Łączenie polaryzacji stężenia jonów między zestawionymi membranami jonowymiennymi w celu zablokowania propagacji strefy polaryzacji
23 lutego 2017
Opisano protokół dla nowatorskiej platformy polaryzacji stężenia jonów (ICP), która może zatrzymać rozprzestrzenianie się strefy ICP, niezależnie od warunków pracy. Ta unikalna zdolność platformy polega na wykorzystaniu łączącego się zubożenia i wzbogacania jonów, które są dwiema biegunowościami zjawiska ICP.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wstępna koncentracja bioczynników poprzez ograniczenie strefy polaryzacji stężenia jonów między dwiema identycznymi błonami wymiany jonowej. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak sposób wykrywania biomolekuły o niskiej liczebności, gdy jej stężenie jest mniejsze niż granica wykrywalności czujnika. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wygenerować strefę ICP i wstępnie skoncentrowany bioagent w bardzo specyficznym zderzeniu, niezależnie od warunków pracy.
Aby rozpocząć tę procedurę, użyj konwencjonalnej fotolitografii lub głębokiego reaktywnego trawienia jonowego, aby wytworzyć wzorce krzemowe dla mikrokanałów polidimetylosiloksanu i form membranowych selektywnych kationowo. Umieść wzorce krzemowe w eksykatorze próżniowym z około 30 mikrolitrami trichlorosilanu. Zamknąć eksykator i salinizować wzorce krzemowe przez 30 minut.
Następnie wymieszaj ze sobą bazę z elastomeru silikonowego i utwardzacz w stosunku wagowym 10 do jednego, aby uzyskać nieutwardzony PDMS. Odgazować mieszaninę w próżni przez 30 minut. Następnie wlej odgazowany, nieutwardzony PDMS na mastery krzemowe.
Usuń bąbelki z PDMS za pomocą ręcznej dmuchawy, a następnie utwardź formy PDMS w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Oddziel utwardzone komponenty PDMS od wzorców krzemowych. Użyj noża, aby uformować każdy element w prostokąt.
Następnie wytnij dwie linie w formie z membraną kationoselektywną od krawędzi formy do prefabrykowanych mikrokanałów. Użyj dwumilimetrowego stempla do biopsji, aby wybić otwór na końcu każdego kanału w kształcie litery L. Wyczyść szkiełko szkiełkowe w powierzchni mikromaszyny formy membrany kationitowej za pomocą akrylowej taśmy klejącej i dmuchawy.
Umieść czystą powierzchnię formy na szkiełku szkiełkowym, aby odwracalnie uszczelnić formę do szkiełka. Umieść 10 mikrolitrów żywicy kationowymiennej na szkiełku podstawowym w kontakcie z końcami kanałów w kształcie litery L. Umieścić końcówkę strzykawki nad otworami mikrokanalików i delikatnie wycofać tłok, aby wciągnąć żywicę do kanałów.
W ciągu minuty od napełnienia kanałów z żywicą ostrożnie odłącz formę, nie dotykając wzorzystej żywicy na szkiełku. Podgrzej szkiełko w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby odparować rozpuszczalnik z żywicy. Użyj żyletki, aby usunąć niepotrzebne odcinki żywicy kationowymiennej ze szkiełka, aby utworzyć membrany selektywne kationowo w kształcie litery L.
Następnie użyj stempla do biopsji, aby przebić zbiornik o średnicy 2,0 milimetra na każdym końcu prefabrykowanego mikrokanału w komponencie mikrokanalikowym PDMS. Następnie przebij dwa kolejne otwory w PDMS odpowiadające końcom membran w kształcie litery L. Traktować komponent mikrokanalików PDMS i podłoże z wzorem membrany plazmą tlenową przez 40 sekund przy mocy 100 watów i 50 Umieść obrabianą powierzchnię podłoża na leczonej powierzchni mikrokanału PDMS, upewniając się, że błony kationoselektywne przecinają mikrokanał i są wyłożone otworami w PDMS.
W razie potrzeby delikatnie dociśnij, aby uszczelnić komponent PDMS do podłoża, aby zakończyć montaż urządzenia. Aby rozpocząć eksperyment, należy uzyskać kilka testowych roztworów jonowych o różnych stężeniach i pH. Przygotować roztwór buforowy jednego molowego chlorku potasu lub chlorku sodu.
Dodać niewielką ilość ujemnie naładowanego barwnika fluorescencyjnego do każdego roztworu testowego, upewniając się, że stężenie barwnika jest na tyle niskie, że jego udział w roztworze prądu elektrycznego jest znikomy. Załaduj pierwszy roztwór testowy do jednego zbiornika mikrokanału. Wciągnij roztwór do mikrokanału, przykładając delikatne podciśnienie do drugiego zbiornika mikrokanałowego.
Umieść dużą kroplę roztworu testowego nad obydwoma zbiornikami mikrokanałów, aby wyeliminować wszelkie gradienty ciśnienia w kanale. Następnie napełnij zbiorniki membranowe selektywne kationowo wybranym roztworem buforowym, aby skompensować efekt ICP. Załaduj chip ICP do odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w kamerę urządzenia sprzężonego z ładunkiem.
Podłącz anodę do lewego zbiornika membrany i katodę do prawego zbiornika membrany. Podłącz elektrody do źródłowej jednostki pomiarowej. Użyj źródłowej jednostki miary, aby przyłożyć napięcie do urządzenia i zmierzyć odpowiedź prądową.
Uzyskaj obrazy fluorescencyjne chipa podczas przyłożenia napięcia. Po eksperymencie przeanalizuj intensywność fluorescencji za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obrazowania. Za pomocą tej metody wytworzono prekoncentrator mikroprzepływowy i zbadano odpowiedzi napięciowe w czasie prądu w profilach intensywności fluorescencji odpowiadających różnym roztworom testowym.
Podobnie jak w konwencjonalnych prekoncentratorach jednomembranowych, zaobserwowano trzy różne reżimy napięcia. Podczas reżimu omowego i ograniczającego liniowy gradient stężenia rozwinął się na błonach kationoselektywnych i połączył się po około sekundzie. W przeciwieństwie do prekoncentratorów z pojedynczą membraną, w reżimie nadmiernego ograniczania, strefy ICP łączyły się w czasie krótszym niż sekunda, a szok zubożeniowy można było zaobserwować za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.
Odpowiadający temu spadek przewodności znalazł odzwierciedlenie w bieżącej odpowiedzi czasowej. Bieżący czas został następnie przywrócony. Zaobserwowano to przy kilku napięciach w reżimie nadmiernego ograniczania.
Odzysk prądu przypisano transportowi łączącemu przez strefy ICP połączone między membranami kationoselektywnymi, które izolują korki wstępnego stężenia w całym podaniu napięcia. Tego odzysku prądu nie zaobserwowano w konwencjonalnych koncentratorach wstępnych ICP, ponieważ strefa zubożenia i korek wstępnego zatężania swobodnie rozchodzą się wzdłuż mikrokanału. Podczas gdy zwiększona siła jonowa, kwasowość i zasadowość zmniejszały względną intensywność korków wstępnego zatężania w czasoprzestrzennie zdefiniowanym prekoncentratorze, korki te były nadal ograniczone.
Dodatkowe testy zbliżające się do wstępnego zatężenia wykazały, że szersze błony kationowymienne w węższym kanale mogą ułatwiać wstępne zatężanie ICP w tych niekorzystnych warunkach. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się elektrokinetyką do zbadania zastosowań w układach mikroprzepływowych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak integrować materiały jonowymienne między systemami mikroprzepływowymi i jak używać tej platformy do wstępnej koncentracji bioagentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje nowatorską platformę polaryzacji stężeniowej jonów (ICP), zaprojektowaną w celu zatrzymania propagacji strefy ICP w różnych warunkach operacyjnych. Wyjątkowa zdolność platformy wynika z połączenia procesów ubytku i wzbogacenia jonów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Bioinżynieria
Wstęp
- Polaryzacja stężeń jonowych jest zjawiskiem, które można wykorzystać do wstępnego zagęszczania bioagentów.
- Wykrywanie biomolekuł o niskiej zawartości stanowi istotne wyzwanie w biosensoryce.
- Konwencjonalne metody często mają trudności z efektywnym działaniem w zmiennych warunkach.
- Niniejsze badanie analizuje nowe podejście w celu zwiększenia możliwości detekcji.
Cel badania
- Opracowanie metody prekondensacji bioagentów z wykorzystaniem polaryzacji stężenia jonów.
- Zbadanie sposobów detekcji biomolekuł w stężeniach poniżej granic czułości czujnika.
- Wykazanie zalet nowej platformy ICP w różnych scenariuszach operacyjnych.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie matryc krzemowych przy użyciu fotolitografii lub głębokiego trawienia jonowego (DRIE).
- Tworzenie mikrokanałów z polidimetylosiloksanu (PDMS) oraz form membran selektywnych względem kationów.
- Sylilacja matryc krzemowych w dysekatorze próżniowym przy użyciu trichlorosilanu.
- Ograniczenie strefy ICP pomiędzy dwiema identycznymi membranami wymiany jonowej.
Główne wyniki
- Strefa ICP może być skutecznie generowana i utrzymywana niezależnie od warunków operacyjnych.
- Bioagenty mogą być wstępnie zagęszczane w sposób kontrolowany.
- Metoda ta rokuje poprawę wykrywalności biomolekuł występujących w niskich stężeniach.
- Wyniki wskazują na zwiększoną wydajność w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Wnioski
- Nowoczesna platforma ICP oferuje istotne zalety w zakresie wstępnego zagęszczania bioagentów.
- Podejście to może prowadzić do postępów w technologiach biosensingu.
- Konieczne są dalsze badania w celu pełnego zbadania jej potencjału w różnych zastosowaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza platforma rozwiązuje kluczowy problem w biosensoryce: trudność w utrzymaniu stabilnych stref prekonecentracji w zmiennych warunkach operacyjnych, co ogranicza niezawodną detekcję niskostężeniowych biomarkerów. Dzięki połączeniu stref ubytku i wzbogacenia jonów, metoda ta umożliwia przestrzennie i czasowo stałą akumulację celu w szerokim zakresie napięcia, siły jonowej oraz pH, co zwiększa odporność analizy. Możliwość ta wspiera walidację celów na wczesnym etapie poprzez poprawę stosunku sygnału do szumu dla śladowych ilości analitów, zwiększając tym samym pewność identyfikacji trafień i redukując liczbę wyników fałszywie negatywnych w kampaniach przesiewowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie biomolekuł o niskim stężeniu poprzez stabilizację stref prekoncentracji, co zwiększa czułość detekcji w testach walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Działa w szerokich zakresach napięcia (0.5-100 V), siły jonowej (1-100 mM) i pH (3.7-10.3), co zmniejsza potrzebę optymalizacji warunków i zwiększa przepustowość.
- Wartość prognostyczna: Ograniczone wtyczki prekoncentracyjne zapewniają spójne odczyty sygnału, co wspiera wiarygodne pomiary zaangażowania celu i minimalizację ryzyka mechanistycznego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje skondensowane wtyczki docelowe na granicy faz membrany, tworząc zdefiniowane mikrośrodowisko biochemiczne do standaryzowanych analiz wiązania lub enzymatycznych.
- Wartość operacyjna: Eliminuje rozprzestrzenianie się stref polaryzacji, zapewniając powtarzalne miejsca prekondensacji, które są kluczowe dla standaryzacji analiz i spójności między płytkami.
- Skalowalność: Format mikroprzepływowy umożliwia równoległość oraz integrację z systemami detekcji w ramach przepływów przesiewowych o średniej wydajności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zachowuje wierność uprzedniego zagęszczania przy fizjologicznie istotnych zmianach pH i siły jonowej, co wspiera detekcję biomarkerów w macierzach próbek istotnych dla przebiegu chorób.
- Redukcja ryzyka mechanicznego: Izoluje uprzednio zagęszczone anality od dyspersji wywołanej przepływem, co umożliwia wyraźniejszą korelację między intensywnością sygnału a stężeniem celu w profilowaniu farmakokinetycznym lub farmakodynamicznym.
- Znaczenie dla modeli przedklinicznych: Kompatybilność z odczytami fluorescencyjnymi lub luminescencyjnymi powszechnie stosowanymi jako zamienniki obrazowania in vivo, co ułatwia walidację międzyplatformową.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, a konkretnie zwiększa gotowość do analizy podczas identyfikacji wiodących związków (lead identification), zapewniając powtarzalny etap uprzedniego zagęszczania przed detekcją, bez konieczności modyfikacji dalszych cykli analitycznych.
- Biologia odkrywcza: Stabilizuje polaryzację stężeń jonów, co umożliwia wiarygodną detekcję celów o niskiej zawartości, wspierając testowanie hipotez w wyjaśnianiu szlaków sygnałowych i dekonwolucji celów.
- Screening: Zapewnia spójną wydajność prekondensacji niezależną od dryftu płynów lub wahań napięcia, co zwiększa wskaźniki potwierdzania trafień w badaniach pierwotnych i wtórnych.
- Analityka: Generuje mierzalne profile intensywności fluorescencji z ograniczonych wtyczek (plugs), umożliwiając analizę porównawczą między różnymi warunkami i bibliotekami związków.
- Badania translacyjne: Zachowuje efektywność prekondensacji w zmiennych warunkach buforowych, co jest zgodne z wymaganiami dotyczącymi obchodzenia się z próbkami fizjologicznymi podczas weryfikacji biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma, wykonana za pomocą standardowej miękkiej litografii, może być ponownie wykorzystywana w różnych projektach i dostosowywana do różnych membran selektywnych jonowo w celu tworzenia multipleksowych paneli celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez umożliwienie detekcji biomolekuł znajdujących się poniżej granicy wykrywalności dzięki zwiększonej wydajności uprzedniego zagęszczania.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność analizy poprzez ustalenie miejsca uprzedniego zagęszczania, co poprawia powtarzalność między poszczególnymi seriami i użytkownikami.
- Wartość strategiczna: Obniża odsetek biologicznych wyników fałszywie ujemnych we wczesnym przesiewie, co wspiera lepsze decyzje typu go/no-go i ogranicza niepotrzebne inwestycje w niewłaściwe cele.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o wiarygodne dane przy niskich stężeniach, co poprawia wydajność konwersji hit-to-lead.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikrofluidyki, w tym fotolitografii lub trawienia oraz pracy z PDMS.
- Wymagany jest dostęp do żywic jonowymiennych, pomp strzykawkowych oraz mikroskopii fluorescencyjnej z możliwością obrazowania CCD.
- Konieczna jest standaryzacja wyrównania membran i napełniania zbiorników w celu zapewnienia spójnego łączenia się stref ICP.
- Adaptacja do innych biomolekuł może wymagać optymalizacji znakowania fluorescencyjnego lub długości fali detekcji.
- Wydajność może różnić się przy ekstremalnej lepkości próbek lub dużym stopniu zanieczyszczenia cząstkami, choć podstawowy mechanizm ograniczania pozostaje stabilny w testowanych warunkach jonowych i pH.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Fabrication of a Spatiotemporally Defined Ion Concentration Polarization (ICP) Preconcentration Device
3:56
Visualization of Preconcentration Dynamics
5:32
Results: ICP Phenomenon in a Spatiotemporally Defined Preconcentration Device
7:21
Conclusion
