Name: Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę badania właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w zarodkach Danio rerio przy użyciu wskaźników napięcia GEVI opartych na FRET. Technika ta umożliwia analizę pobudliwości neuronów motorycznych rdzenia kręgowego w warunkach in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Simonie Rodighiero za jej bezcenne wsparcie przy analizie obrazowania FRET.

1. pHuC_Mermaid Generacja plazmidu
UWAGA: Syrenka to biosensor opracowany przez sparowanie domeny wykrywania napięcia (VSD) jelita Ciona intestinalis (obecnie Ciona robusta)5 czujnik napięcia zawierający fosfatazę (Ci-VSP) z fluoroforami partnerskimi FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: donor) i monomeryczną wersją emitującego pomarańczowo białka fluorescencyjnego Kusabira Orange (mKOk: akceptor). W przypadku tego biosensora zmiany konformacyjne domeny VSD, wywołane depolaryzacją błony, zwiększają bliskość białek fluorescencyjnych donora i akceptora, zwiększając w ten sposób transfer energii między nimi (zwiększając współczynnik FRET)3. VSD zapewnia efektywną lokalizację biosensora na błonie plazmatycznej. Ekspresja neuronalna biosensora (w rdzeniu kręgowym sygnał jest wykrywalny zarówno w interneuronach, jak i neuronach ruchowych) osiąga się poprzez sklonowanie otwartej ramki odczytu Syreny (ORF) pod pan-neurolistycznym promotorem danio pręgowanego HuC6.
<ol>
	<li>Amplifikować za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) Mermaid ORF z plazmidu pCS4+ Mermaid plasmid3 za pomocą polimerazy DNA Pfu (korekta) przy użyciu startera T3 Universal i startera Mermaid SmaI (5′TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) w celu wprowadzenia miejsca ograniczenia SmaI przed Mermaid ORF.
	<ol>
		<li>Użyj następującej mieszaniny PCR: 0,5 μl polimerazy DNA Pfu, 7,5 μl specyficznego buforu 10x, 1 μl 10 mM dNTPs, 2,5 μl dimetylosulfotlenku (DMSO), 0,5 μl (50 ng) preparatu plazmidu i 1 μL 20-μM roztworów podstawowych każdego startera w łącznej objętości 50 μL.</li>
		<li>Podgrzewać mieszaninę PCR przez 15 s w temperaturze 95 °C, zalewać ją przez 15 s w temperaturze 50 °C i wydłużać przez 4 minuty w temperaturze 72 °C, co daje łącznie 35 cykli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść żelem specyficzny produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania żelu, zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Sklonuj fragment DNA do wektora pCMV-SC zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Linearyzuj plazmid syreny dodatni (o nazwie pCMV-SC_Mermaid) enzymem restrykcyjnym SmaI do następnej insercji promotora HuC.
	<ol>
		<li>Ustawić reakcję restrykcyjną w następujący sposób: 0,5 μl (10 U) enzymu restrykcyjnego SmaI, 2 μl zestawu 10x buforu i 5 μg plazmidowego DNA w całkowitej objętości 20 μL. Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Żelem oczyść strawiony plazmid za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania żelu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Amplifikacja PCR promotora HuC (pHuC), z polimerazą DNA Pfu i genomowym DNA danio pręgowanego jako matrycą, przy użyciu pary starterów specyficznych dla HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5′-GTAGTCGACCAGACTTCAAAAGGGTCCA i HuCprom-rev1: 5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) i obejmujący region 3,150 pz przed ATG.
	<ol>
		<li>Przygotuj mieszaninę PCR, stosując następujący schemat: 0,5 μl polimerazy DNA Pfu, 7,5 μl specyficznego buforu 10x, 1 μl 10 mM dNTP, 2,5 μl DMSO, 200 ng genomowego DNA i 1 μl 20-μM roztworów podstawowych każdego startera w całkowitej objętości 50 μL.</li>
		<li>Po początkowym etapie trwającym 2 minuty w temperaturze 95 °C podgrzewać mieszaninę PCR przez 15 s w temperaturze 95 °C, zalewać ją przez 15 s w temperaturze 50 °C i wydłużać przez 4 minuty w temperaturze 72 °C, co daje łącznie 35 cykli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść żelem specyficzny produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania żelu zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Zremisować równomolową ilość oczyszczonego pCMV-SC_Mermaid (etap 1.5) i DNA pHuC (etap 1.7) przy użyciu 1 μl ligazy DNA T4 i 1 μl specyficznego buforu 10X w całkowitej objętości 10 μL. Inkubować reakcję przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przekształć podwielokrotność kompetentnych komórek w 5 μl reakcji ligacji (krok 1.8) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wybrać klony pHuC-dodatnie (pHuC_Mermaid) z promotorem wprowadzonym we właściwej orientacji przez podwójne trawienie Sal I-EcoRV (miejsce restrykcji SalI zostało wstawione przed fragmentem promotora w kroku 1.6, podczas gdy miejsce restrykcji EcoRV znajduje się poniżej regionu poliadenylacji, PolyA, plazmidu pCMV-SC).
	<ol>
		<li>Ustawić reakcję restrykcyjną w następujący sposób: 0,5 μl (10 U) enzymów restrykcyjnych SalI i EcoRV, 2 μl buforu kit10X i 1 μg pHuC_Mermaid DNA w całkowitej objętości 20 μL. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przeprowadzić reakcje na żelu agarozowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja zarodka
<ol>
	<li>Przenieś zapłodnione jaja uzyskane z dorosłego danio pręgowanego typu dzikiego (szczep AB) lub Sod1-G93R Zebry4 na 10-milimetrową szalkę Petriego za pomocą plastikowej pipety.</li>
	<li>Opłucz zarodki w zimnej (4 °C) wodzie dla ryb i natychmiast wstrzyknij je do żółtka z 200 pg plazmidu pHuC_Mermaid za pomocą mikrowstrzykiwacza (ogólny i szczegółowy opis procedury mikroiniekcji znajduje się w piśmiennictwie 7 i 8).</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety przenieść zarodki na szalkę Petriego i inkubować je w wodzie dla ryb w temperaturze 28 °C, aż osiągną pożądany etap rozwojowy (20-24 godziny po zapłodnieniu, hpf) w celu przeprowadzenia kolejnych analiz.</li>
</ol>
3. Analiza spontanicznego zwijania ogona
UWAGA: Oceń spontaniczne zwijanie ogona u 20-24 zarodków hpf z lub bez leku riluzol.
<ol>
	<li>Przenieś zarodek na okrągłą szalkę Petriego o średnicy 90 mm wypełnioną wodą rybną zawierającą 0,2% DMSO (nośnik riluzolu) i ręcznie go zdechorionuj za pomocą dwóch kleszczyków jubilerskich z ostrymi końcówkami. Inkubować zarodek przez 5 minut.</li>
	<li>Wykryj zwijanie ogona przy natężeniu ruchu podczas 1-minutowego nagrania wideo za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na mikroskopie stereoskopowym. Uzyskuj szeregi czasowe w rozdzielczości czasowej 30 klatek/s.</li>
	<li>Oblicz częstotliwość spontanicznych zwijania ogona, licząc liczbę zgięć (zarówno przeciwbieżnych, jak i ipsilateralnych) na jednostkę czasu.</li>
	<li>Aby ocenić działanie leku riluzol, delikatnie użyj plastikowej pipety Pasteura, aby przenieść zarodek na nową 90-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną wodą rybną zawierającą 5 μM riluzolu.
	<ol>
		<li>Inkubuj zarodek przez 5 minut, a następnie nagraj 1-minutowy film i przeprowadź analizę behawioralną, jak powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Konfiguracja obrazowania do wizualizacji biosensora syrenki w żywych zarodkach: jednoczesne wykrywanie sygnałów dawcy i akceptora
<ol>
	<li>Umieść 20 - 24 zarodki hpf w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w wodzie rybnej o temperaturze 37 °C w naczyniu do obrazowania o średnicy 35 mm ze szklanym dnem. Ułóż zarodki na bokach. Poczekaj, aż agaroza zestali się w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść czaszę obrazowania do stolika odwróconej konfokalnej zamontowanej na odwróconym mikroskopie. Zidentyfikuj neurony ruchowe wyrażające bioczujnik za pomocą obiektywu 20X (apertura numeryczna 0,7, NA) poprzez wzbudzenie mUKG za pomocą linii lasera argonowego 488 nm i zarejestrowanie jego emisji w zakresie od 495 do 525 nm.</li>
	<li>Aby uzyskać pomiar FRET, wzbudz mUKG, donora pary FRET, za pomocą linii laserowej 488 nm. Jednoczesne wykrywanie, za pomocą skanera rezonansowego pracującego z częstotliwością 8 000 Hz w trybie dwukierunkowym, fluorescencji emitowanej przez donor (między 495 a 525 nm) oraz fluorescencji emitowanej przez akceptor mKOk (między 550 a 650 nm, kanał FRET). Jeśli to możliwe, użyj lasera 473 nm. 
	UWAGA: Sprawność wzbudzenia dawcy będzie nieznacznie zmniejszona (85% zamiast 93% przy 488 nm), ale wzbudzenie krzyżowe akceptora również zostanie zmniejszone (z 17% przy długości fali 488 nm do 9% przy linii laserowej 473 nm).</li>
	<li>Aby zmniejszyć fototoksyczność i bielenie fluoroforowe, zminimalizuj oświetlenie próbki, zmniejszając moc linii laserowej (w oknie ścieżki wiązki w oprogramowaniu do akwizycji).</li>
	<li>Zoptymalizuj wzbudzenie, aby dopasować parametry wzmocnienia i przesunięcia, które są ustawione na początku eksperymentu i utrzymywane na stałym poziomie przez całą sesję. Aby ustawić przesunięcie, zmień kolor obrazu na wartości intensywności (korzystając z tabeli przeglądowej Q) i podczas skanowania z wyłączonym laserem przekręć pokrętło przesunięcia (inteligentne przesunięcie) tak, aby piksele tła miały intensywność nieco wyższą od zera. Korzystając z tej samej tabeli przeglądowej, włączając laser podczas skanowania, przekręć pokrętło wzmocnienia (inteligentne wzmocnienie), aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, uważając, aby uniknąć nasyconych pikseli.</li>
	<li>Korzystając z otwartego otworka otworkowego (2 jednostki wentylacyjne), uzyskaj 16-bitowe obrazy, aby zapewnić wystarczający zakres dynamiki do analiz ilościowych. Unikaj uśredniania, aby zwiększyć szybkość akwizycji i zminimalizować fotowybielanie.</li>
	<li>W oknie akwizycji oprogramowania wybierz z menu rozwijanego rozmiar pola obrazu 512 x 64 pikseli (rozmiar piksela: 605 nm).</li>
	<li>W oknie trybu akwizycji wybierz xyt (upływ czasu na pojedynczej płaszczyźnie xy) zmenu rozwijanego i rejestruj zmiany napięcia neuronu rdzeniowego zarodka, uzyskując pojedynczą płaszczyznę xy, ustawiając parametry akwizycji tak, aby rejestrować jeden obraz co 30 ms przez 1 min.</li>
	<li>Aby ocenić wpływ podawania riluzolu na depolaryzację błony w tym samym neuronie, należy uzyskać nowy zestaw danych 5 minut po dodaniu wody rybnej zawierającej 5 μM riluzolu.</li>
	<li>Do analizy FRET należy użyć Biosensor_FRET makra ImageJ (wyrażającego jednołańcuchowe biosensory FRET.</li>
	<li>Oceń stosunek FRET błony podstawowej każdego neuronu przy t1 jako ((średnia FRET - tło FRET)/(średnia dawcy - tła dawcy)), gdzie średnia intensywność FRET i dawcy to średnia intensywność fluorescencji obliczona w tym samym obszarze zainteresowania (ROI) narysowanym wokół komórki dla każdego nabytego kanału, a FRET i tło dawcy to średnia intensywność fluorescencji obliczona w ROI pola widzenia bez próbki fluorescencyjnej. 
UWAGA: Szczegółowy opis korzystania z wtyczki krok po kroku znajduje się na stronie <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret</a>.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do tworzenia wykresów, aby porównać częstotliwość, amplitudę i czas trwania depolaryzacji między różnymi paradygmatami eksperymentalnymi. Porównaj dwie grupy za pomocą niesparowanego testu t-Studenta i uznaj średnie wartości za statystycznie różne, gdy P <0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+voltage+indicators+for+large+scale+cortical+imaging+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age.</a> Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).</li>
<li>Chemla, S., Chavane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+imaging%3A+Technique+review+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models.</a> J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li>
<li>Benedetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INaP+selective+inhibition+reverts+precocious+inter-+and+motorneurons+hyperexcitability+in+the+Sod1-G93R+zebrafish+ALS+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model.</a> Sci Rep. 6, 24515(2016).</li>
<li>Pennati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differences+between+larvae+of+the+Ciona+intestinalis+species+complex%3A+hints+for+a+valid+taxonomic+definition+of+distinct+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).</li>
<li>Park, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+upstream+elements+in+the+HuC+promoter+leads+to+the+establishment+of+transgenic+zebrafish+with+fluorescent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons.</a> Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Drapeau, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12450489">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li>
<li>Brustein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+during+the+development+of+the+zebrafish+locomotor+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Steps during the development of the zebrafish locomotor network.</a> J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).</li>
<li>Sungmoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Membrane+Potential+with+Two+Types+of+Genetically+Encoded+Fluorescent+Voltage+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors.</a> J Vis Exp. (108), e53566(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół pozwolił nam zbadać związek między właściwościami elektrycznymi neuronów ruchowych rdzenia kręgowego danio pręgowanego a spontanicznym zwijaniem, najwcześniejszą stereotypową aktywnością motoryczną, która pojawia się około 17 hpf rozwoju embrionalnego i trwa do 24 hpf10.
Nasze podejście zapewnia naukowcom narzędzie do badania układu nerwowego nienaruszonych zarodków, w pełni zachowując złożoność interakcji między komórkami w rozwijającej się...

Analiza komponentów systemowych in vivo pozwala naukowcom badać zachowanie komórek w najbardziej wiarygodny sposób. Jest to szczególnie prawdziwe, gdy badana aktywność jest silnie uzależniona od interakcji komórka-komórka (zarówno zależnej od kontaktu, jak i niezależnej), jak w układzie nerwowym, gdzie zmiany napięcia błonowego napędzają komunikację między pobudliwymi komórkami. Zrozumienie informacji zakodowanych przez te sygnały elektryczne jest kluczem do zrozumienia sposobu, w jaki działa układ nerwowy zarówno w stanach fizjologicznych, jak i chorobowych.
W celu zbadania właściwości elektrycznych komórek w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych, ostatnio opracowano kilka genetycznie kodowanych wskaźników napięcia1. W przeciwieństwie do poprzednich generacji optycznych czujników napięcia (głównie barwników wrażliwych na napięcie)2, GEVI pozwalają na analizy in vivo nienaruszonego układu nerwowego, a ich ekspresja może być ograniczona do określonych typów komórek lub populacji.
Zarodek danio pręgowanego jest wybranym "substratem" in vivo, aby wykorzystać ogromny potencjał przypisywany GEVIs. W rzeczywistości, dzięki swojej przejrzystości optycznej i uproszczonemu, ale ewolucyjnie zachowanemu układowi nerwowemu, model danio pręgowanego pozwala na prostą identyfikację i manipulację każdym elementem komórkowym sieci. Rzeczywiście, zastosowanie opartego na FRET GEVI Mermaid3 doprowadziło do identyfikacji przedobjawowych zmian w zachowaniu rdzeniowego neuronu ruchowego w modelu stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) danio pręgowanego4.
Poniższy protokół in vivo opisuje, jak monitorować właściwości elektryczne neuronów ruchowych rdzenia kręgowego w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego, które wyrażają syrenę w sposób specyficzny dla neuronów. Co więcej, wykazano, w jaki sposób farmakologicznie wywołane zmiany takich właściwości elektrycznych mogą być powiązane ze zmianami w częstotliwości spontanicznych zwijania się zarodka, stereotypowej aktywności motorycznej, która charakteryzuje zachowanie ruchowe danio pręgowanego na bardzo wczesnych etapach rozwoju.

<table><tbody><tr><td>Niska temperatura topnienia agarozy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>Riluzol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R116</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra HQ polimeraza DNA&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - Dział Produktów Stratagene</td><td>600389</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny podkład T3&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Żel i system do czyszczenia PCR</td><td>Promega</td><td>A9280</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny podkład SmaI&nbsp;</td>System wektorów ekspresji ssaków <td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StrataClone / wektor pCMV-SC&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - Dział Produktów Stratagene&nbsp;</td><td></td><td></td>240228</tr><tr><td>SmaI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0141S Ligaza</td><td></td></tr><tr><td>DNA T4</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>35 mm, miska do obrazowania ze szklanym dnem&nbsp;</td><td>Kleszczyki Ibidi</td><td>81151</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>M10 F Aparat</td><td></td></tr><tr><td>cyfrowy</td><td>Oprogramowanie Leica Microsystems</td><td>DFC 310 FX</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 4.7.1&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuickTime Player, v10.4</td><td></td> Mikroskop konfokalny Apple <td></td><td></td></tr><tr><td>(odwrócony)</td><td>Mikrowtryskiwacz Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Makro Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Biosensor_FRET&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.0c&nbsp;</td><td>Oprogramowanie GraphPad, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Opisane tutaj protokoły są zaprojektowane tak, aby umożliwić badaczom badanie komunikacji komórkowej bez zmiany integralności środowiska, w którym komórki się znajdują. W szczególności zostały one opracowane do analizy aktywności elektrycznej komórek pobudliwych, takich jak neurony rdzeniowe. W takim scenariuszu kluczowe znaczenie ma zachowanie integralności komórki rdzenia, ale ważne jest również zachowanie anatomii i fizjologicznego kształtu zaangażowanych układów. Rzeczywiście, zrozumienie sposobu, w jaki działa układ nerwowy – i inne złożone systemy – musi opierać się na podejściu systemowym. Z tego powodu jako system modelowy wybrano żywy zarodek danio pręgowanego, a zmiany napięcia błony neuronu rdzeniowego oceniono bez ingerencji w warunki fizjologiczne zarodków. 
Tutaj opisane jest podejście łączące wykorzystanie embrionów danio pręgowanego z biosensorem opartym na FRET. Zarodki danio pręgowanego charakteryzują się bardzo uproszczonym układem nerwowym i dzięki swojej przezroczystości nadają się szczególnie do zastosowań obrazowych, co pozwala na zastosowanie fluorescencyjnych wskaźników napięcia na błonie plazmatycznej podczas rozwoju danio pręgowanego. Synergia między tymi dwoma składnikami umożliwia analizę aktywności elektrycznej komórek w nienaruszonych organizmach żywych, bez zaburzania stanu fizjologicznego. Wreszcie, to nieinwazyjne podejście może współistnieć z innymi analizami (np. nagraniami spontanicznych ruchów, jak pokazano tutaj).

Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kodującą biosensor Mermaid oparty na technice FRET pod kontrolą panneuronalnego promotora pHuC, który kieruje syntezę białka wyłącznie w układzie nerwowym, wprowadzono do pojedynczych zapłodnionych jaj metodą mikroiniekcji w celu uzyskania przejściowych embrionów transgenicznych (Rysunek 1, lewy panel). Po opanowaniu techniki mikroiniekcji odsetek embrionów Mermaid-dodatnich wynosił blisko 100%. spośród nich do ana...

Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych z wykorzystaniem embrionów zebrafish oraz GEVI opartego na FRET. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące biologii komórek pobudliwych, takich jak neurony. Przykładowo, metoda ta może być wykorzystana do analizy roli pobudliwości w patogenezie zaburzeń neurologicznych.Podejście to wykorzystuje przezroczyste zarodki rybek zebrafish wykazujące ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników napięcia opartych na metodzie FRET. Metoda ta umożliwia nieinwazyjny pomiar właściwości elektrycznych komórek in vivo. Dzięki temu metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w pobudliwość neuronów rdzeniowych w zarodkach rybek zebrafish.Można ją również zastosować w innych układach in-vitro lub in-vivo podatnych na badania obrazowe. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować mieszaninę PCR do amplifikacji sekwencji kodującej biosensor Mermaid. Podgrzewaj mieszaninę PCR przez 15 sekund w temperaturze 95 °C.Przeprowadź denaturację przez 15 sekund w temperaturze 50 °C i elongację przez cztery minuty w temperaturze 72 °C przez łącznie 35 cykli. Następnie oczyść konkretny tępy produkt PCR z żelu, używając komercyjnego zestawu do oczyszczania z żelu. Potem sklonuj fragment DNA do tępego wektora pCMV-SC i zlinearyzuj plazmid Mermaid-dodatni za pomocą enzymu restrykcyjnego SmaI w celu insertowania promotora HuC.Przygotuj reakcję restrykcyjną w całkowitej objętości 20 µL i inkubuj reakcję w temperaturze 25 °C przez jedną godzinę. Następnie oczyść trawiony plazmid z żelu za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania z żelu. Następnie przeprowadź amplifikację PCR promotora HuC z wykorzystaniem polimerazy PFU DNA i genomowego DNA zebrafish jako matrycy.Przygotuj mieszaninę PCR. Po wstępnym etapie trwającym dwie minuty w temperaturze 95 °C, podgrzewaj mieszaninę PCR przez 15 sekund w temperaturze 95 °C. Przeprowadź przyłączanie starterów przez 15 sekund w temperaturze 50 °C i elongację przez cztery minuty w temperaturze 72 °C przez łącznie 35 cykli.Następnie przeprowadź oczyszczanie żelowe specyficznego tępego produktu PCR. Połącz ekimolarne ilości oczyszczonego DNA pCMV-SC Mermaid oraz pHuC, stosując 1 µL ligazy T4 DNA i 1 µL specyficznego buforu 10x w całkowitej objętości 10 µL. Następnie inkubuj reakcję przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.Przeprowadź transformację porcji kompetentnych komórek przy użyciu pięciu µL reakcji ligacji. Wyselekcjonuj klony pHuC-dodatnie z promotorem wstawionym w prawidłowej orientacji za pomocą podwójnego trawienia enzymami CEL1 i EcoRV. Przenieś klony do probówek o pojemności 15 mL i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 °C.Następnie wyizoluj plazmid z komórek, przygotuj podwójną reakcję restrykcyjną CEL1-EcoRV i inkubuj ją w temperaturze 37°C przez jedną godzinę. Następnie rozdziel produkty reakcji w żelu agarozowym. W tej procedurze przenieś zapłodnione jaja otrzymane od dorosłych danio przebrzykłych typu dzikiego lub sod1G93R do 10-milimetrowej szalki Petriego.Opłucz zarodki w zimnej wodzie dla ryb. Następnie bezzwłocznie wykonaj mikroiniekcję do żółtka, podając 200 picograms plazmidu pHuC-Mermaid. Przenieś zarodki do szalki Petriego i inkubuj je w wodzie dla ryb w temperaturze 28 °C do momentu osiągnięcia przez nie odpowiedniego stopnia rozwoju do dalszych analiz.W celu analizy spontanicznego zwijania się ogona przenieś zarodki do 90-milimetrowej okrągłej płytki Petriego wypełnionej wodą dla ryb zawierającą 0,2% DMSO. Następnie przeprowadź manualne usuwanie otoczki chorionowej za pomocą dwóch pęset jubilerskich z ostrymi końcówkami lub igieł. Po tym czasie inkubuj zarodki przez pięć minut w temperaturze 28 °C.Używając kamery cyfrowej zamontowanej na stereomikroskopie, należy wykryć zwijanie się ogona w temperaturze pokojowej podczas jednominutowego nagrania wideo. Następnie należy pozyskać serię czasową z rozdzielczością czasową 30 klatek na sekundę. Następnie oblicz częstotliwość spontanicznych zwinięć ogona, licząc liczbę zgięć na jednostkę czasu.Aby ocenić wpływ leku riluzol, przenieś zarodki do nowej szalki Petriego o średnicy 90 mm wypełnionej wodą dla ryb zawierającą 5 µM riluzolu. Następnie inkubuj zarodki przez 5 minut w temperaturze 28 °C przed nagraniem jednostmiminutowego filmu i przeprowadzeniem analizy behawioralnej. Teraz zamocuj zarodki w wieku 20–24 hpf w 1% agarozy niskotopliwej w wodzie dla ryb, wewnątrz szalki obrazowej z szklanym dnem o średnicy 35 mm w temperaturze 37 °C.Ułożyć zarodki na bokach i odczekać do momentu stężenia agarozy w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść szalkę obrazową na stoлик mikroskopu konfokalnego. Zidentyfikować neurony ruchowe wykazujące ekspresję biosensora poprzez wzbudzenie monomerów Umikinoko-Green za pomocą argonowego lasera o długości fali 488 nanometrów.Następnie ustaw emisję w zakresie od 495 do 525 nanometrów i naciśnij przycisk nagrywania. W celu przeprowadzenia pomiaru FRET wzbudź mUKG, donor pary FRET, laserem o długości fali 488 nanometrów. Jednocześnie, korzystając z dwóch fotopowielaczy, wykryj fluorescencję emitowaną przez donora oraz fluorescencję emitowaną przez monomerowy akceptor Kusibira-Orange.Na początku eksperymentu zoptymalizuj wzmocnienie (gain) i przesunięcie (offset) fotopowielacza nr 1, za pomocą którego rejestrowana jest fluorescencja mUKG, i utrzymuj te wartości na stałym poziomie przez całą sesję. Aby ustawić przesunięcie, zmień kolor obrazu na wartości intensywności, korzystając z tabeli wyszukiwania Q. Podczas skanowania przy wyłączonym laserze użyj suwaka przesunięcia tak, aby piksele tła miały intensywność nieco wyższą od zera.Korzystając z tej samej tabeli wyszukiwania, włącz laser. Podczas skanowania użyj suwaka wzmocnienia (gain), aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, uważając, aby nie dopuścić do nasycenia pikseli. W oknie akwizycji oprogramowania wybierz tryb akwizycji xyt oraz rozmiar pola obrazu 512 na 64 piksele z menu rozwijanego.Następnie skonfigurowano rejestrację zmian napięcia neuronów rdzeniowych zarodka tak, aby przeprowadzać obrazowanie pojedynczej płaszczyzny XY co 30 milisekund przez jedną minutę. Aby ocenić wpływ podania riluzolu na depolaryzację błony w tym samym neuronie, pozyskano nowy zestaw danych pięć minut po dodaniu wody rybiej zawierającej 5 µM riluzolu. W tym filmie zarejestrowano spontaniczne zwijanie się (coilings) – reakcje motoryczne polegające wyłącznie na pełnym skurczu ciała, który przybliża koniec ogona do głowy – na etapie od 20 do 24 hpf w standardowym medium rybim.Film ten przedstawia spontaniczne zwijanie się zarodka po inkubacji w pięciomikromolarnym roztworze rylozolu. Aby sprawdzić, czy zmiany w aktywności elektrycznej neuronów ruchowych rdzenia kręgowego leżały u podstawy wywołanych rylozolem zmian w częstotliwości spontanicznego zwijania, badano potencjał błonowy w neuronach ruchowych rdzenia kręgowego zarodka w sposób całkowicie nieinwazyjny, mierząc stosunek intensywności fluorescencji pary donora i akceptora FRET biosensora Mermaid. Zidentyfikowano pierwotne neurony ruchowe rdzenia kręgowego wykazujące ekspresję biosensora i zarejestrowano ich podstawową aktywność spontanicznej depolaryzacji.Wraz z redukcją częstotliwości ruchów zwijania ogona, podanie riluzolu zmniejszyło częstotliwość zdarzeń spontanicznej depolaryzacji. Po opanowaniu tej metody badacze będą mogli analizować właściwości elektryczne sieci neuronalnych w nienaruszonych embrionach, co pozwala na pełne zachowanie złożoności oddziaływań między komórkami w rozwijającym się systemie funkcjonalnym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak aktywność elektryczna neuronów rdzeniowych koreluje z częstotliwością spontanicznych zwinięć ogona.

biosensing-motor-neuron-membrane-potential-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Larwy danio pręgowanego stanowią pierwszy kręgowcowy system modelowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch-clamp z motoneuronu rdzeniowego i docelowego mięśnia szkieletowego. Niniejszy film prezentuje metody mikroskopowe stosowane do identyfikacji segmentowego motoneuronu CaP oraz docelowych komórek mięśniowych, a także metodologię rejestracji z każdego z tych typów komórek.

Podwójne rejestracje metodą patch-clamp z neuronów ruchowych i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego

Ten film opisuje techniki optogenetyczne poprzez aktywację genetycznie zmodyfikowanych neuronów somatosensorycznych i rejestrowanie wywołanych reakcji behawioralnych za pomocą szybkiej kamery wideo.

Optogenetyka danio pręgowanego: aktywacja genetycznie zmodyfikowanego neuronu somatosensorycznego w celu zbadania reakcji behawioralnych larw

Ten film demonstruje nieinwazyjny test do badania elektrofizjologii neuronów ruchowych w zarodkach danio pręgowanego. Po zmierzeniu zwijania ogona w zarodkach w wyniku spontanicznej depolaryzacji neuronów ruchowych rdzenia kręgowego, stosuje się bloker kanału sodowego w celu zmniejszenia częstotliwości zwijania. Następnie zarodki są unieruchamiane w agarozie i umieszczane pod mikroskopem fluorescencyjnym. Genetycznie zmodyfikowane neurony ruchowe wyrażają bioczujnik wykrywający napięcie z...

Nieinwazyjne podejście do badania elektrofizjologii neuronów ruchowych w zarodkach danio pręgowanego

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z neuronów doprowadzających u sparaliżowanej larwy danio pręgowanego poprzez umieszczenie mikropipety w pobliżu zwoju linii bocznej i utworzenie luźnej uszczelki do przechwytywania sygnału. Roztwór zewnątrzkomórkowy utrzymuje żywotność neuronów podczas tego procesu.

Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Opisujemy protokół monitorowania zmian w aktywności neuronu doprowadzającego podczas poleceń motorycznych w modelowym systemie komórek rzęsatych kręgowców.

Aktywność neuronów aferentnych tylnej linii bocznej podczas pływania u danio pręgowanego

Połączenie nerwowo-mięśniowe larw danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Jest podatny na wiele technik eksperymentalnych, w tym elektrofizjologię i obrazowanie optyczne. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania transmisji synaptycznej za pomocą sondy na bazie pHluoryny pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym.

Obrazowanie na żywo recyklingu pęcherzyków synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym wypreparowanych larw danio pręgowanego

Poznaj nieinwazyjną metodę badania właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w zarodkach Danio rerio przy użyciu wskaźników napięcia GEVI opartych na FRET. Technika ta umożliwia analizę pobudliwości neuronów motorycznych rdzenia kręgowego w warunkach in vivo.

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów