Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego

Ogólnym celem tej techniki pobierania próbek jest zmniejszenie liczby ryb wykorzystywanych do monitorowania stanu zdrowia oraz optymalizacja obrotu, kosztów i czułości wykrywania patogenów, w tym podczas kontroli importu w kwarantannie. Technika ta pomaga określić statut zdrowotny kolonii schronienia. Ta metoda jest przydatnym narzędziem podczas odczytywania lub oceny skuteczności leczenia.

Jedną z głównych zalet tej techniki jest kontrola i klasyfikacja importów przebywających w kwarantannie. Wzmacnia on plan bioasekuracji obiektu wodnego. Aby rozpocząć protokół, wyjmij czysty ośmiolitrowy zbiornik z systemu recyrkulacyjnego.

Napełnij zbiornik około ośmioma litrami wody pochodzącej ze studzienek. Dodaj dwie ceramiczne kulki lub kostki gąbkowe biomediów z systemów do przesiewania. Następnie dodaj jedną, aby zrobić Danio rerio na litr, używając ryb typu dzikiego o dominującym tle genetycznym w obiekcie, na przykład A B. Wybierz co najmniej sześć ryb.

Karm ryby raz dziennie. Zmieniaj diety, aby upewnić się, że wartowniki są narażone na wszystkie diety stosowane w obiekcie dla danio pręgowanego. Aby przeprowadzić podmianę wody, przenieś wartowniki w biopożywkach do tymczasowego zbiornika.

Całkowicie opróżnij zbiornik wartowniczy i wyczyść go. Napełnij zbiornik wartowniczy tylko wodą ze studzienki i umieść strażniki i biomedia z powrotem. Po wystawieniu wartowników na działanie wody miejskiej przez cztery miesiące, należy poddać ryby eutanazji za pomocą zatwierdzonej metody, takiej jak zanurzenie w roztworze 2-fenoksyetanolu w przypadku przedawkowania.

Aby potwierdzić śmierć, odczekaj dziesięć minut po ustaniu ruchu wieczka. Chwyć zwłoki kleszczami i zamroź je w całości w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w zidentyfikowanym pojemniku. Przygotuj sterylny suchy wacik z plastikowym trzonkiem i załóż rękawiczki.

Zlokalizuj powierzchnię do wymazania. Wybierz powierzchnię studzienki o niskim przepływie, ścianę studzienki na powierzchni wody i usuń wszelkie przedmioty uniemożliwiające łatwy dostęp do powierzchni. Następnie wyjmij wacik, zdejmując opakowanie zewnętrzne i wystawij sterylną bawełnianą końcówkę na działanie powietrza.

Przetrzyj ścianę studzienki na głębokości od pięciu do 10 centymetrów, aby wchłonąć wodę i biofilm na poziomie powierzchni wody studzienki. Następnie schowaj wacik z powrotem lub rozbij końcówkę w sterylnej probówce wirówkowej. Oznacz próbkę i wyślij ją do testu PCR lub zamroź w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby przeprowadzić analizę osadu za pomocą mikroskopii, użyj 60-mililitrowej strzykawki, aby zassać osad na dnie studzienki. Podziel próbkę na 15-mililitrowe probówki. Przykręć nakrętki i oznacz rurki.

Odwiruj 15-mililitrowe probówki przy 175 do 250 razy większej grawitacji przez dziesięć minut w wirówce z wahadłowymi wiadrami. Zdekantować probówki. Po dekantacji zachowaj osady.

Następnie przygotuj roztwór nasycony cukrem, mieszając 227 gramów cukru pudru i 177 mililitrów gorącej wody za pomocą mieszadła magnetycznego. Napełnij rurki do połowy roztworem nasyconym cukrem. Zakręć nakrętki i dokładnie wymieszaj osad z roztworem.

Umieść probówki w obrotowych wiadrach wirówki i napełnij je do góry roztworem nasyconym cukrem. Delikatnie umieść jedną szklankę nakrywkową na wierzchu każdej probówki, tak aby stykała się z roztworem nasyconym cukrem. Należy pamiętać, że cztery probówki na każdą próbkę o pojemności 60 mililitrów są na wypadek, gdyby niektóre szkła nakrywkowe spadły i pękły podczas wirowania.

Po zakończeniu wirowania podnieś szkiełko nakrywkowe i umieść je na szklanym szkiełku, a następnie oznacz szkiełko ołówkiem lub markerem. W przypadku wystąpienia zbyt wielu pęknięć szkła nakrywkowego, napełnij większość probówki roztworem nasyconym cukrem i odwiruj probówkę. Napełnij do góry roztworem nasyconym cukrem, a następnie delikatnie ustaw szklankę nakrywkową i odczekaj 30 minut.

Poszukaj jaj pseudocapillaria tomentosa pod mikroskopem. Zidentyfikuj wtyczki bipolarne przy powiększeniu 400X. Aby przebadać importowane zwierzęta w kwarantannie pod kątem jaj P.tomentosa, umieść samca i samicę Danio rerio w zbiorniku i dodaj tacę tarłową w zbiorniku, ale użyj jej tutaj do zbierania kału.

Po tygodniu wyjmij urządzenie hodowlane i zbierz zebrany osad w urządzeniu hodowlanym, jak opisano wcześniej. Zassać osad z dna zbiornika lub studzienki za pomocą 60-mililitrowej strzykawki i przenieść próbkę do 60-mililitrowej probówki. Zamknij rurkę zakręcaną górną częścią i oznacz rurkę.

Wyrzucić strzykawkę. Wstrząśnij 60-mililitrową tubką i przenieś 15 mililitrów do 15-mililitrowej tubki. Zamknij rurkę zakręcaną górną częścią i oznacz rurkę.

Odwiruj 15-mililitrową probówkę przy 175 do 250 razy większej grawitacji przez dziesięć minut w wirówce z wahadłowymi wiadrami. Zdekantować probówki i utrzymać osad w probówce. Wyjmij wacik, zdejmując opakowanie zewnętrzne i wystawij sterylną bawełnianą końcówkę na działanie powietrza.

Wymaz osad w probówce przez 15 sekund. Schowaj wacik z powrotem lub rozbij końcówkę w sterylnej probówce wirówkowej. Oznacz próbkę.

Zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i wysłać do testu PCR. Stosując metodę wymazu z miski olejowej na 115 badanych rybach, Mycobaterium chelonae wykryto w pięciu procentach, a Mycobaterium haemophilum wykryto w trzech procentach próbek i były to jedyne zidentyfikowane gatunki chorobotwórcze. Z tych samych systemów 49 wymazów z miski olejowej ujawniło obecność pięciu gatunków Mycobaterii.

Iloraz szans pokazuje, że technika wymazu z miski olejowej jest cenną alternatywą dla wyłącznego stosowania strażników do badań przesiewowych danio pręgowanego na obecność prątków. Próbki środowiskowe wykorzystano również do badań przesiewowych na obecność Aeromonas hydrophila, które wykryto w próbkach ryb, szlamu i powierzchni, co potwierdza zdolność proponowanych technik do badania biotopu ryb. Mycobacterium chelonae i Mycobacterium fortuitum są częściej wykrywane za pomocą PCR w wymazach z miski olejowej niż w próbce ryb.

Po opanowaniu pobieranie próbek zajmuje tylko kilka minut, a wykrycie jaj pseudocapillaria tomentosa można przeprowadzić w ciągu godziny. Ta technika sprawia, że badania przesiewowe w środowisku są kluczową częścią rutynowego programu monitorowania stanu zdrowia. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patologii ryb, takie jak związek między biofilmem bakteryjnym a infekcją bakteryjną.