Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych z wykorzystaniem embrionów zebrafish oraz GEVI opartego na FRET. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące biologii komórek pobudliwych, takich jak neurony. Przykładowo, metoda ta może być wykorzystana do analizy roli pobudliwości w patogenezie zaburzeń neurologicznych.

Podejście to wykorzystuje przezroczyste zarodki rybek zebrafish wykazujące ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników napięcia opartych na metodzie FRET. Metoda ta umożliwia nieinwazyjny pomiar właściwości elektrycznych komórek in vivo. Dzięki temu metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w pobudliwość neuronów rdzeniowych w zarodkach rybek zebrafish.

Można ją również zastosować w innych układach in-vitro lub in-vivo podatnych na badania obrazowe. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować mieszaninę PCR do amplifikacji sekwencji kodującej biosensor Mermaid. Podgrzewaj mieszaninę PCR przez 15 sekund w temperaturze 95 °C.

Przeprowadź denaturację przez 15 sekund w temperaturze 50 °C i elongację przez cztery minuty w temperaturze 72 °C przez łącznie 35 cykli. Następnie oczyść konkretny tępy produkt PCR z żelu, używając komercyjnego zestawu do oczyszczania z żelu. Potem sklonuj fragment DNA do tępego wektora pCMV-SC i zlinearyzuj plazmid Mermaid-dodatni za pomocą enzymu restrykcyjnego SmaI w celu insertowania promotora HuC.

Przygotuj reakcję restrykcyjną w całkowitej objętości 20 µL i inkubuj reakcję w temperaturze 25 °C przez jedną godzinę. Następnie oczyść trawiony plazmid z żelu za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania z żelu. Następnie przeprowadź amplifikację PCR promotora HuC z wykorzystaniem polimerazy PFU DNA i genomowego DNA zebrafish jako matrycy.

Przygotuj mieszaninę PCR. Po wstępnym etapie trwającym dwie minuty w temperaturze 95 °C, podgrzewaj mieszaninę PCR przez 15 sekund w temperaturze 95 °C. Przeprowadź przyłączanie starterów przez 15 sekund w temperaturze 50 °C i elongację przez cztery minuty w temperaturze 72 °C przez łącznie 35 cykli.

Następnie przeprowadź oczyszczanie żelowe specyficznego tępego produktu PCR. Połącz ekimolarne ilości oczyszczonego DNA pCMV-SC Mermaid oraz pHuC, stosując 1 µL ligazy T4 DNA i 1 µL specyficznego buforu 10x w całkowitej objętości 10 µL. Następnie inkubuj reakcję przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.

Przeprowadź transformację porcji kompetentnych komórek przy użyciu pięciu µL reakcji ligacji. Wyselekcjonuj klony pHuC-dodatnie z promotorem wstawionym w prawidłowej orientacji za pomocą podwójnego trawienia enzymami CEL1 i EcoRV. Przenieś klony do probówek o pojemności 15 mL i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 °C.

Następnie wyizoluj plazmid z komórek, przygotuj podwójną reakcję restrykcyjną CEL1-EcoRV i inkubuj ją w temperaturze 37°C przez jedną godzinę. Następnie rozdziel produkty reakcji w żelu agarozowym. W tej procedurze przenieś zapłodnione jaja otrzymane od dorosłych danio przebrzykłych typu dzikiego lub sod1G93R do 10-milimetrowej szalki Petriego.

Opłucz zarodki w zimnej wodzie dla ryb. Następnie bezzwłocznie wykonaj mikroiniekcję do żółtka, podając 200 picograms plazmidu pHuC-Mermaid. Przenieś zarodki do szalki Petriego i inkubuj je w wodzie dla ryb w temperaturze 28 °C do momentu osiągnięcia przez nie odpowiedniego stopnia rozwoju do dalszych analiz.

W celu analizy spontanicznego zwijania się ogona przenieś zarodki do 90-milimetrowej okrągłej płytki Petriego wypełnionej wodą dla ryb zawierającą 0,2% DMSO. Następnie przeprowadź manualne usuwanie otoczki chorionowej za pomocą dwóch pęset jubilerskich z ostrymi końcówkami lub igieł. Po tym czasie inkubuj zarodki przez pięć minut w temperaturze 28 °C.

Używając kamery cyfrowej zamontowanej na stereomikroskopie, należy wykryć zwijanie się ogona w temperaturze pokojowej podczas jednominutowego nagrania wideo. Następnie należy pozyskać serię czasową z rozdzielczością czasową 30 klatek na sekundę. Następnie oblicz częstotliwość spontanicznych zwinięć ogona, licząc liczbę zgięć na jednostkę czasu.

Aby ocenić wpływ leku riluzol, przenieś zarodki do nowej szalki Petriego o średnicy 90 mm wypełnionej wodą dla ryb zawierającą 5 µM riluzolu. Następnie inkubuj zarodki przez 5 minut w temperaturze 28 °C przed nagraniem jednostmiminutowego filmu i przeprowadzeniem analizy behawioralnej. Teraz zamocuj zarodki w wieku 20–24 hpf w 1% agarozy niskotopliwej w wodzie dla ryb, wewnątrz szalki obrazowej z szklanym dnem o średnicy 35 mm w temperaturze 37 °C.

Ułożyć zarodki na bokach i odczekać do momentu stężenia agarozy w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść szalkę obrazową na stoлик mikroskopu konfokalnego. Zidentyfikować neurony ruchowe wykazujące ekspresję biosensora poprzez wzbudzenie monomerów Umikinoko-Green za pomocą argonowego lasera o długości fali 488 nanometrów.

Następnie ustaw emisję w zakresie od 495 do 525 nanometrów i naciśnij przycisk nagrywania. W celu przeprowadzenia pomiaru FRET wzbudź mUKG, donor pary FRET, laserem o długości fali 488 nanometrów. Jednocześnie, korzystając z dwóch fotopowielaczy, wykryj fluorescencję emitowaną przez donora oraz fluorescencję emitowaną przez monomerowy akceptor Kusibira-Orange.

Na początku eksperymentu zoptymalizuj wzmocnienie (gain) i przesunięcie (offset) fotopowielacza nr 1, za pomocą którego rejestrowana jest fluorescencja mUKG, i utrzymuj te wartości na stałym poziomie przez całą sesję. Aby ustawić przesunięcie, zmień kolor obrazu na wartości intensywności, korzystając z tabeli wyszukiwania Q. Podczas skanowania przy wyłączonym laserze użyj suwaka przesunięcia tak, aby piksele tła miały intensywność nieco wyższą od zera.

Korzystając z tej samej tabeli wyszukiwania, włącz laser. Podczas skanowania użyj suwaka wzmocnienia (gain), aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, uważając, aby nie dopuścić do nasycenia pikseli. W oknie akwizycji oprogramowania wybierz tryb akwizycji xyt oraz rozmiar pola obrazu 512 na 64 piksele z menu rozwijanego.

Następnie skonfigurowano rejestrację zmian napięcia neuronów rdzeniowych zarodka tak, aby przeprowadzać obrazowanie pojedynczej płaszczyzny XY co 30 milisekund przez jedną minutę. Aby ocenić wpływ podania riluzolu na depolaryzację błony w tym samym neuronie, pozyskano nowy zestaw danych pięć minut po dodaniu wody rybiej zawierającej 5 µM riluzolu. W tym filmie zarejestrowano spontaniczne zwijanie się (coilings) – reakcje motoryczne polegające wyłącznie na pełnym skurczu ciała, który przybliża koniec ogona do głowy – na etapie od 20 do 24 hpf w standardowym medium rybim.

Film ten przedstawia spontaniczne zwijanie się zarodka po inkubacji w pięciomikromolarnym roztworze rylozolu. Aby sprawdzić, czy zmiany w aktywności elektrycznej neuronów ruchowych rdzenia kręgowego leżały u podstawy wywołanych rylozolem zmian w częstotliwości spontanicznego zwijania, badano potencjał błonowy w neuronach ruchowych rdzenia kręgowego zarodka w sposób całkowicie nieinwazyjny, mierząc stosunek intensywności fluorescencji pary donora i akceptora FRET biosensora Mermaid. Zidentyfikowano pierwotne neurony ruchowe rdzenia kręgowego wykazujące ekspresję biosensora i zarejestrowano ich podstawową aktywność spontanicznej depolaryzacji.

Wraz z redukcją częstotliwości ruchów zwijania ogona, podanie riluzolu zmniejszyło częstotliwość zdarzeń spontanicznej depolaryzacji. Po opanowaniu tej metody badacze będą mogli analizować właściwości elektryczne sieci neuronalnych w nienaruszonych embrionach, co pozwala na pełne zachowanie złożoności oddziaływań między komórkami w rozwijającym się systemie funkcjonalnym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak aktywność elektryczna neuronów rdzeniowych koreluje z częstotliwością spontanicznych zwinięć ogona.