Ocena wewnątrzkomórkowego lokalizacji reaktywnych form tlenu w plemnikach Solea senegalensis
11 marca 2018
Ten protokół opisuje szczegółową metodologię wykrywania lokalizacji H2O2 w plemnikach Solea senegalensis przy użyciu czułego fluorochromu DCFH-DA dla ROS, żywego barwnika mitochondriów dla mitochondriów i DAPI dla wizualizacji jąder, odpowiednio. Protokół przeznaczony jest do wykonania w ciągu 2 godzin na świeżych lub rozmrożonych plemnikach.
Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ocena wewnątrzkomórkowej lokalizacji reaktywnych form tlenu w plemnikach Solea senegalensis za pomocą mikroskopii konfokalnej. Reaktywne formy tlenu mają wpływ na prawidłowe funkcjonowanie plemników, powodując uszkodzenia komórkowe na różnych poziomach. Plemniki mogą być szczególnie wrażliwe na stres oksydacyjny, ponieważ peroksydacja lipidów może negatywnie wpływać na ruchliwość i zapłodnienie.
Reaktywne formy tlenu mogą nawet wywołać wewnątrzpochodną kaskadę apoptyczną. Nadtlenek jest uwalniany z mitochondriów i dzięki temu, że jest małą, bezładunkową cząsteczką, jest w stanie przeniknąć do jądra komórkowego, oddziałując na DNA. W niniejszym protokole wykorzystujemy fluorofor, który po wbudowaniu do komórki może zostać zmodyfikowany w reakcji utleniania, emitując zieloną fluorescencję.
Dzięki temu można dokładnie określić lokalizację reaktywnych form tlenu. W tym filmie pracujemy na spermatozoami *Solea senegalensis*, jednak protokół ten można zastosować u gatunków pokrewnych o znaczeniu komercyjnym lub u osobników takich jak Sibrifis czy Mirica. Przykłady zastosowania tej techniki w biologii reaktywności fizycznej lub w pszczelarstwie obejmują.
Ocena krio-precypitacji zgodnie z protokołami. Porównanie markerów reaktywnych form tlenu przed i po tej aktywacji plemników. Można również korelować markery reaktywnych form tlenu z dobrą i złą jakością oddechu.
W pierwszej kolejności należy przygotować roztwory stokowe fluorochromów. Należy pamiętać, że manipulacje z fluorochromami muszą być przeprowadzane zgodnie z zaleceniami zawartymi w kartach charakterystyki. Szczególną ostrożność należy zachować podczas ważenia i przygotowywania roztworów stokowych.
Przechowywać roztwory zapasowe w alikwotach w temperaturze -20 °C do momentu użycia. W niniejszym protokole wykorzystano trzy fluorochromy. Dalekoczerwony barwnik fluorescencyjny barwi mitochondria w żywych komórkach i może być stosowany do lokalizacji mitochondrialnej.
DAPI to powszechnie stosowana w mikroskopii fluorescencyjnej sonda do barwienia DNA. Wiąże się ona silnie z regionami bogatymi w adeninę i tyminę w DNA. Natomiast 27-dichlorofluoresceina diacetat jest przepuszczalną przez błony komórkowe, niefluorescencyjną sondą.
Jest on odwesteryfikowany wewnątrzkomórkowo i w wyniku utleniania przekształca się w silnie fluorescencyjną 27-dichlorofluoresceinę. Protokół ten można rozpocząć z użyciem świeżych lub kriokonserwowanych plemników. W tym przypadku wykorzystaliśmy próbkę kriokonserwowaną.
Przygotuj kąpiel do rozmrażania w temperaturze 40 °C. Oczyść materiał. Stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, wybierz kriokonserwowaną słomkę.
Zanurz słomkę w kąpieli na siedem sekund. Za pomocą nożyczek przelej rozmrożoną próbkę do probówki do mikrowirówki. Zawsze pracuj w temperaturze 4 °C.
Odwiruj próbkę przez minutę. Ostrożnie usuń krioprotektanty, tak aby nie naruszyć osadu soweli. Resuspenduj w małej objętości 50 lub 100 µL roztworu RINGA.
Nanieś rozcieńczenie zawiesiny komórkowej do nowej komory Bürkera lub podobnej komory licznikowej i dokonaj zliczenia komórek. Oblicz stężenie próbki. Rozcieńcz zawiesinę komórkową do stężenia od jednego do dwóch milionów komórek na milimetr w końcowej objętości 0,5 ml w schłodzonym roztworze RINGA.
Podczas pipetowania i resuspensji należy obchodzić się z plemnikami delikatnie. Do roztworu roboczego próbki należy dodać 3,125 µL roztworu zapasu dichlorofluoresceiny dioctanu. Końcowe stężenie w próbce wynosi 25 µM.
Inkubować w temperaturze od 4 do 7 °C przez 40 minut. Po 30 minutach dodać do próbki 0,5 µL roztworu stokowego DAPI oraz 0,5 µL roztworu stokowego do barwienia mitochondriów. Oba fluorochromy wymagają 10 minut inkubacji.
Nanieś kroplę 5 µL skoncentrowanej zawiesiny komórek na preparat. Ostrożnie nałóż i uszczelnij szkiełko nakrywkę. Włącz urządzenie i wybierz obiektyw o powiększeniu 100x w panelu sterowania.
Zlokalizuj próbkę w mikroskopie i włącz lampę. Oprogramowanie systemu umożliwia wybór potrzebnych fluorochromów bezpośrednio z listy. Wybierz odpowiedni zestaw.
DAPI z maksimum emisji 465 nanometrów, MitoTracker Deep Red z maksimum emisji 662 nanometrów oraz DCF z maksimum emisji 525 nanometrów. Przekieruj wiązkę do okularów. Ustaw ostrość na interesujący obszar.
Wróć do oprogramowania i wybierz rozmiar ramki. Ustaw tryb skanowania dwukierunkowego, aby uzyskać lepszą rozdzielczość. Wybierz żądaną prędkość skanowania.
Otwórz i wycentruj obszar skanowania, aby rozpocząć. Wykonaj zdjęcie pola. Za pomocą narzędzia przycinania zaznacz obszar zainteresowania, a następnie naciśnij Live.
Następnie należy wybrać obszar pracy. Za pomocą narzędzia wskaźnika zakresu (range-indicator tool) dostosuj cyfrowe przesunięcie (digital offset), aby zredukować tło. Powtórz tę czynność dla każdego kanału, a następnie wykonaj zdjęcie.
Jest to przykład wyników. Przedstawiono obraz scalony, poszczególne kanały dla każdego fluorochromu oraz ich kombinacje. Jest to schemat etykiet komórki plemnika Solea senegalensis.
Po przejrzeniu uzyskanych obrazów można zauważyć, że DAPI i MitoTracker znajdują się, zgodnie z oczekiwaniami, odpowiednio w jądrze komórkowym i pierścieniu mitochondrialnym. Pierwszym krokiem jest przeprowadzenie eksperymentu z serii obrazów w osi Z (z-stack). Przejdź do okna z-stack i za pomocą pokrętła ostrości precyzyjnej wybierz pierwszą i ostatnią pozycję akwizycji.
Wybierz optymalne parametry akwizycji i przeprowadź eksperyment. Otrzymasz obrazy dla każdego preparatu. Jest to przykład wyniku stosu z (zed-stack).
Można rozdzielić kanały i obserwować lokalizację każdego sygnału wewnątrz komórek. Przechodząc do okna 3D, można wybrać różne opcje wyświetlania wykresów. Istnieje możliwość dostosowania wielu parametrów oraz rozdzielania i łączenia kanałów.
To jest przykład widoków 3D pokazujących różne wzorce lokalizacji reaktywnych form tlenu w plemnikach Solea senegalensis. W górnym polu DCF kolokalizuje się głównie z mitochondriami; natomiast w polu poniżej sygnał rozciąga się na jądro komórkowe. Po obejrzeniu tego filmu dowiesz się, jak oceniać wewnątrzkomórkową lokalizację nadtlenków w tych plemnikach za pomocą mikroskopii konfokalnej.
W tekście można znaleźć wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów oraz inne informacje.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodologię wykrywania lokalizacji H2O2 w plemnikach Solea senegalensis z wykorzystaniem DCFH-DA do detekcji reaktywnych form tlenu, barwnika do żywych mitochondriów oraz DAPI do wizualizacji jąder komórkowych. Procedurę można przeprowadzić w ciągu 2 godzin, stosując świeże lub rozmrożone plemniki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozrodu
Wstęp
- Reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu plemników.
- Stres oksydacyjny może negatywnie wpływać na ruchliwość plemników oraz zapłodnienie.
- Nadtlenek uwalniany z mitochondriów może przenikać do jądra komórkowego i oddziaływać na DNA.
- Zrozumienie lokalizacji ROS jest niezbędne do oceny stanu zdrowia plemników.
Cel badania
- Ocena lokalizacji wewnątrzkomórkowej ROS w plemnikach Solea senegalensis.
- Ocena wpływu stresu oksydacyjnego na żywotność plemników.
- Wykorzystanie mikroskopii konfokalnej do szczegółowej wizualizacji komponentów komórkowych.
Zastosowane metody
- Zastosowanie fluorochromu DCFH-DA do detekcji ROS.
- Barwienie żywych mitochondriów w celu wizualizacji aktywności mitochondrialnej.
- Barwienie DAPI do wizualizacji jąder komórkowych.
- Mikroskopia konfokalna do obrazowania i analizy.
Główne wyniki
- Pomyślna lokalizacja H2O2 wewnątrz plemników.
- Identyfikacja wpływu stresu oksydacyjnego na ruchliwość plemników.
- Wizualizacja interakcji mitochondriów i jąder komórkowych z ROS.
- Wykazanie efektywności protokołu w ramach 2-godzinnego przedziału czasowego.
Wnioski
- Protokół skutecznie ujawnia lokalizację ROS w plemnikach.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia stresu oksydacyjnego w biologii rozrodu.
- Metodologię można zastosować w dalszych badaniach nad zdrowiem i funkcją plemników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa lokalizacja reaktywnych form tlenu (ROS) w plemnikach rozwiązuje kluczowy problem w biologii rozrodu oraz badaniach i rozwoju (R&D) w akwakulturze, gdzie stres oksydacyjny bezpośrednio wpływa na żywotność komórek i integralność genetyczną. Ten oparty na mikroskopii konfokalnej schemat postępowania umożliwia precyzyjne mapowanie H2O2 w odniesieniu do przedziałów mitochondrialnych i jądrowych, co wspomaga mitygację ryzyka mechanistycznego oraz prognostyczną ocenę protokołów krio konserwacji. Podejście to ma istotne znaczenie dla decyzji w procesach translacyjnych, w których jakość nasienia i integralność funkcjonalna są niezbędne dla banków genów i programów hodowlanych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia analizę mechanistyczną szlaków stresu oksydacyjnego w biologii gamet.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wyjaśnienie wpływu ROS na cele jądrowe i mitochondrialne.
- Zwiększa pewność prognostyczną w ocenach jakości plemników na potrzeby hodowli i bankowania genów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane testy obrazowania do lokalizacji ROS w próbkach kriozach konserwowanych i świeżych.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do porównywania różnych próbek.
- Przygotowuje ustandaryzowane systemy biologiczne do dalszych analiz funkcjonalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zestawia odczyty stresu oksydacyjnego z translacyjnymi biomarkerami żywotności plemników.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych badań na etapie odkrywania do przedklinicznej oceny protokołów konserwacji.
- Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie krio konserwacji oraz interwencji w zakresie płodności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół obrazowania konfokalnego integruje się z continuum od odkryć do fazy przedklinicznej w badaniach i rozwoju w obszarze reprodukcji oraz akwakultury, dostarczając informacji zarówno dla wczesnych badań mechanistycznych, jak i walidacji translacyjnej strategii konserwacji.
- Biologia odkrywcza: dostarcza bezpośrednich dowodów na uszkodzenia komórkowe wywołane przez ROS oraz pozwala na mapowanie szlaków sygnałowych.
- Screening: oferuje ilościowe, powtarzalne wyniki obrazowania służące do standaryzacji testów.
- Analityka: umożliwia statystyczne porównanie lokalizacji ROS w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: łączy odkrycia mechanistyczne z przedklinicznymi punktami końcowymi dotyczącymi jakości i żywotności plemników.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: protokół można dostosować do pokrewnych gatunków i szerszych zastosowań w biologii rozrodu.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w ocenie jakości plemników oraz zrozumienie mechanizmów stresu oksydacyjnego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy lokalizacji ROS w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go w przypadku krio konserwacji i inwestycji w programy hodowlane.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację technologii konserwacji i płodności z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii konfokalnej oraz obchodzenia się z sondami fluorescencyjnymi.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury obrazowej i oprogramowania analitycznego.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja przygotowania próbek i parametrów obrazowania.
- Możliwość adaptacji do różnych gatunków ryb kostnoszkieletowych i gatunków o znaczeniu komercyjnym poprzez optymalizację protokołu.
- Zależność od skutecznego rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Title
1:32
Preparatory work before the experiment
2:58
Sample preparation before fluorochromes incubation
4:40
Fluorochromes incubation
5:33
Sample preparation for confocal microscopy
5:51
Confocal setting up prior to the experiment
6:49
Acquisition of images
7:49
Results
8:24
Creating a 3D image video
9:53
Conclusions
