 0,1 do 100 ppm w objętościach 100 mL. Przez kolejne trzy dni poddawaj grupy komórek czerwiu działaniu preparatu. Aby potraktować larwy, odsłoń je i dodaj 10 µL roztworu PPN w BLD do każdej komórki czerwiu.Powtórz zabieg następnego dnia, używając 10 µL roztworu do zabiegu, a następnie powtórz go w trzecim dniu, używając 20 µL roztworu do zabiegu. Po trzecim zabiegu pozwól im rozwijać się w kolonii. W projekcie doświadczalnym każdą grupę zabiegową powtórz czterokrotnie, wykorzystując różne kolonie. Siódmego dnia obejrzyj larwy poddane działaniu PPN i odnotuj wskaźniki śmiertelności oraz zasklepiania w grupach zabiegowych.W 13. dniu odnotuj wskaźnik wyklucia dla każdej grupy badawczej. Najpierw usuń wosk pszczeli z zamkniętych komórek z czerwiem. Następnie wyjmij pociechy, używając pęsety z końcówkami, chwytając je bardzo delikatnie i ostrożnie wyciągając je na zewnątrz.Podczas usuwania poczek przeznaczyć chwyt między głową a tułowiem i wyjmować poczek bardzo delikatnie. Przed przeprowadzeniem eksperymentu konieczne będzie wielokrotne ćwiczenie tej czynności, aby uzyskać przeżywalność na poziomie co najmniej 90%. Przenieść poczek do 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowej wyłożonych dwiema warstwami chusteczek laboratoryjnych.Należy odnotować wszelkie uszkodzenia lub śmiertelność występującą podczas przenoszenia. Płytki z kulturą należy utrzymywać w temperaturze 34 °C i 70% wilgotności względnej aż do momentu wyklucia. Przez kolejne osiem dni należy rejestrować wskaźnik eklozji.Przygotuj zdrowe miodne colony w dziewięciu ramkach, w którym matka jest ograniczona do sekcji czterech ramek zawierającej co najmniej jedną pustą ramkę. Sekcję czterech ramek nazwij częścią A, a sekcję pięciu ramek częścią B. Upewnij się, że przegrody dla matki całkowicie dzielą kolonię, tak aby matka nie mogła przemieszczać się między sekcjami. Podział ten jest kluczowy dla zbierania grup jednodniowych larw.Następnego dnia, podobnie jak poprzednio, oznacz grupę 100 komórek czerwia z nowo zniesionymi jajami. Jest to grupa pierwsza, którą należy przenieść do części A na trzy dni. Dwa dni później przenieś królową do części B, aby zniosła jaja.Następnego dnia należy oznakować 100 świeżo zniesionych jaj w części B jako grupę drugą i przenieść tę sekcję z powrotem do części B kolonii. Po kolejnych dwóch dniach należy przenieść królową z powrotem do części A. Następnie należy powtórzyć ten proces, aby utworzyć kolejną grupę, i kontynuować zamianę królowej między częścią A a częścią B co trzy dni, aż do momentu przypisania dziewięciu grup jednodniowych jaj w odstępach trzydniowych. W ciągu pierwszych pięciu dni rozwoju należy ocenić stopień wyklucia w każdej oznakowanej grupie komórek cewkowych.Po 11 dniach rozwoju należy rozpocząć liczenie zamkniętych komórek z czerwiem w każdej grupie. W 13. dniu eksperymentu należy potraktować kolonię 50% syropem cukrowym zawierającym PPN w stężeniu 10 lub 100 części na milion. Należy napełnić karmnik jednym litrem roztworu i podłączyć go do kolonii.Grupa pierwsza stanowi nieleczoną grupę kontrolną, ponieważ komórki te powinny być już teraz zamknięte. Od 17. dnia należy rejestrować wskaźnik wyklucia dla każdej grupy. W tym celu larwy należy przenieść, zgodnie z wcześniejszą procedurą, do płytki 24-dołkowej, a następnie inkubować płytkę i później odnotować wskaźnik wyklucia.Po 49 dniach powinny być znane dane dotyczące wyklucia ze wszystkich dziewięciu grup. Poszczególne komórki czerwowe potraktowano zgodnie z opisem za pomocą PPN BLD. Negatywny wpływ pestycydów na larvalny etap rozwoju pszczół miodnych był łatwo zauważalny i zależny od dawki.Efekty te obejmowały melanizację oraz deformację skrzydeł. Aby zasymulować kolonie pszczół miodnych narażone na pozostałości PPN w środowisku, całe kolonie karmiono syropem z PPN. Grupa pierwsza stanowi grupę kontrolną, ponieważ pszczoły te osiągnęły stadium osobników dorosłych przed rozpoczęciem traktowania.Grupy druga i trzecia były poddawane działaniu w stadium larwalnym, natomiast grupy od czwartej do dziewiątej w stadium jaj. W wyniku zastosowania PPN wystąpiły zmiany w procesach wyklucia, zamykania kokonów, wyjścia z poczwarki oraz w częstotliwości deformacji. Stężenie 100 ppm PPN było skuteczniejsze niż 10 ppm, z wyjątkiem wpływu na wskaźnik wyklucia.Ponadto po zastosowaniu preparatów wiele pociorek zginęło, wykazując czarne kutykule lub nie będąc w stanie wygryźć się z komórek. W przypadku zastosowania PPN w stężeniu 100 ppm zniszczone zostały zamknięte komórki, a uszkodzone pociorek usunięto z kolonii. Po opanowaniu techniki procedura traktowania kolonii może być przeprowadzona w ciągu około jednego miesiąca, a codzienna manipulacja pociorek może zająć około dwóch godzin.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o regularnym sprawdzaniu stanu kolonii oraz o nabyciu biegłości w obchodzeniu się z poczwarkami przed przystąpieniem do eksperymentu. Należy pamiętać, że praca z pszczołami miodnymi może być niebezpieczna ze względu na alergie na jad pszczeli. Podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odzieży ochronnej.

evaluating-effect-environmental-chemicals-on-honey-bee-development

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół przygotowania jednokohortowych kolonii pszczół miodnych - użyteczne narzędzie do analizy fizjologii pracowników związanych z rolą. Opisujemy również szczegółowe protokoły leczenia pracowników hormonem juwenilnym i ekdyzonem, aby ocenić udział tych hormonów w regulacji zachowania i/lub fizjologii pracowników.

Przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym

Konsorcja mikrobiologiczne w ulach trzmieli wzbogacają i zachowują pyłek dla larw pszczół. Wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji, wraz z eksperymentami laboratoryjnymi i terenowymi, manuskrypt ten opisuje protokoły stosowane do testowania hipotezy, że pozostałości fungicydów zmieniają mikrobiom pyłku i demografię kolonii, ostatecznie prowadząc do utraty kolonii.

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

Subletalne dawki pestycydów mogą wpływać na kolonie w sposób, który jest trudny do wykrycia przy użyciu tylko metod okresowych lub wizualnych. Podano metody pomiaru całkowitej masy dorosłych pszczół, czerwiu i zasobów pokarmowych poprzez ważenie uli i części ula, fotografowanie ramek i instalowanie czujników. Poruszana jest również kwestia analizy danych.

Monitorowanie wpływu narażenia na subletalne pestycydy na pszczoły miodne na poziomie kolonii

Spraye fungicydowe na kwitnące rośliny mogą narażać samotne pszczoły na wysokie stężenia pozostałości fungicydów przenoszonych przez pyłki. Wykorzystując eksperymenty laboratoryjne z udziałem larw pszczół hodowanych in vitro, badanie to bada interaktywne efekty spożywania pyłku poddanego działaniu fungicydów pochodzącego z roślin żywicielskich i niebędących żywicielami.

In vitro Hodowla pszczół samotnic: narzędzie do oceny czynników ryzyka larw

Ten protokół został opracowany w celu lepszego zrozumienia, jak agrochemikalia wpływają na reprodukcję pszczół miodnych (Apis mellifera), poprzez ustanowienie metod wystawiania królowych pszczół miodnych i ich opiekunów na działanie agrochemikaliów w kontrolowanych, laboratoryjnych warunkach i uważne monitorowanie ich odpowiednich reakcji.

Ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych

Obecny protokół wyjaśnia metodę karmienia larwami samotnicy, pszczoły samotnicy, Osmia excavata, skażonymi pestycydami. W ramach procedury bada się ekotoksyczność pestycydu dla larw pszczół samotnic.

Ocena wpływu pestycydów na larwy pszczół samotnic

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Przedstawiono protokół projektowania i budowy zbiornika gruntowego połączonego z małym tunelem aerodynamicznym z kontrolowanym klimatem w celu zbadania wpływu wymuszeń atmosferycznych na parowanie. Zarówno zbiornik glebowy, jak i tunel aerodynamiczny są wyposażone w technologie czujników do ciągłego pomiaru warunków środowiskowych in situ.

Badanie wpływu wymuszeń atmosferycznych na parowanie: eksperymentalna integracja atmosferycznej warstwy granicznej i płytkiej warstwy podpowierzchniowej

Produkcja wody odpływowej (PBW) została potraktowana nanocząstkami tlenku miedzi (CuO-NPs) i oceniono toksyczność komórkową w hodowanych komórkach ludzkich. Celem tego protokołu było zintegrowanie rodzimej próbki środowiskowej z formatem hodowli komórkowej oceniającym zmiany toksyczności spowodowane traktowaniem CuO-NP.

Usuwanie pierwiastków śladowych przez nanocząstki tlenku miedzi z wody upustowej z odzysku uranu in situ i jej wpływ na żywotność komórek

Przedstawiono solidny i elastyczny przepływowy system ekspozycji, zaprojektowany do utrzymywania osadu w zawiesinie. System służy do badania wpływu zawieszonego osadu na różne gatunki wodne i etapy życia w laboratorium.

Przepływowy system ekspozycji do oceny wpływu zawieszonych osadów na organizmy wodne

Poznaj metodę oceny wpływu pozostałości pestycydów na pszczoły miodne i całe kolonie w warunkach naturalnych. Technika pozwala badać skutki chemikaliów na poziomie osobnika i populacji.

Ocena wpływu chemikaliów środowiskowych na rozwój pszczół miodnych od poziomu osobnika do poziomu kolonii

Przeglądaj więcej filmów