Name: Wykorzystanie pierwotnych kultur neurosfery do badania rzęsek pierwotnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę hodowli neurosfer do badania biogenezy rzęsek pierwotnych i transportu białek sygnałowych w komórkach macierzystych oraz progenitorowych układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium S.M. jest finansowana z grantów rekrutacyjnych od CPRIT (R1220) i NIH (1R01GM113023-01).

1. Izolacja neurosfer od mózgu dorosłej myszy
<ol>
	<li>Poddać eutanazji dorosłą mysz (w wieku około 2 miesięcy) przez przedawkowanie izofluranu. Dokładnie sprawdź, czy mysz przestała oddychać i przeprowadź sekcję zwłok natychmiast po śmierci.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby otworzyć czaszkę. Usuń mózg.</li>
	<li>Umieść mózg w zimnym PBS w 10 cm naczyniu na lodzie. Postępuj zgodnie z metodą preparacji całego montażu, aby uzyskać SVZ z komory bocznej48.</li>
	<li>Umieścić komorę boczną w probówce o pojemności 1,5 ml, dodać 500 μl 0,05% trypsyny-EDTA do PBS i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Po 15 minutach dodać 500 μl pożywki zatrzymującej i delikatnie pipetować 20 - 30 razy końcówką o pojemności 1 ml. Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas pipetowania. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla przeżycia komórki.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 8 minut. Odrzucić supernatant, dodać 1 ml PBS i ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując 5x końcówką o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 500 x g przez 8 minut. Odlać supernatant za pomocą końcówki o pojemności 1 ml i dodać 1 ml podłoża podstawowego.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Jeśli zaobserwuje się szczątki komórkowe, przepuść komórki przez sitko o średnicy 70 μm.</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru; ogólnie uzyskuje się około 30 000 - 60 000 komórek/SVZ.</li>
	<li>Umieścić komórki z jednego SVZ w 10-centymetrowym naczyniu z 10 ml pożywkiNSC i hodować w temperaturze 37 °C z 5% CO 2 .</li>
	<li>(Opcjonalnie) Aby uniknąć fuzji między kulami49, umieść 1,000 komórek w jednym dołku 6-dołkowej płytki o bardzo niskiej wiązalności, która jest wstępnie wypełniona 1,5 ml pożywki NSC i hoduj w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Po 5-7 dniach można zaobserwować neurosfery (ryc. 2A). Okres hodowli może różnić się w zależności od wieku myszy lub tła genetycznego.</li>
	<li>Dodawać 2 ml pożywki NSC co 3-4 dni, aby utrzymać kulturę (nie usuwać istniejącej pożywki).</li>
</ol>
2. Analiza zdolności różnicowania neurosfer i testy ciliogenezy
<ol>
	<li>Aby przeanalizować zdolność różnicowania, przeanalizuj neurosfery w warunkach przylegających w pożywce różnicowej.</li>
	<li>Przed użyciem wysterylizuj okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w autoklawie lub pod wpływem promieniowania UV. W celu uzyskania przylegającej hodowli komórkowej należy umieścić wysterylizowane okrągłe szkło nakrywkowe o średnicy 12 mm w studzience na płytce 24-dołkowej w warunkach aseptycznych.</li>
	<li>Pokryj szkło nakrywkowe przez 10 s 500 μl 0,002% poli-L-lizyny (PLL). Odessać roztwór i suszyć go przez 10-15 minut.</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu lamininy (5 μg/μl). Inkubować szkło nakrywkowe przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać lamininę i dodać 500 μl pożywki różnicującej lub pożywki NSC (kontrola niezróżnicowana).</li>
	<li>W celu przeprowadzenia testu różnicowania należy wziąć pod mikroskop kulę o średnicy 100 - 200 μm z końcówką o pojemności 200 μl. Dodaj 5-10 neurosfer do każdej studzienki 24-dołkowej płytki i hoduj przez 7-10 dni w pożywce różnicującej.</li>
	<li>Aby przeanalizować niezróżnicowane neurosfery, dodaj 5-10 neurosfer do każdej studzienki 24-dołkowej płytki i hoduj przez 1-2 dni w pożywce NSC. Przyłączone neurosfery rozprzestrzeniają się i rosną jako monowarstwa (ryc. 2B).</li>
	<li>Po ostrożnym usunięciu pożywki utrwalić komórki 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć PBS dwukrotnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Płytka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 1-2 miesiące. 
	UWAGA: Aby uwidocznić nerwowe komórki macierzyste / progenitorowe w pożywce NSC i zróżnicowane komórki w pożywce różnicowej, wykonaj barwienie immunologiczne przeciwko Nestin (marker nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych), β–tubulinie III (monoklonalny TUJ1, marker neuronalny), GFAP (kwaśne białko fibrylarne glejowe, marker astrocytów) i O4 (marker oligodendrocytów) (Figura 2B-E). Aby przeanalizować rzęski, wykonaj barwienie immunologiczne przeciwko Arl13b (pierwszorzędowy marker rzęsek) i Gpr161 (rzęskowy GPCR) (ryc. 3).</li>
	<li>Zamontuj szklankę nakrywkową z roztworem montażowym na szybie przesuwnej. Przechyl szklaną prowadnicę, aby usunąć nadmiar roztworu.</li>
</ol>
3. Analiza ciliogenezy w neurosferach
<ol>
	<li>Aby przeanalizować komórki w nienaruszonych neurosferach za pomocą barwienia immunologicznego, przenieś 1 ml pożywki zawierającej wiele neurosfer do probówki o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 500 x g przez 8 minut. Utrwal kulki 4% (PFA) po usunięciu pożywki przez 15 minut i przemyj PBS. Wiruj kulki przy 500 x g przez 8 min, usunąć supernatant i inkubować kulki O/N z 30% sacharozą w temperaturze 4°C. </li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą końcówki o pojemności 1 ml i dodać 500 μl roztworu OCT za pomocą odciętej końcówki o pojemności 1 ml. Odetnij krawędź końcówki, aby poszerzyć otwór, ponieważ OCT jest lepki.</li>
	<li>Przenieś roztwór OCT zawierający neurosfery do jednorazowej plastikowej formy do zamrażania (10 mm x 10 mm x 5 mm).</li>
	<li>Zamrozić formę na suchym lodzie na co najmniej 15 minut.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Przerwij eksperyment i przechowuj formę w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.</li>
	<li>Wytnij sekcje kriostatem; grubość odcinków powinna wynosić 15-30 μm.</li>
	<li>Aby uwidocznić rzęski pierwotne w neurosferze, wykonaj barwienie immunologiczne przeciwko Arl13b (ryc. 4).</li>
</ol>
4. Kultura i przejście neurosfer i przylegających NSC
<ol>
	<li>Przejdź przez neurosfery, gdy rozmiar kuli wynosi od 100 do 200 μm; gdy neurosfery są zbyt duże (300 μm lub więcej), nie są idealne do eksperymentów.</li>
	<li>Przenieś neurosfery do probówki o pojemności 50 ml za pomocą końcówki o pojemności 1 ml i wiruj w dół przy 500 x g przez 8 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą aspiratora, dodać 500 μl 0,05% trypsyny-EDTA do PBS i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Ilość trypsyny różni się w zależności od liczby kulek.</li>
	<li>Dodać 500 μl pożywki surowicy i delikatnie pipetować 20 razy końcówką o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 500 x g przez 8 minut. Odlać supernatant za pomocą końcówki o pojemności 1 ml i dodać 1 ml podłoża podstawowego.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Jeśli widoczne są szczątki komórkowe lub niezdysocjowane neurosfery, przepuść komórki przez sitko o średnicy 70 μm.</li>
	<li>Umieść komórki w 10-centymetrowym naczyniu o gęstości 10 000 komórek/cm2 w pożywce NSC; komórki będą gotowe do następnego przejścia po tygodniu.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Aby zamrozić komórki, dodaj pożywkę zamrażającą, aby wytworzyć od 500 000 do 1 000 000 komórek/ml zawiesiny. Zamrozić komórki za pomocą pojemników do kriozamrażania; Niezdysocjowane neurosfery również mogą zostać zamrożone.</li>
	<li>W przypadku hodowli adherentnej rozcieńczyć komórki do 50 000 komórek/cm2 na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PLL i Lamininą pożywką NSC i hodować przez 1-2 dni.</li>
</ol>
5. Głód i analiza rzęsek
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę głodową (tabela 1).</li>
	<li>1-2 dni po początkowym posiewie przylegających komórek po dysocjacji, zmień pożywkę na NSC w jednej studzience (kontrola) i pożywkę głodową w innej studzience (eksperyment).</li>
	<li>Hodować przylegające komórki przez 24 godziny.</li>
	<li>Utrwalić komórki 4% PFA w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej i przemyć dwukrotnie PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Przerwać eksperyment i przechowywać 24-dołkowe płytki z szkiełkami nakrywkowymi w PBS w temperaturze 4 °C przez 1-2 miesiące.</li>
	<li>Wykonaj protokół immunofluorescencji do barwienia7,50.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą rozwiązania montażowego. Wysuszyć szkiełko szkiełkowe O/N przy RT w ciemności.</li>
	<li>Rejestruj obrazy pod mikroskopem złożonym w wymaganym powiększeniu. Używaj mikroskopu, kamery i obiektywów (40X/1.3 oleju i 63X/1.4 oleju), sterowanych za pomocą dołączonego oprogramowania. Wykonaj wystarczającą ilość przekrojów z w odstępach 0,5-0,8 μm (ryc. 5).</li>
	<li>W celu analizy ilościowej lokalizacji rzęsek w przylegających komórkach, należy uzyskać stosy obrazów z 3-8 kolejnych pól z łączącymi się komórkami, patrząc na kanał DAPI. Określ ilościowo liczbę rzęsek pierwotnych za pomocą ImageJ/Fiji. Zazwyczaj użyj narzędzia "Licznik komórek" w oknie dialogowym ImageJ Plugins>Analyze, aby policzyć komórki z rzęskami GPCR-dodatnimi; Maksymalne projekcje ze stosów obrazów można również wyeksportować z ImageJ/Fiji.Do celów zliczania i eksportowania należy używać podobnych parametrów intensywności i kontrastu obrazu dla wszystkich obrazów z tego samego eksperymentu.</li>
</ol>
6. Transfekcja neurosfer
<ol>
	<li>Przylegaj zdysocjowane komórki do szkiełek nakrywkowych przez 24 godziny. Użyj gęstości komórek zwykle od 75 000 do 150 000 komórek w 500 μl pożywki NSC w jednym dołku na 24-dołkowej płytce.</li>
	<li>Wymieszać 25 μl zredukowanej pożywki surowicy i 1,5 μl odczynnika do transfekcji w mikroprobówce o pojemności 0,5 ml, wirując przez 5 s.</li>
	<li>Dodać 2,5 μg plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn do oddzielnej mikroprobówki o pojemności 0,5 ml zawierającej 25 μl zredukowanej pożywki surowicy i mieszać przez wirowanie przez 5 sekund.</li>
	<li>Dodać 1 μl odczynnika do transfekcji do drugiej mikroprobówki zawierającej DNA i mieszać przez wirowanie przez 5 s.</li>
	<li>Dodać mieszaninę z probówki zawierającej DNA do pierwszej mikroprobówki i wymieszać pipetując.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji delikatnie dodawać kroplami mieszaninę transfekcyjną do studzienek na wierzchu pożywki NSC (500 μl/studzienkę).</li>
	<li>Zmienić pożywkę 24 godziny po transfekcji na pożywkę kontrolną (pożywka NSC) lub pożywkę głodową (500 μl/studzienkę).</li>
	<li>Utrwal komórki, zmieniając pożywkę na 4% PFA po 24 godzinach i wykonaj barwienie immunologiczne; zazwyczaj przy użyciu tego protokołu uzyskuje się do 10% skuteczności transfekcji.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W tym miejscu opisujemy metodę generowania i utrzymywania kultur neurosfery z dorosłych myszy SVZ. Oto kilka istotnych punktów dotyczących kultur. Po pierwsze, rozmiary kul wynoszą zwykle od 50 do 200 μm. Z naszego doświadczenia wynika, że gdy neurosfera osiąga średnicę większą niż 300 μm, nie osiągnięto optymalnego czasu na pasażowanie. Te większe kule zawierają martwe komórki w jądrze. Po drugie, ponieważ neurosfery są powszechnie używane do badania nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych, ważne jest, aby używa...

Pierwotna rzęska to dynamiczna subkomórkowa kompartment oparty na mikrotubulach, który pełni funkcję anteny sensorycznej koordynującej komórkowe szlaki sygnałowe, w tym szlak Sonic Hedgehog (Shh) podczas rozwoju neuronów embrionalnych1,2, oraz podzielona na przedziały sygnalizacja subkomórkowa w funkcji neuronalnej dorosłego3,4. Komponenty sygnalizacyjne tych szlaków, takie jak receptor Shh Patched5; aktywator szlaku Wygładzony (Smo)6; oraz Gpr1617, sierocy receptor sprzężony z białkiem G (GPCR), który negatywnie reguluje szlak Shh, lokalizując się w rzęskach w dynamiczny sposób. Doniesiono, że wiele GPCR lokalizuje się w rzęskach w neuronach w mózgu7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Defekty rzęsek i szlaków sygnałowych generowanych przez rzęski wpływają na wiele tkanek i są zbiorczo znane jako ciliopaty17,18,19. Spektrum chorób ciliopatii często obejmuje wady neurorozwojowe, takie jak nieprawidłowości twarzoczaszki20,21,22. Ponadto rzęski pierwotne w neuronach podwzgórza regulują ośrodkowe szlaki sytości, a defekty skutkują otyłością centralną23, odzwierciedlając otyłość w rzęskach syndromicznych, takich jak zespół Bardeta Biedela24. Ponadto sygnalizacja receptora neuropeptydowego w rzęskach reguluje centralne szlaki sytości11,14. Rzęskowa lokalizacja cyklazy adenylowej III (ACIII) i GPCR, takich jak receptor somatostatyny 3 w neuronach hipokampa, powoduje nowe defekty rozpoznawania obiektów i deficyty pamięci25,26 i odpowiada brakowi integralności rzęsek27. Rozwojowe aspekty sygnalizacji generowanej przez rzęski są ściśle związane z homeostazą tkanek; w szczególności rzęski są ważne dla progresji rdzeniaków zarodkowych podtypu Shh wynikających z komórek progenitorowych ziarnistości w móżdżku28,29. Tak więc pierwotne rzęski odgrywają ważną rolę podczas rozwoju i funkcji neuronów embrionalnych, pourodzeniowych i dorosłych.
Nerwowe komórki macierzyste (NSC) znajdują się w strefie podkomorowej (SVZ) komory bocznej, strefie podziarnistej zakrętu zębatego hipokampa oraz w strefie komorowej trzeciej komory w podwzgórzu u ssaków30,31,32. NSC są multipotencjalne, posiadają zdolność do samoodnawiania się i są ważne dla rozwoju mózgu i medycyny regeneracyjnej30. Większość NSC w SVZ jest w stanie spoczynku i posiada pojedynczą rzęskę pierwotną, która w wielu przypadkach rozciąga się do komory bocznej33. Pierwotna rzęska sygnalizuje poprzez lokalizację różnych receptorów, indukując dalsze odpowiedzi komórkowe, szczególnie w odniesieniu do szlaków Shh, TGFβ i receptorowej kinazy tyrozynowej2,34,35,36. Ponieważ rzęski pierwotne rozciągają się do komory bocznej, przypuszcza się, że rzęski pierwotne wykrywają cytokiny w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF), aby aktywować NSCs37. Ostatnie badania sugerują, że szlak sygnałowy Shh i rzęski pierwotne mają kluczowe znaczenie dla aktywacji komórek macierzystych w naprawie i regeneracji wielu tkanek, w tym nabłonka węchowego, płuc i nerek38,39,40,41. Nie są jednak znane mechanizmy, za pomocą których płyn mózgowo-rdzeniowy komunikuje się z NSC i czy zaangażowane są rzęski pierwotne. Przylegające NSC w kulturze są orzęsione; lokalizować składniki szlaku Shh, takie jak Smo i Gpr161 w rzęskach; i są responsywne Shh42. W związku z tym NSC mogą służyć jako ważny system modelowy do badania szlaku Shh, transportu rzęskowego i szlaków różnicowania neuronów. Ponadto neurony zróżnicowane od NSC mogą być również wykorzystywane do testów transportu rzęskowego.
Neurosfery składają się z klastrów swobodnie unoszących się komórek, powstałych w wyniku proliferacji nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych, które rosną w obecności specyficznych czynników wzrostu i powierzchni nieadhezyjnych43,44. Neurosfery służą jako ważne modele hodowli in vitro do badania nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w prawidłowym rozwoju i chorobie31,45,46,47. W tym miejscu opisujemy test oparty na neurosferze do hodowli nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych i różnicowania w neurony / glej. Szczególnie kładziemy nacisk na transport składników sygnałowych do rzęsek nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych i zróżnicowanych neuronów (ryc. 1). W przeciwieństwie do hodowli neuronów pierwotnych, neurosfery pierwotne są stosunkowo łatwe do hodowli, są podatne na wielokrotne pasaże i cykle zamrażania-rozmrażania oraz mogą ulegać różnicowaniu w neurony/glej. Co ważne, ustaliliśmy, że neuronalne komórki macierzyste / progenitorowe pochodzące z neurosfery i zróżnicowane neurony są orzęsione w hodowli i lokalizują cząsteczki sygnałowe istotne dla funkcji rzęsek w tych przedziałach. Metody hodowli oparte na neurosferze mogą służyć jako idealny system modelowy do badania ciliogenezy i transportu rzęsek w NSC i zróżnicowanych neuronach.

<table><tbody><tr><td>Okrągła szklana osłona 12 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu (PFA)</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>probówka 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 95 mm x 15 mm, pokrywka wsuwana</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td>10 cm naczynie</td></tr><tr><td>70 &micro; Filtr siatkowy do komórek m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Osioł anty Królik, Alexa 488 przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Arl13B, Clone N295B/66</td><td>Neuromab</td><td>AB_11000053</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50X), bez surowicy</td><td></td><td></td><td>Wirówka</td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific 17504001 B27Thermo scientific</td><td>ST 40R</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka kriogeniczna</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>Dnaza I</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Jednorazowe formy do próbek winylu</td><td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td><td>4565</td><td>10 mm x 10 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco 10X, modyfikowana, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, płynna, sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowych</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Kleszcze Narzędzia naukowe</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td> <td>Fluoromount-GRozwiązanie montażowe Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty mysie IgG1, koniugat Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21127</td><td>Koza anty mysie IgG1, Alexa 555 przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Kozioł anty Mysz IgG2a Przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 555 koniugat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21137</td><td>Koza anty mysz IgG2a, Alexa 555 przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Gpr161</td><td>domowej roboty</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ludzki bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Hemocytometr FGF</td></tr><tr><td>Hausser Scientific</td><td>0,100 mm</td><td>głębokości ulepszony neubauer</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td>Izofluoran</td></tr><tr><td>Laminina z błony podstawnej mięsaka Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina L-Glutamina (200 mM)</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000 Odczynnik do transfekcji</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>5100-0036</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502001</td><td>N2</td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Związek OCT</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko EGF, systemy CF</td><td>R i D</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>EGF Nożyczki</td><td>Narzędzia precyzyjne</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe Superfrost plus</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-15</td><td>Szkiełka</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA (10X)</td><td>Sigma</td><td>T4174-100</td><td>Trypsyna</td></tr><tr><td>COSTAR 6-dołkowa płytka, z pokrywką Płaskie dno Bardzo niska powierzchnia mocowania Polistyren, sterylny</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>ultra-low binding 6-well plate</td></tr> <tr><td>&beta;-tubulina III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>TUJ1</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie pierwotnych kultur neurosfery do badania rzęsek pierwotnych

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Pierwotna rzęska jest fundamentalnie ważna dla proliferacji nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych oraz dla różnicowania neuronów podczas życia embrionalnego, poporodowego i dorosłego. Ponadto większość zróżnicowanych neuronów posiada pierwotne rzęski, w których znajdują się receptory sygnałowe, takie jak receptory sprzężone z białkiem G, oraz cząsteczki sygnałowe, takie jak cyklazy adenylowe. Rzęska pierwotna determinuje aktywność wielu ścieżek rozwojowych, w tym szlaku jeża sonicznego podczas rozwoju neuronów embrionalnych, a także pełni funkcję w promowaniu przedziałowej sygnalizacji subkomórkowej podczas funkcji neuronalnych dorosłych. Nic dziwnego, że defekty w pierwotnej biogenezie i funkcji rzęsek zostały powiązane z anomaliami rozwojowymi mózgu, otyłością centralną oraz deficytami uczenia się i pamięci. Dlatego konieczne jest zbadanie pierwotnej biogenezy rzęsek i transportu rzęsek w kontekście nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych i zróżnicowanych neuronów. Jednak metody hodowli neuronów pierwotnych wymagają znacznej wiedzy specjalistycznej i nie są podatne na cykle zamrażania i rozmrażania. W tym protokole omawiamy metody hodowli mieszanych populacji nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych przy użyciu pierwotnych neurosfer. Metody hodowli oparte na neurosferze zapewniają połączone korzyści płynące z badania pierwotnych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych: zdolność do wielu przejść i cykli zamrażania i rozmrażania, potencjał różnicowania w neurony/glej oraz transfekcyjność. Co ważne, ustaliliśmy, że neuronalne komórki macierzyste / progenitorowe pochodzące z neurosfery i zróżnicowane neurony są orzęsione w hodowli i lokalizują cząsteczki sygnałowe istotne dla funkcji rzęsek w tych przedziałach. Wykorzystując te kultury, dalej opisujemy metody badania ciliogenezy i transportu rzęsek w nerwowych komórkach macierzystych / progenitorowych i zróżnicowanych neuronach. Te metody oparte na neurosferze pozwalają nam badać szlaki komórkowe regulowane rzęskami, w tym receptor sprzężony z białkiem G i sygnalizację sonic hedgehog, w kontekście nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych i zróżnicowanych neuronów.

Po wysianiu komórek z SVZ w medium NSC na okres jednego tygodnia zaobserwowano pływające neurosfery (Rycyna 2A). Wielkość sfer wahała się od 50 do 200 µm. Aby sprawdzić, czy sfery pochodzą z neuralnych komórek macierzystych/progenitorowych, neurosfery wysiano na szkiełka podstawowe pokryte PLL i lamininą w medium NSC na 2 dni. Następnie przeprowadzono immunobarwienie przeciwko markerowi neuralnych komórek macierzystych/progenitorowych, Nestin. Dwa dni były niezbędne, aby ...

Pierwotna rzęska jest fundamentalnie ważna w proliferacji neuronalnych komórek progenitorowych, różnicowaniu neuronów i funkcjonowaniu neuronów dorosłych. W tym miejscu opisujemy metodę badania ciliogenezy i transportu białek sygnałowych do rzęsek w nerwowych komórkach macierzystych / progenitorowych i zróżnicowanych neuronach przy użyciu pierwotnych kultur neurosfery.

Wykorzystanie pierwotnych kultur neurosfery do badania rzęsek pierwotnych

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie metod hodowli opartych na neurosferach dla pierwotnych neuralnych komórek macierzystych i progenitorowych w celu badania biogenezy i transportu rzęsek pierwotnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie rzęsek pierwotnych, takie jak biogeneza rzęsek oraz transport cząsteczek do rzęsek pierwotnych w pierwotnych neuralnych komórkach macierzystych, progenitorach neuralnych i neuronach.Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania podstawowych kryteriów komórkowych komórek macierzystych neuronów, progenitorów neuronalnych i neuronów do analizy biogenezy oraz szlaków rzęskowych w kontekście rzęski pierwotnej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ hodowla komórek macierzystych neuronów jest technicznie wymagająca dla początkujących. Wykazaliśmy, że demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ dyssekcja komory bocznej oraz etapy takie jak hodowla neurosfer i kwantyfikacja rzęsek pierwotnych są łatwo przyswajalne dzięki obserwacji krytycznych kroków.Procedurę należy rozpocząć od strefy podkomorowej komory bocznej wypreparowanej z dorosłej myszy metodą preparacji całego organu. Tkankę zawierającą SVZ należy umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml. Należy dodać 500 µL 0,05% Trypsyny-EDTA w PBS i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej.Po inkubacji należy dodać 500 µl medium zatrzymującego i delikatnie pipetować od 20 do 30 razy, używając końcówki o pojemności 1 ml. Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza podczas pipetowania. Następnie komórki należy odwirować przy 500 ×g przez osiem minut.Odcieć supernatant, następnie dodać 1 milliliter PBS i resuspendować komórki, delikatnie pipetując pięć razy za pomocą końcówki 1 milliliter. Odwirować przy 500 times G przez osiem minut. Następnie odessać medium za pomocą końcówki 1 milliliter i dodać 1 milliliter medium podstawowego.Po policzeniu komórek, przenieś komórki z jednej SVZ do szalki o średnicy 10 cm z 10 ml medium NSC i inkubuj w temperaturze 37°C przy 5% CO2. Po pięciu do siedmiu dni można zaobserwować neurosfery. Aby przeanalizować komórki w przytwierdzonych neurosferach za pomocą immunobarwienia, przenieś 1 ml medium zawierającego wiele neurosfer do probówki 1,5 ml i odwiruj przy 500 ×g przez osiem minut.Po usunięciu pożywki utrwal sfery w 4% paraformaldehydzie przez 15 minut. Po usunięciu paraformaldehydu inkubuj sfery w 30% sacharozie przez noc. Następnie ponownie odwiruj próbki.Przemyć PBS. Następnie, po odwirowaniu w taki sam sposób jak wcześniej, usunąć i odrzucić nadsącz. Następnie założyć na pipetę odciętą końcówkę 1 ml i nanieść 500 µL roztworu OCT na neurosfery.Przenieś roztwór OCT zawierający neurosfery do jednorazowej plastikowej formy do mrożenia. Następnie zamroź formę na suchym lodzie przez co najmniej 15 minut. Wykonaj skrawki przy użyciu kriostatu.Aby zwizualizować komórki macierzyste w neurosferach, należy przeprowadzić immunostaining przeciwko markerowi komórek macierzystych Nestin. Aby zwizualizować rzęskę pierwotną w neurosferze, należy przeprowadzić immunostaining przeciwko ARL13B. Eksperyment ten należy rozpocząć od jednego do dwóch dni po wysianiu adherentnych, rozdzielonych komórek macierzystych neuronów na szkiełka podstawowe pokryte poli-L-lizyną i lamininą.W studzienkach eksperymentalnych należy wymienić pożywkę na pożywkę głodzeniową, a w studzienkach kontrolnych na świeżą pożywkę NSC. Inkubować przez kolejne 24 godziny. Następnego dnia utrwalić komórki w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Po utrwaleniu przemyć PBS dwa razy po pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadzić immunofluorescencję zgodnie ze standardowymi protokołami. Zamocować szkiełka podstawowe za pomocą medium montażowego.Następnie pozostaw szkiełko do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej, w ciemności. Następnego dnia wykonaj zdjęcia za pomocą mikroskopu złożonego przy odpowiednim powiększeniu. Kamera mikroskopu oraz obiektywy powinny być sterowane za pomocą dołączonego oprogramowania.Wykonaj odpowiednią liczbę przekrojów w osi z w odstępach od 0,5 do 0,8 mikrona. W celu ilościowej analizy lokalizacji rzęskowej w komórkach przylegających, po przejrzeniu kanału DAPI, wybierz od trzech do ośmiu następujących po sobie pól z konfluencyjnymi komórkami. Pozyskaj stosy obrazów z każdego pola.Wykwantyfikuj liczbę rzęsek pierwotnych za pomocą programu ImageJ. Otwórz okno dialogowe Plugins Analyze i wybierz narzędzie Cell Counter, aby policzyć komórki z rzęskami wykazującymi pozytywną reakcję na GPCR. W celu liczenia i eksportu danych stosuj podobne parametry intensywności obrazu i kontrastu dla wszystkich obrazów z tego samego eksperymentu.Po 24 godzinach hodowli dysocjowanych komórek w medium NSC lub medium głodzeniowym, komórki utrwalono i poddano immunobarwieniu przeciwko GPR161 (kolor zielony), ARL13B (kolor czerwony) oraz DNA (kolor niebieski). Rzęski wykazujące obecność GPR161 są widoczne w komórkach kontrolnych po lewej stronie oraz w komórkach głodzonych po prawej stronie, co przedstawiono na tych powiększeniach.Białe strzałki i groty strzałek wskazują odpowiednio rzęski GPR161 dodatnie i ujemne. Ten obraz przedstawia kwantyfikację rzęsistych komórek ARL13B dodatnich. Kwantyfikacja została przeprowadzona w dwóch polach widzenia z każdego z dwóch powtórzeń technicznych pojedynczego eksperymentu.Odsetek komórek rzęsowatych wykazujących pozytywną reakcję na ARL13B wzrasta podczas głodzenia. Na tym obrazie przedstawiono kwantyfikację lokalizacji GPR161 w rzęskach pozytywnych pod kątem ARL13B w komórkach kontrolnych oraz głodzonych. Odsetek GPR161 lokalizującego się w rzęskach pozytywnych pod kątem ARL13B również wzrasta podczas głodzenia.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje mniej niż dwie godziny. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inną metodę hodowli komórek pochodzących z guza pierwotnego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak rola rzęsek w genezie nowotworu. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom zajmującym się rzęskami pierwotnymi do eksploracji biogenezy i transportu rzęskowego w pierwotnych układach opartych na neurosferach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób analizy rzęsek pierwotnych w komórkach macierzystych neuronów, progenitorach neuronalnych i neuronach pochodzących z kultur opartych na neurosferach.

using-primary-neurosphere-cultures-to-study-primary-cilia

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Prezentowany tutaj jest protokół spontanicznego generowania neurosfer wzbogaconych w neurony progenitorowe neuronów o dużej gęstości. Podczas tego samego eksperymentu, gdy neurony są powlekane o mniejszej gęstości, protokół powoduje również przedłużone hodowle pierwotnych neuronów szczurów.

Generowanie neurosfer z mieszanych pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley

Przeprowadzanie eksperymentów in vitro w celu jak najdokładniejszego odzwierciedlenia warunków in vivo nie jest łatwym zadaniem. Zastosowanie pierwotnych kultur komórkowych jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia biologii komórki w całym organizmie. Dostarczony protokół określa, jak skutecznie hodować i hodować embrionalne neurony móżdżku myszy.

Pierwotna hodowla neuronów wyizolowanych z embrionalnego móżdżku myszy

Pierwotne rzęski to struktury zewnątrzkomórkowe związane z centriolem. Pierwotne wykrywanie rzęsek za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego jest stosunkowo prostą procedurą, która pozwala uzyskać obrazy o niezwykle wysokiej jakości. W tym protokole fibroblasty wyrażające rzęski pierwotne zostały utrwalone, wybarwione immunologicznie i zobrazowane w mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym.

Proste wykrywanie rzęsek pierwotnych za pomocą immunofluorescencji

Wykorzystanie sztucznej inteligencji (Ai) do analizy obrazów jawi się jako potężne, mniej stronnicze i szybkie podejście w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami. Tutaj wyszkoliliśmy Ai, aby rozpoznawała organellę komórkową, pierwotne rzęski i analizowała właściwości, takie jak długość i intensywność barwienia, w rygorystyczny i powtarzalny sposób.

Podejścia sztucznej inteligencji do oceny rzęsek pierwotnych

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Ta metoda opisuje wykorzystanie endogennego sygnału w transgenicznym modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2 do obrazowania pierwotnych rzęsek in situ, w trzech wymiarach na dużych obszarach zmineralizowanej tkanki, od pobrania tkanki do analizy organizacji rzęsek. Protokół ten może być również stosowany do innych rodzajów tkanek.

Obrazowanie wolumetryczne i analiza rzęsek pierwotnych w tkance mięśniowo-szkieletowej przy użyciu modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2

Hodowla pionowych kropelek ex vivo jest alternatywą dla obecnych technik eksperymentalnych in vitro i in vivo. Protokół ten jest łatwy do wykonania i wymaga mniejszych ilości odczynnika, a jednocześnie umożliwia manipulowanie i badanie unaczynienia, morfogenezy i organogenezy płodu.

Wykorzystanie ex vivo pionowych kultur kropelkowych całych narządów płodu do badania procesów rozwojowych podczas organogenezy myszy

Poznaj metodę hodowli neurosfer do badania biogenezy rzęsek pierwotnych i transportu białek sygnałowych w komórkach macierzystych oraz progenitorowych układu nerwowego.

Wykorzystanie pierwotnych kultur neurosfery do badania rzęsek pierwotnych

Przeglądaj więcej filmów