Układ półkrtaniowy do badania drgań fałdów głosowych w trzech wymiarach
25 listopada 2017
Ten artykuł przedstawia protokół przygotowania próbek półkrtani, ułatwiający wielowymiarowy widok wibracji fałdów głosowych, w celu zbadania różnych biofizycznych aspektów produkcji głosu u ludzi i ssaków innych niż ludzie.
Aby zrozumieć, w jaki sposób powstaje głos u ludzi i ssaków, ważne jest zbadanie drgań fałdów głosowych. Ponieważ są one trudne do analizy wewnątrz organizmu, do uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat zachowania i właściwości fałdów głosowych wykorzystywano wycięte krtanie. W tym filmie demonstrujemy, jak przygotować tak zwany układ półkrtani.
Połowa krtani zostaje usunięta, aby umożliwić wizualizację drgań fałdów głosowych nie tylko z góry, ale także z boku. Jest to korzystne przy badaniu cech wibracyjnych, które pozostają niewidoczne w konwencjonalnym układzie z wykorzystaniem całej krtani. W niniejszej demonstracji zostanie użyta krtań jelenia szlachetnego.
Ponieważ wykorzystywane preparaty krtani są zazwyczaj szybko mrożone w ciekłym azocie i przechowywane w zamrażarce, konieczne jest prawidłowe rozmrożenie wybranego preparatu, aby nie zmienić biomechanicznych właściwości tkanki. Najpierw należy włożyć zamrożoną krtań do podwójnej torby autoklawowej lub dowolnej innej plastikowej torebki z wodoodpornym zamknięciem. Należy również dodać obciążnik, który pomoże utrzymać krtań pod powierzchnią wody.
Zamknij worek i umieść go w kąpieli wodnej o temperaturze około 30 °C, aż krtani zostanie całkowicie rozmrożona. Po całkowitym rozmrożeniu wyjmij krtań z worka i dokładnie oczyść ją roztworem soli fizjologicznej. W razie potrzeby usuń zbędne struktury, takie jak zewnętrzne mięśnie szyi lub kość gnykowa.
W przypadku niektórych pytań badawczych z zakresu bioakustyki struktury nadkrtaniowe mogą zostać pozostawione w całości, co jednak ogranicza widoczność fałdów głosowych od góry. Skrócić tchawicę do długości około 45 centymetrów, aby można było ją później wykorzystać do zamocowania krtani do rurki doprowadzającej powietrze. Przed przystąpieniem do preparacji zawsze należy sprawdzić krtań pod kątem potencjalnych anomalii tkankowych oraz sporadycznie pojawiających się pęknięć powstałych podczas procesu błyskawicznego zamrażania.
Kolejny etap polega na odsłonięciu jednej połowy chrząstki tarczoidalnej. Najpierw należy usunąć zewnętrzne mięśnie krtani za pomocą skalpela. Procedurę cięcia należy rozpocząć od wstępnego cięcia pionowego przez przednią część chrząstki tarczoidalnej.
Należy ostrożnie prowadzić cięcie bardziej w stronę strony, która ma zostać usunięta, aby uniknąć uszkodzenia fałdu głosowego, który musi zostać zachowany i zbadany. Jeśli chrząstka jest zbyt sztywna z powodu kostnienia, należy użyć małej piły. Następnie należy przeciąć chrząstkę pierścieniowatą w płaszczyźnie strzałkowej.
Wykonaj nacięcie wzdłużnie pomiędzy chrząstkami naleźnymi i zakończ je mniej więcej na poziomie poziomym dolnej wcięcia tarczycy. Połącz oba nacięcia, wykonując cięcie poziome zaczynające się od dolnego końca nacięcia pionowego w chrząstce pierśienowatej i prowadząc je w kierunku dolnego wcięcia tarczycy. Odchyl stronę krtani, która ma zostać usunięta, w stronę przednią i wykonaj pionowe cięcie przez tkankę miękką po wewnętrznej stronie chrząstki tarczycy.
Jest to najważniejszy moment całej procedury. Należy zatem zachować najwyższą ostrożność podczas wykonywania nacięcia od przedniego przyczepu fałdów głosowych do chrząstki tarczycawej. Jeśli chrząstka tarczyczawej zostanie prawidłowo przecięta, w powstałej głośni zawsze pojawi się niewielka szczelina przednia.
Aby odsłonić fałdy głosowe i uzyskać dobry widok od strony górnej, czasami przydatne jest usunięcie również struktur znajdujących się powyżej fałdów głosowych. W niektórych przypadkach wewnętrzne miękkie tkanki krtani tracą połączenie z chrząstką tarczową po procedurze cięcia i przeszkadzają w dostępie do fałdu głosowego. W takiej sytuacji usunięcie tej zbędnej tkanki jest nieuniknione.
Na koniec usuń niewielką część tylnej części chrząstki tarczowatej, aby ułatwić przyprzywodzenie fałdów głosowych poprzez chrząstki przysadkowe. Krtań posiada teraz gniazdo w kształcie litery L, dopasowane do L-kształtnego układu płyty klasyfikacyjnej wykorzystanego w zestawieniu. Lewa strona półkrtań zapewnia widok przyśrodkowy, w którym widoczne są nacięcia w chrząstce tarczowatej i pierścieniowatej wraz z pozostałym fałdem głosowym i chrząstką przysadkową.
Układ doświadczalny dla półkrtani składa się z trzech podstawowych elementów. Rurka doprowadzająca powietrze, która dostarcza ogrzane i nawilżone powietrze do krtani. Następnie dwie przezroczyste płytki jako zamiennik usuniętych części krtani oraz trzpienie służące do przywodzenia badanej fałdy głosowej i stabilizacji krtani.
Teraz zamocujemy krtań na rurce doprowadzającej powietrze. Pokrywamy rurkę kremem do mocowania protez i montujemy krtań, wykorzystując jej tchawicę. Krem do mocowania protez pełni rolę kleju i uszczelnia ewentualne szczeliny.
Zabeziecz tchawicę plastikową opaską zaciskową lub innym odpowiednim zaciskiem. Pokryj również krawędzie cięcia kremem do mocowania protez i przymocuj przezroczyste płytki. Stabilizuj chrząstkę tarczową i przywiedź fałd głosowy za pomocą wypustek.
Na tym etapie zestaw półkrtaniowy jest gotowy do użycia. Włącz przepływ powietrza i sprawdź, czy nie występują żadne nieszczelności. Jeśli powietrze ucieka bokiem, uszczelnij przerwy, dodając więcej kremu utrwalającego.
Aby obserwować drgania fałdów głosowych w czasie rzeczywistym, można zastosować światło stroboskopowe. Głównym zastosowaniem zestawu z półkrtanią jest obserwacja drgań fałdów głosowych nie tylko od góry, ale również z boku. W tym celu wykorzystuje się dwie zsynchronizowane szybkoklatkowe kamery wideo.
Jedna dla widoku z góry i jedna dla widoku z boku. Tutaj widzimy wibracje fałdów głosowych półkrtani zarejestrowane przez dwie zsynchronizowane kamery pracujące z częstotliwością 6 000 klatek na sekundę. Lewy panel przedstawia widok z góry, a prawy panel widok z boku.
Fałda głosowa drga z częstotliwością około 70 cykli na sekundę, a zarejestrowane nagrania wideo są tutaj przedstawione w zwolnionym tempie. Przestrzeń między fałdą głosową a płytką szklaną nazywana jest głośnią. Można ją ilościowo określić, mierząc zmianę jej powierzchni w czasie.
W tym przypadku obszar głośni jest wyrażony w pikselach. Przyjmuje on wartość zero, gdy fałd głosowy styka się z płytką szklaną, i wartość różną od zera, gdy powietrze przepływa przez głośnię. Analiza sygnału akustycznego wynikającego z procesu drgań fałdów głosowych w półkrtani wykazuje, że główne zdarzenia wzbudzenia akustycznego występują w dwóch momentach podczas cyklu drgań.
W momencie otwarcia głośni, gdy fałd głosowy traci kontakt z płytą szklaną, oraz w momencie zamknięcia głośni, gdy fałd głosowy ponownie osiąga pełny kontakt z płytą szklaną. W następnej animacji pokazano w kolorze pomarańczowym zmieniającą się w czasie powierzchnię kontaktu fałdu głosowego z płytą szklaną dla jednego cyklu drgań. W tym przypadku zestawienie półkrtani służy do walidacji metody zwanej elektroglottografią lub EGG.
Jednocześnie zarejestrowany sygnał EGG przedstawiono tutaj w kolorze niebieskim. Występuje dość dobra korelacja między powierzchnią kontaktu fałdów głosowych a sygnałem EGG. Zostało to szczegółowo udokumentowane w niedawnej publikacji naszej grupy.
W ostatniej sekcji tego filmu przedstawiamy nową metodę trójwymiarowej oceny drgań fałdów głosowych, zwaną chemograficzną analizą ruchu głośni. W cyfrowym chemogramie informacje obrazowe znajdujące się wzdłuż jednej linii w filmie wysokiej rozdzielczości są analizowane dla każdej klatki wideo i nanoszone na wykres od lewej do prawej strony. Powstały chemogram ukazuje ruch struktury fałdów głosowych wzdłuż linii skanowania w funkcji czasu.
Chemogramy generowane są zarówno dla widoku z góry, jak i z boku, przy czym linie skanowania chemograficznego są umieszczone dokładnie w połowie długości fałdy głosowej. Śledzony jest przesunięcie czasowe krawędzi fałdy głosowej. Jasnoniebieski wykres przedstawia odchylenie boczne fałdy głosowej, a wykresy czerwony i zielony przedstawiają odpowiednio odchylenie pionowe dolnej i górnej krawędzi fałdy głosowej.
Otrzymane informacje można połączyć, aby stworzyć animację przedstawiającą dwuwymiarowy ruch głośni widziany w linii środkowej. W tym filmie przedstawiliśmy instruktaż dotyczący przygotowania modelu półgardła. Zaprezentowaliśmy potencjalne zastosowania w ocenie drgań fałdów głosowych nie tylko z góry, ale również z boku, co dostarcza kluczowych danych empirycznych służących lepszemu zrozumieniu istotnego aspektu generowania głosu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia protokół przygotowania preparatów połowy krtani, umożliwiający wielowymiarową obserwację wibracji fałdów głosowych. Podejście to pozwala na badanie różnych aspektów biofizycznych produkcji głosu u ludzi oraz ssaków innych niż człowiek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Wokalizacja
Wstęp
- Zrozumienie drgań fałdów głosowych jest kluczowe dla badania procesu produkcji głosu.
- Wypreparowane krtanie pozwalają na szczegółową analizę zachowania fałdów głosowych.
- Konwencjonalne układy mogą maskować istotne cechy drgań.
- Układy z półkrtanią umożliwiają wizualizację pod wieloma kątami.
Cel badania
- Opracowanie protokołu przygotowania półkrtani.
- Pogłębienie zrozumienia wibracji fałdów głosowych.
- Ułatwienie badań porównawczych między ludźmi a ssakami innymi niż człowiek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie preparatów półkrtani.
- Wizualizacja drgań fałdów głosowych z góry oraz z boku.
- Wykorzystanie krtani jelenia szlachetnego do celów demonstracyjnych.
- Analiza cech wibracyjnych w kontrolowanym układzie.
Główne wyniki
- Układ pół-krtani zapewnia wyraźniejszy wgląd w dynamikę fałdów głosowych.
- Można zaobserwować kluczowe cechy wibracyjne, które są niewidoczne w układach z pełną krtanią.
- Metoda ta zwiększa zrozumienie mechanizmów produkcji głosu.
- Wyniki mogą być zastosowane zarówno w badaniach nad głosem ludzkim, jak i nie-ludzkim.
Wnioski
- Preparat półkrtani jest cennym narzędziem w badaniach nad fałdami głosowymi.
- Podejście to może prowadzić do nowych spostrzeżeń w zakresie mechanizmu powstawania głosu.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do analiz porównawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie biomechaniki fałdów głosowych jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celu w opracowywaniu terapii związanych z głosem, szczególnie w przypadku zaburzeń obejmujących kontrolę nerwowo-mięśniową lub elastyczność tkanek. Układ półkrtani umożliwia trójwymiarową obserwację dynamiki drgań, dostarczając ilościowych i powtarzalnych danych, które wspierają mechanistyczną minimalizację ryzyka w modelach przedklinicznych. Podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną poprzez powiązanie obserwacji strukturalnych z wynikami funkcjonalnymi, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) we wczesnych etapach procesów odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów drgań fałdów głosowych w kontrolowanych warunkach fizjologicznych, co wspiera weryfikację postawionych hipotez.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny model z wyekcyzowanej tkanki do oceny właściwości biomechanicznych tkanki fałdów głosowych.
- Wartość translacyjna: Ułatwia porównania międzygatunkowe, pomagając w wyborze odpowiednich modeli przedklinicznych dla zaburzeń głosu u ludzi.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne wyniki, takie jak powierzchnia szczeliny głośniowej i powierzchnia kontaktu w czasie, co umożliwia obiektywną ocenę funkcji wibracyjnej.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację analizy poprzez zsynchronizowane obrazowanie o wysokiej szybkości oraz określone procedury mocowania.
- Wartość translacyjna: Pozwala na uzyskanie powtarzalnych zbiorów danych pod wieloma kątami, które nadają się do przesiewowej oceny interwencji wpływających na dynamikę fałdów głosowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na walidację biomarkerów zastępczych, takich jak elektroglotografia (EGG), poprzez korelację wzorców wibracji z sygnałami elektrycznymi.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużną ocenę odpowiedzi tkankowej na manipulacje farmakologiczne lub genetyczne w preparatach wyciętych.
- Wartość translacyjna: Łączy wyniki ex vivo z funkcją in vivo poprzez szczegółową analizę ruchu, wspierając modelowanie predykcyjne.
Integracja potoków i przepływów pracy
Układ półgardła (hemi-larynx) integruje się z wczesnymi procesami badawczymi jako narzędzie do przesiewowego badania fenotypowego celów związanych z głosem, dostarczając odczytów mechanistycznych, które wspierają identyfikację wiodących związków i rozwój przedkliniczny.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących biomechaniki fałdów głosowych, umożliwiając bezpośrednią obserwację zachowania oscylacyjnego pod wpływem stymulacji przepływem powietrza.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowane, ilościowe parametry wibracyjne (np. pole powierzchni gerdła, czas kontaktu), niezbędne do porównywania warunków eksperymentalnych.
- Analityka: Umożliwia chemograficzną analizę ruchu gerdła, syntetyzując wielowymiarowe dane o wibracjach w analizowalne wzorce czasoprzestrzenne.
- Badania translacyjne: Łączy profile wibracyjne ex vivo z potencjalnymi biomarkerami klinicznymi poprzez korelację z sygnałami elektroglottograficznymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny funkcji fałdów głosowych u różnych gatunków, dla różnych związków i modeli chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach produkcji głosu poprzez ujawnienie ukrytych cech wibracyjnych, które są niewidoczne w konwencjonalnych układach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom rozmrażania, montażu i obrazowania z wykorzystaniem synchronizowanego rejestrowania wysokiej prędkości.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność decyzji typu go/no-go poprzez dostarczenie empirycznych, wielowymiarowych danych na temat oddziaływania na cel i reakcji tkanki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów ukierunkowanych na głos z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną aktywność biomechaniczną.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w technikach sekcji oraz histologicznej identyfikacji struktur krtani, takich jak chrząstka tarczowata i pierścieniowata.
- Zależny od dostępu do łaźni wodnych z kontrolą temperatury, precyzyjnych narzędzi tnących (skalpele, piły) oraz sprzętu montażowego (rurki tchawicze, płytki, trzpienie).
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów przygotowania w celu zminimalizowania degradacji tkanek i zapewnienia spójnych właściwości biomechanicznych we wszystkich preparatach.
- Wymaga dostosowania systemów obrazowania do zsynchronizowanego zapisu wideo o wysokiej prędkości w dwóch widokach, z wystarczającą liczbą klatek na sekundę (np. 6,000 fps), aby zarejestrować szybkie oscylacje fałdów głosowych.
- Ograniczony przez żywotność tkanki po rozmrożeniu, co wymusza niezwłoczne przeprowadzenie eksperymentów w celu zachowania naturalnych właściwości wiskoelastycznych tkanki fałdów głosowych.
