Wykorzystanie pierwotnych kultur neurosfery do badania rzęsek pierwotnych

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie metod hodowli opartych na neurosferze dla pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych do badania biogenezy i transportu pierwotnych rzęsek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rzęsek pierwotnych, takich jak biogeneza rzęsek i transport cząsteczek rzęsek do rzęsek pierwotnych. W pierwotnych nerwowych komórkach macierzystych, progenitorach nerwowych i neuronach.

Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wykorzystać pierwotne kryteria komórkowe nerwowych komórek macierzystych, progenitorów nerwowych i neuronów do analizy biogenezy i szlaków rzęskowych w kontekście rzęski pierwotnej. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ hodowla nerwowych komórek macierzystych jest technicznie trudna dla początkujących. Pokażemy, że demonstracja tej metody jest krytyczna, ponieważ rozwarstwienie komory bocznej i etapy, takie jak hodowla neurosfer i kwantyfikacja rzęsek pierwotnych, można łatwo się nauczyć, obserwując krytyczne kroki.

Rozpocznij tę procedurę od strefy podkomorowej bocznej brzusznej wyciętej od dorosłej myszy przy użyciu metody rozwarstwienia całego mocowania. Umieść tkankę zawierającą SVZ w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 500 mikrolitrów 0,05% trypsyny-EDTA w PBS i inkubuj 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.

Po inkubacji dodać 500 mikrolitrów pożywki zatrzymującej i delikatnie pipetować 20 do 30 razy za pomocą końcówki o pojemności 1 mililitra. Podczas pipetowania należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza. Następnie wiruj komórki z prędkością 500 razy G przez osiem minut.

Wyrzuć supernatant, a następnie dodaj 1 mililitr PBS i ponownie zawieś komórki, delikatnie pipetując pięć razy za pomocą końcówki o pojemności 1 mililitra. Wirować przy 500 razy G przez osiem minut. Następnie odessać podłoże za pomocą końcówki o pojemności 1 mililitra i dodać 1 mililitr podłoża podstawowego.

Po policzeniu komórek umieść komórki z jednego SVZ w 10-centymetrowym naczyniu z 10 mililitrami pożywki NSC i hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po pięciu do siedmiu dniach można zaobserwować neurosfery. Aby przeanalizować komórki w przyłączonych neurosferach przez barwienie immunologiczne, przenieś 1 mililitr pożywki zawierającej wiele neurosfer do 1,5 mililitrowej probówki i wiruj w dół z prędkością 500 razy G przez osiem minut.

Po usunięciu pożywki utrwal kulki 4% paraformaldehydem przez 15 minut. Po usunięciu paraformaldehydu inkubuj kulki z 30% sacharozą przez noc. A potem ponownie odwirować.

Umyć PBS. Następnie, po odwirowaniu jak poprzednio, usunąć i wyrzucić supernatant. Następnie dopasuj pipetę z naciętą końcówką o pojemności 1 mililitra i odpipetuj 500 mikrolitrów roztworu OCT na neurosfery.

Przenieś roztwór OCT zawierający neurosfery do jednorazowej plastikowej formy do zamrażania. Następnie zamroź formę na suchym lodzie na co najmniej 15 minut. Wytnij sekcje za pomocą kriostatu.

Aby zobrazować komórki macierzyste w neurosferze, wykonaj barwienie immunologiczne przeciwko markerowi komórek macierzystych Nestin. Aby uwidocznić rzęski pierwotne w neurosferze, wykonaj barwienie immunologiczne przeciwko ARL13B. Rozpocznij ten eksperyment od jednego do dwóch dni po wysianiu przylegających zdysocjowanych nerwowych komórek macierzystych na szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną i Lamininą.

Zmienić pożywkę w dołkach doświadczalnych na pożywkę głodową i na świeżą pożywkę NSC w studzienkach kontrolnych. Inkubować przez kolejne 24 godziny. Następnego dnia utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po utrwaleniu przemyć PBS dwa razy przez pięć minut każdy, w temperaturze pokojowej. A następnie wykonaj immunofluorescencję przy użyciu standardowych protokołów. Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą rozwiązania montażowego.

Następnie wysuszyć szkiełko szkiełkowe przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnego dnia uzyskaj obrazy pod mikroskopem złożonym w wymaganym powiększeniu. Kamerą mikroskopu i obiektywami należy sterować za pomocą dołączonego oprogramowania.

Wykonaj wystarczającą ilość przekrojów z w odstępach od 0,5 do 0,8 mikrona. Do analizy ilościowej lokalizacji rzęsek w przylegających komórkach wybierz od trzech do ośmiu kolejnych pól z łączącymi się komórkami, przeglądając kanał DAPI. Pobieraj stosy obrazów z każdego pola.

Określ ilościowo liczbę rzęsek pierwotnych za pomocą ImageJ. Otwórz okno dialogowe Analiza wtyczek i wybierz narzędzie Licznik komórek, aby policzyć komórki z rzęskami dodatnimi GPCR. Używaj podobnych parametrów intensywności i kontrastu obrazu dla wszystkich obrazów z tego samego eksperymentu na potrzeby zliczania i eksportowania.

24 godziny po wyhodowaniu zdysocjowanych komórek w pożywce NSC lub pożywce głodowej komórki utrwalono i wybarwiono immunologicznie przeciwko GPR161 pokazanemu na zielono, ARL13B, który wydaje się czerwony, i DNA pokazanemu jako niebieskiemu. Rzęski GPR161 dodatnie obserwuje się w komórkach kontrolnych po lewej stronie, a wygłodzone komórki po prawej. Jak widać na tych powiększonych widokach.

Białe strzałki i groty strzałek wskazują odpowiednio dodatnie i ujemne rzęski GPR161. Ten obraz przedstawia kwantyfikację komórek rzęskowych ARL13B dodatnich. Kwantyfikacja jest przeprowadzana z dwóch pól widzenia, z których każde pochodzi z dwóch powtórzeń technicznych jednego eksperymentu.

Odsetek komórek rzęskowych ARL13B dodatnich wzrasta po zagłodzeniu. Ten obraz pokazuje kwantyfikację lokalizacji GPR161 w rzęskach dodatnich ARL13B w komórkach kontrolnych i głodzonych. Odsetek GPR161 lokalizujący się w rzęskach ARL13B dodatnich również wzrasta po głodówce.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż dwie godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inną metodę hodowli pierwotnych komórek pochodzących z nowotworu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak rola rzęsek w genezie guza. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rzęskami pierwotnymi do zbadania biogenezy rzęsek i transportu w pierwotnych systemach opartych na neurosferze.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować pierwotne rzęski w nerwowych komórkach macierzystych, progenitorach nerwowych i neuronach, które pochodzą z kultur opartych na neurosferze.