Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej
24 lutego 2017
Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.
Ogólnym celem tej procedury izolacji jest umożliwienie obrazowania żywych komórek proliferujących komórek, które przechodzą interkinetyczną migrację jądrową w kulturach eksplantatów siatkówki od uszkodzonego danio pręgowanego. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regeneracji siatkówki, takie jak to, jakie mechanizmy napędzają interkinetyczną migrację jądrową lub czy glej Mullera w interkinetycznej migracji jądrowej komórek progenitorowych nerki jest podobnie regulowany. Główną zaletą tej techniki jest to, że można monitorować dynamiczne zachowanie proliferujących komórek ulegających interkinetycznej migracji jądrowej podczas regeneracji, co pozwala na badanie mechanizmów specyficznych dla danego etapu cyklu komórkowego.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat interkinetycznej migracji jądrowej, może być również stosowana w innych obszarach badań siatkówki, takich jak badanie zachowania mikrogleju lub fagocytozy gleju Mullera umierających neuronów. Rozpocznij tę procedurę od przeniesienia danio pręgowanego na suchy ręcznik papierowy. Następnie usuń jedno z oczu za pomocą zakrzywionych kleszczy i przenieś je na FluoroDish.
Pod mikroskopem stereoskopowym ustawić oko w taki sposób, aby źrenica była skierowana w stronę szkiełka nakrywkowego FluoroDish, tak aby widoczny był nerw wzrokowy z tyłu oka. Następnie usuń nerw wzrokowy jak najbliżej tylnej części oka. Ponadto usuń tkankę łączną na zewnątrz oka.
Przytrzymaj oko między jego nosową a skroniową stroną za pomocą kleszczy, wykonując nacięcie na kolbie optycznej, przebijając blaszkę cribrosa jednym ostrzem nożyczek i przecinając wzdłuż zarówno nosowej, jak i skroniowej strony oka. Następnie rozsuń grzbietową i brzuszną stronę siatkówki. Usuń twardówkę z siatkówki grzbietowej za pomocą jednej pary kleszczy, trzymając soczewkę połączoną z siatkówką za pomocą drugiej pary kleszczy.
Następnie usuń soczewkę i ciało szkliste, nie uszkadzając siatkówki. Następnie spłaszcz siatkówkę z warstwą komórek zwojowych skierowaną w stronę szkiełka nakrywkowego FluoroDish. Następnie otocz siatkówkę 10 mikrolitrami 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia.
Upewnij się, że siatkówka nie jest uniesiona przez płynną agarozę, ponieważ nawet niewielkie uniesienie może wpłynąć na zdolność skupienia się przez tkankę. Jeśli zaobserwuje się podnoszenie, użyj pipety, aby usunąć agarozę. Bardzo ważne jest, aby agaroza nie unosiła tkanki ze szkiełka nakrywkowego, ponieważ zmniejsza to zdolność do uzyskania wysokiej jakości obrazów.
Powtórz tę procedurę kilka razy przed dodaniem 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby pokryć całe FluoroDish. Gdy agaroza zestali się, dodaj 1,5 mililitra pożywki hodowlanej do tkanki. W oprogramowaniu do akwizycji obrazów otwórz okienka A1 MP GUI TI, A1 compact GUI i ND acquisition windows.
W przypadku obrazowania wielofotonowego upewnij się, że opcja IRNDD jest wybrana w kompaktowym oknie graficznego interfejsu użytkownika A1. Następnie w polu ustawień wybierz IRDM dla pierwszego lustra dichroicznego i sprawdź, czy filtr pasmowoprzepustowy jest ustawiony na 525 do 50, aby uzyskać fluorescencję GFP. Następnie włącz laser IR w oknie GUI A1 MP.
Zajmie to kilka minut, zanim laser będzie gotowy. Następnie ustaw długość fali na 910 nanometrów, aby wzbudzić fluorescencję GFP i wyrównaj laser, klikając przycisk automatycznego wyrównywania. Po umieszczeniu hodowli siatkówki na stoliku mikroskopu wielofotonowego należy upewnić się, że oświetlenie pomieszczenia i sprzętu jest wyłączone przed otwarciem migawki, aby uniknąć prześwietlenia rurki powielacza zdjęć.
Aby zmniejszyć poziom hałasu, mikroskop należy umieścić w zaciemnionym otoczeniu. Uzyskuj obrazy o polu widzenia 300 na 300 pikseli przy dwukrotnym powiększeniu, które są ustawiane w oknie obszaru skanowania, a czas przebywania pikseli wynosi 4,8 mikrosekundy na piksel wybrany w kompaktowym oknie graficznego interfejsu użytkownika A1. Z grubsza ustaw moc lasera, zmieniając obszar akwizycji w oknie graficznego interfejsu użytkownika A1 MP i wzmocnienie w oknie kompaktowego graficznego interfejsu użytkownika A1.
Teraz skoncentruj się na warstwie komórek zwojowych i ustaw górną płaszczyznę ogniskową stosu z w oknie podrzędnym z w oknie akwizycji ND. Przesuń płaszczyznę ogniskowej przez poziom zewnętrznej warstwy jądrowej, która charakteryzuje się obecnością słabo oznaczonych komórek GFAP i GFP dodatnich, które są okrągłe i powiększone w stosunku do ich odpowiedników w wewnętrznej warstwie jądrowej. Ustaw tę płaszczyznę jako dolną część stosu z.
Następnie ustaw rozmiar kroku z w zakresie od 0,7 do jednego mikrometra. Aby skonfigurować korekcję intensywności z, otwórz okno korekcji intensywności z i wybierz opcję ND do ustawiania zakresu stosu z. Następnie kliknij dolną płaszczyznę ogniskowej w oknie korekcji intensywności z i ustaw intensywność i wzmocnienie lasera.
Następnie kliknij strzałkę obok wartości z w oknie korekcji intensywności z, aby potwierdzić ustawienia, które są następnie wyświetlane w ustawieniach urządzenia w oknie korekcji intensywności z dla wybranej płaszczyzny ogniskowej. Powtórz proces dla środkowej i górnej płaszczyzny, zwiększając moc i wzmocnienie lasera. Ustaw obszar akwizycji w oknie graficznego interfejsu użytkownika A1 MP i unikaj wybierania obszaru akwizycji większego niż 15 i wzmocnienia wyższego niż 126 na początku obrazowania, aby obejść wybielanie zdjęć i zwiększony poziom szumów.
Następnie wybierz opcję Relative intensity correction (Korekcja intensywności względnej) w oknie korekcji intensywności z. W oknie podrzędnym szeregów czasowych okna akwizycji ND ustaw czas trwania na 8 godzin, a interwał na brak opóźnienia. Następnie kliknij przycisk uruchom korekcję z w oknie podrzędnym stosu z w oknie akwizycji ND, aby uzyskać szeregi czasowe 3D.
W tej procedurze należy przyciąć region, który zawiera dzielące się jądro GFAP i GFP dodatnie. Wybierz przycięty obszar, który zawiera co najmniej jedno jądro, które nie ulega INM, aby ustawić punkt odniesienia, aby następnie zmierzyć odległości, na jakie migrowało dzielące się jądro w stosunku do podstawowego INL. Pomaga w przygotowaniu rekonstrukcji 3D.
Korzystając z funkcji widoku pokaż plasterki, wygeneruj rzuty ortogonalne. Następnie zmień tryb z projekcji wycinkowej na projekcję maksymalnej intensywności. Następnie wyłącz widok XY ortogonalnego rzutu maksymalnego.
W zależności od orientacji, w której migrujące i dzielące się jądro jest najlepiej widoczne, należy również wyłączyć widok XZ lub YZ. Kliknij pozostały obraz prawym przyciskiem myszy i wyodrębnij serię obrazów XZ lub YZ za pomocą funkcji tworzenia nowego dokumentu z tej funkcji widoku. W razie potrzeby obróć obraz.
Korzystając z funkcji pomiaru ręcznego, narysuj poziomą linię w poprzek obrazu na dolnym poziomie jądra, które pozostaje w podstawowym INL i nie ulega INM. Zmierz odległość między linią odniesienia a punktem podstawowym migrującego jądra dla szeregów czasowych za pomocą narzędzia do pomiaru linii w oprogramowaniu do analizy. Pokazano tutaj maksymalną projekcję YZ serii obrazów stosu z eksplantatów siatkówki w różnych punktach czasowych zapisu poklatkowego uzyskanego za pomocą mikroskopii wielofotonowej.
Za pomocą narzędzia linii pod funkcją pomiaru ręcznego umieszczono poziomą linię na poziomie komórki odniesienia wskazywanej przez gwiazdę. Ustawiono pionową linię pomiarową rozpoczynającą się od linii poziomej i rozciągającą się do pozycji podstawowej migrującego jądra GF AP i GFP dodatniego. Odległość, na jaką komórka F0 zmierzona na poprzednim rysunku migrowała wierzchołkowo, a powstające komórki potomne, D1 i D2, migrowały zasadniczo w wielofotonowym nagraniu poklatkowym.
Czerwona linia wskazuje pomiary, dla których obliczono wierzchołkową prędkość migracji, natomiast czarne i szare linie wskazują pomiary użyte do obliczenia podstawowych prędkości migracji odpowiednio dla D1 i D2. Odległość została wykreślona w czasie samym w sobie dla migracji wierzchołkowej przed rozpadem otoczki jądrowej i fazy szybkiej migracji podstawowej dla komórki potomnej D1. Po opanowaniu izolacja siatkówki od trzech ryb może być wykonana w ciągu 60 do 90 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Ten czas nie obejmuje etapów przygotowania.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o jak najszybszej pracy, aby zapewnić żywotność eksplantatu siatkówki. Bardzo ważne jest również zamontowanie siatkówki tak płasko, jak to możliwe, aby umożliwić obrazowanie w głębszych warstwach tkanek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i montować siatkówki danio pręgowanego, wykonywać obrazowanie żywych komórek w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej i określania prędkości migracji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca koncentruje się na obrazowaniu żywych komórek w celu analizy międzykinetycznej migracji jąder (INM) w hodowlach eksplantów siatkówki ryb zebrafish. Dzięki zastosowaniu mikroskopii wielofotonowej badacze mogą obserwować dynamiczne procesy uczestniczące w regeneracji siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia regeneracyjna
- Obrazowanie żywych komórek
Wstęp
- Regeneracja siatkówki u danio pręgowanego była badana głównie z wykorzystaniem próbek utrwalonych.
- Procesy dynamiczne, takie jak INM, są kluczowe dla zrozumienia regeneracji.
- Techniki obrazowania na żywo mogą ujawnić mechanizmy, których nie można zaobserwować w próbkach utrwalonych.
- Gleje Müllera odgrywają istotną rolę w regeneracji siatkówki.
Cel badania
- Aby umożliwić obserwację INM w czasie rzeczywistym w kulturach siatkówki danio przebróznego.
- Aby zbadać mechanizmy napędzające INM podczas regeneracji siatkówki.
- Aby zbadać regulację gleju Müllera w związku z INM.
Zastosowane metody
- Izolacja eksplantów siatkówki z danio pręgowanego.
- Obrazowanie żywych komórek z wykorzystaniem mikroskopii wielofotonowej.
- Monitorowanie proliferujących komórek podczas INM.
- Zastosowanie metody w innych obszarach badań nad siatkówką.
Główne wyniki
- Skuteczny monitoring dynamiki INM w czasie rzeczywistym.
- Wgląd w mechanizmy regeneracji siatkówki.
- Potencjalne zastosowania w badaniu zachowania mikrogleju.
- Zrozumienie fagocytozy obumierających neuronów przez glej Müllera.
Wnioski
- Obrazowanie żywych komórek jest potężnym narzędziem do badania regeneracji siatkówki.
- Dynamiczne zachowania komórek mogą być obserwowane w czasie rzeczywistym.
- Metoda ta otwiera nowe możliwości w badaniach nad siatkówką.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym interkinetycznej migracji jąder komórkowych w eksplantach siatkówki dorosłych ryb zebrafish, zapewniając dynamiczny model do badania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw regeneracji tkanek. Poprzez rejestrację zachowań migracyjnych glej komórek Müllera i komórek progenitorowych, wspiera ona ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów dla terapii regeneracyjnych. Podejście to ma wartość prognostyczną, łącząc dynamikę jąder z regulacją cyklu komórkowego w systemie istotnym dla przebiegu chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację dynamiki migracji jąder w proliferujących komórkach siatkówki.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki bezpośredniej obserwacji ponownego wejścia glejistości Müllera w cykl komórkowy oraz generowania komórek progenitorowych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ocenę stopnia zaangażowania celu poprzez korelację interkinetycznej migracji jąder z efektami regeneracyjnymi.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość analizy: Ustanawia standaryzowane hodowle eksplantów siatkówki zdolne do obrazowania żywych komórek przez maksymalnie 8 godzin, co umożliwia spójne przesiewanie związków.
- Wynik ilościowy: Zapewnia mierzalne prędkości migracji apikalnej i bazalnej w celu obiektywnego porównania różnych warunków eksperymentalnych.
- Skalowalność: Wykorzystuje mikroskopię wielofotonową do obrazowania stosów z (z-stacks) przez całą grubość siatkówki, co wspiera analizę wysokotreściową wzorców migracyjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje regenerację siatkówki u dorosłych ryb danio-pręgowanych, system o zachowanych mechanizmach istotnych dla naprawy siatkówki u ludzi.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając podłużne śledzenie zachowania komórek progenitorowych po urazie.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Wpływa na kryteria postępu poprzez ilościowe określenie migracji jąder komórkowych jako funkcjonalnego odczytu zdolności regeneracyjnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania, od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, oferując odczyt z żywych komórek, który uzupełnia testy punktu końcowego w przepływach pracy w biologii regeneracyjnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez, umożliwiając monitorowanie w czasie rzeczywistym ruchów jąder komórkowych zależnych od cyklu komórkowego w odpowiedzi na uszkodzenie.
- Screening: Umożliwia standaryzację testów poprzez kontrolowaną hodowlę eksplantów oraz parametry obrazowania wielofotonowego w celu powtarzalnego gromadzenia danych.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary prędkości migracji, które ułatwiają porównywanie perturbacji genetycznych lub farmakologicznych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne etapy odkryć z modelami przedklinicznymi poprzez utrzymanie żywotności eksplantów siatkówki podczas przedłużonych sesji obrazowania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania dynamiki gleju i zachowania komórek progenitorowych w wielu kontekstach regeneracyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez ujawnienie powiązań mechanistycznych między migracją jąder a przebiegiem cyklu komórkowego w regenerującej się tkance.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji procedur izolacji, montowania i obrazowania eksplantów siatkówki.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie dynamicznych biomarkerów odpowiedzi regeneracyjnej przed przeprowadzeniem testów regeneracji funkcjonalnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ich wpływ na kinetykę interkinetycznej migracji jąder.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z rybkami danio-zebrami, wycinaniu siatkówki oraz obsłudze mikroskopii wielofotonowej.
- Zależy od specjalistycznego instrumentarium, w tym systemów laserowych IR oraz możliwości korekcji intensywności w osi z dla obrazowania głębokich tkanek.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania eksplantów i obrazowania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji podczas stosowania metody w odniesieniu do innych typów komórek siatkówki lub modeli uszkodzeń innych niż uszkodzenia indukowane światłem.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak 8-godzinne okno obrazowania oraz wrażliwość na uniesienie tkanki wywołane przez agarozę, co wpływa na stabilność ostrości.
