Name: Skalowanie zaprojektowanych przeszczepów naczyniowych przy użyciu prowadnic drukowanych w 3D i metody układania pierścieni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T11:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę skalowania przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem prowadnic drukowanych w 3D i układania pierścieni komórek mięśni gładkich. Technika umożliwia wytwarzanie naczyń dopasowanych do wymiarów tętnic wieńcowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować naszym kolegom z laboratorium Lam, Ammarowi Chishti i Bijalowi Patelowi, za ich życzliwą pomoc przy niektórych badaniach histologicznych i hodowli komórkowych. Finansowanie zostało zapewnione przez Wayne State University Nanomedicine Fellowship (CBP), Start-Up Funds oraz Cardiovascular Research Institute Seed Grant (MTL).

1. Przygotowanie hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Wykorzystaj ludzkie komórki mięśni gładkich aorty zakupione komercyjnie.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w pożywce do wzrostu komórek mięśni gładkich składającej się z 88,6% 231 pożywki, po 0,1% rekombinowanej insuliny ludzkiej (rH-insuliny), rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów (rH-FGF), rekombinowanego ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (rH-FGF) i kwasu askorbinowego; oraz po 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i L-glutaminy; oraz 1% antybiotyku/antybiotyku przeciwgrzybiczego. 
	UWAGA: Każdy czynnik wzrostu, FBS i L-glutamina są kupowane jako zestaw do wzrostu pożywki naczyniowej.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 48 godzin, aż komórki będą zlewać się w około 90% i będą gotowe do wysiewu tkanek.</li>
	<li>Przechowuj komórki w inkubatorze pomiędzy wymianami pożywki w celu ekspansji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie drukowanych w 3D wkładek i niestandardowych silikonowych płyt formowanych
<ol>
	<li>Użyj komercyjnej drukarki 3D (np. Replicator Mini) do drukowania 3D wkładek do płyt.
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania do projektowania 3D typu open source, takiego jak Blender, aby stworzyć modele 3D wydrukowanych powłok zewnętrznych i słupków.</li>
		<li>Wyeksportuj plik sterownika modelu w formacie .stl, co pozwala na przenośność do oprogramowania drukarki 3D.</li>
		<li>Produkuj drukowane słupki i powłoki zewnętrzne za pomocą filamentu poli(kwasu mlekowego) (PLA) załadowanego do drukarki 3D.</li>
		<li>Po wydrukowaniu wykonaj 30-minutowe namoczenie w roztworze etanolu o sile 70%-100%, aby wysterylizować każdą wkładkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować utwardzacz w stosunku 1:10 do bazy mieszaniny polimerów silikonowych z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) i pozostawić mieszaninę do odgazowania w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
	<ol>
		<li>Zdefiniuj używane rozmiary szalek Petriego jako małe (35 mm), pośrednie (60 mm) i duże (100 mm).</li>
		<li>Dodaj 2 ml, 4 ml i 6 ml nieutwardzonego silikonu odpowiednio do każdej małej, pośredniej i dużej płytki i utwórz cienką warstwę na całym dnie szalki Petriego.</li>
		<li>Stwórz słupki dla małej płytki, wlewając PDMS do płytki o średnicy 100 mm na wysokość 7 mm i pozostaw do utwardzenia na gorącej płycie w temperaturze 60 °C przez około 2-3 godziny. Następnie użyj dziurkacza do biopsji o średnicy 5 mm, aby wybić cylindryczne słupki. Użyj niewielkiej ilości nieutwardzonego PDMS, aby zabezpieczyć każdą butlę PDMS i do środka każdej małej płytki.</li>
		<li>W przypadku płyt pośrednich i dużych, przed całkowitym utwardzeniem PDMS na dnie płyty, umieść wydrukowane w 3D słupki o średnicy 10 mm i 20 mm centralnie w każdej pośredniej i dużej płycie, odpowiednio. W przypadku dużych płyt należy dodatkowo umieścić wydrukowaną w 3D powłokę zewnętrzną o średnicy około 66,7 mm w równej odległości od słupka.
		<ol>
			<li>Pozostawić każde naczynie do utwardzenia na wolnym powietrzu na płycie grzejnej w temperaturze 60 °C przez około 2-3 godziny, pozostawiając 18 godzin na odgazowanie polimeru. Przymocuj wydrukowane komponenty do płyty w odpowiednim regionie i orientacji, jak pokazano na rysunku 1.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodaj roztwór 70% etanolu z 30% wodą destylowaną przez 30 minut do wnętrza wszystkich płytek w celu sterylizacji, a następnie przykryj każdą płytkę.</li>
		<li>Ostrożnie zassać etanol z każdej płytki i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Ułóż każdą płytkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) obok jej pokrywy, stroną zadrukowaną do góry. Wystaw talerze i pokrywki na działanie światła UV pod BSC przez 30 minut, aby zakończyć sterylizację. Technika sterylna jest wykonywana na każdym kroku po ekspozycji na promieniowanie UV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie hydrożelu fibrynowego, siew komórek mięśni gładkich i pielęgnacja płytek
<ol>
	<li>Wymieszać roztwór żelu fibrynowego zawierający pożywkę wzrostową + 0,01% TGF-β1 w ilościach 0,5 ml, 1,1 ml i 1,81 ml odpowiednio dla małych, pośrednich i dużych rozmiarów płytek.
	<ol>
		<li>Dodać 40 μl, 88,4 μl i 145 μl trombiny z zapasu 100 j/ml do pożywki odpowiednio na każdej małej, pośredniej i dużej płytce. Delikatnie obracaj każdą płytkę ręcznie, aby upewnić się, że trombina jest równomiernie wymieszana z podłożem.</li>
		<li>Następnie dodać 160 μl, 354 μl i 580 μl fibrynogenu z zapasu 20 mg/ml, kroplami okrężnie do mieszaniny trombiny-pożywki odpowiednio na każdą małą, pośrednią i dużą płytkę. Delikatnie zamieszaj ręcznie, aby zapewnić wymieszanie i rozprowadzenie hydrożelu w równą warstwę.</li>
		<li>Pozostaw hydrożel do utwardzenia przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trypsynizuj komórki mięśni gładkich rozprężone na płytkach do hodowli komórkowych o średnicy 150 mm i odwiruj zgodnie ze standardowymi protokołami. Otrzymany osad należy ponownie zawiesić w 3 ml pożywki różnicującej składającej się z 98% - 231 pożywki, 1% FBS i 1% antybiotyku/antybiotyku/antybiotyku.
	<ol>
		<li>Energicznie wymieszaj komórki, miareczkując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 2 ml, aby rozbić wszelkie grudki komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru i utwórz zawiesinę komórek 2 x 106 komórek/ml, 1,0 x 107 komórek/ml i 1,4 x 107 komórek/ml odpowiednio dla małych, pośrednich i dużych płytek.</li>
		<li>Dodać 1 ml każdej zawiesiny komórkowej do odpowiedniego stożkowego pojemnika o pojemności 50 ml oznaczonego jako mały, pośredni i duży. Ustaw w ten sposób dodatkowe 50 ml stożka dla każdego dodatkowego pożądanego pierścienia tkankowego.</li>
		<li>Dodać pożywkę różnicującą do każdego stożka, aby uzyskać końcową objętość wysiewu wynoszącą odpowiednio 2 ml, 4 ml i 5 ml dla każdego małego, pośredniego i dużego naczynia. Następnie ostrożnie odpipetować roztwór komórkowy kroplami na przygotowany hydrożel w każdej odpowiedniej płytce.</li>
		<li>Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieniaj podłoża różnicujące co 48-72 godziny dla każdej płytki. W przypadku większej płytki należy najpierw zmienić podłoże po 24 godzinach, a następnie zmieniać je co 48-24 godziny, aby skompensować gęstość wysiewu dużych komórek.
	<ol>
		<li>Po 2-4 dniach, gdy pierścienie całkowicie skurczą się w kierunku słupka, dodaj 10 μl, 20 μl i 35 μl TGF-β1 odpowiednio do każdego małego, pośredniego i dużego pierścienia. Po wystawieniu na działanie TGF-β1 przez co najmniej 24 godziny, pierścienie są gotowe do pracy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Montaż konstrukcji naczyniowej i konserwacja
<ol>
	<li>Przed wykonaniem ostatecznej konstrukcji naczyniowej tworzony jest specjalistyczny pojemnik do przechowywania gotowego naczynia.
	<ol>
		<li>W przypadku małego naczynia utwórz wysoką płytę do układania pierścieni, odcinając 2-calowy odcinek od góry stożkowej rurki z poliwęglanu o pojemności 50 ml, a następnie PDMS przyklej przyciętą krawędź do płytki o średnicy 35 mm. Użyj stożkowej pokrywki jako pokrywki talerza.</li>
		<li>W przypadku płyt do układania pierścieni o wysokości pośredniej i dużego naczynia należy przyciąć rurkę poliwęglanową o średnicy 1.75 cala na odcinki 2.5 cala wzdłuż, aby służyły jako wysokie ścianki płyty. W przypadku wysokich dna płyt pokrój arkusz poliwęglanu o grubości 0.125 cala na okrągłe kawałki o średnicy 2 cali. Za pomocą akrylowego cementu rozpuszczalnikowego przymocuj odcinek rurki poliwęglanowej do okrągłego wyciętego elementu. Użyj pokrywki z szalki Petriego o średnicy 60 mm jako pokrywki do wysokiego talerza.</li>
		<li>Słupki do druku 3D o średnicy 5, 10 i 20 mm i długości 50 mm.</li>
		<li>Dodaj 10 ml nieutwardzonego silikonu do każdego pojemnika. Przed całkowitym utwardzeniem PDMS należy umieścić centralnie każdy słupek utworzony w kroku 4.1.3 w każdym małym, pośrednim i dużym pojemniku.</li>
		<li>Pozostawić do utwardzenia na gorącej płycie ustawionej na 60 °C przez 2-3 godziny.</li>
		<li>Sterylizuj roztworem 70% etanolu z 30% wodą destylowaną przez 30 minut.</li>
		<li>Ostrożnie zassać etanol z każdego pojemnika, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w BSC. Następnie ułóż pojemniki w okapie tak, aby każdy talerz znajdował się obok pokrywy, stroną do góry. Wystaw pojemniki na działanie światła UV pod BSC przez dodatkowe 30 minut w celu dalszej sterylizacji. Stosuj sterylną technikę na każdym kroku po ekspozycji na promieniowanie UV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą bardzo cienkich kleszczy ostrożnie wyjmij każdy ciasno zwinięty pierścień hydrożelowy mięśni gładkich z jego słupka i przenieś do odpowiedniego większego pojemnika z wysokimi słupkami.
	<ol>
		<li>Użyj kleszczy w każdej ręce i podnieś jedną stronę pierścienia ze słupka, a następnie drugą. Zachowaj ostrożność, aby chronić i utrzymywać światło.</li>
		<li>Wykonaj przenoszenie tą oburęczną metodą, wsuwając najpierw jedną, a następnie drugą stronę pierścienia na wysoki słupek. Delikatnymi, stopniowymi ruchami i pracując obwodowo, powoli dociśnij pierścień w dół na wysoki słupek. Następnie układaj pierścienie tkankowe, aż do uzyskania pożądanej długości naczynia, przy czym każdy pierścień dodaje około 1-2 mm długości do gotowej konstrukcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po umieszczeniu stosu pierścieni na wysokich słupkach wydrukowanych w 3D, obróć płytę tak, aby słupek był równoległy do powierzchni roboczej.
	<ol>
		<li>Za pomocą mikropipety delikatnie dodać 40, 80 i 160 μl trombiny o stężeniu 100 U/ml na zewnętrzną powierzchnię każdego małego, pośredniego i dużego naczynia. Podczas dodawania trombiny powoli obracaj płytkę, aby zapewnić równomierne pokrycie wszystkich powierzchni konstrukcji. Będzie to podstawa dla kleju fibrynowego używanego do zabezpieczania konstrukcji stosu pierścieniowego w pierwszych dniach po budowie.</li>
		<li>Następnie dodaj 40, 80 i 160 μl fibrynogenu o stężeniu 20 mg/ml odpowiednio do każdego małego, pośredniego i dużego konstruktu, używając mikropipety, szybko obracając konstrukt. Trombina i fibrynogen po zmieszaniu szybko łączą się w twardy żel. Ze względu na krótki czas utwardzania, fibrynogen należy nakładać tak szybko i równomiernie, jak to możliwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 20 ml pożywki różnicującej do każdego pojemnika zawierającego konstrukt. Umieścić naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C do czasu, gdy będą potrzebne. Zmieniaj nośniki co 3-5 dni.</li>
</ol>

<ol><li>Luciani, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operative+risk+and+outcome+of+surgery+in+adults+with+congenital+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+J%22%5BJournal%5D)">Operative risk and outcome of surgery in adults with congenital valve disease.</a> ASAIO J. 54 (5), 458-462 (2008).</li>
<li>Lawson, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+acellular+vessels+for+dialysis+access+in+patients+with+end-stage+renal+disease%3A+two+phase+2+single-arm+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human acellular vessels for dialysis access in patients with end-stage renal disease: two phase 2 single-arm trials.</a> Lancet. 14 (387), 2026-2034 (2016).</li>
<li>McAllister, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+haemodialysis+access+with+an+autologous+tissue-engineered+vascular+graft%3A+a+multicentre+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study.</a> Lancet. 373 (9673), 1440-1446 (2009).</li>
<li>Wystrychowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+use+of+an+allogeneic+tissue-engineered+vascular+graft+for+hemodialysis+access%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">First human use of an allogeneic tissue-engineered vascular graft for hemodialysis access.</a> J Vasc Surg. 60 (5), 1353-1357 (2014).</li>
<li>Konig, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+completely+autologous+human+tissue+engineered+blood+vessels+compared+to+human+saphenous+vein+and+mammary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.</a> Biomaterials. 30 (8), 1542-1550 (2009).</li>
<li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+tissue-engineered+small-diameter+vascular+grafts+in+fibrin+scaffolds+in+30+days%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days.</a> Tissue Eng Part A. 20 (9-10), 1499-1507 (2014).</li>
<li>Sundaram, S., Echter, A., Sivarapatna, A., Qiu, C., Niklason, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+vascular+graft+engineered+using+human+embryonic+stem+cell-derived+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small-diameter vascular graft engineered using human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells.</a> Tissue Eng Part A. 20 (3-4), 740-750 (2014).</li>
<li>Quint, C., Arief, M., Muto, A., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+human+tissue-engineered+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Allogeneic human tissue-engineered blood vessel.</a> J Vasc Surg. 55 (3), 790-798 (2012).</li>
<li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 31 (108), 9214-9219 (2011).</li>
<li>Dahl, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Readily+available+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Readily available tissue-engineered vascular grafts.</a> Sci Transl Med. 2 (68), (2011).</li>
<li>Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+completely+biological+engineered+grafts+following+decellularization+into+the+sheep+femoral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery.</a> Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).</li>
<li>Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantable+arterial+grafts+from+human+fibroblasts+and+fibrin+using+a+multi-graft+pulsed+flow-stretch+bioreactor+with+noninvasive+strength+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring.</a> Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).</li>
<li>Meier, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+outgrowth+endothelial+cells+alter+remodeling+of+completely+biological+engineered+grafts+implanted+into+the+sheep+femoral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Blood outgrowth endothelial cells alter remodeling of completely biological engineered grafts implanted into the sheep femoral artery.</a> J Cardiovasc Transl Res. 7 (2), 242-249 (2014).</li>
<li>Pinnock, C. B., Meier, E. M., Joshi, N. N., Wu, B., Lam, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customizable+engineered+blood+vessels+using+3D+printed+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Customizable engineered blood vessels using 3D printed inserts.</a> Methods. S1046-2023 (15), 30184-30185 (2015).</li>
<li>Blakely, A. M., Manning, K. L., Tripathi, A., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Pick%2C+Place%2Cand+Perfuse%3A+A+New+Instrument+for+Three-Dimensional+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Bio-Pick, Place,and Perfuse: A New Instrument for Three-Dimensional Tissue Engineering.</a> Tissue Eng Part C Methods. 21 (7), 737-746 (2015).</li>
<li>Gwyther, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).</li>
<li>Fearon, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+coronary+arterial+dimensions+early+after+cardiac+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Changes in coronary arterial dimensions early after cardiac transplantation.</a> Transplantation. 27 (6), 700-705 (2007).</li>
<li>Erbel, R., Eggebrecht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+dimensions+and+the+risk+of+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">Aortic dimensions and the risk of dissection.</a> Heart. 92 (1), 137-142 (2006).</li>
<li>Ha, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+1+produced+by+vascular+smooth+muscle+cells+predicts+fibrosis+in+the+gastrocnemius+of+patients+with+peripheral+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta 1 produced by vascular smooth muscle cells predicts fibrosis in the gastrocnemius of patients with peripheral artery disease.</a> J Transl Med. 14, 39(2016).</li>
<li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-smooth+muscle+actin%2C+a+differentiation+marker+of+smooth+muscle+cells%2C+is+present+in+microfilamentous+bundles+of+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alpha-smooth muscle actin, a differentiation marker of smooth muscle cells, is present in microfilamentous bundles of pericytes.</a> J Histochem Cytochem. 37 (3), 315-321 (1989).</li>
<li>von der Ecken, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25470062">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda układania pierścieni ma wiele zalet w porównaniu z obecnymi technikami konstruowania tkanek naczyniowych. RSM można dostosować do tworzenia ludzkich naczyń o dowolnej wielkości, po prostu dostosowując wymiary słupka i zewnętrznej powłoki. Nasza metoda pozwala na opracowanie bezpolimerowych naczyń inżynieryjnych składających się wyłącznie z komórek ludzkich i szybko degradującego się materiału podporowego znajdującego się w naturalnym procesie gojenia się ran w organizmie. Wiadomo, że przeszczepy polimerowe powoduj...

W leczeniu choroby wieńcowej (CAD), naczynia krwionośne pacjenta są pobierane jako materiał do operacji wszczepienia bypassów. Często jednak chorzy pacjenci nie mają zdolnych do życia naczyń, które mogliby sobie oddać, a w przypadkach, gdy mają, miejsce dawcze powoduje znaczne dodatkowe szkody i stwarza poważne ryzyko infekcji. 1 Zmodyfikowane przeszczepy naczyniowe mogłyby zaspokoić tę potrzebę. Skalowalność ma ogromne znaczenie dla statków inżynieryjnych, aby sprostać szerokiemu zakresowi wymagań dotyczących wielkości naczyń pacjenta. Jednak obecne metody dla statków inżynieryjnych nie są łatwe do skalowania i zazwyczaj wymagają regeneracji złożonych form lub rusztowań polimerowych. Większość zmodyfikowanych przeszczepów wykorzystuje polimerowe rusztowanie rurkowe, które jest obsiane fibroblastami naczyniowymi, mięśniami gładkimi lub komórkami śródbłonka; lub zwijanie arkusza komórkowego wokół trzpienia, aby utworzyć rurkę z tkanką. Dwa zmodyfikowane przeszczepy naczyniowe w badaniach klinicznych są oparte na bezkomórkowej platformie polimerowo-ECM. 2,3,4 Wiadomo już, że przeszczepy polimerowe dostępne do stosowania w naprawie naczyń krwionośnych mają problemy z drożnością, co może stanowić poważny problem przy długotrwałym stosowaniu przeszczepu z długotrwałą obecnością polimeru. Formy rurowe zostały użyte do produkcji całkowicie komórkowych naczyń,5,6,7,8,9,10,11,12,13 które procedury wymagałyby dodatkowego projektowania i produkcji narzędzi do niestandardowych form w celu wyprodukowania naczyń w różnych rozmiarach.
Metoda opisana tutaj obejmuje nowatorską technikę tworzenia łatwo skalowalnych przeszczepów naczyniowych przy użyciu konfigurowalnych wkładek drukowanych w 3D i tradycyjnych płytek hodowlanych. 14 Komórki są umieszczane na płytkach z wkładkami w postaci środkowego słupka i zewnętrznej powłoki. Słupek kontroluje średnicę światła i umożliwia monowarstwie komórek samoorganizację się w pierścień tkanki. Zewnętrzna powłoka kontroluje grubość pierścienia, a tym samym grubość ścianki końcowego naczynia. Gotowe pierścienie tkankowe są następnie układane w stosy, tworząc rurkowaty, naczyniowy przeszczep. Zaletą tej metody, określanej jako "metoda układania pierścieni", jest to, że każdy przylegający typ komórek może być wysiewany do zestawu płytki, a pierścienie tkankowe lub rurki o dowolnym rozmiarze potrzebnym do pożądanego zastosowania można wygenerować po prostu modyfikując wkładki prowadzące. Techniki porównawcze w inżynierii tkankowej tworzące pierścienie tkanek pozostają trudne do skalowania,15,16 wymagające regeneracji form dla każdego pożądanego rozmiaru. Dodatkowo przeszczepy naczyniowe wykonane tą metodą mogą być wykonane w ciągu 2-3 tygodni, czyli o kilka tygodni szybciej w porównaniu z innymi naczyniami inżynieryjnymi. 6 Dla kliniki, ta rozbieżność czasowa może mieć znaczący wpływ na leczenie pogarszającego się pacjenta.

<table><tbody><tr><td>Ludzkie komórki mięśni gładkich aorty&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td>komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych</td></tr><tr><td>Medium 231</td><td>Gibco (Life Technologies&nbsp;</td><td>M-231-500</td><td>podłoże specyficzne dla komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych</td></tr><tr><td>Zestaw do wzrostu komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty&nbsp;</td><td>Czynniki wzrostu ATCC</td><td>PSC-100-042</td><td>do utrzymania żywotności komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych</td></tr><tr><td>Replicator Mini drukarka 3D&nbsp;</td><td>MakerBot&nbsp;</td><td>Drukarka 3D</td> <td>N/A</td></tr><tr><td>Atrament 3D z poli(kwasu mlekowego) (PLA)</td><td>MakerBot&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>filamentu do drukarki 3D</td></tr><tr><td>Poli(dimetylosiloksan) (PDMS)</td><td>Ellworth Adhesives&nbsp;</td><td>3097358-1004</td><td>polimer do klejenia części płyt</td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Hyclone Labratories, Inc.</td><td>SH30256.01</td><td>składnik żelu fibrynowego</td></tr><tr><td>Trombina&nbsp;</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>F3879-5G</td><td>składnik żelu fibrynowego</td></tr><tr><td>Tranformingowy czynnik wzrostu-Beta 1&nbsp;</td><td>Czynnik wzrostu PeproTech</td><td>100-21</td><td>do stymulacji produkcji kolagenu</td></tr><tr><td>Hemocytometr&nbsp;</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td>do zliczania komórek</td></tr><tr><td>Rurki poliwęglanowe&nbsp;</td><td>Tworzywa sztuczne w USA&nbsp;</td><td>PCTUB1.750X1.625</td><td>materiał do wyrobu wysokich, pierścieniowych płyt do układania w stosy</td></tr><tr><td>Płyta poliwęglanowa&nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>409497</td><td>materiał do produkcji wysokich, pierścieniowych płyt do układania w stosy</td></tr><tr><td>Klej polimerowy rozpuszczalnik&nbsp;</td><td>SCIGRIP</td><td>10799</td><td>materiał do wykonywania wysokich, pierścieniowych płyt do układania w stosy</td></tr><tr><td>Instron 5940</td><td>Instron</td><td>N/A</td><td>maszyna do prób rozciągania</td></tr><tr><td>U-Stretch</td><td>Cell Scale</td><td>N/A</td><td>Maszyna do prób rozciągania</td></tr><tr><td>Aktyna mięśni gładkich&nbsp;</td><td>MA5-11547</td><td>Przeciwciało Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Tropomiozyna</td><td>MA5-11783</td><td>Przeciwciało Thermo Fisher</td><td></td></tr></tbody></table>

skalowanie zaprojektowanych przeszczepów naczyniowych przy użyciu prowadnic drukowanych w 3d i metody układania pierścieni

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Choroba wieńcowa pozostaje główną przyczyną zgonów, dotykając miliony Amerykanów. Ze względu na brak dostępnych autologicznych przeszczepów naczyniowych, przeszczepy inżynieryjne oferują ogromny potencjał w leczeniu pacjentów. Jednak zmodyfikowane przeszczepy naczyniowe na ogół nie są łatwe do skalowania, co wymaga produkcji niestandardowych form lub rurek polimerowych w celu dostosowania do różnych rozmiarów, co stanowi czasochłonną i kosztowną praktykę. Średnica światła tętnic ludzkich wynosi około 2,0-38 mm, a grubość ścian około 0,5-2,5 mm. Stworzyliśmy metodę, zwaną "Metodą Układania Pierścieni", w której pierścienie tkanki o pożądanym typie komórek, zademonstrowane tutaj z komórkami mięśni gładkich naczyń krwionośnych (SMC), mogą być tworzone za pomocą prowadnic środkowych słupków do kontrolowania średnicy światła i zewnętrznych powłok do dyktowania grubości ścianki naczynia. Te pierścienie tkankowe są następnie układane w stosy, aby utworzyć rurową konstrukcję, naśladującą naturalną formę naczynia krwionośnego. Długość naczynia można dostosować, po prostu układając w stos liczbę pierścieni wymaganych do uzyskania potrzebnej długości. Dzięki naszej technice tkanki o kształtach rurkowych, podobnych do naczynia krwionośnego, mogą być łatwo wytwarzane w różnych wymiarach i długościach, aby zaspokoić potrzeby kliniki i pacjenta.

Przedstawiono tutaj wytwarzanie trzech różnych rozmiarów zaprojektowanych graftów naczyniowych (Rysunek 1), co wykazuje, że metoda układania pierścieni (Ring Stacking Method, RSM) jest skalowalna. Aby udowodnić możliwość zastosowania, wybrano trzy różne rozmiary naczyń, które odpowiadają rzeczywistym rozmiarom ludzkich naczyń: przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (małe; średnica światła = 4 mm)17, aorty zstępującej (średnie; średnica światła = 1...

Skalowalne naczynia krwionośne poprawiłyby możliwości zastosowania klinicznego. Korzystając z łatwo zwymiarowanych prowadnic drukowanych w 3D, stworzono pierścienie mięśni gładkich naczyń krwionośnych i ułożono je w formę rurkową, tworząc przeszczep naczyniowy. Przeszczepy można dobrać tak, aby spełniały zakres wymiarów ludzkich tętnic wieńcowych, po prostu zmieniając rozmiar prowadnicy wydrukowanej w 3D.

Skalowanie zaprojektowanych przeszczepów naczyniowych przy użyciu prowadnic drukowanych w 3D i metody układania pierścieni

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Ogólnym celem tej metody jest stabilne i powtarzalne wytwarzanie inżynieryjnych naczyń krwionośnych o dowolnym rozmiarze. Technika ta pozwala na niezawodną i skuteczną inżynierię naczyń krwionośnych. Główną zaletą tej metody jest możliwość łatwego i pewnego wytwarzania naczyń o dowolnych wymiarach.Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy podczas dyskusji na temat inżynierii tkanki w kształcie rury; porównaliśmy naszą metodę do budowy tuneli drogowych, segment po segmencie. Aby przygotować wstawki wydrukowane w 3D, należy najpierw nalać cienką warstwę 2, 4 lub 6 mL nieutwardzonego silikonu na dno odpowiednio 35, 60 lub 100 mm szalki Petriego. W celu stworzenia słupków dla płytek 35 mm, należy wlać PDMS do innej płytki 100 mm do wysokości 7 mm, a następnie utwardzać PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 60 °C przez dwie do trzech godzin.Po utwardzeniu PDMS, użyj pięciomilimetrowego wycinaka do biopsji w celu utworzenia cylindrycznych słupków. Używając niewielkiej ilości nieutwardzonego PDMS, przymocuj cylindry do środka każdej płytki 35 mm. Umieść wydrukowaną w technologii 3D zewnętrzną obudowę o średnicy około 66,7 mm w równej odległości od słupka na płytkach 100 mm.Przed ut

scaling-engineered-vascular-grafts-using-3d-printed-guides-ring

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nasz zespół opracował system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne naprężenia pulsacyjne układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych zastążek naczyniowych o małej średnicy.

Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Aby poszerzyć naszą wiedzę na temat komórkowego i molekularnego tworzenia się nowotworów, niedawno opracowano mysi model TEVG. Przeszczepy wszczepiono jako przeszczepy z interpozycją żyły głównej podnerkowej u myszy C57BL/6. Model ten osiąga wyniki podobne do tych osiągniętych w naszym badaniu klinicznym, ale w znacznie krótszym czasie.

Implantacja przeszczepu interpozycji żyły głównej dolnej w modelu mysim

Protokół krok po kroku do międzypozycyjnego umieszczania naczyń TEV (Tissue Engineered Departments) w tętnicy szyjnej owcy za pomocą zespolenia end-to-end i cyfrowej oceny w czasie rzeczywistym in vivo, aż do uśmiercenia zwierzęcia.

Technika chirurgiczna implantacji przeszczepów naczyniowych wykorzystujących inżynierię tkankową, a następnie monitorowanie in vivo

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Tutaj przedstawiono protokół implantacji przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej do tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej, dostarczając odpowiedniego modelu zwierzęcego do badania mechanizmów regeneracji tkanki naczyniowej.

Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej

Poznaj metodę skalowania przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem prowadnic drukowanych w 3D i układania pierścieni komórek mięśni gładkich. Technika umożliwia wytwarzanie naczyń dopasowanych do wymiarów tętnic wieńcowych.

Skalowanie zaprojektowanych przeszczepów naczyniowych przy użyciu prowadnic drukowanych w 3D i metody układania pierścieni

Przeglądaj więcej filmów