Prosta komora do długoterminowego obrazowania konfokalnego rozwoju korzeni i hipokotylu

Ogólnym celem tego systemu obrazowania jest wykorzystanie konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej do obserwacji rozwoju organów roślinnych przez kilka dni w rozdzielczości subkomórkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące morfogenezy roślin, takie jak to, w jaki sposób komórki organizmów wielokomórkowych koordynują swoje wzorce wzrostu i proliferacji podczas organogenezy? Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta w konfiguracji i nie opiera się na specjalistycznym sprzęcie często używanym w obrazowaniu poklatkowym, takim jak systemy profuzji.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy przeczytaliśmy publikację Littlejohna i Love'a w New Phytologist, która opisuje zalety perfluorodekaliny w obrazowaniu w tkankach liści. Na początek użyj noża do szkła, aby zrobić szklane paski o szerokości trzech milimetrów ze szkiełka o grubości jednego milimetra. Następnie za pomocą kleju cyjanoakrylowego lub taśmy dwustronnej zabezpiecz paski w odległości około 45 milimetrów od siebie na całej szerokości nowego szkiełka.

Zrób dodatkową szkiełko o tych samych wymiarach, aby służyło jako forma. Teraz wykonaj uszczelkę o tej samej wysokości z przepuszczalnej dla gazu gumy PDMS. Zwilż drugi szkiełko niewielką ilością absolutnego etanolu i spłaszcz PDMS na szkiełku do wysokości pasków szkła.

Następnie zwilż ostrze absolutnym etanolem i odetnij nadmiar PDMS. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ narzędzia mokre etanolem nie przyklejają się do PDMS. Następnie ponownie spłaszcz PDMS do wysokości paska.

Następnie wytnij wgłębienie w PDMS, w którym będzie znajdowała się sadzonka i płyta agarowa. Aby uzyskać spójny rozmiar wnęki, używamy domowego noża na zamówienie zbudowanego z doskonałych materiałów, ale zamiast tego można użyć żyletki. Następnie przytnij wokół zewnętrznej krawędzi, aby uszczelka miała grubość około dwóch milimetrów.

Teraz na szkiełku bez uszczelki PDMS oprzyj szkiełko nakrywkowe na obu szklanych paskach. Następnie do przestrzeni poniżej szkiełka nakrywkowego odpipetować około jednego mililitra ciepłego upłynnionego podłoża agarowego wystarczającego do wypełnienia przestrzeni. Agar może zawierać eksperymentalne związki będące przedmiotem zainteresowania.

Następnie powietrze zrównoważy część PFD, potrząsając niewielką objętością PFD w probówce. Po związaniu agaru załaduj około 200 mikrolitrów PFD do uszczelki PDMS, ale nie napełniaj jej całkowicie. Usuń szkiełko nakrywkowe z płyty agarowej i pokrój je w kształt, który będzie pasował do studzienki uszczelki żelowej PDMS.

Pozostaw od dwóch do czterech milimetrów odstępu między agarem a ścianką uszczelki. Następnie całkowicie napełnij komorę zrównoważonym powietrzem PFD. Aby zobrazować grawitropowe korzenie pierwotne, błona celulozowa jest używana jako fizyczna bariera na powierzchni płyty agarowej.

Płyta agarowa musi być również bardziej miękka z 0,8% agarem zamiast 1,5%. Wytnij kawałek membrany, który ma w przybliżeniu takie same wymiary jak blok agaru. Następnie wysterylizuj go 80% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

Po wysuszeniu namocz membranę w płynnym podłożu wzrostowym, a następnie przenieś ją na powierzchnię agaru. Na początek ostrożnie umieść do trzech sadzonek na agarze . Ich umiejscowienie ma kluczowe znaczenie.

Liścienie i hipokotyl muszą zwisać z krawędzi agaru, unosząc się w PFD. Między sadzonkami należy zapewnić przestrzeń, aby umożliwić wzrost. Sadzonki można zwinąć, jeśli są zbyt duże, aby zmieścić się w komorze.

Następnie zamknij komorę za pomocą szkiełka nakrywkowego o grubości dopasowanej do wybranego obiektywu. Delikatnie dociśnij wzdłuż krawędzi, aby zetknąć się ze szklanymi paskami. Użyj kolejnego szkiełka, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby równomiernie spoczywało na dwóch szklanych paskach.

Następnie zabezpiecz szkiełko nakrywkowe za pomocą taśmy chirurgicznej z mikroporami przeciętej wzdłuż na pół. Teraz pozwól próbce osiąść na około pół godziny przed obrazowaniem. Aby przygotować sadzonki arabidopsis thaliana do komór, najpierw wysterylizuj nasiona 70% etanolem.

A następnie posadź je na uzupełnionym podłożu. Rozwarstwiaj posadzone nasiona przez dwa lub cztery dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś posadzone nasiona do 22 stopni Celsjusza i hoduj je pionowo w 16-godzinnym dziennym cyklu świetlnym.

Aby zobrazować korzenie boczne, hoduj rośliny przez siedem do 10 dni, a następnie przenieś je do komór obrazowania. Korzenie boczne rosnące w fizjologicznym tempie w komorach obrazowania były dokumentowane co pół godziny. Dla porównania, korzenie boczne wyhodowano również na standardowych płytkach Petriego w tym samym podłożu.

Tempo wzrostu poszczególnych korzeni różniło się znacznie w obu konfiguracjach, ale zakres był podobny w obu warunkach. Ogólnie rzecz biorąc, tempo wzrostu rosło wraz z długością. Tempo wzrostu roślin w komorach obrazowania lub na płytkach było nie do odróżnienia w ciągu pierwszych 27 godzin wzrostu.

Obie grupy startowały z tą samą średnią długością korzeni bocznych. Korzenie boczne wykazujące jednoczesną ekspresję markera błony plazmatycznej i markera mikrokanalików obrazowano w odstępach godzinnych w komorach obrazowania. Korzenie były bardzo stabilne w swoich pozycjach, co pozwoliło na kilkugodzinne obrazowanie konfokalne.

Wizualne wskaźniki proliferacji obserwowano przez cały czas trwania eksperymentu. W komórkach merystematycznych można było zidentyfikować pasma pre-profazowe, wrzeciona mitotyczne i fragmoplasty. W ciągu trzech dni boczny wzrost korzeni nie różnił się znacząco w komorach obrazowania w porównaniu z płytkami Petriego w ciągu pierwszych 48 godzin, ale po 72 godzinach średnie tempo wzrostu spadło.

Jednak znaczna część korzeni w komorach nadal rosła w tempie porównywalnym do korzeni na płytkach w ciągu 72 godzin. Po opanowaniu można zrobić dwa slajdy w 15 minut, jeśli wszystko pójdzie gładko. Możliwe jest użycie tego systemu obrazowania do badania efektu leczenia farmakologicznego, chociaż inne, bardziej złożone metody, takie jak systemy perfuzyjne, są wymagane do eksperymentów z wymywaniem.

Po opracowaniu technika ta zapewniła tani i prosty sposób śledzenia zdarzeń komórkowych leżących u podstaw morfogenezy roślin, w szczególności w celu zbadania roli krawędzi komórek, wymagań przestrzennych dzielących organogenezę w korzeniach bocznych rzodkiewnika pospolitego.