Name: Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę wymazów z zbiorników i analizy osadu do wykrywania patogenów w systemach danio pręgowanego. Technika ta zwiększa skuteczność detekcji Mycobacterium spp., Aeromonas hydrophila i jaj P. tomentosa, wspierając biobezpieczeństwo obiektów akwariowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować zespołowi BRF Aquatics z Francis Crick Institute za ich pomoc techniczną i krytyczny wkład. Prace te były wspierane przez Francis Crick Institute, który otrzymuje podstawowe fundusze od Cancer Research UK (FC001999), UK Medical Research Council (FC001999) i Wellcome Trust (FC001999).

1. Ekspozycja strażników filtracji wstępnej z systemu recyrkulacyjnego
<ol>
	<li>Wyjmij czysty zbiornik o pojemności 8 l z systemu recyrkulacji. Napełnij go wodą pochodzącą ze studzienek. Dodaj 2 ceramiczne kulki lub kostki gąbki z biopożywkami z systemów do przesiewania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Dodać 1 - 2 D. rerio/L (tj. 12 ryb). W obiekcie należy używać ryb typu dzikiego o dominującym tle genetycznym, na przykład AB.
	<ol>
		<li>Wybierz co najmniej 6 ryb w następujący sposób: co najmniej jedną samicę i jednego samca w wieku poniżej 6 miesięcy, jedną samicę i jednego samca w wieku od 6 do 18 miesięcy oraz jedną samicę i jednego samca w wieku powyżej 18 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Karm raz dziennie. Zmieniaj diety (np. sucha dieta, krewetki solankowe), aby upewnić się, że wartowniki są narażone na wszystkie diety stosowane w obiekcie dla danio pręgowanego. Zmieniaj wodę w poniedziałki, środy i piątki, tj. trzy razy w tygodniu przez 4 miesiące.
	<ol>
		<li>Aby przeprowadzić wymianę wody, przenieś wartowniki i biomedia do tymczasowego zbiornika. Całkowicie opróżnij zbiornik wartowniczy i wyczyść go. Napełnij zbiornik wartowniczy tylko wodą ze studzienki. Odłóż z powrotem strażników i biomedia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wystaw wartowniki na 4 miesiące, aby zebrać wodę. Rybę należy poddać eutanazji za pomocą zatwierdzonej metody, takiej jak zanurzenie w roztworze 2-fenoksyetanolu (3 ml/l) roztworu dla przedawkowania.</li>
	<li>Aby potwierdzić zgon, odczekaj 10 minut po ustaniu ruchu wieczka.
	<ol>
		<li>Chwycić zwłoki kleszczami i zamrozić je w całości w temperaturze -80 °C w oznaczonym pojemniku. Będzie to używane dla PCR12,15.</li>
		<li>Alternatywnie, odetnij ogon na szypułce ogonowej, nacinaj ścianę brzucha i ustaw w 4% formalinie. 
		UWAGA: Do histopatologii używać rękawiczek i dygestoriów. Oznacz pojemnik na próbkę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wymazy z miski olejowej
<ol>
	<li>Użyj sterylnego suchego wacika z plastikowym trzonkiem. Nosić rękawice. Zlokalizuj powierzchnię do wymazu (ściana studzienki na powierzchni wody) i usuń wszelkie przedmioty uniemożliwiające łatwy dostęp do powierzchni. Wybierz powierzchnię studzienki o niskim przepływie.</li>
	<li>Wyjmij wacik, zdejmując opakowanie zewnętrzne i wystawij sterylną bawełnianą końcówkę na działanie powietrza. Unikaj zanieczyszczenia krzyżowego wacika, uważając, aby nie dotykać nieprzetestowanych powierzchni.
	<ol>
		<li>Przetrzyj ścianę studzienki na głębokości 5 - 10 cm, aby wchłonąć wodę i biofilm na poziomie powierzchni studzienki.</li>
		<li>Schowaj wacik z powrotem lub wbij końcówkę do sterylnej probówki wirówkowej. Oznaczyć próbkę i wysłać do testu PCR lub zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wykrywanie jaj P. tomentosa na dnie zbiornika
<ol>
	<li>Analiza osadu za pomocą mikroskopii
	<ol>
		<li>Użyj strzykawki o pojemności 60 ml9, aby zassać szlam na dnie studzienki lub dowolnego zbiornika, w którym znajdują się ryby, w tym wartowniki. Podzielić próbkę na probówki o pojemności 15 ml. Zamknij rurki zakrętkami i oznacz rurki.</li>
		<li>Przygotować roztwór nasycony cukrem (ciężar właściwy = 1,27), mieszając 227 g cukru pudru w 177 ml gorącej wody za pomocą mieszadła magnetycznego14.</li>
		<li>Odwirować probówki o pojemności 15 ml przy 175 - 250 x g przez 10 minut w wirówce z odchylanymi wiadrami. Zdekantować probówki i zatrzymać osad w ich probówce.</li>
		<li>Napełnij probówki do połowy roztworem nasyconym cukrem. Zamknij probówki zakrętką i dokładnie wymieszaj osad z roztworem.</li>
		<li>Umieść probówki w obrotowych wiadrach wirówki i napełnij je roztworem nasyconym cukrem do góry. Delikatnie umieść jedną szklankę nakrywkową na wierzchu każdej probówki i w kontakcie z roztworem nasyconym cukrem.</li>
		<li>Wirować przy 175 - 250 x g przez 10 minut. Należy pamiętać, że niektóre szkła nakrywkowe mogą spaść i pęknąć podczas wirowania, dlatego na każde 60 ml próbki przypadają 4 probówki. Podnieś szklankę nakrywkową i umieść ją na szkiełku podstawowym. Oznacz slajd ołówkiem lub markerem.
		<ol>
			<li>W przypadku wystąpienia zbyt wielu pęknięć szkła nakrywkowego, napełnij większą część probówki roztworem nasyconym cukrem, odwiruj przy 175 - 250 x g przez 10 minut, napełnij do góry roztworem nasyconym cukrem, a następnie delikatnie ustaw szkło nakrywkowe. Poczekaj 30 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Poszukaj jaj P. tomentosa za pomocą mikroskopu13 (Rysunek 2 i Wideo 1). Zidentyfikuj wtyki bipolarne w powiększeniu 400X6. 
		UWAGA: Rozmiar jaj to 57 - 78 μm długości i 27 - 39 μm średnicy16,17. Należy pamiętać, że wystarczy jeden dodatni preparat, aby próbka o objętości 60 ml została uznana za pozytywną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania przesiewowe przywożonych zwierząt poddanych kwarantannie na obecność jaj P. tomentosa
	<ol>
		<li>Umieść samca i samicę D. rerio w zbiorniku. Dodaj do zbiornika urządzenie zwykle używane do zbierania i przechowywania ikry tarłowej, ale użyj go tutaj do zbierania kału (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
		UWAGA: Na przykład pełny zbiornik hodowlany o pojemności 1 litra (zbiornik zewnętrzny i zbiornik wewnętrzny z kratowanym dnem) jest całkowicie zanurzony w zbiorniku o pojemności 13 litrów, co umożliwia rybom swobodny dostęp do wchodzenia i wychodzenia z urządzenia hodowlanego.</li>
		<li>Po tygodniu wyjąć urządzenie hodowlane i zebrać zebrany osad w urządzeniu hodowlanym zgodnie z opisem w kroku 3.1 "analiza osadu pod mikroskopem".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. PCR na osad osadowy
<ol>
	<li>Odessać osad z dna zbiornika lub studzienki za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml9 i przenieść próbkę do probówki o pojemności 60 ml. Zamknij rurkę zakrętką i oznacz rurkę. Wyrzucić strzykawkę.</li>
	<li>Wstrząśnij probówką o pojemności 60 ml i przenieś 15 ml do probówki o pojemności 15 ml. Zamknij rurkę zakrętką i oznacz rurkę.</li>
	<li>Odwirować probówkę o pojemności 15 ml przy 175 - 250 x g przez 10 minut w wirówce z odchylanymi wiadrami. Zdekantować probówki i utrzymać osad w probówce.</li>
	<li>Wyjmij wacik, zdejmując opakowanie zewnętrzne i wystawij sterylną bawełnianą końcówkę na działanie powietrza. Unikaj zanieczyszczenia krzyżowego wacika, uważając, aby nie dotykać nieprzetestowanych powierzchni.
	<ol>
		<li>Wytrzyj osad w probówce przez 15 sekund.</li>
		<li>Schowaj wacik z powrotem lub wbij końcówkę do sterylnej probówki wirówkowej. Oznaczyć próbkę, zamrozić w temperaturze -80 °C i wysłać do testu PCR. 
		UWAGA: W probówce o pojemności 60 ml pozostało 45 ml. Można je przechowywać w celu wykrycia jaj P. tomentosa za pomocą analizy osadu pod mikroskopem, jak opisano w kroku 3.1, na przykład w celu potwierdzenia wyniku PCR. Test PCR w osadzie można przeprowadzić w celu przeprowadzenia badań przesiewowych importowanych zwierząt zgodnie z krokiem 3.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schroeder, P., Mocho, J. P. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/313035049_A_veterinary_perspective_on_laboratory_zebrafish_welfare">A veterinary perspective on laboratory zebrafish welfare.</a> Fish Veterinary Journal. 14, 37-46 (2014).</li>
<li>Mason, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+Mitigate+a+Mycobacterium+marinum+Outbreak+in+a+Zebrafish+Research+Facility%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Strategies to Mitigate a Mycobacterium marinum Outbreak in a Zebrafish Research Facility.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 77-87 (2016).</li>
<li>Barton, C. L., Johnson, E. W., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facility+Design+and+Health+Management+Program+at+the+Sinnhuber+Aquatic+Research+Laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Facility Design and Health Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 39-43 (2016).</li>
<li>Borges, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+Zebrafish+Health+Program+in+a+Research+Facility%3A+A+4-Year+Retrospective+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Implementation of a Zebrafish Health Program in a Research Facility: A 4-Year Retrospective Study.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 115-126 (2016).</li>
<li>Collymore, C., Crim, M. J., Lieggi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+Health+Monitoring+and+Reporting+for+Zebrafish+Research+Facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Recommendations for Health Monitoring and Reporting for Zebrafish Research Facilities.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 138-148 (2016).</li>
<li>Geisler, R., Borel, N., Ferg, M., Maier, J. V., Strähle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+Zebrafish+Lines+at+the+European+Zebrafish+Resource+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Maintenance of Zebrafish Lines at the European Zebrafish Resource Center.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 19-23 (2016).</li>
<li>Liu, L., Pan, L., Li, K., Zhang, Y., Zhu, Z., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Health+Conditions+in+the+China+Zebrafish+Resource+Center+and+20+Major+Chinese+Zebrafish+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Health Conditions in the China Zebrafish Resource Center and 20 Major Chinese Zebrafish Laboratories.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 8-18 (2016).</li>
<li>Martins, S., Monteiro, J. F., Vito, M., Weintraub, D., Almeida, J., Certal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+Integrated+Zebrafish+Health+Management+Program+Supporting+Cancer+and+Neuroscience+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Toward an Integrated Zebrafish Health Management Program Supporting Cancer and Neuroscience Research.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 47-55 (2016).</li>
<li>Mocho, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Screen%3A+A+Comprehensive+Approach+to+the+Health+Monitoring+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Screen: A Comprehensive Approach to the Health Monitoring of Zebrafish.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 132-137 (2016).</li>
<li>Murray, K. N., Varga, Z. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosecurity+and+Health+Monitoring+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Biosecurity and Health Monitoring at the Zebrafish International Resource Center.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 30-38 (2016).</li>
<li>Legendre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RESAMA%3A+A+Network+for+Monitoring+Health+and+Husbandry+Practices+in+Aquatic+Research+Facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">RESAMA: A Network for Monitoring Health and Husbandry Practices in Aquatic Research Facilities.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 56-65 (2016).</li>
<li>Whipps, C. M., Matthews, J. L., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+genetic+characterization+of+Mycobacterium+chelonae+in+laboratory+zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Aquat+Organ%22%5BJournal%5D)">Distribution and genetic characterization of Mycobacterium chelonae in laboratory zebrafish Danio rerio.</a> Dis Aquat Organ. 82 (1), 45-54 (2008).</li>
<li>Murray, K. N., Peterson, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+in+practice.+P.+tomentosa+infection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Vet+Med+Assoc%22%5BJournal%5D)">Pathology in practice. P. tomentosa infection in zebrafish.</a> J Am Vet Med Assoc. 246 (2), 201-203 (2015).</li>
<li>Foreyt, W. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForeyt%2C+WJ+%22Veterinary+Parasitology+Reference+Manual%22">Veterinary Parasitology Reference Manual</a>. , 5th Edition, Wiley-Blackwell. Ames, IA. (2001).</li>
<li>Whipps, C. M., Lieggi, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteriosis+in+zebrafish+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Mycobacteriosis in zebrafish colonies.</a> ILAR J. 53 (2), 95-105 (2012).</li>
<li>Kent, M. L., Bishop-Stewart, J. K., Matthews, J. L., Spitsbergen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudocapillaria+tomentosa%2C+a+nematode+pathogen%2C+and+associated+neoplasms+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+kept+in+research+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Pseudocapillaria tomentosa, a nematode pathogen, and associated neoplasms of zebrafish (Danio rerio) kept in research colonies.</a> Comp Med. 52 (4), 354-358 (2002).</li>
<li>Moravec, F. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201302126899">Observations on the bionomy of the nematode Pseudocapillaria brevispicula (Linstow, 1873).</a> Folia Parasitol. 30, 229-241 (1983).</li>
<li>Ramsay, J. M., Watral, V., Schreck, C. B., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudoloma+neurophilia+infections+in+zebrafish+Danio+rerio%3A+effects+of+stress+on+survival%2C+growth%2C+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Aquat+Organ%22%5BJournal%5D)">Pseudoloma neurophilia infections in zebrafish Danio rerio: effects of stress on survival, growth, and reproduction.</a> Dis Aquat Organ. 88 (1), 69-84 (2009).</li>
<li>Watral, V., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Mycobacterium+spp.+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+from+research+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Mycobacterium spp. in zebrafish (Danio rerio) from research facilities.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 145, 55-60 (2007).</li>
<li>Whipps, C. M., Dougan, S. T., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+haemophilum+infections+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+in+research+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium haemophilum infections of zebrafish (Danio rerio) in research facilities.</a> FEMS Microbiol Lett. 270, 21-26 (2007).</li>
<li>Chow, F. W., Xue, L., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+study+of+the+prevalence+of+Pseudoloma+neurophilia+shows+male+sex+bias+in+zebrafish+Danio+rerio+%28Hamilton-Buchanan%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Dis%22%5BJournal%5D)">Retrospective study of the prevalence of Pseudoloma neurophilia shows male sex bias in zebrafish Danio rerio (Hamilton-Buchanan).</a> J Fish Dis. 39 (3), 367-370 (2016).</li>
<li>Murray, K. N., Bauer, J., Tallen, A., Matthews, J. L., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+management+of+asymptomatic+Mycobacterium+infections+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization and management of asymptomatic Mycobacterium infections at the Zebrafish International Resource Center.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 675-679 (2011).</li>
<li>Crim, M. J., Lawrence, C., Livingston, R. S., Rakitin, A., Hurley, S. J., Riley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Antemortem+and+Environmental+Samples+for+Zebrafish+Health+Monitoring+and+Quarantine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of Antemortem and Environmental Samples for Zebrafish Health Monitoring and Quarantine.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. , (2017).</li>
<li>Jensen, E. S., Allen, K. P., Henderson, K. S., Szabo, A., Thulin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+testing+of+a+ventilated+caging+system+to+detect+murine+fur+mites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">PCR testing of a ventilated caging system to detect murine fur mites.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (1), 28-33 (2013).</li>
<li>Commission Regulation (EC) No 1168/2006 of 31 July 2006 implementing Regulation (EC) No 2160/2003 as regards a Community target for the reduction of the prevalence of certain salmonella serotypes in laying hens of Gallus gallus and amending Regulation (EC) No 1003/2005 (Text with EEA relevance). OJ. L. 211, 4-8 (2006).</li>
<li>Chang, C. T., Colicino, E. G., DiPaola, E. J., Al-Hasnawi, H. J., Whipps, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+effectiveness+of+common+disinfectants+at+preventing+the+propagation+of+Mycobacterium+spp.+isolated+from+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluating the effectiveness of common disinfectants at preventing the propagation of Mycobacterium spp. isolated from zebrafish.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 45-50 (2015).</li>
<li>Le Dantec, C., Duguet, J. P., Montiel, A., Dumoutier, N., Dubrou, S., Vincent, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine+disinfection+of+atypical+mycobacteria+isolated+from+a+water+distribution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlorine disinfection of atypical mycobacteria isolated from a water distribution system.</a> Appl Environ Microbiol. 68 (3), 1025-1032 (2002).</li>
<li>Goto, K., Hayashimoto, N., Ishida, T., Takakura, A., Kagiyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+trial+in+the+developmental+phase+of+the+%26%2334%3Bperformance+evaluation+program%26%2334%3B+based+on+the+ICLAS+animal+quality+network+program%3A+self-assessment+of+microbiological+monitoring+methods+using+test+samples+supplied+by+ICLAS%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">First trial in the developmental phase of the &#34;performance evaluation program&#34; based on the ICLAS animal quality network program: self-assessment of microbiological monitoring methods using test samples supplied by ICLAS.</a> Exp Anim. 58 (1), 47-52 (2009).</li>
<li>Nogueira, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+saopaulense+sp.+nov.%2C+a+rapidly+growing+mycobacterium+closely+related+to+members+of+the+Mycobacterium+chelonae--Mycobacterium+abscessus+group%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Evol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium saopaulense sp. nov., a rapidly growing mycobacterium closely related to members of the Mycobacterium chelonae--Mycobacterium abscessus group.</a> Int J Syst Evol Microbiol. 65 (12), 4403-4409 (2015).</li>
<li>Massa, S., Armuzzi, R., Tosques, M., Canganella, F., Trovatelli, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Note%3A+susceptibility+to+chlorine+of+Aeromonas+hydrophila+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Note: susceptibility to chlorine of Aeromonas hydrophila strains.</a> J Appl Microbiol. 86 (1), 168-173 (1999).</li>
<li>Martins, M. L., Watral, V., Rodrigues-Soares, J. P., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+collecting+eggs+of+Pseudocapillaria+tomentosa+%28Nematoda%3A+Capillariidae%29+from+zebrafish+Danio+rerio+and+efficacy+of+heat+and+chlorine+for+killing+the+nematode%27s+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Dis%22%5BJournal%5D)">A method for collecting eggs of Pseudocapillaria tomentosa (Nematoda: Capillariidae) from zebrafish Danio rerio and efficacy of heat and chlorine for killing the nematode's eggs.</a> J Fish Dis. 40 (2), 169-182 (2017).</li>
<li>Maley, D., Laird, A. S., Rinkwitz, S., Becker, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+protocol+for+the+treatment+of+zebrafish+colonies+infected+with+parasitic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient protocol for the treatment of zebrafish colonies infected with parasitic nematodes.</a> Zebrafish. 10 (3), 447-450 (2013).</li>
<li>Samaee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Assessment+of+the+Efficacy+of+Five+Veterinary+Broad-Spectrum+Anthelmintics+to+Control+the+Intestinal+Capillariasis+in+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Experimental Assessment of the Efficacy of Five Veterinary Broad-Spectrum Anthelmintics to Control the Intestinal Capillariasis in Zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 12 (3), 255-267 (2015).</li>
<li>Collymore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+Efficacy+of+Emamectin+Benzoate+and+Ivermectin+for+the+Treatment+of+Pseudocapillaria+tomentosa+in+Laboratory+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Tolerance and Efficacy of Emamectin Benzoate and Ivermectin for the Treatment of Pseudocapillaria tomentosa in Laboratory Zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 11 (5), 490-497 (2014).</li>
<li>Chang, C. T., Whipps, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Antibiotics+against+Mycobacterium+Species+Commonly+Found+in+Laboratory+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Aquatic+Animal+Health%22%5BJournal%5D)">Activity of Antibiotics against Mycobacterium Species Commonly Found in Laboratory Zebrafish.</a> Journal of Aquatic Animal Health. 27 (2), 88-95 (2015).</li>
<li>Chang, C. T., Doerr, K. M., Whipps, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+treatment+of+zebrafish+mycobacteriosis%3A+tolerance+and+efficacy+of+treatments+with+tigecycline+and+clarithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Dis%22%5BJournal%5D)">Antibiotic treatment of zebrafish mycobacteriosis: tolerance and efficacy of treatments with tigecycline and clarithromycin.</a> J Fish Dis. , (2017).</li>
<li>Peterson, T. S., Ferguson, J. A., Watral, V. G., Mutoji, K. N., Ennis, D. G., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramecium+caudatum+enhances+transmission+and+infectivity+of+Mycobacterium+marinum+and+M.+chelonae+in+zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Aquat+Organ%22%5BJournal%5D)">Paramecium caudatum enhances transmission and infectivity of Mycobacterium marinum and M. chelonae in zebrafish Danio rerio.</a> Dis Aquat Organ. 106 (3), 229-239 (2013).</li>
<li>Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vital+Relationship+Between+Nutrition+and+Health+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ograniczenia technik, kroków krytycznych i rozwiązywania problemów:
Wiek, płeć, szczep i czas ekspozycji wartowników nie są znormalizowane. Przedstawiono to w tabeli 1. Badania przesiewowe ryb w wieku poniżej 6 miesięcy lub ryb w wieku poniżej 6 miesięcy są bardzo ograniczone. Mogą istnieć pewne patogeny, które wpływają na młode ryby, ponieważ istnieją pewne patogeny, które są bardziej rozpowszechnione w starszej populacji 10,18,19,20. Podobnie, płeć nie jest brana pod uwagę przy doborze niektórych grup wskaźnikowych, mimo że niektóre doniesienia wskazują na uprzedzenia ze względu na płeć w przypadku niektórych patogenów21. Proponowana technika ma na celu rozwiązanie tych problemów, chociaż wybór szczepu może być dokonany w zależności od konkretnego patogenu, który ma być monitorowany. Na przykład TU może pomóc w wykrywaniu Mycobacterium spp.12,22, ale istnieje ryzyko, że wartowniki będą wtedy działać jako rezerwuar lub wykazywać objawy kliniczne. Jeśli chodzi o długość ekspozycji, podejście Międzynarodowego Centrum Zasobów Danio Pręgowanego10 zwiększa szanse na wykrycie patogenów, które mogłyby zostać pominięte przy nieodpowiednim okresie zanieczyszczenia. Konieczność długotrwałego narażenia oznacza, że wartowniki nie są łatwo dostępne. Dodanie próbek środowiskowych pozwala na pewną elastyczność i zwielokrotnienie zdarzeń przesiewowych. Na przykład pobieranie próbek może odbywać się co drugi miesiąc w odstępach 4 miesięcy między każdą metodą przesiewową. Może to skrócić czas, jaki upływa przed wykryciem nowo wprowadzonego patogenu.
Techniki badań przesiewowych w środowisku polegają na wykrywaniu patogenów w środowisku. Patogeny są wydalane przez ryby, a zatem rozcieńczane w wodzie systemowej. Nie zbadano możliwości wychwytywania patogenów za pomocą filtracji wodnej23 . Metody, które opisujemy, są skuteczne tylko wtedy, gdy patogeny mają wystarczająco dużo czasu na namnażanie się w rybach i biofilmie, aby osiągnąć próg zanieczyszczenia umożliwiający wykrycie. To ograniczenie technik jest zminimalizowane przez krytyczny wybór miejsc pobierania próbek: próbki pobiera się z osadu w zbiorniku, a nie z osadu ze studzienki, a próbki wody i biofilmu pobiera się na powierzchni studzienki, a nie w zbiorniku lub po filtracji. Niemniej jednak jest mało prawdopodobne, aby wszystkie próbki z tego samego systemu dały takie same wyniki. Pozytywne wyniki dla P. tomentosa można potwierdzić za pomocą innego testu (histopatologia, PCR lub analiza osadu). Dodatnie wyniki Mycobacterial PCR można potwierdzić za pomocą posiewu lub innego laboratorium diagnostycznego. Jednak przy ustalaniu statusu zdrowotnego zaleca się pobranie dodatkowych próbek w celu potwierdzenia negatywnych wyników wszelkich technik badań przesiewowych w warunkach środowiskowych.
Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod:
Mycobacterium spp. są pospolite w środowisku, a ich obecność w studzience nie pozwala na przesądzenie o ich chorobotwórczości12. Mocho9 wykazał, że monitorowanie wskaźników śmiertelności jest kluczem do badania rozwoju problemów zdrowotnych. Wykorzystanie próbek zwierzęcych pozostaje niezbędne we wszelkich dochodzeniach weterynaryjnych. Monitorowanie stanu zdrowia oznacza wykrywanie wszystkich patogenów rozpowszechnionych w obiekcie, a tego nie można osiągnąć wyłącznie przy użyciu technik badań przesiewowych w środowisku. Niemniej jednak brak czułości narzędzi diagnostycznych może opóźnić lub uniemożliwić dokładny opis stanu zdrowia. Podczas gdy wykorzystanie wskaźników wykrywających zmniejsza liczbę ryb potrzebnych do wykrycia drobnoustroju występującego w populacji, brak czułości zwiększa wagę stosowania kombinacji metod, w tym badań przesiewowychw środowisku 5,23. Rzeczywiście, status wolnego od specyficznego czynnika chorobotwórczego jest zwykle definiowany jako brak gatunku w obiekcie, w związku z czym próbki środowiskowe i zwierzęce muszą być ujemne24,25.
Wyniki wymazu z miski olejowej w celu identyfikacji Mycobacterium spp. pokazują, że poleganie na próbkach ryb może prowadzić do fałszywie ujemnego stanu zdrowia. 6 badanych gatunków prątków jest opisanych jako chorobotwórcze lub potencjalnie chorobotwórcze u danio pręgowanego15 , a niektóre z nich nie zostałyby wyeliminowane przez dezynfekcję powierzchni jaj chlorem26 , jak rutynowo przeprowadza się w kwarantannie. W związku z tym wynik fałszywie ujemny może mieć pewne konsekwencje dla współpracowników, którzy importują wiersze. Na przykład M. fortuitum został pominięty przez PCR na próbce ryb, ale wykryła go ponad połowa PCR z wymazu z miski olejowej. Biorąc pod uwagę, że prątki te są bardziej odporne na chlor niż inne i ich zdolność do rozwoju w systemach wodnych27, stanowi to ryzyko dla nieskażonego zakładu importującego. Aby zezwolić na importowanie linii, menedżerowie muszą ufać raportom o kondycji zakładu eksportującego i porównywać je ze swoimi. Program oceny działania ICLAS28 ma kluczowe znaczenie dla tego procesu u gryzoni. Sieć RESAMA informuje o wykryciu M. gordonae i M. mucogenicum u francuskiego D. rerio11. Te prątki nie są proponowane w panelach komercyjnych laboratoriów, z których korzystamy. Przydatne byłoby rozszerzenie programu ICLAS i ujednolicenie testów diagnostycznych, jak również wykazu gatunków chorobotwórczych29.
A. hydrophila jest również patogenem, który może zostać wprowadzony podczas importu zwierząt, chociaż jego podatność na chlor30 sprawia, że jego eliminacja jest bardziej prawdopodobna podczas rutynowej dezynfekcji powierzchni jaj. Wyniki studzienki, wymazu i osadu pokazują, że do wykrycia tego patogenu można zastosować badania przesiewowe w środowisku. Inne bakterie, takie jak Mycobacterium spp., zostały wykryte w osadzie za pomocą PCR23. Ten rodzaj próbki jest szczególnie istotny, ponieważ umożliwia wykrycie wydalanych patogenów. Na przykład innym nowym zastosowaniem jest analiza osadu w celu przesiewania importowanych ryb objętych kwarantanną na obecność P. tomentosa. Pasożyt stanowi zagrożenie dla zdrowia zwierząt13 i modele neoplazji16. Ponadto stężenia chloru stosowane w rutynowej dezynfekcji powierzchni ikry danio pręgowanego nie są skuteczne31. W związku z tym możliwość badania przesiewowego importowanych zwierząt z tygodniową rotacją i bez eutanazji ryb wydaje się bardzo atrakcyjna. Technika ta może wpłynąć na zasady kwarantanny i bioasekuracji, umożliwiając klasyfikację importowanych towarów. Następnie opracowuje się proces decyzyjny w zależności od czynników chorobotwórczych występujących w zakładzie wywozu, wykrytych czynników chorobotwórczych w próbkach pochodzących z przywożonych ryb oraz ryzyka pogorszenia statusu zdrowotnego zakładu przywozu10.
Przyszłe zastosowania lub wskazówki po opanowaniu tych technik:
Nawet jeśli wybraną opcją jest rutynowe leczenie kwarantanną, skuteczność takiego leku 32,33,34,35,36 można ocenić za pomocą analizy osadu za pomocą urządzenia hodowlanego. Mówiąc bardziej ogólnie, badania przesiewowe w środowisku mogą być wykorzystywane do testowania związków przeciwko bakteriom i zwalczaniu pasożytów, w tym w biotopie ryb. Innym niszowym zastosowaniem badań przesiewowych w środowisku jest monitorowanie populacji patogenów w paszy na żywo 37,38. Chociaż głównym zastosowaniem tych technik jest cenne uzupełnienie zestawu narzędzi diagnostycznych do monitorowania stanu zdrowia w obiektach danio pręgowanego. Dzięki dokładniejszemu, oszczędniejszemu i bardziej efektywnemu kosztowo i czasowo określeniu stanu zdrowia, wymazy z studzienki ściekowej i analiza osadu stanowią uzupełnienie nadzoru wartowniczego i rutynowej praktyki kwarantanny. Rzeczywiście, przyszłość tych technik ma być rutynową częścią każdego raportu o stanie zdrowia w laboratorium wodnym.

W celu ochrony badań i dobrostanu zwierząt1,2, obecność patogenów jest monitorowana w obiektach dla zwierząt. W przypadku danio pręgowanego, monitorowanie zdrowia3,4,5,6,7,8,9,10,11 często opiera się na zwierzętach analizowanych pośmiertnie za pomocą histopatologii, hodowli bakteriologicznej lub metod molekularnych. Badanie wyłącznie zwierząt z kolonii nie jest zalecaną metodą ze względu na liczbę ryb i związane z tym wydatki, które byłyby wymagane do wykrycia patogenów o niskiej częstości występowania. Dlatego preferowaną metodą jest narażenie niewielkiej grupy zwierząt na większe obciążenie zanieczyszczeniami. Ryby te nazywane są strażnikami przed filtracją. To narażenie trwa miesiącami i wiąże się ze zwiększonym obciążeniem pracą opiekuna zwierząt i/lub jakimś specjalnie opracowanym rozwiązaniem inżynieryjnym. Kolejnym wyzwaniem jest kontrola importowanych linii w kwarantannie, w której płodne zwierzęta mają być utrzymywane przy życiu, co nie jest zgodne z rutynowymi badaniami tusz.
Opisujemy tutaj kilka metod wykrywania niektórych patogenów danio pręgowanego (A. hydrophila, Mycobacterium spp. i P. tomentosa) poprzez badanie środowiska wodnego. Celem jest zmniejszenie liczby ryb wykorzystywanych do monitorowania stanu zdrowia oraz optymalizacja obrotu, kosztów i czułości wykrywania. Takie metody stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt, a niektóre techniki można zastosować do kontroli importu w kwarantannie. Na przykład Mocho9 był w stanie zidentyfikować więcej patogennych gatunków prątków, wykonując PCR na wymazach z miski olejowej, a nie na danio pręgowanych (w tym wskaźnikowych), i uzyskano to przy mniejszej liczbie próbek. W tym samym badaniu jaja P. tomentosa wykryto z większą czułością poprzez badanie przesiewowe osadu w zbiorniku za pomocą flotacji i mikroskopii, a nie badanie ryb za pomocą PCR i histopatologii.
Tabela 1 podsumowuje różne cechy programów sentinel3,4,5,6,7,8,9,10 używany przez szereg obiektów dla danio pręgowanego. Strażnicy po filtracji otrzymują wodę w taki sam sposób, jak każda ryba kolonijna, podczas gdy strażnicy przed filtracją otrzymują wodę, gdy najpierw przepłynie ona przez akwarium kolonijne. Na przykład w systemie recyrkulacyjnym można ustawić wartowniki filtracji wstępnej, które w sposób ciągły odbierają wodę z miski olejowej. Może to nie być możliwe, gdy w jednym pomieszczeniu znajduje się wiele niezależnych systemów. W takim przypadku jeden zbiornik strażników filtracji wstępnej może być wykorzystany do przesiewania całego pomieszczenia. Strażnicy znajdują się w zbiorniku statycznym, poza systemem recyrkulacyjnym, a ich woda jest regularnie wymieniana, przy użyciu wyłącznie wody z filtracji wstępnej, tj. wody ze studzienki ze wszystkich systemów w pomieszczeniu. Technika ta została opisana poniżej jako punkt odniesienia do porównania ze skutecznością badań przesiewowych w warunkach środowiskowych. Proponowana konfiguracja ma na celu kontrolę problemów z jakością wody, takich jak spadek pH lub zanieczyszczenie azotem.
Koncepcja badania środowiska bakteryjnego opiera się na hipotezie, że bakterie są wykrywalne w biofilmie, takim jak ten znajdujący się na ścianie studzienki na powierzchni wody lub w szlamie na dnie zbiornika. Studzienka wydaje się idealnym punktem pobierania próbek w recyrkulacyjnym systemie akwakultury, ponieważ zbiera odpady (wodę, kał, paszę i inny materiał organiczny) ze wszystkich zbiorników przed filtracją. Powierzchnia studzienki jest często łatwo dostępna, pobieranie wymazu jest szybkie i można je wykonywać aseptycznie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbki (na przykład w rękawiczkach). Koncepcja ta jest używana do identyfikacji rozpowszechnionych chorobotwórczych Mycobacterium spp. w systemach danio pręgowanego9,12. Technika jest opisana poniżej, a my również informujemy o wykryciu A. hydrophila w wymazach z powierzchni studzienek danio pręgowanego i szlamie.
Środowiskowe badanie przesiewowe na obecność jaj pasożytów opiera się na detekcji przeprowadzonej przez Murraya i wsp.13 a technika flotacji jest rutynowo stosowana do parazytologii i mikroskopijnych badań przesiewowych jaj pasożytów w kale14. Mocho9 zaproponował alternatywę dla procesu pobierania próbek i pokazał, że technika ta może być wykorzystana do wykrywania innych gatunków biotopu ryb. Zakażone D. rerio przepuszczają jaja P. tomentosa wraz z kałem, a jaja pasożyta pozostają na dnie zbiornika, w szlamie. Można je tam zbierać, ponieważ ich gęstość jest większa niż wody. Gęstość jaj jest również wykorzystywana do przetwarzania próbki środowiskowej. Pierwsza flotacja z odwirowaniem oddziela wodę i lekkie zanieczyszczenia od cięższej materii. Drugie wirowanie opiera się na nasyconym roztworze cukru (o gęstości większej niż gęstość jaj P. tomentosa), aby umożliwić pojawienie się jaj pasożyta na powierzchni probówki.
Badanie przesiewowe na obecność bakterii w biofilmie i na obecność P. tomentosa z dna zbiornika można połączyć poprzez wykonanie PCR dla wszystkich tych patogenów na osadzie próbki osadu uzyskanej po pierwszym odwirowaniu. Optymalizuje to czas próbkowania. Metoda jest opisana poniżej. Proponujemy również stosowanie tych technik w kontekście kwarantanny. Aby przesiać importowane dorosłe rybo danio pręgowanego, które muszą być utrzymywane przy życiu, do zbiornika kwarantanny umieszcza się urządzenie hodowlane. Po tygodniu kał i inne odpady w urządzeniu hodowlanym są zbierane i badane pod kątem mikroskopii lub PCR. Technika jest opisana poniżej i w tym kontekście niektóre jaja P. tomentosa zostały wykryte za pomocą mikroskopii.

<table><tbody><tr><td>Aqua-Sed 250 ml</td><td>Vetark</td><td></td><td>2-fenoksyetanol</td></tr><tr><td>Rurka sterylna sucha końcówka wacika</td><td></td><td>MW100</td><td>Powierzchnia miski olejowej</td></tr><tr><td>BD Plastipak Jednorazowa strzykawka 50 ml Ekscentryczna</td><td>Becton Dickinson</td><td>300866</td><td>W rzeczywistości są z podziałką do 60 ml</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml Corning</td><td></td><td>Corning 430766</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa Centaur 2 z 4 x 200 ml Swing&ndash; Zewnętrzny wirnik (nieuszczelniony)</td> <td>Sanyo</td><td>MSB020. CX1.5</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe 22 mm x22 mm</td><td>Menzel-Glaser</td><td>MNJ-350-020H</td><td></td></tr><tr><td>Zwykły wacik Sterylny plastikowy aplikator Białe nasadki ze sztucznego jedwabiu</td><td>Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific</td><td>F155CA</td><td>Wymaz z osadu</td></tr><tr><td>50 ml Wolnostojąca probówka wirówkowa CentriStar Cap</td><td>Corning</td><td>430921</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw tacek tarłowych w zbiorniku</td><td>MBK Installations Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe środowiskowe aeromonas hydrophila, mycobacterium spp. i pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

Systemy monitorowania zdrowia są rozwijane i używane w ośrodkach badawczych nad danio pręgowanymi, ponieważ patogeny Danio rerio, takie jak Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa mogą potencjalnie zaszkodzić dobrostanowi zwierząt i badaniom naukowym. Ryby są zwykle analizowane post mortem w celu wykrycia drobnoustrojów. Wykorzystanie wskaźników wybiórczych jest sugerowanym sposobem poprawy czułości nadzoru i zmniejszenia liczby zwierząt do pobrania. Opisano ustawienie zbiornika wskaźnikowego filtracji wstępnej z systemu recyrkulacji. Technika ta została opracowana w celu zapobiegania zanieczyszczeniu wody i reprezentowania populacji ryb poprzez staranny dobór wieku, płci i szczepów. W celu wykorzystania jak najmniejszej liczby zwierząt szczegółowo opisano również techniki monitorowania środowiska. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) na wymazach z miski olejowej jest stosowana w celu znacznej poprawy wykrywania niektórych rozpowszechnionych i chorobotwórczych gatunków prątków, takich jak Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilum i Mycobacterium chelonae. Inna metoda środowiskowa polega na przetwarzaniu osadu na dnie zbiornika retencyjnego lub studzienki w poszukiwaniu jaj P. tomentosa. Jest to tania i szybka technika, którą można zastosować w kwarantannie, gdzie urządzenie hodowlane jest zanurzone w zbiorniku hodowlanym importowanych zwierząt. Na koniec do próbki osadu nakłada się PCR i wykrywa A. hydrophila na dnie i powierzchni studzienki. Ogólnie rzecz biorąc, te środowiskowe techniki przesiewowe zastosowane do tych konkretnych patogenów doprowadziły do zwiększonej czułości w porównaniu z testowaniem wskaźników wstępnej filtracji.

Zalety stosowania wymazów z osadników w celu identyfikacji powszechnie występujących gatunków Mycobacterium sp. w porównaniu z próbkami ryb znajdują potwierdzenie w wynikach przedstawionych na Rysunku 4. Spośród 115 przebadanych ryb, M. chelonae i M. haemophilum wykryto odpowiednio w 5% i 3% próbek. Nie zidentyfikowano żadnych innych patogennych gatunków prątków. Z tych samych systemów pobrano 49 wymazów z osadników, które ujawniły obecność 5 gatunków prątków. Iloraz szans obliczono przy założeniu hipotezy, że M. chelonae i M. fortuitum są częściej wykrywane metodą PCR w wymazach z powierzchni osadników niż w próbkach ryb. Wynik ten jest istotny statystycznie, z odpowiednimi wartościami ilorazu szans wynoszącymi 11 (95% CI: 4 do 29; p &lt;0,0001) oraz 306 (95% CI: 18 do 5208; p = 0,0001). Wyniki pokazują, że technika wymazów z powierzchni osadników stanowi wartościową alternatywę dla wyłącznego stosowania zwierząt sentinelnych w celu przesiewowego badania zaplecza dla danio pręgowanych pod kątem Mycobacterium spp. Próbki środowiskowe wykorzystano również do wykrywania A. hydrophila. Bakterie te zidentyfikowano w rybach, osadach oraz próbkach powierzchniowych (Rysunek 4). Potwierdza to ponadto skuteczność proponowanych technik w badaniu biotopu ryb.
W odniesieniu do analizy osadów w celu wykrycia jaj P. tomentosa, Mocho9 wykrył pasożyta metodami PCR i histopatologii w 27% próbek ryb, podczas gdy jaja stwierdzono w 93% analizowanych osadów z tego samego systemu. W niniejszej pracy technikę tę przetestowano pod kątem odzwierciedlenia przesiewowej kontroli kwarantannowej. W tym kontekście nie można pobierać próbek z importowanych zwierząt, a szybka ocena ich stanu zdrowia wspomaga zarządzanie biosecurity. Ryby o nieznanym stanie zdrowia z placówki z dodatnim wynikiem na P. tomentosa umieszczono w 8 zbiornikach z urządzeniami do rozrodu: maksymalnie 16 ryb na zbiornik o pojemności 13 L, z 7 linii transgenicznych i 1 linii typu dzikiego, obu płci, w wieku od 4 do 24 miesięcy. Osady zebrano z urządzeń po jednym tygodniu i przeanalizowano mikroskopowo. Jaja P. tomentosa zaobserwowano w 7 (88%) próbach. Na koniec przetestowano detekcję PCR pasożyta w wymazach z sumpa oraz w osadach. 4 z 6 próbek osadu uzyskały wynik dodatni w teście PCR, natomiast wszystkie wyniki z wymazów powierzchniowych były ujemne. Nie jest to zaskakujące, ponieważ przesiewowe badanie osadów opiera się na zdolności jaj do opadania na dno zbiornika. Wykazuje to, że techniki analizy osadów mogą być stosowane do badania akwariów z D. rerio pod kątem infekcji P. tomentosa oraz że metody te można dostosować do kontroli importowanych zwierząt.
<img alt="Zebry w akwarium do eksperymentu biologicznego; ustawienie badania behawioralnego, metoda badań wodnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zbiornik strażniczy do wstępnej filtracji poza systemem recyrkulacyjnym. Zbiornik o pojemności 8 L jest napełniany wodą oraz bio-medią z sumpów systemów w celu przesiewania. Dwie białe ceramiczne kulki bio-medii znajdują się na dnie zbiornika (na środku zdjęcia). Wybieranych jest 12 ryb zgodnie z ich wiekiem, szczepem i płcią, a następnie są one przenoszone do zbiornika strażniczego. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy jaja Ascaris; podkreśla anatomię i cechy morfologiczne pasożyta." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Jajo P. tomentosa wykryte podczas analizy osadów za pomocą mikroskopii. Zastosowane powiększenie wynosiło 400X. Strzałki wskazują korki bipolarne. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zebry w zbiorniku laboratoryjnym, wykorzystywane do badań genetycznych, przesiewania leków i badań rozwojowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Urządzenie hodowlane zanurzone w zbiorniku dla ryb w celu zbierania osadu do analizy. Zbiornik ten został ustawiony na stole laboratoryjnym na potrzeby zdjęcia; w systemie recyrkulacyjnym jest on rozmieszczony w inny sposób. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy wyników PCR przedstawiający procent pozytywnych wyników dla różnych powierzchni bakteryjnych i próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Procent identyfikacji Mycobacterium spp., A. hydrophila oraz P. tomentosa metodą PCR w rybach, wymazach z powierzchni sumpa oraz osadzie z sumpa. Procent uzyskano poprzez podzielenie liczby wyników pozytywnych dla każdego gatunku patogenu przez liczbę badanych próbek. Procent wyników pozytywnych podano w zależności od rodzaju próbki jako FISH (ryby), SURFACE (powierzchnia) lub SLUDGE (osad), co zaznaczono po nazwie bakterii. Pod kątem identyfikacji Mycobacterium spp. metodą PCR przebadano 115 ryb i 49 wymazów z powierzchni sumpa. Dane zestawiono z wynikami Mocho9, ponieważ niniejsza praca stanowi rozszerzenie tamtego badania. Ryby to głównie zwierzęta wskaźnikowe z etapu przedfiltracji, zgodnie z sekcją 1 protokołu. Rzadko, w przypadku braku zwierząt wskaźnikowych, pobierano próbki od osobników, które uciekły z innych zbiorników, oraz od starszych ryb z kolonii (&gt;18 miesięcy). Wszystkie systemy testowane pod kątem Mycobacterium spp. badano w rybach i wymazach z sumpa. Ilorazy szans obliczono przy założeniu hipotezy, że M. chelonae i M. fortuitum są wykrywane metodą PCR częściej w wymazach z powierzchni sumpa niż w próbkach z ryb. Jest to statystycznie istotne przy odpowiednich ilorazach szans wynoszących 11 (95% CI: 4 do 29; p &lt;0.0001) i 306 (95% CI: 18 do 5208; p = 0.0001). Wyniki PCR dla Mycobacterium marinum były negatywne dla wszystkich próbek, w związku z czym uznano ten gatunek za nieobecny w badanych obiektach i nie uwzględniono go w analizie. Pod kątem obecności A. hydrophila metodą PCR przebadano 12 ryb, 14 wymazów z powierzchni sumpa i 6 próbek osadu z sumpa. Pod kątem obecności P. tomentosa przebadano 6 sumpów na powierzchni i w osadzie. PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy. CI = przedział ufności. * i ** oznaczają istotność statystyczną; pozostałe porównania nie były istotne statystycznie. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy, równowaga statyczna; mikroorganizmy, analiza komórkowa, badania biologiczne." src="/files/ftp_upload/55306/55306vid1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Wideo 1"> 
Wideo 1: Poszukiwanie jaja P. tomentosa za pomocą mikroskopu. Preparat uzyskano z analizy osadu, zgodnie z opisem w kroku 3.1. Pole widzenia jest skanowane w celu wykrycia jaja P. tomentosa. Po rozpoznaniu struktury zwiększa się powiększenie, aby potwierdzić identyfikację przy wyższej rozdzielczości. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/video_scan_for_egg.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Autorzy</td>
			<td >Wiek w momencie rozpoczęcia ekspozycji</td>
			<td >Czas trwania ekspozycji</td>
			<td >Wiek podczas pobierania próbek</td>
			<td >Przed lub po 
			filtracją</td>
			<td >Płeć</td>
			<td >Szczep(y)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Barton et al.3</td>
			<td >4 miesiące</td>
			<td >6 miesięcy</td>
			<td >10 miesięcy</td>
			<td >Przed filtracją</td>
			<td >N/D</td>
			<td >N/D</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Borges et al.4</td>
			<td >6 miesięcy</td>
			<td >6 miesięcy</td>
			<td >12 miesięcy</td>
			<td >Przed filtracją</td>
			<td >N/D</td>
			<td >AB wild type</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collymore et al.5</td>
			<td >Tak młode, jak to możliwe</td>
			<td >3 miesiące</td>
			<td >&lt;6 miesięcy</td>
			<td >Przed filtracją</td>
			<td >N/D</td>
			<td >N/D</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Geisler et al.6</td>
			<td >4 miesiące</td>
			<td >4 miesiące</td>
			<td >8 miesięcy</td>
			<td >Przed i po 
			filtracją</td>
			<td >N/D</td>
			<td >AB wild type</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Liu et al.7</td>
			<td >3 miesiące</td>
			<td >1-6 miesięcy</td>
			<td >4-9 miesięcy</td>
			<td >Przed i po 
			filtracją</td>
			<td >N/D</td>
			<td >Wild type</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Martins et al.8</td>
			<td >3 miesiące</td>
			<td >3 miesiące</td>
			<td >6 miesięcy</td>
			<td >Przed filtracją</td>
			<td >N/D</td>
			<td >Wild type</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mocho9</td>
			<td >&lt;6 miesięcy, 
			6 - 12 miesięcy, 
			&gt;18 miesięcy</td>
			<td >4 miesiące</td>
			<td >7 - 24 miesiące</td>
			<td >Przed filtracją</td>
			<td >1 samica i 
			1 samiec z 
			każdej grupy wiekowej</td>
			<td >AB wild type</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murray et al.10</td>
			<td >3-4 miesiące</td>
			<td >3 miesiące, 6 miesięcy, 1 rok</td>
			<td >7, 10 i 16 
			miesięcy</td>
			<td >Przed i po 
			filtracją</td>
			<td >N/D</td>
			<td >AB wild type</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Porównanie ustawień ryb sentinelnych w zapleczach dla danio pręgowanego. Ryby sentinelne mogą być dobierane ze względu na wiek, płeć lub szczep. Są one eksponowane przez określony czas i otrzymują wodę przed lub po systemie filtracji. Dane zostały zestawione z wydania specjalnego czasopisma Zebrafish z 2016 roku dotyczącego zdrowia ryb3,4,5,6,7,8,9,10.

Ten protokół opisuje użycie wymazów z miski olejowej i analizy osadu w systemach danio pręgowanego, co prowadzi do zwiększenia wykrywalności w porównaniu do samego użycia wartowników do wykrywania patogenów, takich jak Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa. Zaproponowano również system monitorowania jaj P. tomentosa w kwarantannie.

Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, ...

Ogólnym celem tej techniki pobierania próbek jest zmniejszenie liczby ryb wykorzystywanych do monitorowania stanu zdrowia oraz optymalizacja rotacji, kosztów i czułości wykrywania patogenów, w tym podczas badania importowanych osobników w kwarantannie. Technika ta pomaga określić status zdrowotny kolonii w rezerwatach. Metoda ta stanowi przydatne narzędzie podczas odczytu lub oceny skuteczności leczenia.Główną zaletą tej techniki jest możliwość przesiewania i segregacji importowanych organizmów w kwarantannie. Wzmacnia ona plan bezpieczeństwa biologicznego obiektu wodnego. Aby rozpocząć protokół, przygotuj czysty zbiornik o pojemności ośmiu litrów poza systemem recyrkulacyjnym.Napełnij zbiornik około ośmioma litrami wody pochodzącej z sumpów. Dodaj dwa ceramiczne kuleczki lub kostki gąbkowe biometrii z systemów do przesiewania. Następnie dodaj od jednej do dwóch osobników Danio rerio na litr, używając ryb typu dzikiego o dominującym tle genetycznym w placówce, na przykład A B. Wybierz co najmniej sześć ryb.Karm ryby raz dziennie. Zmieniaj dietę, aby upewnić się, że ryby strażnicze są eksponowane na wszystkie rodzaje pokarmów stosowanych w jednostce hodowli zebrafish. Aby przeprowadzić wymianę wody, przenieś ryby strażnicze w biomediach do zbiornika tymczasowego.Całkowicie opróżnij zbiornik strażniczy i wyczyść go. Ponownie napełnij zbiornik strażniczy samą wodą z sumpa, a następnie umieść w nim ponownie ryby strażnicze i biometaria. Po czteromiesięcznej ekspozycji ryb strażniczych na wodę z sumpa, utul ryby metodą zatwierdzoną, taką jak zanurzenie w roztworze 2-fenoksyetanolu w dawce przedawkowanej.Aby potwierdzić śmierć, należy odczekać dziesięć minut po ustaniu ruchu operculum. Chwycić zwłoki pęsetą i zamrozić je całkowicie w temperaturze -80 °C w oznakowanym pojemniku. Przygotować steryльный suchy wymaz z plastikowym trzonem i założyć rękawiczki.Zlokalizuj powierzchnię do pobrania wymazu. Wybierz powierzchnię zbiornika przelewowego o niskim przepływie, ściankę zbiornika na poziomie lustra wody i usuń wszelkie elementy utrudniające łatwy dostęp do powierzchni. Następnie wyjmij wymaz z opakowania zewnętrznego, eksponując sterylną bawełnianą końcówkę na powietrze.Przetrzyj ściankę zbiornika na odcinku od 5 do 10 cm, aby zebrać wodę i biofilm z poziomu powierzchni wody w zbiorniku. Następnie wprowadź wymaz do sterylnej probówki doywirowania lub przełam końcówkę wymazu wewnątrz probówki. Oznacz próbkę i przekaż ją do badania PCR lub zamroź w temperaturze -80 °C.Aby przeprowadzić analizę osadu za pomocą mikroskopii, należy użyć strzykawki o pojemności 60 mililitrów do aspiracji osadu z dna zbiornika. Przenieść próbkę do probówek o pojemności 15 mililitrów. Zakręcić nakrętki i opisać probówki.Wiruj probówki o pojemności 15 ml z prędkością od 175 do 250 ×g przez dziesięć minut w wirówce z rotorem kątowym. Odlej nadsącz z probówek. Po odlaniu zachowaj osady.Następnie przygotuj nasycony roztwór cukru, mieszając 227 g cukru granulowanego i 177 ml gorącej wody za pomocą mieszadła magnetycznego. Wypełnij probówki do połowy nasyconym roztworem cukru. Zakręć nakrętki i dokładnie wymieszaj osad z roztworem.Umieść probówki w koszyczkach wirówki i napełnij je po brzegi roztworem nasyconym cukrem. Delikatnie połóż jedno szkiełko nakrywkę na każdej probówce w taki sposób, aby stykało się z roztworem nasyconym cukrem. Należy pamiętać, że dla każdej próbki o objętości 60 mililitrów stosuje się cztery probówki na wypadek, gdyby szkiełko nakrywka spadło i rozbiło się podczas wirowania.Po zakończeniu wirowania podnieś szkiełko nakrywki i połóż je na szkiełku przedmiotowym, a następnie opisz szkiełko ołówkiem lub markerem. W przypadku wystąpienia zbyt wielu pęknięć szkiełek nakrywek, wypełnij większość probówki nasyconym roztworem cukru i odwiruj probówkę. Dolej nasycony roztwór cukru aż po samą górę, następnie delikatnie połóż szkiełko nakrywki i odczekaj 30 minut.Należy poszukać jaj *Pseudocapillaria tomentosa* przy użyciu mikroskopu. Przy powiększeniu 400X zidentyfikować korki bipolarne. W celu przesiewowego badania zwierząt importowanych w kwarantannie pod kątem obecności jaj *P. tomentosa*, należy umieścić samca i samicę *Danio rerio* w zbiorniku, dodając do niego tace tarłowej, która w tym przypadku posłuży do zbierania odchodów.Po jednym tygodniu należy usunąć urządzenie do hodowli i zebrać zgromadzone w nim osady zgodnie z wcześniejszym opisem. Osad z dna zbiornika lub dołu należy odessać za pomocą strzykawki 60 ml i przenieść próbkę do probówki o pojemności 60 ml. Probówkę należy zamknąć zakrętką i odpowiednio ją opisać.Zutylizuj strzykawkę. Wymieszaj zawartość probówki o pojemności 60 ml i przenieś 15 ml do probówki o pojemności 15 ml. Zamknij probówkę nakrętką i opisz ją.Wirować probówkę 15 ml z prędkością od 175 do 250 ×g przez dziesięć minut w wirówce z rotorem kątowym (swing-bucket). Odlać nadsącz z probówek, zachowując osad wewnątrz. Rozpakować wymaz, usuwając zewnętrzne opakowanie i wystawiając sterylną bawełnianą końcówkę na powietrze.Przejedź wymazem po osadzie w probówce przez 15 sekund. Wsuń wymaz z powrotem do osłonki lub odłam jego końcówkę do sterylnej probówki do wirowania. Oznacz próbkę.Zamrozić w temperaturze -80°C i wysłać do badania PCR. Stosując metodę wymazów z odpływu, spośród 115 przebadanych ryb u 5% wykryto Mycobacterium chelonae, a u 3% próbek wykryto Mycobacterium haemophilum; były to jedyne zidentyfikowane gatunki patogenne. Z tych samych systemów 49 wymazów z odpływów wykazało obecność pięciu gatunków Mycobacterium.Ilorazy szans wykazują, że technika wymazów z powierzchni zbiornika przelewowego jest wartościową alternatywą dla wyłącznego stosowania ryb strażniczych do przesiewowego badania zaplecza dla zebrafish pod kątem obecności Mycobacterium. Próbki środowiskowe wykorzystano również do wykrywania Aeromonas hydrophila, które zidentyfikowano w rybach, osadzie oraz próbkach powierzchniowych, co potwierdza skuteczność proponowanych technik w monitorowaniu biotopu ryb. Mycobacterium chelonae oraz Mycobacterium fortuitum są częściej wykrywane metodą PCR w wymazach z powierzchni zbiornika przelewowego niż w próbkach ryb.Po opanowaniu techniki pobieranie próbek zajmuje zaledwie kilka minut, a wykrycie jaj *Pseudocapillaria tomentosa* może zostać przeprowadzone w ciągu godziny. Dzięki tej metodzie monitorowanie środowiska staje się kluczowym elementem rutynowego programu nadzoru zdrowotnego. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu patologii ryb, takie jak zależność między biofilmem bakteryjnym a infekcją bakteryjną.

environmental-screening-aeromonas-hydrophila-mycobacterium-spp

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym artykule, zarodki danio pręgowanego są wykorzystywane do badań przesiewowych toksyczności chemicznej. Toksyczność chemiczna jest skorelowana z odczytami fenotypu. W protokole próbki przedstawiono metodologiczne podejście do przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności chemicznej.

Badania przesiewowe toksyczności chemicznej na podstawie zarodków: ocena wpływu na rozwój zarodków danio pręgowanego

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.

Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do oceny neurobehawioralnej toksyczności zanieczyszczeń środowiska przy użyciu modelu larw danio pręgowanego, w tym procesu ekspozycji i testów wskaźników neurobehawioralnych.

Badanie neurobehawioralnych skutków zanieczyszczeń środowiska na larwy danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy kompleksowy zestaw testów behawioralnych, w tym nowatorski zbiornik, Shoaling i testy preferencji społecznych, aby skutecznie określić potencjalne neurotoksyczne skutki chemikaliów (np. metamfetaminy i glifosatu) na dorosłe rybki danio pręgowane za pomocą jednego zbiornika. Metoda ta jest istotna dla badań neurotoksycznych i środowiskowych.

Ocena neurotoksyczności u dorosłych Danio rerio przy użyciu baterii testów behawioralnych w jednym zbiorniku

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do oceny wewnętrznych poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego.

Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

Poznaj metodę wymazów z zbiorników i analizy osadu do wykrywania patogenów w systemach danio pręgowanego. Technika ta zwiększa skuteczność detekcji Mycobacterium spp., Aeromonas hydrophila i jaj P. tomentosa, wspierając biobezpieczeństwo obiektów akwariowych.

Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów