In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego
8 czerwca 2017
Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.
Ogólnym celem tej metody jest monitorowanie zmian patologicznych eksperymentalnej malarii mózgowej in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące patogenezy eksperymentalnej malarii mózgowej, ponieważ pozwala nam zobrazować in vivo, jak patologia całego mózgu ewoluuje w przestrzeni i czasie. Technika ta pozwala na szczegółową ocenę patologii mózgu i może być wykorzystana do oceny skuteczności nowych strategii leczenia malarii mózgowej.
Instalację MRI wykona Manuel Fischer, kierownik naszego laboratorium. Zacznij od zebrania samic komarów z klatki, 17 do 22 dni po posiłku z krwi. Użyj kleszczy, aby umieścić trzy do czterech komarów na szklanym szkiełku w połączeniu z kroplą zimnego podłoża RPMI.
Następnie umieść szkiełko pod mikroskopem. Ostrożnie rozciągnij komara między głową a ciałem za pomocą kleszczy i użyj strzykawki i igły, aby odizolować gruczoł ślinowy. Następnie zbierz gruczoły ślinowe ze szklanego szkiełka, zasysając je szklaną pipetą i przenosząc do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.
Następnie użyj małego plastikowego patyczka, aby rozbić izolowane gruczoły ślinowe w probówce wirówkowej przez trzy minuty, aby wyizolować sporozoity z tkanki gruczołu ślinowego. Wirować przez trzy minuty w temperaturze 1 000 g i czterech stopniach Celsjusza, aby oczyścić sporozoity z pozostałej tkanki. Odpipetować supernatant, który zawiera sporozoity, do nowej probówki wirówkowej i policzyć oczyszczone sporozoity w hemocytometrze Neubauera.
Sporozoity wykazują typowy ruch w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Następnie dostosuj stężenie oczyszczonych sporozoitów do 10 000 na mililitr, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanami. Na koniec umieść mysz C57BL/6 w ograniczniku i włóż jej ogon do ciepłej wody, aby lepiej uwidocznić żyłę ogonową.
Następnie wstrzyknij łącznie 1000 sporozoitów lub 0,1 mililitra do żyły ogonowej, aby zainicjować infekcję. Zacznij od przyłączenia myszy do skanera rezonansu magnetycznego (MRI) o masie 9,4 ton, który wykorzystuje rezonator objętościowy do transmisji fal radiowych. Następnie nałóż maść do oczu z dekspantenolem na oba oczy.
Włącz łaźnię wodną o kontrolowanej temperaturze do 42 stopni Celsjusza, aby utrzymać temperaturę ciała myszy. Następnie umieść cewnik do żyły ogonowej w żyle ogonowej myszy. Następnie ustaw mysz do rezonansu magnetycznego, kładąc ją na brzuchu i z chrupniętymi plecami na legowisku dla zwierząt wyposażonym w blokadę głowy i listwę zębatą, aby zminimalizować ruchy głowy.
Uważaj, aby nie wyprostować odcinka szyjnego kręgosłupa myszy. Podłączyć system wstrzykiwań środka kontrastowego wypełniony 0,3 milimola na kilogram Gd-DTPA do cewnika do żyły ogonowej. Następnie umieść cewkę głowicy 4-kanałowego odbiornika powierzchniowego Phased Array na główce myszy.
Na koniec umieść podkładkę oddechową z tyłu myszy i sprawdź oddech w urządzeniu monitorującym. Włącz laser pozycyjny, naciskając F2 na panelu sterowania, i poruszaj myszą, aż poziome światło pozycyjne znajdzie się w środku mniejszej części cewki, która zakrywa głowę myszy. Wyłącz laser pozycyjny, naciskając ponownie F2, a następnie przesuń mysz do pozycji końcowej, naciskając F3 na panelu sterowania.
Zacznij od wykonania skanowania lokalizacyjnego, aby upewnić się, że mózg myszy znajduje się w izocentrum magnesu. Jakościowa ocena obrzęku naczyniopochodnego za pomocą obrazowania 3D T2-zależnego. Wybierz wielorzędową sekwencję RARE i dostosuj pozycję plasterka, upewniając się, że cały mózg, od nosa do móżdżku, jest pokryty.
Po dostosowaniu wycinków nasycenia rozpocznij sekwencję i odczekaj 10 minut i 48 sekund, aby uzyskać obrazy. Następnie wykonaj relaksometrię T2, aby ilościowo ocenić obrzęk naczyniopochodny, wybierając wielorzędową, wielospinową sekwencję echa. Dostosuj pozycję wycinka i rozpocznij akwizycję sekwencji, która trwa osiem minut i 53 sekundy.
Aby ilościowo ocenić zarówno obrzęk naczyniopochodny, jak i obrzęk cytotoksyczny, należy przeprowadzić obrazowanie zależne od dyfuzji, wybierając sekwencję dyfuzji EPI spin-echo. Dostosuj położenie plasterka i plasterek nasycenia. Następnie rozpocznij sekwencję i odczekaj siedem minut i 56 sekund, aż zostaną uzyskane surowe obrazy.
Następnie oceń mikrokrwotoki, używając obrazowania 3D T2 ważonego gwiazdą. Wybierz sekwencję FLASH z kompensacją przepływu, dostosuj pozycję plasterka i rozpocznij sekwencję, która trwa 15 minut i 40 sekund. Następnie oceń drożność tętnic za pomocą angiografii czasu lotu, wybierając sekwencję 3D FLASH.
Dostosuj położenie plasterka, rozpocznij sekwencję, a następnie odczekaj siedem minut i 16 sekund, aż obrazy zostaną pobrane. Na koniec oceń zakłócenie bariery krew-mózg. Wybierz obrazowanie 3D T1-zależne z sekwencją FLASH, dostosuj pozycję plasterka i rozpocznij sekwencję.
Poczekaj minutę i 14 sekund, aż zostaną uzyskane obrazy bez kontrastu. Następnie wstrzyknąć kontrast 0,3 milimola na kilogram i powtórzyć pomiar. Wzrost zaburzenia bariery krew-mózg i wzrost płynu wskazują na wczesny obrzęk naczyniopochodny w opuszce węchowej, który jest już obecny w łagodnej chorobie i zaczyna rozprzestrzeniać się w kierunku pnia mózgu wraz ze wzrostem nasilenia choroby.
Na mapach T2 nasilenie obrzęku naczyniopochodnego można określić ilościowo, rysując interesujące regiony w określonych regionach anatomicznych. Dla każdego regionu można uzyskać czas relaksacji T2, który wydłuża się wraz ze wzrostem obrzęku. Co więcej, objętość mózgu wskazująca na obrzęk zaczyna znacznie rosnąć u umiarkowanie chorych myszy w porównaniu z wartością wyjściową i dalej wzrasta u poważnie chorych myszy.
Wreszcie, patologia mikrokrążenia, o czym świadczą mikrokrwotoki i wzrost kontrastu podatności naczyń, występuje po pierwszych oznakach przerwania bariery krew-mózg w obrzęku naczyniopochodnym. Te mikrohemmoraże występują głównie w opuszce węchowej. Jeśli uzyskany zostanie cały protokół MRI, wszystkie obrazy wraz z pozycjonowaniem można uzyskać w ciągu jednej godziny, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.
Minimalny protokół powinien obejmować sekwencję ważoną T2 lub relaksometrię T2 oraz sekwencję ważoną gwiazdą T2 w celu oceny obecności obrzęku naczyniopochodnego, obciążenia mikrokrwotokami i upośledzenia mikrokrążenia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób rezonans magnetyczny całego mózgu wizualizuje patologiczne zmiany w eksperymentalnej malarii mózgowej, w tym takie zmiany, jak obrzęk mózgu, który jest trudny do wykrycia ex vivo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i demonstruje, w jaki sposób zmiany zapalne oraz patologię mikro naczyniową można monitorować in vivo za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI). Metoda ta umożliwia wizualizację patologii mózgu w czasie, co pomaga w zrozumieniu progresji choroby oraz skuteczności leczenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Choroby zakaźne
- Techniki obrazowania
Wprowadzenie
- Eksperymentalna malaria mózgowa jest ciężkim powikłaniem malarii.
- Zrozumienie jej patogenezy jest kluczowe dla opracowania skutecznych metod leczenia.
- Techniki obrazowania in vivo mogą dostarczyć informacji na temat progresji choroby.
- Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) jest nieinwazyjną metodą oceny patologii mózgu.
Cel badania
- W celu monitorowania zmian patologicznych w przebiegu eksperymentalnej malarii mózgowej.
- W celu wizualizacji ewolucji patologii mózgu w przestrzeni i czasie.
- W celu oceny skuteczności nowych strategii terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej.
- Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) do śledzenia in vivo.
- Ocena patologii zapalnej i mikronaczyniowej.
- Zbiór samic komarów do konfiguracji eksperymentalnej.
Główne wyniki
- Skuteczne śledzenie patologii mózgu przy użyciu MRI.
- Wizualizacja odpowiedzi zapalnych w mózgu.
- Wgląd w przestrzenną i czasową ewolucję choroby.
- Potencjalne implikacje dla oceny skuteczności leczenia.
Wnioski
- Badanie dostarcza cennego narzędzia do zrozumienia malarii mózgowej.
- Obrazowanie in vivo może usprawnić ocenę strategii terapeutycznych.
- Dalsze badania są niezbędne w celu zgłębienia interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia nieinwazyjne, podłużne monitorowanie przerwania bariery krew-mózg, obrzęku oraz patologii mikro naczyniowej w translacyjnym modelu malarii mózgowej. Dostarczając ilościowe odczyty MRI w zakresie progresji choroby, wspiera ona mechanistyczne ograniczanie ryzyka w badaniu szlaków neurozapalnych oraz predykcyjną ocenę terapeutyków celowanych w ośrodkowy układ nerwowy. Podejście to usprawnia walidację celów terapeutycznych poprzez powiązanie mechanizmów naczyniowych i zapalnych z mierzalnymi biomarkerami obrazowymi in vivo.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację przestrzennej i czasowej ewolucji przerwania bariery krew-mózg oraz obrzęku in vivo.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów zaangażowanych w neurozapalenie i patologię mikro naczyniową poprzez obrazowanie podłużne.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez ilościowe określanie rozwoju obrzęku i stopnia mikrokrwawień jako translacyjny biomarkerów ciężkości choroby.
Przesiewy i rozwój analizy
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy istotne dla przebiegu choroby do dalszych badań przesiewowych poprzez ustalenie bazowych fenotypów MRI obrzęku naczyniowego i cytotoksycznego.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza pomiary czasów relaksacji T2 oraz objętości mózgu, co umożliwia znormalizowaną, powtarzalną ocenę obrzęku w grupach terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Tworzy skalowalną platformę obrazowania do oceny wpływu związków na integralność bariery krew-mózg oraz patologię mikro naczyniową w modelach chorób OUN.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje kluczowe cechy ludzkiej malarii mózgowej, w tym obrzęk, opuchliznę mózgu oraz patologię mikro naczyniową, wspierając dostrojenie biomarkerów translacyjnych.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając nieinwazyjne śledzenie patologii od wczesnych do ciężkich stadiów choroby.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez korelację obciążenia obrzękiem i mikrokruwawienami w MRI z pogorszeniem stanu neurologicznego i przeżywalnością.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności – dostarczając punktów końcowych opartych na obrazowaniu, które odzwierciedlają funkcję bariery krew-mózg oraz stan zdrowia układu naczyniowo-nerwowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów naczyniowych i zapalnych poprzez umożliwienie wizualizacji ewolucji patologii w całym mózgu w czasie i przestrzeni.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy dzięki ustandaryzowanym protokołom MRI, które ilościowo określają stopień obrzęku i mikrokrzwotoków w celu wiarygodnego screeningu związków.
- Analityka: Generuje ilościowe wyniki relaksometrii T2, obrazowania dyfuzyjnego i obrazowania podatności magnetycznej, co ułatwia porównania między grupami i modelowanie zależności dawka-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez monitorowanie istotnych dla choroby zmian patologicznych, które odzwierciedlają objawy ludzkiej malarii mózgowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako możliwość wielokrotnego wykorzystania w programach dotyczących zakaźnych chorób OUN, stanów zapalnych układu nerwowego oraz przenikania przez barierę krew-mózg.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w zakresie neuronaczyniowych i zapalnych czynników przyczyniających się do patologii.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki ustandaryzowanym protokołom akwizycji obrazów MRI i postprocesingu w celu kwantyfikacji obrzęku oraz mikrokrwawień.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie translacyjnych biomarkerów obrazowych, które zmniejszają ryzyko niepowodzenia w późnych fazach rozwoju leków na OUN.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez powiązanie parametrów obrzęku i mikrokrwawień pochodzących z MRI z ciężkością choroby i odpowiedzią na leczenie.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie MRI małych zwierząt, obsługi środków kontrastowych oraz interpretacji neuropatologicznej obrzęków i zmian mikro naczyniowych.
- Zależne od aparatury MRI wysokopolowej (9.4T), rezonatorów objętościowych, cewek z macierzą fazową oraz systemów wstrzykiwania kontrastu do podawania Gd-DTPA.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej pomiędzy zespołami parasitologii, obrazowania i patologii w celu zapewnienia spójności modeli infekcji oraz analizy obrazów.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne przy zastosowaniu modelu w odniesieniu do innych szczepów, gatunków lub patologii OUN poza eksperymentalną malarią mózgową.
- Ograniczone przez złożoność techniczną protokołów MRI wielosekwencyjnego oraz konieczność precyzyjnego monitorowania parametrów fizjologicznych podczas skanowania.
