Wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami

Ogólnym celem tych procedur jest wykorzystanie syntetycznie zmodyfikowanych bakterii E.coli do kontrolowania i manipulowania programowalnymi powierzchniami materiałów poprzez połączenie strategii modyfikacji genetycznej i funkcjonalizacji powierzchni. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w takich dziedzinach jak medycyna molekularna i monitorowanie środowiska. Wykorzystując genetycznie zaprogramowane komórki do interpretowania lokalnego środowiska i odpowiedniego modyfikowania funkcjonalizowanego materiału, dostarczamy modułowe narzędzie do szerokiego zakresu zastosowań.

Główną zaletą tej techniki jest to, że żywe komórki mogą pełnić rolę dynamicznych sensorów zdolnych do odczytywania, przetwarzania i rejestrowania warunków w swoim otoczeniu za pomocą funkcjonalizowanych interfejsów. Po przygotowaniu roztworów i zebraniu wzbogaconego w biotynę supernatantu z produkujących biotynę E.coli zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 1,4 µL roztworu SPDP do 20 µL streptawidyny lub roztworu SA. Protkę należy owinąć folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny, aby umożliwić wiązanie się łącznika SPDP z SA poprzez grupę aminową, tworząc SA aktywowaną pyridylditio. Po inkubacji do probówki należy dodać 2,4 µL roztworu DTT i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby umożliwić rozszczepienie pirydyno-2-tionu, co prowadzi do powstania SA aktywowanej sulfhydrylowo. Następnie należy dodać 7,5 µL roztworu SCC do 72 µL roztworu HRP, owinąć go folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny.

W rezultacie powstaje HRP aktywowany maleimidem, związany z grupą aminową. Wymieszać 17 µL roztworu biotyny LC-LC z 200 µL roztworu BSA, owinąć probówkę folią i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny. Ten etap umożliwia sprzężenie biotyny z BSA poprzez wiązanie amidowe.

Przenieś roztwór SA-SPDP, HRP-SMCC oraz roztwór biotyny sprzężonej z BSA do oddzielnych koncentratorów odśrodkowych w probówkach wirówkowych. Odśrodkuj SA-SPDP przy 10 000 ×g, aż objętość w probówce osiągnie 100 µL lub przez 16 minut, następnie uzupełnij objętość w probówce do 500 µL za pomocą PBS-EDTA przed powtórzeniem wirowania i dodaniem PBS-EDTA jeszcze pięć razy. Po odśrodkowaniu roztworu do objętości 100 µL, przechowuj roztwór zapasowy w temperaturze 4 °C.

W przypadku HRP SMCC, odwiruj probówki przy 10 000 ×g, aż objętość osiągnie 25 µL lub przez 16 minut. Napełnij probówkę do 4500 µL, używając PBS, a następnie powtórz wirowanie i dodawanie PBS jeszcze pięć razy. Po odwirowaniu roztworu do objętości 100 µL, przechowuj roztwór zapasowy w temperaturze 4 °C.

W przypadku biotynilowanej BSA, odwiruj próbkę przy 10 000 ×g aż do osiągnięcia objętości 100 µL lub przez 12 minut, a następnie dopełnij probówkę wirówkową do 500 µL za pomocą PBS. Po powtórzeniu wirowania i dodawania PBS jeszcze cztery razy, odwiruj probówkę do osiągnięcia objętości 100 µL lub przez 12 minut, następnie dodaj do probówki 100 µL PBS i przechowuj roztwór stokowy w temperaturze 4 °C. Następnie połącz 25 µL HRP o stężeniu 10 mg/mL z 25 µL roztworu SA o stężeniu 10 mg/mL i przechowuj probówkę w temperaturze 4 °C przez noc, po czym przygotuj dwie alikwoty biotynilowanej BSA w PBS, dodając 10 µL roztworu stokowego biotynilowanej BSA do 490 µL PBS.

Pipetuj 100 µL roztworu do każdej studni płytki 96-dołkowej. Owiń płytkę folią i inkubuj w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Następnie dodaj do studni 200 µL 0,5% Tween 80 oraz BPS.

Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, następnie odessać i odlać ciecz. Po trzykrotnym powtórzeniu płukania, dodać 200 µL 0,5% roztworu blokującego do każdego otworu, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez godzinę. Po kolejnej serii płukań przeprowadzonych w ten sam sposób, zmieszać 12 mL 0,5% roztworu blokującego z 7,5 µL 0,5% Tween 80, a następnie użyć tego roztworu do rozcieńczenia roztworu zapasu SA-HRP w stosunku 1:10 000.

Do każdego dołka płytki 96-dołkowej pipetować 80 µL rozcieńczonego SA-HRP, a następnie dodać 20 µL przygotowanej próbki biotyny do każdego dołka płytki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Krok ten umożliwia konkurencyjne wiązanie wolnej biotyny i unieruchomionej biotyny BSA o miejsca wiążące SA-HRP.

Następnie, po trzykrotnym przemyciu płytki w sposób opisany wcześniej, przygotuj 20 mililitrów roztworu 50 milimolarnego octanu sodu, 1% TMB i 3% nadtlenku wodoru w stosunku 1 000 do 10 do 1. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu do każdej studzienki płytki, owiń ją folią i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Do każdej studzienki nanieś pipetą 50 mikrolitrów dwumolarnego kwasu siarkowego, aby zatrzymać reakcję, a następnie użyj czytnika płytek do pomiaru OD 450.

Po przygotowaniu roztworów zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 7,5 µL biotyny LC-LC do 72 µL HRP. Roztwór należy owinąć folią i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny przy ciągłym mieszaniu. Na tym etapie dochodzi do sprzęgnięcia biotyny z HRP poprzez wiązanie amidowe.

Przenieś roztwór do koncentratora odśrodkowego w probówce wirówkowej i odwiruj roztwór przy 10, 000 ×g, aż objętość osiągnie 100 µL lub przez 12 minut, następnie uzupełnij probówkę wirówkową buforem PBS do objętości 500 µL i powtórz odśrodkowanie oraz dodawanie buforu cztery razy. Następnie do każdej studzienki płytki 96-dołkowej dodaj 100 µL SA w PBS o stężeniu 0,17 µg/mL. Owiń płytkę folią i inkubuj w temperaturze 37 °C przez godzinę.

Aby przemyć dołki płytki, pipetować 200 µL 0,5% Tween 80 do każdego dołka. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, a następnie odlać ciecz. Po powtórzeniu płukania jeszcze trzy razy, dodać do dołków 200 µL 0,5% roztworu blokującego.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, a następnie przemyj studzienki trzy razy w ten sam sposób co poprzednio. Wykorzystując wcześniej przygotowany, przemyty i skoncentrowany roztwór biotyny HRP, rozcieńcz roztwór zapasowy biotyny HRP w stosunku 1:10 000, a następnie dodaj 80 µL tego roztworu do studzienek płytki 96-dołkowej. Do każdej studzienki płytki dodaj 20 µL przygotowanej próbki biotyny i inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, aby umożliwić konkurencyjne wiązanie wolnej biotyny i biotyny HRP w unieruchomionych miejscach wiążących SA.

Po trzykrotnym przemyciu studni w ten sam sposób co poprzednio, należy przygotować 20 mililitrów roztworu 50 milimolarnego octanu sodu, 1% TMV oraz 3% nadtlenku wodoru w stosunku 1 000 do 10 do jednego. Do każdej studni płytki należy dodać 200 mikrolitrów roztworu, przykryć ją folią i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodać 50 mikrolitrów dwumolarnego kwasu siarkowego do każdej studni w celu zatrzymania reakcji. Na koniec, za pomocą czytnika płytek, należy zmierzyć OD 450.

Zmodyfikowane indukowalne komórki szczepu dzikiego E.coli MG1655 hodowano i monitorowano w medium minimalnym, a także w medium minimalnym uzupełnionym o DTB i/lub IPTG. Wykresy te przedstawiają pomiary OD 600 wykonywane co pięć minut przez 24 godziny. W tym doświadczeniu w miejsce genu bioB zastosowano białko fluorescencyjne mCherry, aby można było zmierzyć profil indukcji po indukowaniu zmodyfikowanych komórek za pomocą IPTG.

Wyniki te wykazują skuteczność indukowalnej sieci genowej. Przedstawiono tutaj sygnały optyczne przy OD 450 w odpowiedzi na różne stężenia biotyny dla obu schematów funkcjonalizacji powierzchni: pośredniego i bezpośredniego. W tym doświadczeniu produkty indukowanych zmodyfikowanych komórek zostały wykorzystane do chemicznej modyfikacji funkcjonalizowanej powierzchni.

Różne stężenia biotyny przedstawiono na podstawie pomiarów z powierzchni funkcjonalizowanej za pomocą pośredniego schematu kontrolnego dla komórek typu dzikiego, nieindukowanych komórek zawierających plazmid pKE1-lacI-bioB oraz indukowanych komórek zawierających plazmid pKE1-lacI-bioB. Po opanowaniu metody, modyfikacja genetyczna komórek może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch dni, natomiast techniki bezpośredniej i pośredniej funkcjonalizacji powierzchni można wykonać odpowiednio w ciągu pięciu godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o unikaniu kontaminacji hodowli komórek bakteryjnych oraz o zasłanianiu powierzchni podczas funkcjonalizacji, aby zapobiec fotoblakaniu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób funkcjonalizacji powierzchni zarówno dla bezpośredniego, jak i pośredniego schematu sterowania. Należy pamiętać, że praca z bromkiem etydyny może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek.