Skalowanie zaprojektowanych przeszczepów naczyniowych przy użyciu prowadnic drukowanych w 3D i metody układania pierścieni

Ogólnym celem tej metody jest solidne i konsekwentne generowanie zmodyfikowanych naczyń krwionośnych o dowolnej wielkości. Technika ta pozwala na niezawodną i skuteczną inżynierię naczyń krwionośnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że naczynia o dowolnej wielkości można łatwo i niezawodnie wyprodukować.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy dyskutowaliśmy o tym, jak zaprojektować rurkę z tkanki i porównaliśmy naszą metodę do budowy tuneli drogowych, segment po odcinku. Aby przygotować wydrukowane w 3D wkładki, najpierw dodaj cienką warstwę dwóch, czterech lub sześciu ml nieutwardzonego silikonu na dno odpowiednio 35, 60 lub 100 milimetrowej szalki Petriego. Aby utworzyć słupki dla płyt 35 mm, wlej PDMS do innej płytki 100 mm na wysokość siedmiu mm i podgrzej PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin.

Po utwardzeniu PDMS użyj pięciomilimetrowego stempla do biopsji, aby utworzyć cylindryczne wkłady. Używając niewielkiej ilości nieutwardzonego PDMS, aby przymocować cylindry do środka każdej płytki 35 mm. Umieść wydrukowaną w 3D powłokę zewnętrzną o średnicy około 66,7 mm w równej odległości od słupka w płytach 100 mm.

Zanim PDMS na dole płyt 60 i 100 mm zostanie utwardzony, umieść wydrukowane w 3D słupki o średnicy 10 i 20 mm centralnie w każdej płycie 60 i 100 mm. Pozostaw naczynia do utwardzenia na świeżym powietrzu na płycie grzejnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin, a następnie osiemnaście godzin odgazowywania polimeru. Pod koniec odgazowywania wysterylizuj wnętrze wszystkich płytek 70% etanolem i przykryj każdą płytkę na 30 minut.

Następnie ostrożnie zassaj etanol z każdej płytki, aby umożliwić wyschnięcie na powietrzu. Gdy płytki wyschną, przenieś je do szafki bezpieczeństwa biologicznego obok odpowiadających im pokryw zadrukowanymi do góry. i wystaw materiały na działanie światła UV przez 30 minut, aby zakończyć sterylizację.

Aby przygotować hydrożel fibrynowy, najpierw dodaj 0,5, 1,1 i 1,81 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej żelem fibrynowym i TGF Beta 1 do odpowiednio 35, 60 i 100 mm szalek hodowlanych. Następnie dodaj 40 88,4 i 145 mikrolitrów trombiny odpowiednio do płytek 35, 60 i 100 mm i delikatnie zakręć każdą płytką ręcznie. Gdy trombina jest równomiernie rozprowadzona, dodaj 160, 354 i 580 mikrolitrów fibrynogenu okrężnymi ruchami kroplami do mieszaniny pożywki trombinowej na płytkach odpowiednio 35, 60 i 100 mm i delikatnie zakręć płytki, aby równomiernie rozprowadzić hydrożel.

Pozostaw hydrożel do utwardzenia przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie trypsynizuj interesujące nas komórki mięśni gładkich, namnażaj się na 150-milimetrowych płytkach do hodowli komórkowych i zbieraj oderwane komórki przez wirowanie. Ponownie zawiesić granulki w trzech ml pożywki różnicującej i użyć pipety o pojemności dwóch ml, aby energicznie rozprowadzić komórki w celu rozbicia wszelkich grudek komórek.

Po zliczeniu podziel komórki na 2/10 10 do 6, 1/10 10 do 7 i 1,4 x 10 do 7 komórek na ml podwielokrotności w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml, oznaczonych zgodnie z odpowiadającymi im płytkami hodowlanymi. Dodaj pożywkę różnicującą do każdej probówki, aby uzyskać końcowe objętości wysiewu wynoszące dwa, cztery i pięć ml odpowiednio na każdą płytkę 35, 60 i 100 mm Następnie ostrożnie dodawać roztwory komórkowe kroplami na przygotowany hydrożel na każdej odpowiedniej płytce w celu ekspansji w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po dwóch, czterech dniach pierścienie całkowicie skurczą się w kierunku swoich słupków.

Dodaj więc 10, 20 lub 35 ml TGF Beta 1 do każdego pierścienia o średnicy odpowiednio 35, 60 i 100 mm. Aby zmontować konstrukcję naczyniową dla naczynia 35 mm, wytnij dwucalowy odcinek od góry 50 ml stożkowej rurki z poliwęglanu, a PDMS przyklej górną krawędź do płytki 35 mm, aby utworzyć wysoką płytę do układania pierścieni. W przypadku zbiorników o średnicy 60 i 100 mm płyty do układania w stosy z wysokimi pierścieniami należy pociąć rurkę poliwęglanową o średnicy 1,75 cala na odcinki 2,5 cala wzdłuż, aby służyły jako wysokie ścianki płyty.

W przypadku wysokich dna płyt pokrój arkusz poliwęglanu o grubości 0.125 cala na okrągłe kawałki o średnicy dwóch cali. Za pomocą akrylowego cementu rozpuszczalnikowego zwiąż odcinki rur poliwęglanowych z okrągłymi wyciętymi kawałkami. Drukuj w 3D słupki o średnicy pięciu, dziesięciu i 20 mm o długości 50 mm.

Następnie dodaj 10 ml nieutwardzonego silikonu do każdego pojemnika, centralnie umieszczając każdy wydrukowany w 3D słupek w każdym pojemniku 35, 60 i 100 mm, zanim PDMS zostanie całkowicie utwardzony. I umieść naczynia na płycie grzejnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza na dwie do trzech godzin. Po utwardzeniu PDMS wysterylizuj płytki 70% etanolem, jak właśnie pokazano, a następnie wystawij wysuszone pojemniki wysterylizowane etanolem na działanie światła UV przez 30 minut.

Teraz użyj dwóch par bardzo cienkich kleszczy, aby ostrożnie podnieść najpierw jedną stronę, a następnie drugą ciasno zwiniętego pierścienia hydrożelowego mięśni gładkich z jego słupka. Następnie ostrożnie wsuń jedną stronę pierścienia, a następnie drugą na wysoki słupek odpowiedniego większego pojemnika o następnym rozmiarze. Pracując obwodowo, delikatnymi stopniowymi ruchami, powoli dociskaj pierścień w dół słupka, a następnie układaj dodatkowe pierścienie tkankowe, aż do uzyskania pożądanej długości naczynia.

Gdy wszystkie pierścienie zostaną ułożone w stos, obróć płytki tak, aby słupki były równoległe do powierzchni roboczej i delikatnie dodaj 40, 80 i 160 mikrolitrów trombiny na zewnętrzną powierzchnię każdego naczynia odpowiednio 35, 60 i 100 mm, powoli obracając płytki. Następnie dodaj 40, 80 i 160 mikrolitrów fibrynogenu do każdego konstruktu o średnicy odpowiednio 35, 60 i 100 mm, tak szybko i równomiernie, jak to możliwe, energicznie obracając konstruktor. Trombina i fibrynogen po zmieszaniu szybko stwardnieją w twardy żel.

Następnie dodaj 20 ml pożywki różnicującej do każdego pojemnika i umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Analiza histologiczna ujawnia wysoką komórkowość we wszystkich rozmiarach pierścieni, z niewielką ilością resztkowego żelu fibrynowego obserwowaną na zewnętrznych krawędziach małych pierścieni. W większych pierścieniach pewna ilość żelu fibrynowego jest przeplatana zawartością komórkową, ze wskazaniami na produkcję kolagenu widoczną zarówno w pierścieniach pośrednich, jak i dużych.

Analiza pierścieni tkankowych pod kątem ekspresji aktyny mięśni gładkich alfa i tropomiozyny ujawnia, że wszystkie rozmiary pierścieni są dodatnie dla obu przeciwciał, co potwierdza, że fenotyp mięśni gładkich został utrzymany. Próba rozciągania wskazuje na stałą tendencję do zwiększania wytrzymałości korelującej ze wzrostem rozmiaru pierścienia i naczynia we wszystkich trzech rozmiarach pierścieni. Liczby wysiewu komórek do tworzenia różnych rozmiarów pierścieni są również skorelowane z powierzchnią wysiewu.

Te konstrukcje naczyń są również w stanie wytrzymać przepływ do pięciu minut przy natężeniu przepływu od 100 do 417 ml na minutę, przy czym obserwuje się tylko niewielkie nieszczelności w miejscu, w którym naczynia łączą się z systemem obfitości. Po opanowaniu pierścienie można zaprojektować w ciągu jednej godziny, jeśli technika jest prawidłowo wykonana. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym wymieszaniu składników hydrożelu, aby zapewnić utrwalenie żelu i prawidłowe utworzenie pierścienia.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak tworzenie pierścieni innych typów komórek, w celu inżynierii innych typów tkanek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać metody układania pierścieni do inżynierii tkanek naczyniowych o różnych rozmiarach.