Identyfikacja białek wiążących lód roślinny poprzez ocenę inhibicji i izolacji rekrystalizacji lodu za pomocą oczyszczania o powinowactwie do lodu

Ogólnym celem tego protokołu jest identyfikacja nowych białek wiążących lód lub IBP z roślin poprzez testowanie aktywności wiązania lodu i izolowanie natywnych peptydów za pomocą oczyszczania z powinowactwem do lodu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie tolerancji na marnowanie roślin, w szczególności białek wiążących lód. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na wyizolowanie białek wiążących lód z natywnych ekstraktów bez użycia skomplikowanych metod oczyszczania.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ konfiguracja aparatury może być trudna do konceptualizacji. Rozpocznij ten protokół od ustawienia aparatu splat zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wywołać ekspresję białek wiążących lód lub IBP w trawach odpornych na mróz lub innych gatunkach roślin odpornych na mróz, rośliny aklimatyzują się w niskich temperaturach przez okres do jednego tygodnia w temperaturze czterech stopni Celsjusza w warunkach słabego oświetlenia.

Uzyskaj około 0,1 grama tkanki liścia, przecinając u podstawy łodygi, a następnie umieszczając w tubce o pojemności 1,5 mililitra. Natychmiast błyskawicznie zamrozić próbkę w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby zlizać komórki, zmiel próbkę tkanki na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka pod ciekłym azotem.

Upewnij się, że ciekły azot nie odparuje podczas procesu homogenizacji. Zmielone próbki należy natychmiast umieścić na lodzie i pozostawić do całkowitego odparowania ciekłego azotu. Następnie dodaj jeden mililitr natywnego buforu do ekstrakcji białka i pipetę do wymieszania.

Delikatnie wstrząsnąć próbkami przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przeprowadzić pozostałe etapy w tej samej temperaturze. Następnego dnia usuń resztki komórkowe, odwirowując próbki w temperaturze około 1600 razy G przez pięć minut. Zachowaj rozpuszczalną frakcję i odwiruj przez dodatkowe pięć minut, jeśli resztki komórkowe utrzymują się.

Oczyszczone próbki można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. Wlej 100 mililitrów heksanu do zewnętrznej komory ustawionej z folią spolaryzowaną i dodaj pięć do sześciu kulek osuszających, aby zapobiec gromadzeniu się wilgoci na szkiełkach. Następnie dodaj niewielką ilość smaru próżniowego do płytki pokrywającej kąpiel i przekręć, aby zapewnić szczelne uszczelnienie i zapobiec parowaniu heksanu.

Na 40 minut przed rozpoczęciem eksperymentu umieść blok chłodzący w styropianowym pudełku bezpośrednio pod plastikową rurką i całkowicie przykryj go suchym lodem. Przed rozpoczęciem testu upewnij się, że probówka jest wypoziomowana. Następnie usuń suchy lód z górnej części zimnego bloku.

Najpierw przetestuj tę procedurę z wodą, aby określić, w którym miejscu bloku chłodzącego próbka spadnie. Zanurz jednorazową końcówkę przymocowaną do pipety automatycznej w olejku immersyjnym, co pozwoli na opadnięcie próbki, a nie przyleganie do niej na zewnątrz pipety. Użyj ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar oleju.

Następnie odessać 10 mikrolitrów wody. Umieść pipetę bezpośrednio nad plastikową rurką przed wypuszczeniem wody. Wyraźny dźwięk rozprysku powinien być słyszalny, gdy woda uderza w blok chłodzący, tworząc monowarstwę kryształków lodu.

Następnie umieść szklane szkiełko podstawowe mikroskopu na znaku kropli, który został określony za pomocą wody. Bezpośrednio przed rozpoczęciem testu włącz źródło światła i zeskrob lód, który utworzył się na dnie szklanej komory. Następnie wykonaj test rozprysków z próbką, tak jak w przypadku wody, uwalniając 10 mikrolitrów próbki na szkiełko podstawowe, aby utworzyć monowarstwę kryształków lodu.

Szybko i ostrożnie wyjmij szkiełko mikroskopowe z zimnego bloku za pomocą pęsety i umieść w kąpieli heksanowej na wierzchu folii polaryzacyjnej. Patrząc pod mikroskop, umieść szkiełko mikroskopowe w polu view i wyreguluj soczewkę obiektywu tak, aby polaryzacja krzyżowa pozwalała na wizualizację kryształków lodu o wysokim kontraście. Podłącz kamerę do mikroskopu i dostosuj ustawienia do makro, aby umożliwić wyraźną wizualizację kryształków lodu i uchwycenie obrazu.

Powtórz te czynności dla wszystkich próbek. Zazwyczaj umieszcza się do sześciu szkiełek z inną próbką w komorze heksanu. Po zakończeniu wyłącz źródło światła.

Następnie umieść plastikową płytkę na kąpieli heksanowej, zapewniając szczelne uszczelnienie, i pozwól kryształkom lodu wyżarzać się przez noc. Po inkubacji uchwyć obrazy warstw lodu, tak jak wcześniej. Po aklimatyzacji tkanki roślinnej na zimno, jak poprzednio, zbierz około 100 do 150 gramów zmielonej biomasy w 20-mililitrowych probówkach.

Próbki należy natychmiast błyskawicznie zamrozić i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed użyciem. Przygotować próbkę jak poprzednio, stosując stosunek jeden do jednego do ponownego zawieszenia tkanki liścia. Stosować dodatkowe tabletki inhibitorów proteazy, aby uniknąć degradacji IBP przez endogenne proteazy.

Aby usunąć resztki komórkowe, przesiej lizat przez dwie warstwy gazy trzy razy. Osadzaj szczątki przez odwirowanie w temperaturze 30 000 razy G przez 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zwiększ objętość próbki do 120 mililitrów za pomocą natywnego bufora do ekstrakcji białek i natychmiast użyj lizadu do oczyszczenia powinowactwa do lodu, aby uniknąć utraty aktywności wiązania lodu.

Po schłodzeniu lodowego palca do minus 0,5 stopnia Celsjusza, zanurz go następnie w 50-mililitrowej rurce zawierającej zimną wodę destylowaną. Dodaj kilka kawałków lodu, aby ułatwić zarodkowanie lodu i pozwól, aby na palcu utworzyła się cienka warstwa lodu. Ten proces trwa zwykle od 20 do 30 minut.

Umieść próbkę w szklanej zlewce o pojemności 150 mililitrów zawierającej małe mieszadło magnetyczne, które umieszcza się w pojemniku z polistyrenu na mieszadle magnetycznym. Upewnij się, że palec lodowy jest wyśrodkowany i opuszczony co najmniej do połowy próbki cieczy. Następnie zamknij pojemnik.

Pozwól programowi działać przez około dwa dni, sprawdzając co 24 godziny. Gdy 50% próbki zostanie zamrożone, zatrzymaj program. Włączenie IBP do półkuli lodowej spowoduje wytrawienie lodu.

Aby usunąć półkulę lodu, rozgrzej sondę do czterech stopni Celsjusza. Następnie spłucz półkulę wodą destylowaną, aby usunąć niezwiązane białko i rozmrozić w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jeśli półkula lodowa nadal zawiera pigment lub aby zwiększyć oczyszczanie próbki, powtórz kroki oczyszczania dwa do trzech razy.

Pokazane tutaj są ekstrakty zebrane z kontroli buforowej pozbawionej IBP oraz ekstrakty z Arabidopsis thaliana typu dzikiego, które nie zawierają IBP. Po 18 godzinach kontrola buforowa i ekstrakty A.thaliana nie są w stanie ograniczyć wzrostu kryształków lodu. W przeciwieństwie do tego, małe kryształki lodu widoczne z ekstraktami transgenicznego A.thaliana wyrażającego IBP z aklimatyzowanego w zimnie Lolium perenne znacznie ograniczają wzrost kryształków lodu.

Po pierwszej rundzie oczyszczania, wysoki stopień wytrawienia lodu na powierzchni półkuli wskazuje, że IBP adsorbowały się do lodu i modyfikowały wzrost kryształków lodu. Aby usunąć dodatkowe substancje rozpuszczone, pigmenty i zanieczyszczające białka, zastosowano drugą rundę powinowactwa do lodu, co zaowocowało wyraźniejszą półkulą lodową. Po tej procedurze kształtowanie się lodu i histerezę termiczną można ocenić za pomocą nanolitrowego osmometru w celu dalszego scharakteryzowania białek wiążących lód.

Dodatkowo wyizolowane frakcje mogą być wysyłane do spektrometrii mas w celu identyfikacji sekwencji peptydowych.