Name: Wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metody inżynierii żywych komórek E. coli do sterowania programowalnymi powierzchniami materiałowymi. Technika ta łączy modyfikacje genetyczne z funkcjonalizacją powierzchni dla zastosowań w medycynie molekularnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony nagrody FA9550-13-1-0108 przyznanej przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych USA. Autorzy dodatkowo dziękują za wsparcie w postaci nagrody N00014-15-1-2502 przyznanej przez Biuro Badań Marynarki Wojennej USA, dofinansowania z Instytutu Technologii Krytycznych i Nauk Stosowanych w Virginia Polytechnic Institute i Uniwersytecie Stanowym oraz z National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, nagroda numer 1607310.

<ol><li>Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+Surface+Chemistry+with+Engineered+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Programming Surface Chemistry with Engineered Cells.</a> ACS Synth. Biol. , (2016).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+graphene+oxide+films+used+as+matrix+of+MALDI-TOF-MS+for+detection+of+octachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165, 1255-1266 (2016).</li>
<li>Bähring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Sensing+Properties+of+a+Self-Assembled+Supramolecular+Oligomer%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer.</a> Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).</li>
<li>Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+persistence+and+the+optimality+of+run-and-tumble+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis.</a> Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).</li>
<li>Du, J., Shao, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbial+factories+for+synthesis+of+value-added+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering microbial factories for synthesis of value-added products.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).</li>
<li>Kim, H., Kim, M. J. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7365478/">Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm.</a> IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).</li>
<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li>
<li>Heyde, K. C., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Host-Microbiome+Interactions+using+an+in+Silico+Model+of+Biomimetic+Robots+and+Engineered+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells.</a> Sci. Rep. 5, 11988(2015).</li>
<li>Rice, M. K., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+biological+nanomaterials+using+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tech.+Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Creating biological nanomaterials using synthetic biology.</a> Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401(2014).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem. J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Mesulam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramethyl+benzidine+for+horseradish+peroxidase+neurohistochemistry%3A+a+non-carcinogenic+blue+reaction+product+with+superior+sensitivity+for+visualizing+neural+afferents+and+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents.</a> J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).</li>
<li>Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+plug-and-play+methodology+for+constructing+and+modifying+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks.</a> Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Chemical+Synthesis%2C+Assembly%2C+and+Cloning+of+a+Mycoplasma+genitalium+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome.</a> Science. 319, 1215-1220 (2008).</li>
<li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biotin-%28strept%29avidin+system%3A+principles+and+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).</li>
<li>Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob,, Lee, A. J., Sever, Y. J., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+use+of+capture+biotin-streptavidin+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Micro%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay.</a> J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).</li>
<li>Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+Nanosensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Biological+and+Chemical+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species.</a> Science. 293, 1289-1292 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiliśmy nową strategię łączenia zmodyfikowanych żywych komórek z funkcjonalizowaną powierzchnią materiału. Udało się to osiągnąć poprzez opracowanie linii komórkowej zdolnej do syntezy podwyższonych poziomów biotyny podczas indukcji za pomocą IPTG. Podwyższony poziom biotyny może być następnie wykorzystany do modyfikacji funkcjonalizowanej powierzchni. Protokoły szczegółowo opisywały, jak zaprojektować linię komórkową E. coli i jak stworzyć dwie różne funkcjonalizowane powierzchnie.
<p class="jove_co...

Tutaj opisujemy procedury tworzenia programowalnego substratu zdolnego do reagowania na sygnał chemiczny z zaprojektowanej linii komórkowej. 1 Robimy to, tworząc interfejs biotyna-streptawidyna, który reaguje na biotynę wytwarzaną przez syntetycznie modyfikowane komórki Escherichia coli (E. coli). Wcześniej programowalne powierzchnie były projektowane z myślą o szerokim zakresie zastosowań, od wykrywania toksyn 2 i diagnostyki w miejscu opieki nad pacjentem3 po obronę i bezpieczeństwo. 4 Podczas gdy programowalne powierzchnie mogą być użyteczne jako czujniki i siłowniki, można je uczynić "inteligentniejszymi" poprzez wyposażenie ich w zdolność adaptacji do różnych wyzwań środowiskowych. W przeciwieństwie do tego, nawet proste mikroorganizmy, takie jak E. coli, mają wrodzone zdolności adaptacyjne i są w stanie reagować na wyzwania za pomocą wyrafinowanych i często nieoczekiwanych rozwiązań. Ta zdolność adaptacji umożliwiła populacjom E. coli, kontrolowanym przez ich złożone sieci genów, efektywne kosztowo poszukiwanie zasobów,5 tworzyć produkty o wartości dodanej,6, a nawet napędzać robotykę na mikroskalę. 7 Łącząc adaptacyjne zalety żywych komórek z wykorzystaniem programowalnych powierzchni, możemy stworzyć inteligentne podłoże zdolne do reagowania na różne warunki środowiskowe.
Biologia syntetyczna dała naukowcom nowe możliwości programowania zachowania organizmów żywych. Poprzez modyfikację komórek tak, aby zawierały nowe sieci regulacyjne genów, naukowcy mogą projektować komórki, które wykazują szereg zaprogramowanych zachowań. 8,9 Poza badaniami podstawowymi, zachowania te mogą być wykorzystywane do zastosowań takich jak kontrolowanie montażu materiałów i biologiczne wytwarzanie produktów o wartości dodanej. 10 Tutaj szczegółowo opisujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy narzędzia biologii syntetycznej do stworzenia szczepu E. coli, który syntetyzuje biotynę podczas indukcji. Szczep ten został opracowany przy użyciu metod klonowania enzymów restrykcyjnych w celu złożenia plazmidu, pKE1-lacI-bioB. Ten plazmid, po przekształceniu w szczep E. coli K-12 MG1655, nadaje komórkom zdolność do ekspresji podwyższonego poziomu bioB, enzymu niezbędnego do syntezy biotyny. Gdy transformowane komórki indukowano izopropylowym β-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG) i zaopatrzono w prekursor biotyny, destiobiotynę (DTB), wytwarzano podwyższone poziomy biotyny.
Wiązanie biotyny ze streptawidyną jest jednym z najsilniejszych niekowalencyjnych wiązań występujących w naturze. W związku z tym interakcja biotyna-streptawidyna jest zarówno dobrze scharakteryzowana, jak i szeroko stosowana w biotechnologii. 11 W tym manuskrypcie prezentujemy dwie strategie wykorzystujące interakcję biotyna-streptawidyna do wykrywania i wykrywania biotyny wytwarzanej przez komórki za pomocą funkcjonalizowanej powierzchni. Te kontrastujące ze sobą powierzchnie nazywamy "pośrednimi" i "bezpośrednimi" schematami sterowania. W schemacie kontroli pośredniej biotyna wytwarzana przez komórki konkuruje z biotyną, która została sprzężona i unieruchomiona na powierzchni polistyrenu w poszukiwaniu miejsc wiązania streptawidyny. Ponadto streptawidyna jest sprzężona z peroksydazą chrzanową (HRP). HRP modyfikuje 3, 3', 5, 5'-tetrametylobenzydynę (TMB), w celu wytworzenia sygnału optycznego, 12, który może być monitorowany przez ilościowe określenie absorbancji widmowej (tj. gęstości optycznej) przy 450 nm (OD450). W ten sposób schemat kontroli pośredniej pozwala naukowcom mierzyć biotynę wytwarzaną przez komórki poprzez monitorowanie tłumienia sygnału OD450.
Schemat bezpośredniej kontroli wykorzystuje zdarzenie streptawidyna-biotyna, unieruchamiając streptawidynę bezpośrednio na powierzchni materiału i pozwalając wytwarzanej przez komórki biotynie i biotynylowanemu HRP konkurować o miejsca wiązania streptawidyny. Ponownie, względne poziomy biotyny wytwarzanej przez komórki są monitorowane poprzez pomiar sygnału OD450.
Razem wzięte, zmodyfikowane komórki i funkcjonalizowane powierzchnie pozwalają nam kontrolować właściwości programowalnej powierzchni poprzez indukowanie sieci w żywych komórkach. Innymi słowy, stworzyliśmy system, który wykorzystuje zdolności adaptacyjne organizmów żywych oraz niezawodność i specyfikację interfejsu z materiałów inżynieryjnych, łącząc te systemy ze sobą.

<table><tbody><tr><td>Rosół LB, młynarz&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, Sole minimalne, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Casamino Acids&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu, bezwodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia, dwuwodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza (D-glukoza), bezwodna</td> linia komórkowa <td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB Turbo</td> New <td>England Biolabs</td><td>C2984l</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotyd Podkłady</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Synteza N/A</td><td>25N, oczyszczanie DSL</td></tr><tr><td>Q5 Polimeraza wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Bufor reakcyjny</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mieszanina roztworów</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>Etydyna Bromek, 1%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy do ekstrakcji żelu</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA Miniprep</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Lodoksyjka reakcyjna ligazy DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane ColiRolle&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Desthiobiotin (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>Sukcynimidyl Trans-4-(maleimidylometylo)cykloheksano-1-karboksylan (SMCC)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>3-(2-pirydylodyjodio)propionian sukcynimidylu (SPDP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanowa (HRP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanami (PBS), 10x roztwór</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna (SA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminooctowy (EDTA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Animacja 80&nbsp;</td><td>Nadtlenek wodoru Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5'-tetrametylobenzydyna (TMB)</td><td>Koncentratory</td> odśrodkowe Fisher <td>Scientific AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500&nbsp;</td><td>Viva Products</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu, bezwodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki polistyrenowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Opracowaliśmy interfejs abiotyczno-biotyczny, który pozwala komórkom inżynieryjnym kontrolować właściwości materialne funkcjonalizowanej powierzchni. System ten składa się z dwóch modułów: syntetycznie zmodyfikowanego szczepu komórek E. coli oraz funkcjonalizowanego interfejsu materiałowego. W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół inżynierii genetycznej wybranych zachowań w obrębie szczepu E. coli przy użyciu strategii klonowania molekularnego. Po opracowaniu, szczep ten wytwarza podwyższony poziom biotyny pod wpływem induktora chemicznego. Dodatkowo szczegółowo opisujemy protokoły tworzenia dwóch różnych funkcjonalizowanych powierzchni, z których każda jest w stanie reagować na biotynę syntetyzowaną przez komórki. Podsumowując, przedstawiamy metodologię tworzenia połączonego, abiotyczno-biotycznego systemu, który pozwala zmodyfikowanym komórkom kontrolować skład materiału i montaż na podłożach nieożywionych.

Reprezentatywne wyniki przedstawiono na pięciu towarzyszących rycinach. Najpierw graficznie prezentujemy proces klonowania (Rycina 1), aby czytelnik mógł wizualnie prześledzić kluczowe etapy tworzenia syntetycznie zmodyfikowanego szczepu E. coli. W celu scharakteryzowania dynamiki populacyjnej komórek przedstawiamy krzywą wzrostu (Rycina 2) wygenerowaną poprzez pomiar gęstości optycznej populacji przy 600 nm (OD60). Następnie pokazujem...

Ten artykuł przedstawia serię protokołów do rozwoju inżynieryjnych komórek i funkcjonalizowanych powierzchni, które umożliwiają syntetycznie modyfikowanym E. coli kontrolowanie i manipulowanie programowalnymi powierzchniami materiałów.

Wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Ogólnym celem tych procedur jest wykorzystanie syntetycznie zmodyfikowanych bakterii E.coli do kontrolowania i manipulowania programowalnymi powierzchniami materiałów poprzez połączenie strategii modyfikacji genetycznej i funkcjonalizacji powierzchni. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w takich dziedzinach jak medycyna molekularna i monitorowanie środowiska. Wykorzystując genetycznie zaprogramowane komórki do interpretowania lokalnego środowiska i odpowiedniego modyfikowania funkcjonalizowanego materiału, dostarczamy modułowe narzędzie do szerokiego zakresu zastosowań.Główną zaletą tej techniki jest to, że żywe komórki mogą pełnić rolę dynamicznych sensorów zdolnych do odczytywania, przetwarzania i rejestrowania warunków w swoim otoczeniu za pomocą funkcjonalizowanych interfejsów. Po przygotowaniu roztworów i zebraniu wzbogaconego w biotynę supernatantu z produkujących biotynę E.coli zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 1,4 µL roztworu SPDP do 20 µL streptawidyny lub roztworu SA. Protkę należy owinąć folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny, aby umożliwić wiązanie się łącznika SPDP z SA poprzez grupę aminową, tworząc SA aktywowaną pyridylditio. Po inkubacji do probówki należy dodać 2,4 µL roztworu DTT i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby umożliwić rozszczepienie pirydyno-2-tionu, co prowadzi do powstania SA aktywowanej sulfhydrylowo. Następnie należy dodać 7,5 µL roztworu SCC do 72 µL roztworu HRP, owinąć go folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny.W rezultacie powstaje HRP aktywowany maleimidem, związany z grupą aminową. Wymieszać 17 µL roztworu biotyny LC-LC z 200 µL roztworu BSA, owinąć probówkę folią i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny. Ten etap umożliwia sprzężenie biotyny z BSA poprzez wiązanie amidowe.Przenieś roztwór SA-SPDP, HRP-SMCC oraz roztwór biotyny sprzężonej z BSA do oddzielnych koncentratorów odśrodkowych w probówkach wirówkowych. Odśrodkuj SA-SPDP przy 10 000 ×g, aż objętość w probówce osiągnie 100 µL lub przez 16 minut, następnie uzupełnij objętość w probówce do 500 µL za pomocą PBS-EDTA przed powtórzeniem wirowania i dodaniem PBS-EDTA jeszcze pięć razy. Po odśrodkowaniu roztworu do objętości 100 µL, przechowuj roztwór zapasowy w temperaturze 4 °C.W przypadku HRP SMCC, odwiruj probówki przy 10 000 ×g, aż objętość osiągnie 25 µL lub przez 16 minut. Napełnij probówkę do 4500 µL, używając PBS, a następnie powtórz wirowanie i dodawanie PBS jeszcze pięć razy. Po odwirowaniu roztworu do objętości 100 µL, przechowuj roztwór zapasowy w temperaturze 4 °C.W przypadku biotynilowanej BSA, odwiruj próbkę przy 10 000 ×g aż do osiągnięcia objętości 100 µL lub przez 12 minut, a następnie dopełnij probówkę wirówkową do 500 µL za pomocą PBS. Po powtórzeniu wirowania i dodawania PBS jeszcze cztery razy, odwiruj probówkę do osiągnięcia objętości 100 µL lub przez 12 minut, następnie dodaj do probówki 100 µL PBS i przechowuj roztwór stokowy w temperaturze 4 °C. Następnie połącz 25 µL HRP o stężeniu 10 mg/mL z 25 µL roztworu SA o stężeniu 10 mg/mL i przechowuj probówkę w temperaturze 4 °C przez noc, po czym przygotuj dwie alikwoty biotynilowanej BSA w PBS, dodając 10 µL roztworu stokowego biotynilowanej BSA do 490 µL PBS.Pipetuj 100 µL roztworu do każdej studni płytki 96-dołkowej. Owiń płytkę folią i inkubuj w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Następnie dodaj do studni 200 µL 0,5% Tween 80 oraz BPS.Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, następnie odessać i odlać ciecz. Po trzykrotnym powtórzeniu płukania, dodać 200 µL 0,5% roztworu blokującego do każdego otworu, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez godzinę. Po kolejnej serii płukań przeprowadzonych w ten sam sposób, zmieszać 12 mL 0,5% roztworu blokującego z 7,5 µL 0,5% Tween 80, a następnie użyć tego roztworu do rozcieńczenia roztworu zapasu SA-HRP w stosunku 1:10 000.Do każdego dołka płytki 96-dołkowej pipetować 80 µL rozcieńczonego SA-HRP, a następnie dodać 20 µL przygotowanej próbki biotyny do każdego dołka płytki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Krok ten umożliwia konkurencyjne wiązanie wolnej biotyny i unieruchomionej biotyny BSA o miejsca wiążące SA-HRP.Następnie, po trzykrotnym przemyciu płytki w sposób opisany wcześniej, przygotuj 20 mililitrów roztworu 50 milimolarnego octanu sodu, 1% TMB i 3% nadtlenku wodoru w stosunku 1 000 do 10 do 1. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu do każdej studzienki płytki, owiń ją folią i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Do każdej studzienki nanieś pipetą 50 mikrolitrów dwumolarnego kwasu siarkowego, aby zatrzymać reakcję, a następnie użyj czytnika płytek do pomiaru OD 450.Po przygotowaniu roztworów zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 7,5 µL biotyny LC-LC do 72 µL HRP. Roztwór należy owinąć folią i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny przy ciągłym mieszaniu. Na tym etapie dochodzi do sprzęgnięcia biotyny z HRP poprzez wiązanie amidowe.Przenieś roztwór do koncentratora odśrodkowego w probówce wirówkowej i odwiruj roztwór przy 10, 000 ×g, aż objętość osiągnie 100 µL lub przez 12 minut, następnie uzupełnij probówkę wirówkową buforem PBS do objętości 500 µL i powtórz odśrodkowanie oraz dodawanie buforu cztery razy. Następnie do każdej studzienki płytki 96-dołkowej dodaj 100 µL SA w PBS o stężeniu 0,17 µg/mL. Owiń płytkę folią i inkubuj w temperaturze 37 °C przez godzinę.Aby przemyć dołki płytki, pipetować 200 µL 0,5% Tween 80 do każdego dołka. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, a następnie odlać ciecz. Po powtórzeniu płukania jeszcze trzy razy, dodać do dołków 200 µL 0,5% roztworu blokującego.Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, a następnie przemyj studzienki trzy razy w ten sam sposób co poprzednio. Wykorzystując wcześniej przygotowany, przemyty i skoncentrowany roztwór biotyny HRP, rozcieńcz roztwór zapasowy biotyny HRP w stosunku 1:10 000, a następnie dodaj 80 µL tego roztworu do studzienek płytki 96-dołkowej. Do każdej studzienki płytki dodaj 20 µL przygotowanej próbki biotyny i inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, aby umożliwić konkurencyjne wiązanie wolnej biotyny i biotyny HRP w unieruchomionych miejscach wiążących SA.Po trzykrotnym przemyciu studni w ten sam sposób co poprzednio, należy przygotować 20 mililitrów roztworu 50 milimolarnego octanu sodu, 1% TMV oraz 3% nadtlenku wodoru w stosunku 1 000 do 10 do jednego. Do każdej studni płytki należy dodać 200 mikrolitrów roztworu, przykryć ją folią i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodać 50 mikrolitrów dwumolarnego kwasu siarkowego do każdej studni w celu zatrzymania reakcji. Na koniec, za pomocą czytnika płytek, należy zmierzyć OD 450.Zmodyfikowane indukowalne komórki szczepu dzikiego E.coli MG1655 hodowano i monitorowano w medium minimalnym, a także w medium minimalnym uzupełnionym o DTB i/lub IPTG. Wykresy te przedstawiają pomiary OD 600 wykonywane co pięć minut przez 24 godziny. W tym doświadczeniu w miejsce genu bioB zastosowano białko fluorescencyjne mCherry, aby można było zmierzyć profil indukcji po indukowaniu zmodyfikowanych komórek za pomocą IPTG.Wyniki te wykazują skuteczność indukowalnej sieci genowej. Przedstawiono tutaj sygnały optyczne przy OD 450 w odpowiedzi na różne stężenia biotyny dla obu schematów funkcjonalizacji powierzchni: pośredniego i bezpośredniego. W tym doświadczeniu produkty indukowanych zmodyfikowanych komórek zostały wykorzystane do chemicznej modyfikacji funkcjonalizowanej powierzchni.Różne stężenia biotyny przedstawiono na podstawie pomiarów z powierzchni funkcjonalizowanej za pomocą pośredniego schematu kontrolnego dla komórek typu dzikiego, nieindukowanych komórek zawierających plazmid pKE1-lacI-bioB oraz indukowanych komórek zawierających plazmid pKE1-lacI-bioB. Po opanowaniu metody, modyfikacja genetyczna komórek może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch dni, natomiast techniki bezpośredniej i pośredniej funkcjonalizacji powierzchni można wykonać odpowiednio w ciągu pięciu godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o unikaniu kontaminacji hodowli komórek bakteryjnych oraz o zasłanianiu powierzchni podczas funkcjonalizacji, aby zapobiec fotoblakaniu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób funkcjonalizacji powierzchni zarówno dla bezpośredniego, jak i pośredniego schematu sterowania. Należy pamiętać, że praca z bromkiem etydyny może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek.

using-synthetic-biology-to-engineer-living-cells-that-interface-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Opisano proces wytwarzania wielowarstwowego, mikroprzepływowego urządzenia opartego na PDMS, które umożliwia przeprowadzanie reakcji transkrypcji i translacji in vitro (IVTT) przez dłuższy czas. Ponadto zapewniony jest kompleksowy przegląd sprzętu i oprogramowania wymaganego do automatyzacji i utrzymania tych reakcji przez dłuższy czas.

Wielowarstwowa platforma mikroprzepływowa do prowadzenia przedłużonej ekspresji genów bez komórek

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Dobrze scharakteryzowane części genetyczne są niezbędne do projektowania nowych obwodów genetycznych. W tym miejscu opisujemy ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę szybkiego charakteryzowania części genetycznych. Nasza metoda zmniejsza koszty i czas dzięki połączeniu lizatów bezkomórkowych, liniowego DNA w celu uniknięcia klonowania oraz akustycznej obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości i zmniejszenia objętości reakcji.

Szybka charakterystyka części genetycznych za pomocą systemów bezkomórkowych

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Tutaj przedstawiono protokół projektowania, konstruowania i dostarczania sterowanego tetracykliną indukowalnego obwodu syntetycznego. Wpływ obwodów syntetycznych na eliminację pasożytów i ekspresję cytokin można badać poprzez kanalizację prezentowanego rurociągu. Protokół ten jest istotny dla naukowców badających syntetyczne terapie oparte na obwodach w chorobach zakaźnych.

Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza

Niniejszy artykuł opisuje podejście w zakresie biofabrykacji: osadzanie polisacharydów reagujących na bodźce w obecności spolaryzowanych elektrod w celu stworzenia biokompatybilnych filmów, które mogą zostać funkcjonalizowane komórkami lub białkami. Przedstawiamy laboratoryjną strategię wytwarzania tych filmów, a także ich podstawowe zastosowania w tworzeniu interaktywnych, biofunkcjonalizowanych powierzchni dla aplikacji typu lab-on-a-chip.

Łączenie interfejsu bioelektronicznego za pomocą biofabrykacji

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Poznaj metody inżynierii żywych komórek E. coli do sterowania programowalnymi powierzchniami materiałowymi. Technika ta łączy modyfikacje genetyczne z funkcjonalizacją powierzchni dla zastosowań w medycynie molekularnej.

Wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami

Przeglądaj więcej filmów