Name: Pobieranie nasienia ptaków za pomocą masażu kloacznego i izolacji DNA z plemników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Naucz się pobierać nasienie ptaków metodą masażu kloacznego i izolować DNA z plemników. Technika jest nieinwazyjna, szybka i nadaje się do badań terenowych oraz laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jose Noguera za wczesną pomoc w masażu kloaicznym oraz Jeffreyowi Kittilsonowi za wsparcie laboratorium. Praca ta została wsparta nagrodą ND EPSCoR FAR0022429 dla BJH. Koszty publikacji zostały hojnie wsparte przez Wydział Nauk Biologicznych NDSU.

Niniejszy protokół obejmuje zwierzęta kręgowce i został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Dakota Północna.
1. Pobieranie nasienia od ptaka wróblowego za pomocą masażu kloaki
UWAGA: Masaż kloaki jest skuteczną techniką pobierania nasienia wyłącznie u ptaków aktywnych rozrodczo, jednak może zostać z sukcesem przeprowadzony poza sezonem lęgowym w odpowiednich warunkach niewoli. Przed zastosowaniem masażu kloaki należy określić aktywność rozrodczą gatunków docelowych. Technikę tę można stosować u ptaków dzikich bezpośrednio po odłowieniu lub u ptaków przetrzymywanych w niewoli.
<ol>
	<li>Zaczynając od samca ptaka (w stanie hodowlanym), trzymając go chwytem obrączkarskim w niedominującej dłoni, przenieś ptaka do dłoni dominującej tak, aby jego strona brzuszna dotykała wnętrza dłoni (Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że głowa ptaka znajduje się najbliżej bocznej krawędzi dłoni. Delikatnie unieruchom głowę i ciało, używając małego, serdecznego i środkowego palca. W ten sposób kloaka i ogon ptaka pozostają odsłonięte.</li>
		<li>Pozostaw nogi ptaka luźno lub lekko unieruchom je wnętrzem dłoni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Proces obrączkowania ptaków, trzymanie ptaka w dłoni, badania terenowe, badanie w zakresie ochrony dzikiej przyrody." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Chwyt do masażu kloaki. Ptaka należy lekko unieruchomić w dłoni dominującej tak, aby jego strona brzuszna stykała się z wnętrzem dłoni, a głowa była przytrzymywana palcem małym. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="2">
	<li>Umieść palec wskazujący i kciuk dominującej dłoni po obu stronach górnego końca kloaki i lekko zaciśnij palce, wywierając bardzo delikatny nacisk w kierunku ogona ( Rysunek 2). Kloaka wywinięcie się, odsłaniając śluzówkę kloaki (różowe wnętrze). 
	UWAGA: Jeśli ptak nie produkuje obecnie nasienia, wyniosłość kloaki może być niewielka, a kloaka trudna do wywinięcia. Dzięki doświadczeniu można łatwo odróżnić kloaki samców aktywnych i nieaktywnych rozrodczo5,1.</li>
</ol>
<img alt="Metoda pobierania próbek krwi ptaków; schemat gromadzenia danych terenowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Pozycja palca i wybrzuszenie kloaki. Wyewersuj kloakę, wywierając lekki nacisk na jej górny koniec (A). U reprodukcyjnie aktywnego samca wróblokształtnych guzowatość kloakowa jest wyraźna i twarda (B). <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Niedominującą ręką należy oprzeć opuszkę palca wskazującego o grzbietową stronę nasady ogona, aby ustabilizować dłoń, a następnie umieścić koniec kciuka tuż poniżej wywiniętej kloaki. 
	UWAGA: Krótki i gładki paznokieć u kciuka jest korzystny podczas wykonywania masażu kloaki i chroni ptaka przed przypadkowym zranieniem.</li>
	<li>Niedominujący kciuk należy przesuwać głęboko i w kierunku głowowym w powtarzalnym ruchu z umiarkowanym naciskiem, pozostając poniżej kloaki. Czynność tę kontynuuje się aż do momentu ejakulacji ptaka. W zależności od osobnika zazwyczaj wymaga to od jednego do kilkudziesięciu ruchów.</li>
	<li>Natychmiast po ejakulacji należy zebrać nasienie do rurki mikrohematokrytowej. Masaż kloaki można powtórzyć, aby uzyskać kilka ejakulatów. 
	​UWAGA: Nasienie wróblowych ma jasnobrązowy kolor i zazwyczaj dość gęstą konsystencję. Białe lub ciemne substancje wydzielane z kloaki nie są nasieniem i mogą zanieczyścić próbkę. Pojawienie się niewielkiej ilości krwi na kloace lub zmieszanej z nasieniem jest zazwyczaj spowodowane zbyt dużym naciskiem podczas masażu.</li>
	<li>W celu ekstrakcji DNA nasienie należy umieścić w probówce do mikrocentryfugi z 20 µL 1x PBS (pH 7.4). UWAGA: Nasienie przechowywane w 1x PBS nie nadaje się do sztucznego zapłodnienia, ale może być wykorzystane do późniejszej ekstrakcji DNA, jeśli jest przechowywane w temperaturze -80 °C. Roztwór PBS może być w temperaturze pokojowej lub schłodzony, lecz w momencie dodawania próbki nasienia musi być w stanie ciekłym.
	<ol>
		<li>Obecność plemników w próbce należy potwierdzić, oglądając niewielką ilość rozcieńczonej próbki pod mikroskopem złożonym (Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczone nasienie należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji.</li>
</ol>
2. Izolacja DNA z nasienia ptaków
UWAGA: Protokół ten został przetestowany z wieloma komercyjnymi zestawami do ekstrakcji DNA, jednak pomyślne wyniki uzyskano jedynie przy zastosowaniu jednego zestawu do DNA12. Kroki zmodyfikowane względem protokołu producenta zestawu zostały oznaczone symbolem *.
<ol>
	<li>Przygotować 1 M roztwór ditiotreitolu (DTT) w wodzie i wymieszać za pomocą wortexa.*
	<ol>
		<li>Rozdzielić roztwór DTT na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Do każdej próbki przeznaczonej do ekstrakcji wymagane jest 10 µL roztworu 1 M DTT.*</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor zawierający 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 20 mM NaCL oraz 4% SDS. Do każdej próbki przeznaczonej do ekstrakcji wymagane jest 90 µL tego buforu.*
	<ol>
		<li>Przechowywać bufor w temperaturze pokojowej. W przypadku wytrącenia osadu podgrzać do 56 °C w celu rozpuszczenia.*</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozgrzać inkubator z wbudowaną kołysarką lub wytrząsarką do 65 °C.*</li>
	<li>Bezpośrednio przed rozpoczęciem ekstrakcji, dla każdej próbki przeznaczonej do ekstrakcji, zmieszać 10 µL roztworu DTT z 90 µL buforu przygotowanego w kroku 2.2, np. 90 µL buforu oraz 10 µL roztworu DTT przy ekstrakcji 10 próbek. Mieszaninę tę nazwano buforem DTT-buffer.*</li>
	<li>Do całej rozcieńczonej próbki nasienia dodać 70 µL 1x PBS i dobrze wymieszać za pomocą wortexa.*</li>
	<li>Do próbki dodać 100 µL buforu DTT-buffer oraz 10 µL roztworu proteinazy K. Mieszać w vortexie przez 20 sekund, a następnie inkubować w rozgrzanym inkubatorze przez 1 godzinę na kołysarce lub wytrząsarce.*</li>
	<li>Dodać 20 µL buforu AL oraz 200 µL świeżego EtOH (10%) i mieszać w vortexie przez 20 sekund.*</li>
	<li>Przenieść całą próbkę do kolumny wiriówek i wirować przez 1 minutę przy 6,0 x g. Usunąć probówkę zbiorczą.</li>
	<li>Umieścić kolumnę w nowej probówce i dodać 500 µL przygotowanego buforu AW1. Wirować przez 1 minutę przy 6,0 x g. Usunąć probówkę zbiorczą.</li>
	<li>Umieścić kolumnę w nowej probówce i dodać 50 µL przygotowanego buforu AW2. Wirować przez 1 minutę przy 6,0 x g. Usunąć filtrat i ponownie umieścić kolumnę w probówce.</li>
	<li>Wirować przez 3 minuty przy 20,0 x g. Usunąć probówkę zbiorczą i umieścić kolumnę w probówce do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Nanieść pipetą 35 µL buforu AE bezpośrednio na membranę kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.*</li>
	<li>Wirować przez 1 minutę przy 14,00 x g. Usunąć kolumnę wiriówek i przechowywać wyekstrahowane próbki w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1349186">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li>
<li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+life+histories%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li>
<li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+male+gamete%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li>
<li>Burrows, W. H., Quinn, J. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/ps/article-abstract/16/1/19/1564432?redirectedFrom=fulltext">The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey.</a> Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).</li>
<li>Wolfson, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4510381?seq=1#page_scan_tab_contents">The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds.</a> Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).</li>
<li>Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4089416?seq=1#page_scan_tab_contents">Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment.</a> The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).</li>
<li>Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00265-009-0871-x">Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).</li>
<li>Purchase, C. F., Earle, P. T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jai.12070/abstract">Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data.</a> J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).</li>
<li>Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/318577a0">Forensic application of DNA 'fingerprints'.</a> Nature. 318 (12), 577-579 (1985).</li>
<li>Criscuolo, F., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-048X.2008.04623.x/abstract">Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres.</a> J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).</li>
<li>Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. <a target="_blank" href="http://www.birds.cornell.edu/homestudy/handbook-of-bird-biology">Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition</a>. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.scribd.com/document/54238221/QIAamp-DNA-Micro-Handbook">QIAamp DNA Micro Handbook</a>. , Third edition (2014).</li>
<li>Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+DNA+extraction+method+for+sperm+on+the+perivitelline+membrane+of+avian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs.</a> Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).</li>
<li>Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347296904236">Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler.</a> Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).</li>
<li>Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+morphology+and+sperm+velocity+in+passerine+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).</li>
<li>Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semen+collection+and+spermatozoa+characteristics+in+budgerigars+%28Melopsittacus+undulates%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Rec%22%5BJournal%5D)">Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates).</a> Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).</li>
<li>Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/232663050_Attempted_Semen_Collection_Using_the_Massage_Technique_and_Semen_Analysis_in_Various_Psittacine_Species">Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species.</a> J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisujemy prostą i niezawodną metodę pobierania nasienia od małych i średnich ptaków w stanie czynnym rozrodczość oraz ekstrakcji DNA z plemników ptaków.
Opisany protokół ekstrakcji DNA nasienia jest zmodyfikowany z zestawu dla uproszczenia, ale został udoskonalony do stosowania na nasieniu ptaków. Plemniki są odporne na lizę przez standardowe chemikalia do ekstrakcji 9,13, a próbki nasienia pobrane z wróblowych są dość małe (zwykle ki...

Ptaki są idealnymi obiektami do badań nad jakością nasienia i konkurencją1, dynamika telomerów plemników2, epigenetics3, i podobne tematy, ponieważ są szeroko stosowane w badaniach biologicznych, a plemniki można łatwo pobrać za pomocą masażu kloacznego. Masaż kloaką to delikatna, nieinwazyjna technika manualna służąca do pobierania nasienia od ptaków4,5,6. Powtarzające się próbki można łatwo uzyskać i nie są wymagane żadne specjalne narzędzia, co ułatwia wykonywanie ich w terenie lub w laboratorium. Chociaż masaż kloaką jest stosowany od dziesięcioleci, trudno jest dowiedzieć się tego z dostępnych pisemnych opisów. Niniejsza publikacja ma na celu skrócenie czasu i niepewności związanych z nauką masażu kloacznego.
Nasienie pobrane od ptaków za pomocą masażu kloacznego może być natychmiast wykorzystane do oceny ruchliwości4,7 lub sztuczne zapłodnienie8, lub zamrożone do innych zastosowań, takich jak zaawansowane obrazowanie i ekstrakcja DNA. Próbki nasienia ptaków wróblowych są małe, ale zawierają gęsto upakowane plemniki. DNA jest ekstrahowane przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji dla uproszczenia, z modyfikacjami w celu przezwyciężenia specjalistycznych cech ochronnych spermy9. Po ekstrakcji telomery plemników można zmierzyć za pomocą qPCR10.

<table><tbody><tr><td>Rurki kapilarne mikrohematokrytu</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362566</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy. Mniejsze probówki mogą być bardziej skuteczne w pobieraniu małych próbek nasienia, takich jak bardzo małe ptaki wróblowate, takie jak wróbel ćwierkający.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Służy do przechowywania próbek nasienia przed ekstrakcją DNA.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1233508</td><td>Można skorzystać z dowolnego dostawcy.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>Można użyć dowolnego dostawcy.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>Można skorzystać z dowolnego dostawcy.</td></tr><tr><td>Zestaw QIAamp DNA micro</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Zalecany jest szczególnie zestaw Qiagen QIAamp DNA micro. Ten protokół ekstrakcji DNA został wypróbowany z innymi komercyjnymi zestawami, ale z niewielkim powodzeniem. Przyczyny tego są nam nieznane.</td></tr></tbody></table>

pobieranie nasienia ptaków za pomocą masażu kloacznego i izolacji dna z plemników

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Pobieranie nasienia może być przydatne do szerokiego zakresu zastosowań, w tym do badań dotyczących jakości nasienia, dynamiki telomerów plemników i epigenetyki. Ptaki są szeroko stosowanymi obiektami w badaniach biologicznych i idealnie nadają się do badań obejmujących powtarzające się próbki nasienia. Jednak obecnie dostępnych jest niewiele zasobów dla tych, którzy chcą dowiedzieć się, jak zbierać i ekstrahować DNA z plemników ptaków. Tutaj opisujemy masaż kloaczny, delikatną, nieinwazyjną manualną technikę pobierania plemników ptaków. Chociaż technika ta jest ugruntowana w literaturze, może być trudno nauczyć się jej na podstawie dostępnych opisów. Dostarczamy również informacji na temat ekstrakcji DNA z nasienia ptaków za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji z modyfikacjami. Masaż kloaką można z łatwością zastosować u każdego małego i średniego samca ptaka w stanie rozrodczym. Po pobraniu nasienie można natychmiast wykorzystać do testów ruchliwości lub zamrozić w celu ekstrakcji DNA zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym dokumencie. Ten protokół ekstrakcji został udoskonalony dla plemników ptaków i został z powodzeniem zastosowany na próbkach pobranych od kilku gatunków wróblowych (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus i Turdus migratorius) i jednego kolumbida (Columba livia).

Masaż kloaki oraz ekstrakcja DNA z zastosowaniem opisanego protokołu zostały przeprowadzone u kilku gatunków wróblowych oraz jednego gołębiowatego (Tabela 1). Obecność plemników w próbkach nasienia pobranych za pomocą masażu kloaki potwierdzono, oglądając niewielką ilość rozcieńczonych próbek pod mikroskopem złożonym przy powiększeniu 40X (Rysunek 3). Po wyekstrahowaniu DNA z próbek nasienia pobranych od wróbli domowych zgodnie z tutaj opisan...

Ten protokół opisuje masaż kloaczny, nieinwazyjną technikę manualną pobierania nasienia od ptaków, oraz ekstrakcję DNA z plemników ptaków za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji z modyfikacjami.

Pobieranie nasienia ptaków za pomocą masażu kloacznego i izolacji DNA z plemników

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

Ogólnym celem tej procedury jest pobranie nasienia od samców ptaków oraz izolacja DNA z próbek nasienia. Metodę tę można zastosować w celu uzyskania odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekologii behawioralnej i ewolucyjnej dotyczące konkurencji plemników oraz dziedziczenia epigenetycznego. Główną zaletą tej techniki jest łatwość jej zastosowania.Masaż kloaki można przeprowadzić szybko w terenie lub w laboratorium, a metoda ekstrakcji DNA wykorzystuje dostępny komercyjnie zestaw z modyfikacjami. Technikę tę można stosować u ptaków dzikich lub w niewoli podczas sezonu lęgowego, a w określonych sytuacjach dotyczących ptaków w niewoli może być ona skuteczna przez cały rok. Chwyć reprodukcyjnie aktywnego samca za pomocą chwytu obrączkarskiego w niedominującej dłoni.Następnie przenieś ptaka do ręki dominującej tak, aby jego strona brzuszna dotykała dłoni, a głowa znajdowała się przy bocznej krawędzi dłoni. Teraz lekko unieruchom głowę i ciało za pomocą małego, serdecznego i środkowego palca. Kloaka i ogon ptaka są teraz odsłonięte.Nogi można pozostawić luźno lub lekko unieruchomić dłonią. Następnie należy wyewaginować kloakę, kładąc palec wskazujący i kciuk dominującej ręki po obu stronach jej górnego końca i lekko ściskając, jednocześnie wywierając lekki nacisk w kierunku ogona. Różowa błona śluzowa kloaki powinna być wyraźnie widoczna, chyba że ptak nie produkuje nasienia.Z doświadczeniem łatwo jest odróżnić kloaki samców aktywnych i nieaktywnych rozrodczo. Aby pobrać nasienie, należy oprzeć opuszkę palca wskazującego niedominującej ręki o grzbietową stronę nasady ogona w celu stabilizacji, a następnie przyłożyć czubek kciuka tuż poniżej wywiniętej kloaki. Zaleca się posiadanie krótko i gładko opiłowanego paznokcia kciuka.Następnie wprowadź kciuk głęboko i w kierunku głowowym, wykonując powtarzalne ruchy z umiarkowanym naciskiem, pozostając poniżej kloaki aż do momentu ejakulacji ptaka. Może to wymagać od jednego do kilkudziesięciu ruchów. Natychmiast po ejakulacji ptaka zbierz lepki, jasnobrązowy nasienie do rurki mikrohematokrytowej.Substancje białe lub ciemne są zanieczyszczeniami, natomiast jakakolwiek ilość krwi wskazuje na zastosowanie zbyt dużego nacisku. W razie potrzeby powtórz masaż, aby uzyskać kilka ejakulatów. W celu ekstrakcji DNA przenieś próbkę do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 20 µL PBS.Aby potwierdzić obecność plemników w próbce, należy obejrzeć niewielką ilość rozcieńczonej próbki pod mikroskopem złożonym przy powiększeniu 400X. Następnie próbki plemników należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ich użycia. Niniejszy protokół stanowi modyfikację zestawu komercyjnego.Należy przygotować 10 µL aliquoty 1 M DTT w wodzie i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Bezpośrednio przed rozpoczęciem ekstrakcji DNA, dla każdej próbki wymieszać jedną aliquotę DTT z jedną aliquotą chlorku TRIS. Następnie do każdej próbki dodać 70 µL PBS i wymieszać zawiesiny za pomocą wortexa.Następnie do każdej próbki należy dodać jedną porcję mieszaniny buforu DTT oraz 10 µL roztworu proteinazy K. W celu wymieszania próbek należy je wstrząsnąć w wortexie przez 20 sekund. Następnie próbki należy umieścić w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 65 °C i inkubować przez godzinę przy łagodnym mieszaniu.Po inkubacji należy dodać 200 µL buforu AL oraz 200 µL świeżego 100% ethanol, a następnie wymieszać próbki na vortexie przez 20 sekund. Następnie każdą próbkę przenosi się do kolumny wirowej i wiruje próbki przez jedną minutę przy 6 000G. Należy usunąć probówki zbiorcze i umieścić kolumny w nowych probówkach.Dodaj 500 µL buforu AW1 do kolumny i ponownie odwiruj kolumny. Ponownie wyrzuć probówki do zbierania i umieść kolumny w nowych probówkach. Teraz dodaj 500 µL buforu AW2 i powtórz cykl wirowania.Następnie odrzuć frakcję przepływową i umieść kolumnę wirową z powrotem w wirówce na trzy minuty wirowania, tym razem przy 20 000G. Następnie wyrzuć probówkę zbiorczą i umieść kolumnę w probówce do mikrowirówki. Teraz bezpośrednio na membranę kolumny nanieś 35 µL buforu AE i pozostaw roztwór na pięć minut w temperaturze pokojowej, aby doszło do elucji DNA.Następnie przenieś bufor elucyjny z DNA do probówki do mikrocentryfugi, wirując przez 60 sekund. Teraz usuń kolumny i przechowuj DNA w temperaturze -80 °C. Opisane metody masażu kloaki i ekstrakcji DNA zostały z powodzeniem zastosowane u kilku gatunków wróblowych oraz u jednego gołębia.Gdy elektroforeza żelowa wyekstrahowanego DNA wykazuje wyraźne prążki bez rozmycia, świadczy to o pomyślnej izolacji wysokiej jakości DNA. Niniejszy przykład przedstawia DNA z nasienia wróbla zwyczajnego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak delikatnie pobierać próbki nasienia od samców ptaków w okresie rozrodczym za pomocą masażu kloaki oraz jak ekstrahować DNA z tych próbek nasienia przy użyciu zestawu do ekstrakcji.Po opanowaniu techniki, masaż kloaki może zostać wykonany w zaledwie kilka sekund, jeśli jest przeprowadzany prawidłowo.

avian-semen-collection-cloacal-massage-isolation-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym protokole opisano metodę izolacji i aktywacji spermatyd z samców C. elegans. Odcięcie tylnego końca samca powoduje uwolnienie spermatyd. Spermatydy można aktywować poprzez dodanie proteazy.

Izolacja i aktywacja in vitro plemników Caenorhabditis elegans

Ten film pokazuje przezskórne aspirację plemników najądrza od pacjenta z azoospermią, stanem charakteryzującym się brakiem plemników w nasieniu. Zabieg polega na dezynfekcji okolicy moszny, odessaniu płynu najądrza za pomocą strzykawki ze specjalistycznym roztworem hodowlanym i przetworzeniu pobranej próbki w celu wyizolowania żywotnych plemników. Przygotowane plemniki są następnie gotowe do wykorzystania w zaawansowanych procedurach leczenia niepłodności.

Technika przezskórnego aspiracji i przetwarzania plemników najądrza

Mutacje de novo w męskiej linii zarodkowej mogą przyczyniać się do niekorzystnych skutków zdrowotnych w kolejnych pokoleniach. W tym miejscu opisujemy protokół użycia transgenicznego modelu gryzoni do ilościowego określania mutacji w męskich komórkach rozrodczych wywołanych przez czynniki środowiskowe.

Test transgenicznych gryzoni do ilościowego określania częstości mutantów męskich komórek rozrodczych

W tym artykule staramy się opisać wydajność techniki wirowania w gradiacji gęstości i jej zastosowanie w badaniach nad fizjologią plemników.

Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Zapłodnienie in vitro jest powszechnie stosowaną techniką z różnymi organizmami modelowymi do utrzymania populacji laboratoryjnych i produkcji zsynchronizowanych zarodków do dalszych zastosowań. Tutaj przedstawiamy protokół, który implementuje tę technikę dla różnych populacji meksykańskiej ryby tetra, Astyanax mexicanus.

Pobieranie gamet i zapłodnienie in vitro Astyanax mexicanus

Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Protokół ten opisuje, jak przeprowadzać rejestracje elektryczne z komórek plemników ssaków w konfiguracji całej komórki, z celem bezpośredniego rejestrowania aktywności kanałów jonowych. Metoda ta odegrała kluczową rolę w opisie elektrofizjologicznych profili kilku kanałów jonowych plemników i pomogła ujawnić ich tożsamość molekularną oraz regulację.

Rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków

Ten protokół opisuje metodę badania przesiewowego wysokiej jakości plemników o niskim wskaźniku fragmentacji DNA poprzez wykorzystanie cech ruchliwości plemników i thigmotaxis. Metoda wykorzystuje poziomy tor pływacki w kształcie litery U, dzięki czemu wysokiej jakości plemniki docierają do przeciwnej strony przez kropelki buforowe, przy jednoczesnym wykluczeniu martwych plemników, szczątków komórek i zanieczyszczeń.

Technika pływania poziomego w kształcie litery U do przygotowywania wysokiej jakości plemników o niskim wskaźniku fragmentacji DNA

Procedura ta ma na celu identyfikację metabolitów przenoszonych z plemników do oocytów podczas zapłodnienia za pomocą znakowania stabilnymi izotopami za pomocą 2H2O lub U13C Glukozy, a następnie analizy metabolomicznej. Buhaje znakowane deuterem są kojarzone z matkami nieoznakowanymi. Pobrane zarodki przedimplantacyjne są analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu oddzielenia metabolitów ojcowskich (deuterowanych) od matczynych (niedeuterowanych).

Znakowanie in vivo stabilnych izotopów do identyfikacji spektrometrii mas ojcowskich metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu podczas zapłodnienia

Protokół ten przedstawia prostą technikę mikroaspiracji izolującą żywotne komórki somatyczne (SC) z krioprezerwacji nasienia koń. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, ta technika unika długotrwałych hodowli in vitro i pozwala na natychmiastowe zastosowanie w klonowaniu komórek somatycznych.

Prosta technika mikroaspiracji izolującej komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia jako dawców jądrowych do klonowania

Naucz się pobierać nasienie ptaków metodą masażu kloacznego i izolować DNA z plemników. Technika jest nieinwazyjna, szybka i nadaje się do badań terenowych oraz laboratoryjnych.

Pobieranie nasienia ptaków za pomocą masażu kloacznego i izolacji DNA z plemników

Przeglądaj więcej filmów