Name: Ocena wewnątrzkomórkowego lokalizacji reaktywnych form tlenu w plemnikach Solea senegalensis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę wykrywania H₂O₂ w plemnikach Solea senegalensis przy użyciu mikroskopii konfokalnej z barwnikami fluorescencyjnymi. Protokół umożliwia ocenę lokalizacji reaktywnych form tlenu w mitochondriach i jądrze komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Prace te zostały wsparte finansowo w ramach projektu AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce został sfinansowany przez Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) i Fondo Social Europeo. Autorami są dr Ana Riaza i Stolt Sea Farm S.A., dr Paulino de Paz, dr Ignacio Martínez Montero i José Ramón Guiérrez. Dziękujemy również Pauli Fernández Colado za filmowanie.

UWAGA: Inkubacja fluorochromu i analiza konfokalna zajmą co najmniej 2-3 godziny dla próbki kontrolnej i poddanej działaniu substancji. Przetwarzanie danych nie jest uwzględniane w tym obliczaniu czasu. Wymagane materiały znajdują się w Tabeli Materiałów. Protokół ten można zastosować do plemników świeżych lub kriokonserwowanych. Solea senegalensis to gatunek ryby, który składa ikrę w zimnej wodzie, pracuje zawsze w niskich temperaturach (4-7 °C). Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z ogólnym widokiem protokołu.
1. Prace przygotowawcze przed eksperymentem
<ol>
	<li>Przygotować 1 mM roztwór podstawowy do barwienia mitochondriów w DMSO klasy analitycznej.</li>
	<li>Przygotować 1 μg/ml roztworu podstawowego dichlorowodorku 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Przygotować roztwór Ringera o stężeniu 200 mOsm/kg (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,7)</li>
	<li>Przygotować 4 mM roztwór podstawowy dioctanu 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA) w metanolu o czystości analitycznej. 
	UWAGA: Roztwory podstawowe należy przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	<li>Ustawić mikrowirówkę na 4-7 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki przed inkubacją fluorochromu
UWAGA: Delikatne obchodzenie się z plemnikami jest pożądane podczas pipetowania i ponownego zawieszania.
<ol>
	<li>W przypadku pracy z komórkami kriokonserwowanymi przygotuj kąpiel wodną do rozmrożenia w temperaturze 40 °C dla plemników Solea senegalensis10. Zanurz próbki słomki w łaźni wodnej na 7 sekund.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek do cięcia opróżnić próbkę do probówki do mikrofugi i odwirować w temperaturze 1000 x g, 4-7 °C przez 1 min.</li>
	<li>Usunąć osocze nasienne lub osocze nasienne za pomocą krioprotektantów z próbki kriokonserwowanej przez pipetowanie w celu odrzucenia wszelkich składników, które mogłyby zakłócać protokół barwienia.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 50-100 μl roztworu Ringera o temperaturze 4 °C 200 mOsm/kg.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie plemników za pomocą Neubauera lub podobnej komory liczącej pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 1-2 x 106 komórek/ml w końcowej objętości 0,5 ml w roztworze Ringera o temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Inkubacja fluorochromu
UWAGA: Z fluorochromami należy obchodzić się w warunkach słabego oświetlenia, zwłaszcza gdy są w roztworze.
<ol>
	<li>Dodać 3,125 μl roztworu podstawowego DCFH-DA (końcowe stężenie w próbce: 25 μM) do rozcieńczenia próbki roboczej. Inkubować w temperaturze 4-7 °C przez 40 minut w ciemności10.</li>
	<li>Po 30 minutach dodać do próbki 0,5 μl roztworu podstawowego DAPI (stężenie końcowe w próbce: 2 μM) i 0,5 μl roztworu podstawowego barwienia mitochondriów (stężenie końcowe w próbce: 100 nM). Inkubuj oba fluorochromy przez 10 minut w ciemności.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki do mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Po czasie inkubacji odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 1000 x g, 4-7 °C przez 1 min.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie.</li>
	<li>Dodać 10-20 μl roztworu Ringera o stężeniu 200 mOsm/kg.</li>
	<li>Umieścić 5 μl kropli skoncentrowanej zawiesiny komórek na szkiełku.</li>
	<li>Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe na preparat i uszczelnij go pastą. Po wyschnięciu pasty preparat jest gotowy do mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>
5. Konfiguracja konfokalna przed eksperymentem
UWAGA: W zależności od mikroskopu, DCFH-DA może zostać "spalony". Najpierw ustal najlepsze warunki z próbką niewartościową.
<ol>
	<li>Włącz mikroskop, lasery, kamerę i komputer, na którym działa mikroskop.</li>
	<li>Ustaw lasery wzbudzenia biorąc pod uwagę maksima wzbudzenia i emisji każdego fluorochromu:
	<ol>
		<li>W przypadku DAPI należy przyjąć maksimum wzbudzenia 358 nm i maksimum emisji 465 nm.</li>
		<li>W przypadku barwienia mitochondriów należy zastosować maksimum wzbudzenia 644 nm i maksimum emisji 662 nm.</li>
		<li>W przypadku DCFH-DA należy przyjąć maksimum wzbudzenia 504 nm i maksimum emisji 525 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij pracę z obiektywem 25X, aby skupić się na plemnikach. Wybierz kanał DAPI, aby ustawić ostrość, ponieważ ten fluorochrom zgłasza najwyższą intensywność. Po zogniskowaniu komórek użyj obiektywu 63X lub 100X w celu dokładnej oceny, ponieważ rozmiar plemników Solea senegalensis wynosi około 2 μm.</li>
	<li>Dla każdego kanału zoptymalizuj otworek, wzmocnienie i napięcie. W ten sam sposób dostosuj przesunięcie cyfrowe, aby zmniejszyć tło. Gdy wszystkie parametry zostaną zoptymalizowane pod kątem użytego fluorochromu, zapisz ustawienia. Do rutynowego eksperymentu na pojedynczym plemniku Solea senegalensis użyliśmy następujących parametrów (parametry te mogą się zmieniać w każdym eksperymencie): otworek 1 i napięcie wzmocnienia 750 V.</li>
</ol>
6. Akwizycja obrazów
<ol>
	<li>Wybierz żądane warunki jakości akwizycji obrazu. Zdefiniuj ustawienia akwizycji, takie jak głębia bitowa, format obrazu, grubość jasnego arkusza i wybierz jednostronne oświetlenie. Do rutynowego eksperymentu na pojedynczym plemniku Solea senegalensis użyliśmy następujących parametrów (parametry te mogą ulec zmianie w każdym eksperymencie): rozmiar klatki 1024 px; bitów na piksel 16; szybkość skanowania 2-4).</li>
	<li>Otwórz i wyśrodkuj obszar skanowania, aby rozpocząć i zrobić zdjęcie pola.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia do przycinania wybierz obszar zainteresowania i naciśnij na żywo.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia wskaźnika zasięgu dostosuj przesunięcie cyfrowe, aby zmniejszyć tło. Zrób to dla każdego kanału i zrób zdjęcie.</li>
	<li>Sprawdź jakość poszczególnych kanałów dla każdego fluorochromu i ich kombinacji.</li>
</ol>
7. Tworzenie filmu z obrazem 3D
<ol>
	<li>Ustawienia akwizycji Z-stack.
	<ol>
		<li>Wybierz opcję Z-stack w oprogramowaniu.</li>
		<li>Zaznacz pojedynczą komórkę, grupę komórek lub obszar zainteresowania i ustaw na nim fokus</li>.
		<li>Ogranicz stos Z za pomocą opcji "Pierwszy plasterek" i "Ostatni plasterek" i ustal krok z do interwału 0,2 μm za pomocą precyzyjnego ogniskowania. Wybierz kanał DAPI, aby ustawić ostrość, ponieważ ten fluorochrom może zgłaszać najwyższą intensywność i możesz łatwo wybrać całą głowę plemników. Wybierz optymalne parametry pozyskiwania dla każdego kanału i przeprowadź eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom eksperyment Z-stack. Podziel kanały i obserwuj lokalizację każdego sygnału w komórkach.</li>
	<li>Proces Z-stack.
	<ol>
		<li>Renderowanie woluminu: Po zakończeniu eksperymentu wybierz opcje oprogramowania do przetwarzania stosu Z i wybierz opcję renderowania woluminu. Wybierz liczbę kroków i stopnie obrotu (360°). Zapisz plik z rozszerzeniem wideo.</li>
		<li>Anaglif stereo: Wybierz anaglif stereo w oknie procesu opcji. To narzędzie pozwala na stworzenie obrazu 3D wideo z podzielonymi kanałami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li>
<li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li>
<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383(2015).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li>
<li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li>
<li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation%2C+intracellular+hydrogen+peroxide%2C+and+DNA+integrity+in+canine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li>
<li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li>
<li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li>
<li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li>
<li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li>
<li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0044848614002105">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powszechnie wiadomo, że mitochondria są kluczowymi organellami dla ruchliwości i funkcji plemników. Te organelle są jednocześnie bezpośrednio zaangażowane w produkcję ROS. Co ciekawe, kontrolowane poziomy ROS są potrzebne do prawidłowego funkcjonowania plemników1. Wykazano pozytywne związki między płodnością a stresem oksydacyjnym u ssaków11 , ale nadmierne poziomy wpływają na jakość nasienia12. Jednym z kluczowych czynników, który może mieć decydują...

Produkcja reaktywnych form tlenu została ostatnio powiązana z jakością nasienia1. Chociaż produkcję ROS w mitochondriach można uznać za normalny proces fizjologiczny, stres oksydacyjny spowodowany nadmierną produkcją ROS jest wyraźną przyczyną uszkodzenia plemników na różnych poziomach. U ludzi stres oksydacyjny jest związany z niepłodnością męską, zmianą motoryki i zdolnością do ulegania kapacytacji2; u ssaków zmiana integralności DNA w zamrożonych próbkach nasienia była również związana z synteząH2O23.
Kriokonserwacja jest powszechną techniką bankowania genów w akwakulturze. Technologia ta jest szczególnie ważna w przypadku gatunków z problemami reprodukcyjnymi, takich jak Solea senegalensis. Ten cenny gatunek na rynku wykazuje dysfunkcję rozrodczą u osobników urodzonych w niewoli z powodu braku zalotów. Fakt ten sprawia, że kriokonserwacja nasienia jest konieczna, aby mieć dostępność plemników do sztucznego zapłodnienia. Jednak kriokonserwacja może być źródłem stresu oksydacyjnego, który może być szkodliwy dla plemników4, ponieważ badania wykazały korzystny wpływ suplementacji przeciwutleniaczami. Hamowanie ROS za pomocą przeciwutleniacza ukierunkowanego na mitochondria było podobno korzystne dla kriokonserwacji plemników u suma żółtego5.
Dlatego ważne jest, aby znać poziomy ROS w próbkach nasienia, szczególnie po krioprezerwacji6,7, ponieważ te cząsteczki zostały uznane za wadę dla przeżywalności i płodności plemników8. Co więcej, badanie rozmieszczenia ROS w komórce może mieć kluczowe znaczenie dla wywnioskowania poziomu potencjalnych uszkodzeń. Na przykład niski poziom ROS w mitochondriach można uznać za normalny i zgodny z funkcją plemników, ale wysoki poziom ROS w jądrze może być wskaźnikiem uszkodzenia DNA plemników. H2O2jest jednym z najbardziej istotnych ROS, który może zostać uwolniony z mitochondriów i przeniknąć do jądra, ponieważ jest małą i pozbawioną ładunku cząsteczką9. Dioctan dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) może specyficznie ujawniać wewnątrzkomórkowy nadtlenek emitujący zieloną fluorescencję. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół wykrywania lokalizacji wewnątrzkomórkowej H2O2w plemnikach Solea senegalensis za pomocą mikroskopii konfokalnej.

<table><tbody><tr><td>Dioctan 2&,,7&-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883</td><td></td></tr><tr><td>4&,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, klasa analityczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, klasa analityczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MitoTrackerGłęboka czerwień&nbsp;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka (z chłodzeniem)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neubauerchamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717810</td><td></td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10143562BEF</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena wewnątrzkomórkowego lokalizacji reaktywnych form tlenu w plemnikach solea senegalensis

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Stres oksydacyjny jest jednym z ważnych czynników obniżających jakość nasienia. Opracowanie skutecznych protokołów wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w plemnikach ma duże znaczenie dla każdego gatunku, ale metody te są rzadko stosowane, a tym bardziej w teleostach. Kriokonserwacja jest przydatną techniką w akwakulturze do różnych celów, w tym do bankowania genów i gwarantowanej dostępności plemników przez cały rok. Procedury zamrażania/rozmrażania mogą powodować produkcję ROS i uszkodzić plemniki. Biorąc pod uwagę potencjalne uszkodzenia, jakie nadmierna produkcja ROS może spowodować w plemnikach w zależności od ich lokalizacji, przedstawiono szczegółową metodologię wykrywaniaH2O2i oceny jego lokalizacji wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej. W tym celu stosuje się kombinację 3 fluorochromów (dioctan 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA), żywe barwienie mitochondriów i dichlorowodorek 4′,6-dimidino-2-fenyloindolu (DAPI)) w celu oceny kolokalizacjiH2O2z jądrami plemników lub mitochondriami w próbkach nasienia Solea senegalesis.

Mikroskopia konfokalna jest idealną metodą oceny wewnątrzkomórkowych ROS w plemnikach ryb kostnoszkieletowych. Połączenie trzech fluorochromów (DAPI, barwnika mitochondriów oraz DCFH-DA) przedstawione w niniejszej pracy (Rysunek 1) dostarcza wielu użytecznych informacji, które mogą zostać wykorzystane w badaniach podstawowych oraz znaleźć zastosowanie w ulepszaniu procedur stosowanych w przemysłowych zakładach akwakultury, takich jak protokoły kriokonserwacji...

Ten protokół opisuje szczegółową metodologię wykrywania lokalizacji H2O2 w plemnikach Solea senegalensis przy użyciu czułego fluorochromu DCFH-DA dla ROS, żywego barwnika mitochondriów dla mitochondriów i DAPI dla wizualizacji jąder, odpowiednio. Protokół przeznaczony jest do wykonania w ciągu 2 godzin na świeżych lub rozmrożonych plemnikach.

Ocena wewnątrzkomórkowego lokalizacji reaktywnych form tlenu w plemnikach Solea senegalensis

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ocena wewnątrzkomórkowej lokalizacji reaktywnych form tlenu w plemnikach Solea senegalensis za pomocą mikroskopii konfokalnej. Reaktywne formy tlenu mają wpływ na prawidłowe funkcjonowanie plemników, powodując uszkodzenia komórkowe na różnych poziomach. Plemniki mogą być szczególnie wrażliwe na stres oksydacyjny, ponieważ peroksydacja lipidów może negatywnie wpływać na ruchliwość i zapłodnienie.Reaktywne formy tlenu mogą nawet wywołać wewnątrzpochodną kaskadę apoptyczną. Nadtlenek jest uwalniany z mitochondriów i dzięki temu, że jest małą, bezładunkową cząsteczką, jest w stanie przeniknąć do jądra komórkowego, oddziałując na DNA. W niniejszym protokole wykorzystujemy fluorofor, który po wbudowaniu do komórki może zostać zmodyfikowany w reakcji utleniania, emitując zieloną fluorescencję.Dzięki temu można dokładnie określić lokalizację reaktywnych form tlenu. W tym filmie pracujemy na spermatozoami *Solea senegalensis*, jednak protokół ten można zastosować u gatunków pokrewnych o znaczeniu komercyjnym lub u osobników takich jak Sibrifis czy Mirica. Przykłady zastosowania tej techniki w biologii reaktywności fizycznej lub w pszczelarstwie obejmują.Ocena krio-precypitacji zgodnie z protokołami. Porównanie markerów reaktywnych form tlenu przed i po tej aktywacji plemników. Można również korelować markery reaktywnych form tlenu z dobrą i złą jakością oddechu.W pierwszej kolejności należy przygotować roztwory stokowe fluorochromów. Należy pamiętać, że manipulacje z fluorochromami muszą być przeprowadzane zgodnie z zaleceniami zawartymi w kartach charakterystyki. Szczególną ostrożność należy zachować podczas ważenia i przygotowywania roztworów stokowych.Przechowywać roztwory zapasowe w alikwotach w temperaturze -20 °C do momentu użycia. W niniejszym protokole wykorzystano trzy fluorochromy. Dalekoczerwony barwnik fluorescencyjny barwi mitochondria w żywych komórkach i może być stosowany do lokalizacji mitochondrialnej.DAPI to powszechnie stosowana w mikroskopii fluorescencyjnej sonda do barwienia DNA. Wiąże się ona silnie z regionami bogatymi w adeninę i tyminę w DNA. Natomiast 27-dichlorofluoresceina diacetat jest przepuszczalną przez błony komórkowe, niefluorescencyjną sondą.Jest on odwesteryfikowany wewnątrzkomórkowo i w wyniku utleniania przekształca się w silnie fluorescencyjną 27-dichlorofluoresceinę. Protokół ten można rozpocząć z użyciem świeżych lub kriokonserwowanych plemników. W tym przypadku wykorzystaliśmy próbkę kriokonserwowaną.Przygotuj kąpiel do rozmrażania w temperaturze 40 °C. Oczyść materiał. Stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, wybierz kriokonserwowaną słomkę.Zanurz słomkę w kąpieli na siedem sekund. Za pomocą nożyczek przelej rozmrożoną próbkę do probówki do mikrowirówki. Zawsze pracuj w temperaturze 4 °C.Odwiruj próbkę przez minutę. Ostrożnie usuń krioprotektanty, tak aby nie naruszyć osadu soweli. Resuspenduj w małej objętości 50 lub 100 µL roztworu RINGA.Nanieś rozcieńczenie zawiesiny komórkowej do nowej komory Bürkera lub podobnej komory licznikowej i dokonaj zliczenia komórek. Oblicz stężenie próbki. Rozcieńcz zawiesinę komórkową do stężenia od jednego do dwóch milionów komórek na milimetr w końcowej objętości 0,5 ml w schłodzonym roztworze RINGA.Podczas pipetowania i resuspensji należy obchodzić się z plemnikami delikatnie. Do roztworu roboczego próbki należy dodać 3,125 µL roztworu zapasu dichlorofluoresceiny dioctanu. Końcowe stężenie w próbce wynosi 25 µM.Inkubować w temperaturze od 4 do 7 °C przez 40 minut. Po 30 minutach dodać do próbki 0,5 µL roztworu stokowego DAPI oraz 0,5 µL roztworu stokowego do barwienia mitochondriów. Oba fluorochromy wymagają 10 minut inkubacji.Nanieś kroplę 5 µL skoncentrowanej zawiesiny komórek na preparat. Ostrożnie nałóż i uszczelnij szkiełko nakrywkę. Włącz urządzenie i wybierz obiektyw o powiększeniu 100x w panelu sterowania.Zlokalizuj próbkę w mikroskopie i włącz lampę. Oprogramowanie systemu umożliwia wybór potrzebnych fluorochromów bezpośrednio z listy. Wybierz odpowiedni zestaw.DAPI z maksimum emisji 465 nanometrów, MitoTracker Deep Red z maksimum emisji 662 nanometrów oraz DCF z maksimum emisji 525 nanometrów. Przekieruj wiązkę do okularów. Ustaw ostrość na interesujący obszar.Wróć do oprogramowania i wybierz rozmiar ramki. Ustaw tryb skanowania dwukierunkowego, aby uzyskać lepszą rozdzielczość. Wybierz żądaną prędkość skanowania.Otwórz i wycentruj obszar skanowania, aby rozpocząć. Wykonaj zdjęcie pola. Za pomocą narzędzia przycinania zaznacz obszar zainteresowania, a następnie naciśnij Live.Następnie należy wybrać obszar pracy. Za pomocą narzędzia wskaźnika zakresu (range-indicator tool) dostosuj cyfrowe przesunięcie (digital offset), aby zredukować tło. Powtórz tę czynność dla każdego kanału, a następnie wykonaj zdjęcie.Jest to przykład wyników. Przedstawiono obraz scalony, poszczególne kanały dla każdego fluorochromu oraz ich kombinacje. Jest to schemat etykiet komórki plemnika Solea senegalensis.Po przejrzeniu uzyskanych obrazów można zauważyć, że DAPI i MitoTracker znajdują się, zgodnie z oczekiwaniami, odpowiednio w jądrze komórkowym i pierścieniu mitochondrialnym. Pierwszym krokiem jest przeprowadzenie eksperymentu z serii obrazów w osi Z (z-stack). Przejdź do okna z-stack i za pomocą pokrętła ostrości precyzyjnej wybierz pierwszą i ostatnią pozycję akwizycji.Wybierz optymalne parametry akwizycji i przeprowadź eksperyment. Otrzymasz obrazy dla każdego preparatu. Jest to przykład wyniku stosu z (zed-stack).Można rozdzielić kanały i obserwować lokalizację każdego sygnału wewnątrz komórek. Przechodząc do okna 3D, można wybrać różne opcje wyświetlania wykresów. Istnieje możliwość dostosowania wielu parametrów oraz rozdzielania i łączenia kanałów.To jest przykład widoków 3D pokazujących różne wzorce lokalizacji reaktywnych form tlenu w plemnikach Solea senegalensis. W górnym polu DCF kolokalizuje się głównie z mitochondriami; natomiast w polu poniżej sygnał rozciąga się na jądro komórkowe. Po obejrzeniu tego filmu dowiesz się, jak oceniać wewnątrzkomórkową lokalizację nadtlenków w tych plemnikach za pomocą mikroskopii konfokalnej.W tekście można znaleźć wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów oraz inne informacje.

evaluation-intracellular-location-reactive-oxygen-species-solea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Dostosowaliśmy zestaw protokołów do pomiaru reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą być stosowane w różnych modelach komórkowych ameb i ssaków do badań jakościowych i ilościowych.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Tutaj przedstawiamy protokół pomiaru stresu oksydacyjnego u żywych zarodków danio pręgowanego. Procedura ta umożliwia wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) zarówno w całych tkankach zarodka, jak i w populacjach pojedynczych komórek. W ramach tego protokołu zostaną przeprowadzone zarówno analizy jakościowe, jak i ilościowe.

Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego

Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest jednoznaczną metodą pomiaru wolnych rodników. Zastosowanie selektywnych sond spinowych pozwala na wykrywanie wolnych rodników w różnych przedziałach komórkowych. Przedstawiamy praktyczną, efektywną metodę pobierania próbek biologicznych, która ułatwia obróbkę, przechowywanie i przenoszenie próbek do pomiarów EPR.

Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 K

Tutaj prezentujemy metodologie oceny integralności błony plemników, cechy komórkowej związanej z kompetencją zapłodnienia plemników. Opisujemy trzy techniki fluorymetrycznej oceny błon plemników: jednoczesne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych, mikroskopię fluorescencyjną oraz zaawansowaną cytometrię przepływową dedykowaną plemnikom. Przedstawiono również przykłady łączenia metodyk.

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Escherichia coli jest główną przyczyną Gram-ujemnego bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Podczas infekcji bakteryjnej główną rolę bakteriobójczą odgrywają reaktywne formy tlenu wytwarzane przez neutrofile. Tutaj przedstawiamy metodę wykrywania reaktywnych form tlenu w neutrofilach w odpowiedzi na zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych E. coli.

Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym reaktywnych form tlenu w neutrofilach zakażonych meningitycznymi Escherichia coli

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Analiza funkcji mitochondriów plemników za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez swobodnie poruszające się plemniki w systemie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w plemnikach ludzkich, co dostarcza informacji na temat cech mitochondriów i integralności plemników.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich

Ten artykuł przedstawia ekonomiczny i efektywny protokół badania leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu. Za pomocą systemu komputerowej analizy nasienia (CASA) stężenie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu można uzyskać w ciągu łącznie 60 minut, skutecznie poprawiając wydajność laboratorium andrologicznego i andrologów.

Badanie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Poznaj metodę wykrywania H₂O₂ w plemnikach Solea senegalensis przy użyciu mikroskopii konfokalnej z barwnikami fluorescencyjnymi. Protokół umożliwia ocenę lokalizacji reaktywnych form tlenu w mitochondriach i jądrze komórkowym.

Ocena wewnątrzkomórkowego lokalizacji reaktywnych form tlenu w plemnikach Solea senegalensis

Przeglądaj więcej filmów