Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest charakterystyka progenitorów krwiotwórczych worka żółtkowego oraz ich potomstwa in vivo przy użyciu systemu mapowania losów indukowanego tamoksyfenem u myszy oraz cytometrii przepływowej. Może to pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii dotyczące rozwoju i różnicowania progenitorów krwiotwórczych, które są odrębne od macierzystych komórek krwiotwórczych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość monitorowania w okresie rozwoju i w wieku dorosłym progenitorów krwiotwórczych oznakowanych w ograniczonym oknie czasowym oraz ich potomstwa, takiego jak makrofagi rezydentne.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na niewielką liczbę komórek w tkance embrionalnej oraz dużą objętość próbek poddawanych jednoczesnej obróbce. Aby rozpocząć eksperyment, należy najpierw przenieść wypreparowane rogi macicy myszy do szalki Petriego o średnicy 10 mm wypełnionej około 30 ml lodowatego PBS. Następnie należy chwycić warstwy mięśniowe macicy na końcu szyjkowym rogu i wsunąć precyzyjne nożyczki pomiędzy warstwę mięśniową a tkankę decydualną, aby uwolnić embriony.

Następnie za pomocą precyzyjnej pęsety należy usunąć błonę Reicherta oraz łożysko. Ostrożnie wypreparować worek żółtkowy i przenieść go do 24-dołkowej płytki hodowlanej wypełnionej 0,5 milliliters roztworu trawiennego. Po odcięciu naczyń pępowinowych i witelinowych natychmiast przenieść embrion do 12-dołkowej płytki hodowlanej wypełnionej 2 milliliters 10 millimolar lodowatego EDTA.

Po odcięciu głowy od zarodka za pomocą ostrych, precyzyjnych nożyczek, należy inkubować ciało i głowę w lodzie od 10 do 15 minut, a następnie wyjąć zarodek i zebrać krew zawierającą EDTA. Następnie należy usunąć otaczający zarodek błon owodniowy. Po tym zabiegu należy odciąć kończyny tylne oraz kończyny obce od zarodka.

Za pomocą pęsety precyzyjnej otwórz klatkę piersiową. Następnie chwyć przednią część serca i delikatnie odciągnij tkankę, jednocześnie uwalniając narządy wewnętrzne z ciała za pomocą drugiej pęsety. Pod mikroskopem stereoskopowym oddziel wątrobę płodową od serca i jelit.

Następnie przenieś organ na płytkę 24-dołkową wypełnioną 0,5 ml roztworu trawiennego. Połączenie anatomiczne z układem sercowo-naczyniowym jest kluczowe dla identyfikacji wątroby płodowej. Wątroba płodowa znajduje się wciąż na tym etapie rozwoju i im młodsze są embriony, tym trudniejsza może być sekcja.

Aby przygotować pierwotne zawiesiny komórek, inkubować zebrane organy w roztworze trawiennym w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przenieść tkankę w roztworze enzymatycznym na sito o oczkach 10 µm umieszczone nad jednym dołkiem sześciodołkowej płytki hodowlanej wypełnionej 1 mL buforu FACS. Użyć czarnego gumowego tłoka z strzykawki 2 mm, aby rozdzielić tkankę poprzez delikatne rozcieranie w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.

Następnie odessać zawiesinę komórkową za pomocą pipety Pasteura i przenieść ją do probówki o pojemności 15 ml. Wirować zawiesinę przy 320 ×g w temperaturze 4 °C przez 7 minut. Po wirowaniu odessać i usunąć nadosad.

Następnie należy przygotować świeży bufor blokujący Fc i resuspendować osad w 60 µl. Potem należy przenieść 50 µl zawiesiny pojedynczych komórek do dołka płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie. Płytkę należy inkubować na lodzie przez co najmniej 15 minut.

Następnie przenieś pozostałe 10 µL zawiesiny do polistyrenowej probówki FACS o pojemności 5 mL, aby uzyskać pulę próbek pochodzących z różnych tkanek. Przenieś 50 µL z tej puli na 96-dołkową płytkę w celu przygotowania kontroli FMO dla każdego fluorochromu. Aby przystąpić do barwienia antygenów powierzchniowych, użyj zestawu sześciu przeciwciał znakowanych fluorochromami do przygotowania roztworu przeciwciał oraz buforu FACS.

Następnie przygotować sześć roztworów przeciwciał oraz bufor FACS wykorzystywany do barwienia kontrolnego FMO. Po tym czasie dodać 50 µL roztworów przeciwciał do próbek w 96-dołkowej płytce wielodołkowej. Próbki wymieszać poprzez delikatne dwukrotne pipetowanie, a następnie inkubować płytkę na lodzie przez 30 minut.

Odwiruj płytkę 96-dołkową z siłą 320 ×g w temperaturze 4 °C przez 7 minut i usuń nadosad. Przemyj komórki 200 µL buforu FACS i ponownie odwiruj płytkę. Należy zachować szczególną ostrożność podczas usuwania nadosadu poprzez odwrócenie płytki.

Płytkę 96-dołkową należy odwrócić jednym szybkim ruchem nadgarstka, aby uniknąć odklejenia się komórek. Na koniec, używając sitka o oczkach 70 µm, należy przefiltrować próbki tkanek i kontrolne do polistyrenowych probówek o średnicy 6 mm. Teraz można przeprowadzić analizę cytometryczną.

Populację żywych, nieerytrocytarnych pojedynczych komórek przeanalizowano pod kątem ekspresji markera progenitorów KIT oraz markera komórek hematopoetycznych CD45. W obrębie docelowej populacji wyróżniono trzy różne subpopulacje komórek: KIT-dodatnie CD45-ujemne, KIT-dodatnie CD45-niskie oraz KIT-ujemne CD45-dodatnie.

Wśród progenitorów dodatnich pod względem kit z worka żółtkowego, zarówno populacje komórek CD45 ujemnych, jak i CD45 niskich zawierały komórki AA4.1 dodatnie wykazujące ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego (YFP), co wskazuje, że niedojrzałe progenitory KIT dodatnie najpierw wykazują ekspresję AA4.1 niezależnie od ekspresji CD45. Komórki AA4.1 dodatnie i YFP dodatnie w wątrobie oraz mózgu znaleziono wyłącznie w populacji progenitorów KIT dodatnich i CD45 niskich, co najprawdopodobniej odpowiada krążącym progenitorom pochodzącym z progenitorów worka żółtkowego. Makrofagi znaleziono w populacji kit ujemnej i CD45 dodatniej, a zidentyfikowano je jako komórki F480 jasne i CD11 B dodatnie.

Makrofagi w worku żółtkowym, wątrobie i mózgu zostały efektywnie oznakowane poprzez jednorazowe podanie 4-hydroksytamoksifenu, co może wskazywać na ich pochodzenie z ENP. Po opanowaniu techniki, procedura izolacji i barwienia komórek może zostać wykonana w ciągu trzech do czterech godzin, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby próbki zawsze przechowywać w lodzie niezwłocznie po ich pobraniu.

Świeże bufory do FACS należy przygotowywać codziennie i filtrować. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne linie reporterowe mash lub linie flux, takie jak Rosa MTMG lub Rosa confetti, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące potencjału dedyferencjacji i fazy proto komórek po znakowaniu.