Name: In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę śledzenia zmian patologicznych w eksperymentalnym malarii mózgowej u myszy przy użyciu rezonansu magnetycznego. Technika umożliwia wizualizację obrzęku i patologii mikrokrążenia w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za fachową pomoc techniczną Miriam Reinig. AH otrzymał dofinansowanie ze stypendium podoktorskiego Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Heidelbergu. MP jest wspierany przez stypendium Fundacji Else-Kröner-Fresenius. AKM jest stypendystką Niemieckiego Centrum Badań nad Zakażeniami (DZIF) w ramach stypendium urlopowego DZIF. JP jest stypendystą stypendium Heidelberg Research Center for Molecular Medicine (HRCMM) Career Development Fellowship. Wyrażamy również wdzięczność Julii M. Sattler i Friedrichowi Frischknechtowi za stworzenie przykładowego filmu o ruchu sporozoitowym.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane w tym artykule zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi kategorii B Federacji Stowarzyszeń Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (FELASA) oraz standardowymi wytycznymi Towarzystwa Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (GV-SOLAS) i zostały zatwierdzone przez lokalne władze niemieckie w Karlsruhe (Regierungspräsidium Karlsruhe, Niemcy). Należy pamiętać, że poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 dotyczy pracy komarów i sporozoitów Plasmodium berghei ANKA.
1. Infekcja
<ol>
	<li>Zainfekuj komary Anopheles stephensi Plasmodium berghei ANKA, karmiąc je przez 15 minut myszą gametocytemiczną. Utrzymuj zakażone komary w temperaturze 80% wilgotności i 21 °C.</li>
	<li>Zbierz samice komarów z klatki od 17 do 22 dni po posiłku z krwi. Umieść je na lodzie, aby je znieczulić.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy umieść trzy do czterech komarów na szklanym szkiełku pokrytym kroplą zimnego podłoża RPMI. Umieść szkiełko pod mikroskopem.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie rozciągnij komara między głową a ciałem. Odizolować gruczoł ślinowy za pomocą strzykawki i igły. Powtórz tę procedurę z pozostałymi komarami.</li>
	<li>Pobrać gruczoły ślinowe ze szkiełka podstawowego, zasysając je szklaną pipetą, a następnie umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: W zależności od wskaźników infekcji, zwykle można uzyskać od 8 000 do 15 000 zakaźnych sporozoitów na gruczoł ślinowy.</li>
	<li>Przez około 3 minuty rozbij izolowane gruczoły ślinowe w probówce wirówkowej małym, plastikowym patyczkiem, aby wyizolować sporozoity z tkanki gruczołu ślinowego.</li>
	<li>Wirować przez 3 minuty w temperaturze 1 000 x g i w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia sporozoitów z pozostałej tkanki.</li>
	<li>Odpipetować supernatant, który zawiera sporozoity (SPZ), do nowej probówki wirówkowej i odliczyć oczyszczone sporozoity w hemocytometrze Neubauera.</li>
	<li>Dostosuj stężenie oczyszczonych sporozoitów do 10 000/ml, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanami.</li>
	<li>Wstrzyknij łącznie 1,000 sporozoitów (0,1 ml) do żył ogonowych wsobnych myszy C57BL/6, aby zainicjować infekcję. Aby ułatwić wstrzykiwanie, umieść myszy C57BL/6 w ograniczniku i umieść ogony w ciepłej (około 37 °C) wodzie, aby pomóc w wizualizacji żył ogonowych; 
	UWAGA: Samo wstrzyknięcie jest krótkim zabiegiem, który można wykonać w ciągu kilku sekund.</li>
	<li>Raz dziennie sprawdzaj parazytemię w fazie krwi w rozmazach krwi od 3 dnia po zakażeniu SPZ. 
	UWAGA: Monitorowanie parazytemii zostało wcześniej zwizualizowane w artykule JoVE autorstwa Muellera i wsp.8</li>
	<li>Oceniaj myszy raz dziennie za pomocą skali szybkiej mysiej śpiączki i zachowania (RMCBS), zaczynając od 5 dnia po wstrzyknięciu sporozoitu. 
	UWAGA: Szczegółowy opis tej procedury, w tym demonstracja wideo, został opublikowany przez Caroll i wsp.6</li>
	<li>Oceń myszy za pomocą obrazowania MRI zgodnie z wynikiem RMCBS i pytaniem badawczym, na które należy odpowiedzieć. 6</li>
</ol>
2. Konfiguracja obrazowania metodą rezonansu magnetycznego
<ol>
	<li>Wykonaj rezonans magnetyczny na skanerze małych zwierząt 9,4 T przy użyciu rezonatora objętościowego do transmisji fal radiowych i 4-kanałowej cewki odbiorczej z układem fazowym. Włącz łaźnię wodną o kontrolowanej temperaturze do 42 °C, aby utrzymać temperaturę ciała myszy.</li>
	<li>Wywołaj znieczulenie w komorze za pomocą 2% izofluranu i sprężonego powietrza, aż mysz przestanie reagować na uszczypnięcie palca u nogi. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1-1,5%.</li>
	<li>Umieść cewnik do żyły ogonowej w żyle ogonowej myszy. Ustaw mysz do rezonansu magnetycznego, kładąc ją na brzuchu i z chrupniętym grzbietem na łóżku dla zwierząt wyposażonym w blokadę głowy i listwę zębatą, aby zminimalizować ruchy głowy. Uważaj, aby nie wyprostować odcinka szyjnego kręgosłupa myszy.</li>
	<li>Podłączyć system do wstrzykiwania środka kontrastowego do cewnika do żyły ogonowej. Należy użyć specjalnie przygotowanego systemu iniekcyjnego wypełnionego strzykawką Gd-DTPA (0,3 mmol/kg) lub użyć rurki PE podłączonej do strzykawki Gd-DTPA (0,3 mmol/kg).</li>
	<li>Nałóż maść do oczu z dekspantenolem na oba oczy. Umieść 4-kanałową cewkę głowicy odbiornika powierzchniowego z układem fazowym na główce myszy. Umieść podkładkę oddechową z tyłu myszy i podłącz ją do urządzenia monitorującego oddech.</li>
</ol>
3. Protokół obrazowania
UWAGA: Wybierz sekwencje obrazowania z poniższego protokołu zgodnie z pytaniami badawczymi, które mają być odniesione. Wszystkie wymienione parametry są ważne dla oprogramowania MRI, ale mogą wymagać dostosowania, jeśli używane są inne programy.
<ol>
	<li>Zacznij od wykonania skanowania lokalizacyjnego, aby upewnić się, że mózg myszy znajduje się w izocentrum magnesu.</li>
	<li>Aby jakościowo ocenić obrzęk naczyniopochodny, użyj obrazowania 3D T2-zależnego, wybierając wielorzędową sekwencję RARE.
	<ol>
		<li>Wprowadź następujące parametry do oprogramowania MRI: czas powtórzenia = 2.000 ms, czas echa = 22 ms, rozdzielczość izotropowa = 0,1 mm, pole widzenia = 20 x 10 x 12 mm3; matryca = 200 x 100 x 120, kąt odwrócenia = 90-180°; (spin-echo) i rzadki czynnik = 8. Rozpocznij sekwencję i odczekaj 10 minut 48 s, aby uzyskać surowe obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ilościowo ocenić obrzęk naczyniopochodny, należy wykonać relaksometrię T2, wybierając wielorzędową, wieloczęściową sekwencję echa spinowego.
	<ol>
		<li>Użyj następujących parametrów: czas powtarzania = 3.100 ms, czas echa = 8-136 ms w krokach co 8 ms, liczba plasterków = 17, grubość warstwy = 0,7 mm, rozdzielczość w płaszczyźnie = 0,116 mm x 0,116 mm, pole widzenia 20 x 20 mm2, matryca = 172 x 172, kąt odwrócenia = 90-180 stopni; (echa spinowe). Rozpocznij sekwencję i odczekaj 8 minut 53 s, aby uzyskać surowe obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ilościowo ocenić zarówno obrzęk naczyniopochodny, jak i obrzęk cytotoksyczny, należy przeprowadzić obrazowanie zależne dyfuzją/mapowanie współczynnika pozornej dyfuzji (ADC), wybierając sekwencję dyfuzji EPI spin-echo.
	<ol>
		<li>Użyj następujących parametrów: czas powtarzania = 3.400 ms, czas echa = 20 ms, grubość warstwy = 0,7 mm, liczba warstw = 17, liczba kierunków uczulonych dyfuzji = 30, wartość b = 1.500 s/mm2, δ = 3 ms, Δ = 9 ms, częściowy współczynnik przyspieszenia kodowania Fouriera = 1,51, pole widzenia = 12 x 15 mm2, matryca = 96 x 128, Rozdzielczość w płaszczyźnie = 0,125 mm x 0,117 mm, kąt odwrócenia = 90-180 stopni i liczba wycinków nasycenia (strzałkowa) = 1. Rozpocznij sekwencję i odczekaj 7 minut 56 s, aż zostaną uzyskane obrazy raw.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ocenić mikrokrwotoki, użyj obrazowania 3D T2*-zależnego. Wybierz sekwencję FLASH z kompensacją przepływu.
	<ol>
		<li>Wprowadź następujące parametry do oprogramowania MRI: czas powtarzania = 2.000 ms, czas echa = 22 ms, rozdzielczość izotropowa 0,08 mm, pole widzenia = 32 x 15 x 8 mm3, rozmiar matrycy = 400 x 188 x 100 i kąt odwrócenia = 12 stopni. Rozpocznij sekwencję i odczekaj 15 minut 40 s, aby uzyskać surowe obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ocenić drożność tętnic, użyj angiografii czasu lotu, wybierając sekwencję 3D FLASH.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu MRI należy użyć następujących parametrów: czas powtarzania = 16 ms, czas echa = 3,5 ms, grubość warstwy = 0,07 mm, rozdzielczość w płaszczyźnie = 0,104 x 0,104 mm, pole widzenia = 20 x 20 x 10 mm3, matryca = 192 x 192 x 142 i kąt odwrócenia = 15 stopni. Rozpocznij sekwencję i odczekaj 7 minut 16 s, aż obrazy zostaną uzyskane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ocenić przerwanie bariery krew-mózg, należy zastosować obrazowanie 3D T1-zależne przed i po wstrzyknięciu środka kontrastowego w ilości 0,3 mmol/kg. Wybierz sekwencję FLASH z zakłóceniem częstotliwości radiowej z globalnym wzbudzeniem częstotliwości radiowej.
	<ol>
		<li>Użyj następujących parametrów sekwencji w oprogramowaniu MRI: czas powtarzania = 5 ms, czas echa = 1,9 ms, rozdzielczość izotropowa = 0,156 mm, pole widzenia 20 x 18,7 x 18,7 mm3, matryca 128 x 120 x 120 i kąt odwrócenia = 8,5°;. Rozpocznij sekwencję i odczekaj 1 minutę i 14 sekund, aż obrazy zostaną pobrane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i analiza obrazu
<ol>
	<li>Aby przeanalizować zakłócenie bariery krew-mózg, odejmij 3D nieulepszone obrazy T1 zależne od ulepszonych obrazów T1 za pomocą narzędzia arytmetycznego lub kalkulatora obrazów w ImageJ. Oceń obrazy odejmowania pod kątem wzrostu sygnału, który odpowiada przerwaniu bariery krew-mózg. 9</li>
	<li>Aby przeanalizować objętość mózgu, użyj natywnych zestawów danych 3D T1 lub 3D T2-ważonych. Nakreśl mózg od opuszki węchowej do móżdżku za pomocą edytora segmentacji. 10</li>
	<li>Obrzęk naczyniopochodny
	<ol>
		<li>Przetwarzaj dane relaksometryczne T2 za pomocą oprogramowania MRI lub użyj nieliniowej procedury dopasowania najmniejszych kwadratów. 11 Przetwarzaj dane ważone dyfuzją, aby uzyskać mapy ADC za pomocą oprogramowania MRI lub zestawu narzędzi FDT (zobacz Tabelę materiałów).</li>
		<li>Ręczne umieszczanie obszarów zainteresowania w różnych regionach anatomicznych. 
		UWAGA: Automatyczne umieszczanie obszarów zainteresowania może rejestrować się nieprawidłowo z powodu znacznego obrzęku mózgu. W ten sposób uzyskuje się wartości czasów T2 i ADC wybranych obszarów anatomicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeanalizować objętość mikrokrwotoku, należy nakreślić mikrokrwotoki, które pojawiają się jako jajowate, ciemne ogniska na zestawach danych ważonych T2*, za pomocą edytora segmentacji.</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Malaria+Report%22">World Malaria Report</a>. , (2014).</li>
<li>Seydel, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+swelling+and+death+in+children+with+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Brain swelling and death in children with cerebral malaria.</a> N Engl J Med. 372 (12), 1126-1137 (2015).</li>
<li>Penet, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+experimental+cerebral+malaria+in+vivo%3A+significant+role+of+ischemic+brain+edema%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging experimental cerebral malaria in vivo: significant role of ischemic brain edema.</a> J Neurosci. 25 (32), 7352-7358 (2005).</li>
<li>de Souza, J. B., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes Infect. 4 (3), 291-300 (2002).</li>
<li>Curfs, J. H., van der Meide, P. H., Billiau, A., Meuwissen, J. H., Eling, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+berghei%3A+recombinant+interferon-gamma+and+the+development+of+parasitemia+and+cerebral+lesions+in+malaria-infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium berghei: recombinant interferon-gamma and the development of parasitemia and cerebral lesions in malaria-infected mice.</a> Exp Parasitol. 77 (2), 212-223 (1993).</li>
<li>Carroll, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+murine+coma+and+behavior+scale+for+quantitative+assessment+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria.</a> PLoS One. 5 (10), (2010).</li>
<li>Hoffmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Cerebral+Malaria+Spreads+along+the+Rostral+Migratory+Stream%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Experimental Cerebral Malaria Spreads along the Rostral Migratory Stream.</a> PLoS Pathog. 12 (3), e1005470(2016).</li>
<li>Mueller, A. K., Behrends, J., Blank, J., Schaible, U. E., Schneider, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+to+study+tuberculosis-malaria+coinfection+upon+natural+transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei.</a> J Vis Exp. (84), e50829(2014).</li>
<li>Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+reversible+blood-brain+barrier+disruption+by+noninvasive+focused+ultrasound+at+frequencies+suitable+for+trans-skull+sonications%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications.</a> Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).</li>
<li>Nag, N., Mellott, T. J., Berger-Sweeney, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+postnatal+dietary+choline+supplementation+on+motor+regional+brain+volume+and+growth+factor+expression+in+a+mouse+model+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of postnatal dietary choline supplementation on motor regional brain volume and growth factor expression in a mouse model of Rett syndrome.</a> Brain Res. 1237, 101-109 (2008).</li>
<li>Giri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T2+quantification+for+improved+detection+of+myocardial+edema%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">T2 quantification for improved detection of myocardial edema.</a> J Cardiovasc Magn Reson. 11, 56(2009).</li>
<li>Engwerda, C., Belnoue, E., Gruner, A. C., Renia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experimental models of cerebral malaria.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 297, 103-143 (2005).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+plays+a+key+role+in+spatiotemporal+pathogenesis+of+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Olfactory plays a key role in spatiotemporal pathogenesis of cerebral malaria.</a> Cell Host Microbe. 15 (5), 551-563 (2014).</li>
<li>Nacer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cerebral+malaria+pathogenesis--hemodynamics+at+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Experimental cerebral malaria pathogenesis--hemodynamics at the blood brain barrier.</a> PLoS Pathog. 10 (12), e1004528(2014).</li>
<li>Nacer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmunological+blood+brain+barrier+opening+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Neuroimmunological blood brain barrier opening in experimental cerebral malaria.</a> PLoS Pathog. 8 (10), e1002982(2012).</li>
<li>Pai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+dynamics+of+leukocyte+behaviour+during+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the dynamics of leukocyte behaviour during experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> PLoS Pathog. 10 (7), e1004236(2014).</li>
<li>Shaw, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+Arrest+of+CD8%2B+T+Cells+Is+a+Signature+of+Experimental+Cerebral+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Perivascular Arrest of CD8+ T Cells Is a Signature of Experimental Cerebral Malaria.</a> PLoS Pathog. 11 (11), e1005210(2015).</li>
<li>Potchen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+MRI+findings+in+120+Malawian+children+with+cerebral+malaria%3A+new+insights+into+an+ancient+disease%5BTitle%5D)+AND+%22AJNR+Am+J+Neuroradiol%22%5BJournal%5D)">Acute brain MRI findings in 120 Malawian children with cerebral malaria: new insights into an ancient disease.</a> AJNR Am J Neuroradiol. 33 (9), 1740-1746 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

W tym artykule opisujemy protokół MRI całego mózgu w celu nakreślenia zmian w eksperymentalnej malarii mózgowej. Uważamy, że do tej pory rezonans magnetyczny nie był w pełni wykorzystywany w badaniach nad malarią i mamy nadzieję, że nasze protokoły pomogą innym badaczom. Chcielibyśmy opisać kilka dodatkowych punktów, które mogą być pomocne.
Jeśli obrazowane są poważnie chore myszy, kluczowe znaczenie ma pozycjonowanie. Ze względu na zwiększone ciśnienie śródczaszkowe myszy są podatne na śmierć...

Malaria jest poważnym globalnym problemem zdrowotnym. 1 Ciężka malaria charakteryzuje się częściowo zajęciem mózgu i często jest złym czynnikiem prognostycznym. Zajęcie mózgu jest powszechne u dzieci poniżej piątego roku życia na obszarach o wysokiej transmisji malarii i stanowi główną przyczynę zgonów związanych z malarią w tej grupie wiekowej. 1 Podczas gdy agresywne leczenie może uratować życie, wykrycie malarii mózgowej, zwłaszcza we wczesnych stadiach, może być trudne. Procesy patologiczne związane z malarią mózgową obejmują zaburzenia mikrokrążenia i obrzęk mózgu, co może prowadzić do poważnego obrzęku mózgu. W tym artykule przedstawiamy protokół obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI), który umożliwia obrazowanie in vivo całego mózgu eksperymentalnej malarii mózgowej (ECM). Metody obrazowania całego mózgu o wysokiej rozdzielczości są szeroko stosowane w tej chorobie, mimo że niewiele wiadomo o tym, w jaki sposób ECM inicjuje się w ośrodkowym układzie nerwowym lub jakie konkretne mechanizmy prowadzą do choroby. In vivo (in vivo) Rezonans magnetyczny, obejmujący cały mózg, stanowi ważne narzędzie badawcze pozwalające lepiej zrozumieć patologię ECM. Rezonans magnetyczny jest w stanie ocenić globalny obrzęk mózgu mózgu, który niedawno został uznany za ważny czynnik prognostyczny zgonu nie tylko w ECM, ale także w ludzkiej malarii mózgowej. 2,3 Ciężki obrzęk mózgu występuje w przypadku śmiertelnej choroby i stanowi jedną z kilku patologicznych cech między modelami ECM a chorobą człowieka, chorobą, która charakteryzuje się zarówno zmianami zapalnymi, jak i mikronaczyniowymi. 4
ECM może być wywołany u myszy CBA lub C57BL poprzez zakażenie śmiertelnym Plasmodium berghei ANKA.5 Początek ECM zwykle występuje między 6 a 10 dniem po infekcji i powoduje napady, ataksję, niewydolność oddechową i śpiączkę, które prowadzą do szybkiej śmierci. 4 Skala Szybkiej Mysiej Śpiączki i Zachowania (RMCBS) jest pomocna do oceny objawów klinicznych ECM. Składa się z 10 parametrów, z których każdy jest oceniany w skali od 0 do 2, z maksymalną możliwą oceną 20. 6 Ostatnio wykazaliśmy dobrą zgodność między nasileniem wyników RMCBS u myszy ECM a zmianami patologicznymi wykazanymi przez MRI. 7 W tym protokole opisujemy indukcję ECM u myszy oraz rezonans magnetyczny in vivo myszy z ECM.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001747</td><td>do znieczulenia</td></tr><tr><td>Dotarem</td><td>Guebert</td><td>1086923</td><td>środek kontrastowy Gd-DTPA; 0,5 mmol/ml</td></tr><tr><td>Amira (program do przetwarzania obrazu)</td><td>FEI Group</td><td></td><td>Wersja Amira 5.3.2</td></tr><tr><td>MATLAB&nbsp;</td><td>MathWorks, Inc.,</td><td></td> <td>wydanie 2012b</td></tr><tr><td>Zestaw narzędzi FDT&nbsp;</td><td>Biblioteka oprogramowania</td> <td>FMRIB<a href="http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html">http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html</a></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Malaria mózgowa jest oznaką ciężkiej choroby malarycznej i często jest zwiastunem śmierci. Podczas gdy agresywne leczenie może uratować życie, wykrycie malarii mózgowej może być trudne. Przedstawiamy eksperymentalny mysi model malarii mózgowej, który ma wiele cech charakterystycznych dla choroby ludzkiej, w tym obrzęk i patologię mikrokrążenia. Za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) możemy wykryć i śledzić przerwanie bariery krew-mózg, rozwój obrzęku, a następnie obrzęk mózgu. Opisujemy wiele technik MRI, które mogą uwidocznić te istotne zmiany patologiczne. W ten sposób pokazujemy, że rezonans magnetyczny stanowi cenne narzędzie do wizualizacji i śledzenia zmian patologicznych, takich jak obrzęk, obrzęk mózgu i patologia mikrokrążenia, in vivo.

U myszy C57BL/6 pierwsze objawy kliniczne ECM można zaobserwować między 6. a 10. dniem po zakażeniu sporozoitami P. berghei ANKA. ECM rozwija się u 60–80% zakażonych myszy i szybko postępuje do stanu śpiączki i śmierci w ciągu 24–48 h. Z kolei myszy, u których nie rozwija się ECM, giną po drugim tygodniu od zakażenia z powodu ciężkiej anemii wynikającej z hiperpasytemii.12
W obrazowaniu MRI najwc...

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Ogólnym celem tej metody jest monitorowanie zmian patologicznych w przebiegu eksperymentalnej malarii mózgowej in vivo. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące patogenezy eksperymentalnej malarii mózgowej, ponieważ pozwala na wizualizację in vivo tego, jak patologia całego mózgu rozwija się w przestrzeni i czasie. Technika ta umożliwia tym samym szczegółową ocenę patologii mózgu i może być wykorzystana do oceny skuteczności nowych strategii terapeutycznych w malarii mózgowej.Konfigurację MRI przeprowadzi Manuel Fischer, nasz kierownik laboratorium. Należy rozpocząć od zebrania samic komarów z klatki, od 17 do 22 dni po posiłku krwi. Za pomocą pęsety należy umieścić trzy do czterech komarów na szkiełku przedmiotowym, dodając kroplę schłodzonego podłoża RPMI.Następnie umieść preparat pod mikroskopem. Ostrożnie rozciągnij komara między głową a odwłokiem za pomocą pincety, a następnie użyj strzykawki z igłą, aby wyizolować gruczoły ślinowe. Kolejno zbierz gruczoły ślinowe z szkiełka przedmiotowego, odsysając je pipetą szklaną i przenosząc do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.Następnie, za pomocą małego plastikowego patyczka, rozgnieć wyizolowane gruczoły ślinowe w probówce do wirowania przez trzy minuty, aby uwolnić sporozoity z tkanki gruczołów ślinowych. Wirować przez trzy minuty przy 1 000 ×g i temperaturze 4 °C, aby oczyścić sporozoity z pozostałej tkanki. Przenieś pipetą nadsącz zawierający sporozoity do nowej probówki do wirowania, a następnie policz oczyszczone sporozoity przy użyciu komory licznikowej Neubauera.Sporozoity wykazują typowy ruch przeciwny do ruchu wskazówek zegara. Następnie należy dostosować stężenie oczyszczonych sporozoitów do 10 000 na mililitr, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanem. Na koniec umieścić mysz C57BL/6 w stabilizatorze i zanurzyć jej ogon w ciepłej wodzie, aby lepiej uwidocznić żyłę ogonową.Następnie, w celu zainicjowania infekcji, wstrzyknij do żyły ogonowej łącznie 1 000 sporozoitów, czyli 0,1 mililitra. Rozpocznij od umieszczenia myszy w skanerze obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) dla małych zwierząt o natężeniu pola 9,4T, który wykorzystuje rezonator objętościowy do transmisji częstotliwości radiowych. Następnie nałóż maść do oczu z dekspantenolem do obu oczu.Włącz kąpiel wodną z kontrolą temperatury, ustawiając ją na 42 stopnie Celsjusza, aby utrzymać temperaturę ciała myszy. Następnie wprowadź cewnik do żyły ogonowej myszy. W kolejnym kroku przygotuj mysz do badania MRI, kładąc ją na brzuchu z podwiniętymi plecami na legowisku dla zwierząt wyposażonym w stabilizator głowy i pasek do zębów, aby zminimalizować ruchy głowy.Należy uważać, aby nie prostować kręgosłupa szyjnego myszy. Do cewnika w żyle ogonowej podłączyć system wtryskiwania środka kontrastowego wypełniony Gd-DTPA w stężeniu 0,3 millimole per kilogram. Następnie na głowę myszy nałożyć cewkę głowową 4-Channel Phased Array Surface Receiver.Na koniec umieść podkładkę oddechową na grzbiecie myszy i sprawdź czynność oddechową na urządzeniu monitorującym. Włącz laser pozycjonujący, naciskając klawisz F2 na panelu sterowania, a następnie przesuń mysz tak, aby pozioma wiązka światła pozycjonującego znajdowała się w środku mniejszej części cewki, która obejmuje głowę myszy. Wyłącz laser pozycjonujący, ponownie naciskając F2, a następnie przesuń mysz do pozycji końcowej, naciskając F3 na panelu sterowania.Zacznij od wykonania skanu lokalizacyjnego, aby upewnić się, że mózg myszy znajduje się w izocentrum magnesu. Jakościowo oceń obrzęk naczyniowy, korzystając z obrazowania 3D ważonego T2. Wybierz wielowarstwową sekwencję RARE i dostosuj położenie warstw, upewniając się, że objętość obrazowania obejmuje cały mózg, od nosa do móżdżku.Po dostrojeniu plastrów nasycenia uruchom sekwencję i odczekaj 10 minut i 48 sekund do czasu uzyskania obrazów. Następnie przeprowadź relaksometrię T2 w celu ilościowej oceny obrzęku naczyniopochodnego, wybierając sekwencję wielopłatstrową z wielokrotnym echem spinowym. Dostosuj położenie plastrów i rozpocznij akwizycję sekwencji, która trwa osiem minut i 53 sekundy.Aby ilościowo ocenić zarówno obrzęk naczyniowy, jak i obrzęk cytotoksyczny, należy przeprowadzić obrazowanie rozszerzone dyfuzyjnie (DWI), wybierając sekwencję dyfuzyjną spin-echo EPI. Dostosuj położenie przekrojów oraz przekrój nasycenia. Następnie uruchom sekwencję i odczekaj siedem minut i 56 sekund do czasu uzyskania surowych obrazów.Następnie należy ocenić mikrokrawienie, wykorzystując obrazowanie 3D T2-star-weighted. Wybierz sekwencję FLASH z kompensacją przepływu, dostosuj położenie warstw i uruchom sekwencję, która trwa 15 minut i 40 sekund. Następnie oceń drożność tętnic za pomocą angiografii time of flight, wybierając sekwencję 3D FLASH.Dostosuj pozycję przekroju, uruchom sekwencję, a następnie odczekaj siedem minut i 16 sekund do czasu uzyskania obrazów. Na koniec oceń przerwanie bariery krew-mózg. Wybierz obrazowanie 3D T1-zależne z sekwencją FLASH, dostosuj pozycję przekroju i uruchom sekwencję.Odczekaj jedną minutę i 14 sekund do czasu uzyskania obrazów bez kontrastu. Następnie wstrzyknij kontrast w dawce 0,3 millimole na kilogram i powtórz pomiar. Wzrost przerwania bariery krew-mózg oraz zwiększenie ilości płynu wskazują na wczesny obrzęk naczyniopochodny w opuszce węchowej, który występuje już w łagodnym przebiegu choroby i zaczyna rozprzestrzeniać się w kierunku pnia mózgu wraz ze wzrostem stopnia zaawansowania choroby.Na mapach T2 stopień nasilenia obrzęku naczyniopochodnego można określić ilościowo poprzez wyznaczenie obszarów zainteresowania (ROI) w konkretnych regionach anatomicznych. Dla każdego regionu można uzyskać czas relaksacji T2, który wydłuża się wraz ze wzrostem obrzęku. Ponadto objętość mózgu wskazująca na obecność obrzęku zaczyna istotnie wzrastać u myszy w stanie umiarkowanego zachorowania w porównaniu z wartościami bazowymi, a następnie ulega dalszemu zwiększeniu u myszy w stanie ciężkiego zachorowania.Na koniec, patologia mikro naczyniowa, objawiająca się mikrokrwawieniami i wzrostem kontrastu podatności naczyń, występuje po pierwszych oznakach przerwania bariery krew-mózg w obrzęku naczyniopochodnym. Mikrokrwawienia te występują głównie w opłacie węchowej. Jeśli cały protokół MRI jest realizowany, wszystkie obrazy, w tym pozycjonowanie, można uzyskać w ciągu jednej godziny, pod warunkiem prawidłowego wykonania badania.Minimalny protokół powinien obejmować sekwencję ważoną T2 lub relaksometrię T2 oraz sekwencję ważoną T2*, aby ocenić obecność obrzęku wazogennego, stopień mikrokrwawień oraz uszkodzenia naczyniowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, w jaki sposób MRI całego mózgu obrazuje zmiany patologiczne w eksperymentalnej malarii mózgowej, w tym zmiany takie jak obrzęk mózgu, który jest trudny do wykrycia ex vivo.

in-vivo-tracking-edema-development-microvascular-pathology-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Przedstawiamy metodę wykonywania mikroskopii intravitalnej ślezy z wykorzystaniem transgenicznych pasożytów malarii GFP oraz kwantyfikacji ruchliwości pasożytów i przepływu krwi w obrębie tego narządu.

Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

Ten film demonstruje generowanie eksperymentalnego mysiego modelu malarii mózgowej. Sporozoity wyizolowane z samic komarów zakażonych Plasmodium berghei są wstrzykiwane do uwięzionych żył ogonowych myszy, co prowadzi do przerwania bariery krew-mózg i zapalenia mózgu, powodując malarię mózgową. Ten zakażony model myszy stanowi cenne narzędzie do badania in vivo patologii mikrokrążenia związanej z malarią mózgową.

Wygenerowanie mysiego modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem sporozoitów pochodzących od komarów gospodarzy

Źródło: Arango-Lievano, M. et. al., Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje obrazowanie dwufotonowe in vivo w celu wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie blaszek amyloidowych i naczyń mózgowych. Niebieska fluorescencja oznacza blaszki miażdżycowe, podczas gdy zielona fluorescencja podkreśla naczynia krwionośne mózgu. Mapa 3D obszaru zainteresowania i obrazowanie mozaikowe o wysokiej rozdzielczości ujawniają szczegółowe...

Obrazowanie in vivo naczyń mózgowych i blaszek amyloidowych w mysim modelu choroby Alzheimera

Opisujemy ogólny protokół śledzenia komórek in vivo za pomocą MRI w modelu mysim z komórkami oznaczonymi ex vivo. Dołączony jest typowy protokół do znakowania komórek, przetwarzania akwizycji obrazu i kwantyfikacji.

Rezonans magnetyczny in vivo 19F do śledzenia komórek

Ten film ilustruje metodę, przy użyciu klinicznego skanera 3 T, do obrazowania MR z kontrastem projekcji wzrokowej naiwnej myszy oraz do powtarzalnych i podłużnych badań in vivo zwyrodnienia nerwu wzrokowego związanego z ostrym uszkodzeniem nerwu wzrokowego i przewlekłym zwyrodnieniem nerwu wzrokowego u myszy z nokautem (p50KO).

In vivo (in vivo) Obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania i śledzenia nieinwazyjnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza są wykorzystywane jako sonda rezonansu magnetycznego (MRI) do znakowania MSC i nieinwazyjnego śledzenia in vivo po podaniu donosowym za pomocą rezonansu magnetycznego w czasie rzeczywistym.

Śledzenie superparamagnetycznych mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych tlenkiem żelaza za pomocą rezonansu magnetycznego po dososowym podaniu w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Poznaj metodę śledzenia zmian patologicznych w eksperymentalnym malarii mózgowej u myszy przy użyciu rezonansu magnetycznego. Technika umożliwia wizualizację obrzęku i patologii mikrokrążenia w czasie rzeczywistym.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Przeglądaj więcej filmów