Name: Pomiar i modelowanie wysuszania kurczliwego w ludzkiej warstwie rogowej naskórka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę pomiaru sztywności mechanicznej i wysychania ludzkiej warstwy rogowej naskórka po zabiegach chemicznych. Technika ta umożliwia szybką ocenę właściwości skóry z mniejszą ilością tkanki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Uzyskano zwolnienie z wymogu zgody (302-13) na prowadzenie badań z wykorzystaniem zanonimizowanych próbek tkanek zgodnie z przepisami Departamentu Zdrowia i Usług Społecznych, 45 CFR 46.101(b)(4). Pełnowarstwowa skóra pochodzi z zabiegów planowych. W niniejszym artykule źródłem tkanki jest pierś 6-letniej białej kobiety.
1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych powleczonych elastomerem
<ol>
	<li>W szklanej fiolce o pojemności 20 mL wymieszać 0,107 g utwardzacza Sylgard 184 z 5,893 g bazy. Całkowita masa mieszaniny wynosi 6 g przy stosunku bazy do utwardzacza 5:1.</li>
	<li>Po wymieszaniu szklaną bagietką w celu zapewnienia jednorodności, umieścić fiolkę w komorze próżniowej i odgazować, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkę (5 mm x 25 mm) w centrum urządzenia do nanoszenia warstw metodą spin coatingu. Nanieść ~1 mL mieszaniny na środek szkiełka. Użyć pipety 5 0 µL z końcówką odciętą nożyczkami. Wykonać spin coating szkiełka przy 2 0 rpm przez 60 s.
	<ol>
		<li>Powtórzyć ten proces, aby przygotować 5-6 podłoży.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwardzać szkiełka nakrywki w piekarniku przez 12 h w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Za pomocą żyletki częściowo oddzielić film elastomerowy od podłoża pomocniczego. Użyć niezmywalnego markera, aby oznaczyć górną stronę filmu elastomerowego oraz odsłonięte szkło.</li>
	<li>Umieścić próbkę w mikroskopie odwróconym i użyć akcesorium do zdalnego ustawiania ostrości, aby zarejestrować różnicę wysokości w osi z pomiędzy płaszczyznami ogniskowymi obu oznaczeń. Wartość ta odpowiada grubości podłoża elastomerowego, h.</li>
</ol>
2. Przygotowanie warstwy rogowej
<ol>
	<li>Używając łaźni wodnej lub grzejącej mieszadła magnetycznego, podgrzać szklany zlew wypełniony w połowie wodą dejonizowaną (DW) do 60 °C. Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego zanurzyć ludzką skórę o pełnej grubości w wodzie na 4 min.</li>
	<li>Natychmiast przenieść próbkę skóry do zlewka zawierającego DW schłodzoną do &lt;10 °C na 4 min. Wypełnienie zlewka w połowie minimalizuje rozbryzg materiału biologicznie niebezpiecznego.</li>
	<li>Wyjąć skórę ze zlewka, umieścić w szalce Petriego i delikatnie wyizolować naskórek za pomocą pęsety tkankowej z zakrzywionym końcem.</li>
	<li>Umieścić wyizolowany naskórek stroną podstawną do dołu w szalce Petriego wyłożonej gazą. Upewnić się, że warstwa podstawna w pełni styka się z gazą.
	<ol>
		<li>Namoczyć gazę w 0,25% (w/v) roztworze trypsyny z trzustki świni typu IX-S rozpuszczonej w 0,1 M roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo przez 6-8 h w temperaturze pokojowej. Dodać do pojemnika tylko taką ilość trypsyny, która zwilży gazę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podnieść gazę pęsetą tkankową i utrzymać ją na powierzchni wody w pojemniku częściowo wypełnionym DW. Delikatnie odciągnąć warstwę rogą (SC), aby oddzielić ją od gazy.</li>
	<li>Przemyć warstwę rogą 3-4 razy w DW, aby usunąć resztki tkanki naskórka, które pozostały przytwierdzone do SC.</li>
	<li>Utrzymać wyizolowaną SC na powierzchni roztworu 0,4% inhibitora trypsyny z Glycine max (soi) w DW. Użyć wstrząsarki do płytek, aby agitować tkankę przez 10 min.</li>
	<li>Utrzymać SC na powierzchni wody w szalce Petriego częściowo wypełnionej DW. Użyć wstrząsarki do płytek, aby agitować tkankę przez 10 min.</li>
	<li>Wysuszyć wyizolowany arkusz SC na ultra-cienkiej plastikowej siatce przez 48 h w temperaturze pokojowej (25 °C, 40% wilgotności względnej (R.H.)).</li>
	<li>Oddzielić SC od siatki i wyciąć pojedyncze okrągłe próbki o promieniu R=3 mm za pomocą okrągłego wycinaka. Zaznaczyć środek zewnętrznej powierzchni małym znakiem spiralnym za pomocą niezmywalnego markera. Stanowi to wskazówkę wizualną do rozpoznania górnej strony SC. 
	UWAGA: Niezmywalny znak należy nanieść w centrum próbki, gdzie deformacje podczas suszenia będą najmniejsze. Zminimalizuje to wpływ markera na zarejestrowane profile przemieszczenia podczas suszenia.</li>
</ol>
3. Obróbka i nanoszenie próbki
<ol>
	<li>Mieszać próbki SC przez 30 min w 15 mL DW zawierających 90 µL fluorescencyjnych kulek markerowych (505/515 nm, średnica 1 µm, modyfikowane karboksylowo). Powoduje to osadzenie kulek na powierzchni SC 
	UWAGA: Chociaż osadzenie dużej liczby kulek na SC może nieznacznie spowolnić wysychanie w porównaniu z próbkami bez kulek12, zmaksymalizuje to rozdzielczość przestrzenną pól odkształceń w płaszczyźnie, które można uzyskać w dalszej kolejności. Wybór objętości dodawanych kulek powinien być zatem dokonany ad hoc.</li>
	<li>Wyjąć próbki SC i umieścić je w czarce Petriego częściowo wypełnionej DW.</li>
	<li>Zanurzyć podłożem częściowo w DW pod niewielkim kątem 15-30°.</li>
	<li>Przymocować krawędź pływającej próbki SC w linii styku między podłożem a powierzchnią wody. Pionowe wyciąganie podłoża z wody spowoduje gładkie zalaminowanie próbki SC do podłoża, bez zmarszczek lub uwięzionych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.4, aby umieścić do 6 próbek SC na każdym podłożu. Pozostawić co najmniej 2-3 mm odstępu między próbkami i unikać laminowania próbek blisko krawędzi podłoża. Zapobiega to wpływowi wysychania jednej próbki na przemieszczenia wynikające z wysychania innej próbki.</li>
	<li>Suszyć zamontowane próbki SC w warunkach laboratoryjnych przez 60 min. Pozwala to na odparowanie resztkowej wody między SC a podłożem i zapewnia całkowite przyleganie tkanki. 
	UWAGA: Na tym etapie próbki SC można poddać działaniu preparatów chemicznych lub kosmetycznych7,8, umieszczając podłoża odwrócone do góry dnem w odpowiednim roztworze przez wymagany czas. Po przeprowadzeniu etapu traktowania powtórzyć krok 3.6. Po wysuszeniu można zweryfikować niepełne przyleganie próbek SC do podłoża za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym. Uwięzione pęcherzyki pod próbką SC lub odwarstwione krawędzie utworzą wyraźne różnice w kontraście w próbce o dobrze zdefiniowanych krawędziach.</li>
	<li>Stworzyć komorę wilgotności, umieszczając czarkę Petriego częściowo wypełnioną wodą w szczelnie zamkniętym pojemniku.</li>
	<li>Umieścić podłoża w komorze na 24 h, aby wyrównać je do wilgotności względnej 9%. Nie wkładać podłoży bezpośrednio do czarki Petriego.</li>
</ol>
4. Kontrola środowiska mikroskopowego
<ol>
	<li>Osiągnij kontrolę nad warunkami środowiskowymi za pomocą systemu kontroli wilgotności podłączonego do komory perfuzyjnej montowanej na mikroskopie. Szczegóły systemu kontroli wilgotności przedstawili German et al. (2013)7 oraz Liu i German (2015)8.</li>
	<li>Zamontuj podłoże na mikroskopie, umieść komorę perfuzyjną nad podłożem i uszczelnij krawędzie komory perfuzyjnej do elastomeru za pomocą smaru próżniowego.</li>
	<li>Po zamontowaniu, przed rozpoczęciem eksperymentu, wyrównaj wilgotność powietrza wewnętrznego do 9% R.H. Zapobiega to odparowywaniu wody przed rozpoczęciem doświadczenia. Po rozpoczęciu obrazowania w sekcjach 5 lub 7 obniż wilgotność powietrza wewnętrznego do pożądanej wartości. 
	UWAGA: W niniejszym artykule próbki SC są suszone do 25% R.H.</li>
</ol>
5. Obrazowanie przemieszczeń w płaszczyźnie podczas suszenia
<ol>
	<li>Należy wykonać obrazy próbek SC przy użyciu mikroskopu odwróconego z obiektywem 1X. Kuleczki fluorescencyjne należy wzbudzać za pomocą silnika świetlnego z filtrem FITC (pasmo przepustowe emisji 503-530 nm). Wiele próbek można obrazować sekwencyjnie podczas procesu suszenia, wykorzystując zautomatyzowany stolik x-y.</li>
	<li>Obrazy w świetle fluorescencyjnym i przechodzącym należy rejestrować za pomocą cyfrowej kamery CCD przy rozdzielczości 1 392 x 1 040 pikseli. Pole widzenia każdego obrazu wynosi 8,98 x 6,71 mm, co pozwala na uchwycenie całej próbki SC na pojedynczym obrazie. Obrazy należy pobierać co 10 min przez 16 h.</li>
</ol>
6. Przygotowanie podłoża do pomiaru grubości
<ol>
	<li>W dygestorium chemicznym umieść 1 mL silanu (3-aminopropyltriethoxysilane; ≥98%) w niewielkim plastikowym nakapslu. Umieść podłoża elastomerowe z sekcji 1 oraz nakapsul w szczelnym pojemniku na 5 h. Nie dopuść do bezpośredniego kontaktu podłoży z silanem.</li>
	<li>Dodaj 5 mg EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride; ≥99%) do probówki o pojemności 1,5 mL. Dodaj 50 µL DW do EDC. Wymieszaj roztwór przez 10 s za pomocą wstrząsarki wortexowej.</li>
	<li>Dodaj 0,076 g tetraboranu sodu i 0,1 g kwasu borowego do 20 mL DW. Mieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 70 °C (1 h). Dodawaj kwas borowy, aż pH osiągnie wartość 7,4.</li>
	<li>Dodaj 20 mL buforu boratowego do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL. Dodaj 60 µL kulek 1 µm (535/575 nm, modyfikowanych karboksylowo) do buforu boratowego. Na koniec dodaj 20 µL roztworu EDC do naczynia. Wstrząśnij probówką, aby wymieszać roztwór kulek, a następnie wlej go do płytki Petriego o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Wyjmij silanizowane podłoża z pojemnika i umieść je stroną z filmu elastomerowego skierowaną w dół w roztworze kulek. Czynność tę wykonaj powoli, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza. W każdej płytce Petriego zmieszczą się dwa podłoża.</li>
	<li>Pozostaw podłoża w roztworze kulek na 45 min.</li>
	<li>Używając pęsety, wyjmij podłoża z roztworu kulek, a następnie opłucz w DW, aby usunąć niezwiązane kulki.</li>
	<li>Wysusz podłoża na powietrzu. Nadmuchiwanie sprężonym powietrzem powierzchni filmu elastomerowego ogranicza powstawanie plam wodnych.</li>
	<li>Zamknij podłoża w nieprzezroczystym pudełku, aby zapobiec fotobleakowaniu kulek do czasu nanoszenia próbek SC.</li>
</ol>
7. Obrazowanie grubości SC
<ol>
	<li>Nanieś próbki SC na podłoże zgodnie z sekcją 3. Jednakże krok 3.1 należy przeprowadzić bez dodawania kulek fluorescencyjnych do DW. Dodatkowo, przed zakończeniem kroku 3.6, nanieś pipetą kroplę 5 µL nierozcieńczonego roztworu fluorescencyjnych kulek markerowych (505/515 nm, średnica 0,1 µm) na powierzchnię każdej naniesionej próbki SC.</li>
	<li>Wyznacz pomiary grubości SC, korzystając z mikroskopu z obiektywem 40X. Mierz grubość próbek SC w czasie, używając akcesorium do zdalnego ostrzenia, aby zarejestrować różnicę w wysokości z między dwiema płaszczyznami ogniskowania warstw kulek znajdujących się na styku SC i podłoża oraz na górnej powierzchni SC.</li>
	<li>Zmierz grubość w 3 obszarach każdej próbki SC w ciągu 3-godzinnego okresu suszenia. W tym przedziale czasowym grubość próbek SC osiąga wartość stanu stacjonarnego8.</li>
</ol>
8. Ilościowe określanie i modelowanie deformacji tkanek
<ol>
	<li>Zastosowanie welocymetrii obrazu cząstek13 aby uzyskać przestrzennie rozdzielcze przemieszczenia podczas suszenia w płaszczyźnie z obrazów fluorescencyjnych dla każdego zarejestrowanego kroku czasowego.</li>
	<li>Użyj programu MATLAB, aby uzyskać średnie azymutalnie profile przemieszczeń radialnych i azymutalnych z pola przemieszczeń dla każdej radialnie symetrycznej próbki SC. 
	UWAGA: W materiałach uzupełniających udostępniono przykładowy zestaw danych (o nazwie „d.mat”) oraz kod MATLAB (o nazwie „PIV-processing.m”), który wykonuje zarówno ten etap, jak i etap 8.3.</li>
	<li>Dopasowanie profili przemieszczenia radialnego do modelu7,8,14,15,16 opisując suszenie SC jako kurczący się liniowo sprężysty okrągły dysk o grubości h zmieniającej się w czasieSC, promień, R, oraz moduł sprężystości, ESC, przytwierdzony do odkształcalnego podłoża sprężystego o module sprężystości E. Przyjmijmy, że SC ma dobrze zdefiniowany i stały współczynnik Poissona νSC = 0.47,8Wyznaczyć najlepsze dopasowania, stosując metodę najmniejszych kwadratów. 
	UWAGA: Model wykorzystany do dopasowania opisuje przemieszczenia radialne za pomocą zmodyfikowanych funkcji Bessela w następujący sposób: 
	<img alt="Równanie przemieszczenia promienistego w układzie współrzędnych cylindrycznych z wykorzystaniem funkcji Bessela." src="/files/ftp_upload/55336/55336eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie">             (1) 
	z <img alt="Wzór analizy naprężeń materiałów, α = Psc(1+νsc)(1-2νsc)/Esc(1-νsc), schemat równania." src="/files/ftp_upload/55336/55336eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie">, <img alt="Równowaga statyczna, wzór β=R/lₚ, ilustruje zależności w równaniach fizycznych." src="/files/ftp_upload/55336/55336eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> i <img alt="Równanie równowagi statycznej, wzór na sprężystość, wyrażenie matematyczne, analiza fizyczna, równanie A(β)^-1." src="/files/ftp_upload/55336/55336eq13.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
	Termin <img alt="Równanie symbolu długości Plancka $l_p$; koncepcja fizyki teoretycznej w zapisie naukowym." src="/files/ftp_upload/55336/55336eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> odpowiada głębokości penetracji danej przez 
	<img alt="Wzór na równowagę statyczną; równanie analizy naprężeń inżynieryjnych; właściwości mechaniczne; wykres." src="/files/ftp_upload/55336/55336eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie">. 
	<img alt="Równanie modułu Younga Y=E/2(1+ν)h, wzór do obliczeń sprężystości w inżynierii materiałowej." src="/files/ftp_upload/55336/55336eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> oznacza parametr sztywności podłoża; ma zastosowanie, gdy rozmiary próbki są znacznie większe od grubości podłoża. W tym przypadku parametry, <img alt="Równowaga statyczna, równanie ΣFx=0, schemat edukacyjny, pojęcie fizyczne, analiza równowagi sił" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> i <img alt="Proces chromatograficzny; wartości Rf, schemat płyty TLC; układ rozpuszczalników, rozdział związków." src="/files/ftp_upload/55336/55336eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> odpowiednio oznaczają grubość podłoża i współczynnik Poissona. Współczynnik Poissona podłoża z elastomeru silikonowego17 przy $\nu = 0,5$.</li>
	<li>Wyznaczyć parametry modelu α oraz β dla każdego kroku czasowego na podstawie dopasowania metodą najmniejszych kwadratów równania (1) do profilu przemieszczenia radialnego.
	<ol>
		<li>Należy wykorzystać parametr dopasowania β w celu wyznaczenia modułu sprężystości SC, ESCprzy użyciu wyrażenia, 
		<img alt="Wzór stanu równowagi statycznej, równanie E_sc, wyrażenie matematyczne dla analizy strukturalnej." src="/files/ftp_upload/55336/55336eq11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"></li>
		<li>Użyj parametru dopasowania α, aby wyznaczyć zmienną w czasie skurczową naprężenie suszenia, PSC, korzystając z wyrażenia: 
		<img alt="Wzór na równowagę statyczną $P_{sc}$, równanie obliczania naprężeń, zastosowanie edukacyjne, matematyka inżynieryjna." src="/files/ftp_upload/55336/55336eq12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Van Hal, D., Jeremiasse, E., Junginger, H. E., Spies, F., Bouwstra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+fully+hydrated+human+stratum+corneum%3A+a+freeze-fracture+electron+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Structure of fully hydrated human stratum corneum: a freeze-fracture electron microscopy study.</a> J. Invest. Dermatol. 106 (1), 89-95 (1996).</li>
<li>Norlén, L., Al-Amoudi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratum+corneum+keratin+structure%2C+function%2C+and+formation%3A+the+cubic+rod-packing+and+membrane+templating+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Stratum corneum keratin structure, function, and formation: the cubic rod-packing and membrane templating model.</a> J. Invest. Dermatol. 123 (4), 715-732 (2004).</li>
<li>Liu, X., Cleary, J., German, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+mechanical+properties+and+multi-scale+failure+mechanics+of+heterogeneous+human+stratum+corneum%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The global mechanical properties and multi-scale failure mechanics of heterogeneous human stratum corneum.</a> Acta Biomater. , (2016).</li>
<li>Geerligs, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeerligs%2C+M+%22Skin+layer+mechanics%22">Skin layer mechanics</a>. , Technische Universiteit Eindhoven. (2010).</li>
<li>Farage, M. S., Miller, K. W., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFarage%2C+MS+%22Textbook+of+Aging+Skin%22">Textbook of Aging Skin</a>. , (2010).</li>
<li>Levi, K., Kwan, A., Rhines, A. S., Gorcea, M., Moore, D. J., Dauskardt, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emollient+molecule+effects+on+the+drying+stresses+in+human+stratum+corneum%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Emollient molecule effects on the drying stresses in human stratum corneum.</a> Br. J. Dermatol. 163 (4), 695-703 (2010).</li>
<li>German, G. K., Pashkovski, E., Dufresne, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+treatments+influence+drying+mechanics+in+human+stratum+corneum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Surfactant treatments influence drying mechanics in human stratum corneum.</a> J. Biomech. 46 (13), 2145-2151 (2013).</li>
<li>Liu, X., German, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+barrier+disruption+and+moisturization+on+the+dynamic+drying+mechanics+of+human+stratum+corneum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mech.+Behav.+Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">The effects of barrier disruption and moisturization on the dynamic drying mechanics of human stratum corneum.</a> J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 49 (13), 80-89 (2015).</li>
<li>Levi, K., Weber, R. J., Do, J. Q., Dauskardt, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+stress+and+damage+processes+in+human+stratum+corneum%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cosmet.+Sci%22%5BJournal%5D)">Drying stress and damage processes in human stratum corneum.</a> Int. J. Cosmet. Sci. 32 (4), 276-293 (2010).</li>
<li>Levi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glycerin+on+drying+stresses+in+human+stratum+corneum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dermatol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of glycerin on drying stresses in human stratum corneum.</a> J. Dermatol. Sci. 61, 129-131 (2011).</li>
<li>Fluhr, J. W., Darlenski, R., Surber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+and+the+skin%3A+holistic+approach+to+its+origin+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Glycerol and the skin: holistic approach to its origin and functions.</a> Br. J. Dermatol. 159 (1), 23-34 (2008).</li>
<li>German, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+drying+stresses+in+stratum+corneum%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous drying stresses in stratum corneum.</a> Biophys. J. 102 (11), 2424-2432 (2012).</li>
<li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF00190388">Digital particle image velocimetry.</a> Exp. Fluids. 10 (4), 181-193 (1991).</li>
<li>Mertz, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+of+traction+forces+with+the+size+of+cohesive+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Scaling of traction forces with the size of cohesive cell colonies.</a> Phys. Rev. Lett. 108 (19), 1-5 (2012).</li>
<li>Banerjee, S., Marchetti, M. C. <a target="_blank" href="https://arxiv.org/pdf/1106.0929.pdf">Substrate rigidity deforms and polarizes active gels.</a> Euro Phys. Lett. 96 (2), 28003(2011).</li>
<li>Edwards, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+localization+in+contracting+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Force localization in contracting cell layers.</a> Phys. Rev. Lett. 107 (12), 128101(2011).</li>
<li>Cesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+silicone+elastomer+substrates+for+high+resolution+analysis+of+cellular+force+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Micropatterned silicone elastomer substrates for high resolution analysis of cellular force patterns.</a> Rev. Sci. Instrum. 78 (3), 34301(2007).</li>
<li>Wu, K. S., Van Osdol, W. W., Dauskardt, R. H. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/235089062_Mechanical_and_Microstructural_Properties_of_Stratum_Corneum">Mechanical And Microstructural Properties Of Stratum Corneum.</a> Mater. Res. Soc. 724, 27-33 (2002).</li>
<li>Yuan, Y., Verma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+microelastic+properties+of+stratum+corneum%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf.+B%22%5BJournal%5D)">Measuring microelastic properties of stratum corneum.</a> Colloids Surf. B. 48 (1), 6-12 (2006).</li>
<li>Christensen, M. S., Hargens, C. W., Nacht, S., Gans, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+intact+human+skin%3A+instrumentation%2C+hydration+effects%2C+and+the+contribution+of+the+stratum+corneum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of intact human skin: instrumentation, hydration effects, and the contribution of the stratum corneum.</a> J Invest. Dermatol. 69 (3), (1977).</li>
<li>Pailler-Mattei, C., Bec, S., Zahouani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurements+of+the+elastic+mechanical+properties+of+human+skin+by+indentation+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Eng.Phys%22%5BJournal%5D)">In vivo measurements of the elastic mechanical properties of human skin by indentation tests.</a> Med. Eng.Phys. 30 (5), 599-606 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisujemy technikę, którą można wykorzystać do pomiaru dynamicznego suszenia i właściwości mechanicznych ludzkiego SC. Wcześniejsze badania wykazały, że technika ta może być stosowana do ilościowego określania wpływu warunków środowiskowych i produktów chemicznych powszechnie stosowanych w kosmetycznych środkach czyszczących i nawilżających na dynamiczne wysychanie SC 7,8. W protokole składa się kilka kluczowych kroków. Po pierwsze, SC pęcznieje zw...

Najbardziej zewnętrzna warstwa naskórka, czyli warstwa rogowa naskórka (SC) składa się ze spójnych komórek korneocytów otoczonych bogatą w lipidy matrycą1,2. Skład i integralność strukturalna SC jest niezbędna do utrzymania prawidłowej funkcjonalności bariery3, która zapobiega inwazji mikroorganizmów i jest odporna zarówno na siły mechaniczne, jak i nadmierną utratę wody4. Zdolność produktów higieny osobistej do utrzymywania lub degradacji funkcji bariery skórnej jest bardzo interesująca dla zdrowia skóry i przemysłu kosmetycznego5. Wiadomo, że codzienne stosowanie produktów higieny osobistej zmienia właściwości mechaniczne SC6,7,8. Na przykład środki powierzchniowo czynne zawarte w kosmetycznych środkach czyszczących mogą powodować znaczny wzrost modułu sprężystości i narastanie naprężeń związanych z suszeniem w SC, zwiększając skłonność tkanki do pękania7,9. Glicerol zawarty w prawie wszystkich kosmetycznych środkach nawilżających może zmiękczać SC i zmniejszać narastanie stresów związanych z suszeniem8,10,11, zmniejszając prawdopodobieństwo pęknięcia tkanki.
Metoda opisana w tym artykule jest w stanie określić ilościowo dynamiczne zachowanie podczas suszenia i właściwości mechaniczne suszenia SC w kontrolowanych środowiskach7,8. Wcześniej wykazano, że technika ta jest w stanie wyjaśnić wpływ różnych produktów kosmetycznych na zmiany w dynamicznym schnięciu i właściwościach mechanicznych tkanki SC. Osiąga się to poprzez ilościowe określenie wywołanego suszeniem skurczu ludzkiej tkanki SC przylegającej do miękkiego podłoża elastomerowego, dopasowanie przemieszczeń suszenia za pomocą prostego modelu kurczliwości, a następnie wyodrębnienie modułu sprężystości i naprężenia suszącego z dopasowanego profilu. Gdy wymagane jest badanie wielu próbek SC, metoda ta stanowi szybszą alternatywę dla tensometrii jednoosiowej, wykorzystuje znacznie mniej tkanki i zapewnia bardziej fizjologicznie istotne suszenie, zapobiegając parowaniu od spodu próbki.

<table><tbody><tr><td>Baza z elastomeru silikonowego</td><td>Dow-Corning</td><td>1064291</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy Utwardzacz</td><td>Dow-Corning</td><td>1015311</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Karboksylan 0,1 &mikro; M Żółty Zielony Fluorescencyjny 505/515&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Karboksylan 1 i mikro; M Żółty Zielony Fluorescencyjny 505/515&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8823</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Karboksylan 1 i mikro; M Nil czerwony fluorescencyjny 535/575&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8819</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6567</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny typu II-s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>Tetraboran sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0294</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-dimetyloaminopropylo)-N-etylokarbodimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7750</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik Vortexer</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz o średnicy 6 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z708860</td><td></td></tr><tr><td>SOLA 6-LCR-SB&nbsp;</td><td>Silnik oświetleniowy Lummencor</td><td>No.3526</td><td></td></tr><tr><td>Cfi Plan Achro Uw 1X Obiektyw</td><td>Nikon Plan UW</td><td>MRL00012</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor 40X Olej Obiektyw 1.3 na - 0.20&nbsp; mm wd</td><td>Nikon Plan Fluor</td><td>MRH01401</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-U odwrócony mikroskop&nbsp;</td><td>Aparat Nikon</td><td>MEA53200</td><td></td></tr><tr><td>Clara-E</td><td>Andor</td><td>DR-328G-C02-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka do zdalnego ustawiania ostrości E-RFA Ergo Design</td><td>Nikon</td><td>99888</td><td></td></tr><tr><td>Ti-S-E Zmotoryzowany stolik</td><td>Nikon</td><td>MEC56110</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar i modelowanie wysuszania kurczliwego w ludzkiej warstwie rogowej naskórka

Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

Warstwa rogowa naskórka (SC) to najbardziej powierzchowna warstwa skóry. Jej kontakt ze środowiskiem zewnętrznym oznacza, że ta warstwa tkankowa jest poddawana zarówno działaniu środków czyszczących, jak i codziennych zmian wilgotności otoczenia; Oba te czynniki mogą zmieniać zawartość wody w tkance. Zmniejszenie zawartości wody spowodowane poważną dysfunkcją bariery lub środowiskiem o niskiej wilgotności może zmienić sztywność SC i spowodować narastanie naprężeń związanych z suszeniem. W skrajnych warunkach czynniki te mogą spowodować mechaniczne pęknięcie tkanki. Opracowaliśmy wysokoprzepustową metodę ilościowego określania dynamicznych zmian właściwości mechanicznych SC po wysuszeniu. Technika ta może być wykorzystana do ilościowego określenia zmian w zachowaniu podczas suszenia i właściwościach mechanicznych SC za pomocą kosmetycznych środków czyszczących i nawilżających. Osiąga się to poprzez pomiar dynamicznych zmian przestrzennie rozdzielczych przemieszczeń suszenia w płaszczyźnie kolistych próbek tkanek przylegających do podłoża elastomerowego. Przemieszczenia promieniowe w płaszczyźnie uzyskane podczas suszenia są uśredniane azymutalnie i dopasowywane do profilu opartego na liniowym modelu kurczliwości sprężystej. Dynamiczne zmiany naprężeń suszących i modułu sprężystości SC można następnie wyodrębnić z dopasowanych profili modelu.

Rycina 1(a) przedstawia reprezentatywny obraz fluorescencyjny próbki SC pokrytej fluorescencyjnymi kuleczkami (sekcja 3). Odpowiadający mu obraz próbki w świetle przechodzącym pokazano na Rycini 1(b), na którą nałożono wykres wektorowy (quiver plot) rozdzielonych przestrzennie przemieszczeń podczas suszenia, które powstały po 16 h suszenia przy 25% R.H. Ze względu na symetrię obrotową próbek, przemieszczenia te można uśrednić azymutalnie. Rycina 1...

Ten artykuł opisuje metodę ilościowego określania dynamicznego schnięcia i właściwości mechanicznych warstwy rogowej naskórka poprzez pomiar przestrzennie rozdzielczych przemieszczeń suszenia w płaszczyźnie kolistych próbek tkanek przylegających do podłoża elastomerowego. Technika ta może być wykorzystana do pomiaru, w jaki sposób różne zabiegi chemiczne zmieniają właściwości suszenia i mechaniczne tkanek.

Pomiar i modelowanie wysuszania kurczliwego w ludzkiej warstwie rogowej naskórka

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both ...

Ogólnym celem tej metody jest ilościowe określenie dynamicznej sztywności mechanicznej oraz narastania naprężeń związanych z wysychaniem w próbkach ex vivo ludzkiego warstwy rogiej po różnych zabiegach chemicznych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biomechaniki i nauki o kosmetykach, takie jak wpływ składu warstwy rogiej lub traktowania tkanki skóry produktami do pielęgnacji osobistej na jej właściwości mechaniczne i dynamiczne zachowanie podczas wysychania. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona szybszą alternatywę dla innych metod oceny mechanicznej, wymaga znacznie mniejszej ilości tkanki skórnej i zapewnia bardziej fizjologicznie istotne wysychanie poprzez zapobieganie parowaniu z dolnej strony próbki.Aby przygotować szkiełka nakrywki powlekane elastomerem, najpierw przygotować czynnik utwardzający Sylgard 184 z bazą w stosunku bazy do czynnika utwardzającego 55:1, mieszając do uzyskania homogenicznej konsystencji. Wymagane jest łącznie sześć gramów. Następnie odgazować roztwór.Następnie należy wykorzystać roztwór do pokrycia szkiełek cover-slip za pomocą powlekarki wirówkowej. Używając pipety o szerokim otworze, nanieś 1 ml mieszani

measuring-and-modeling-contractile-drying-in-human-stratum-corneum

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Metoda indukowanej suszeniem samointegracji megamolekularnych biopolimerów na granicy powietrzno-ciekłokrystalicznej jest dostępna tutaj. Metodologia ta będzie przydatna nie tylko do zrozumienia makroskopowego potencjału biopolimerów, ale także jako metoda oceny materiałów miękkich w dziedzinach biomedycznych i środowiskowych.

Metody samointegracji biopolimerów megamolekularnych na granicy faz powietrze-LC

Tutaj prezentujemy protokół zbierania konfokalnych widm Ramana od ludzi w badaniach klinicznych w połączeniu z metodami chemometrycznymi do usuwania widmowych wartości odstających i późniejszej ekstrakcji kluczowych cech.

Rozpoznawanie wody, białek i lipidów z konfokalnych widm ramanowskich warstwy rogowej naskórka in vivo za pomocą podejścia chemometrycznego

Celem tego protokołu jest ocena, czy różne preparaty sztucznych łez mogą chronić ludzkie komórki nabłonka rogówki przed wysuszeniem za pomocą modelu in vitro. Po wystawieniu na działanie preparatów sztucznych łez i wysuszeniu, ludzkie komórki nabłonka rogówki są oceniane pod kątem aktywności metabolicznej.

Wpływ preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki po ekspozycji na wysuszenie

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Stripping Only Descemeta to eksperymentalna procedura, w której pacjenci z centralnym gutem rogówki wynikającym z dystrofii śródbłonka Fuchsa mają usuniętą błonę Descemeta na potrzeby komórek obwodowych w celu regeneracji warstwy śródbłonka. Przedstawiono nowatorską metodologię symulującą DSO w dystroficznych rogówkach ludzkich ex vivo z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez eFGF1 (NM141).

Model hodowli ludzkiego narządu rogówki z usuwaniem Descemeta tylko z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez zmodyfikowany czynnik wzrostu fibroblastów 1

Badanie gojenia się ran związanych z urazami mięśniowo-szkieletowymi często wymaga oceny interakcji in vitro między komórkami Schwanna (SC), keratynocytami i fibroblastami. Protokół ten opisuje izolację, hodowlę i charakterystykę tych pierwotnych komórek z ludzkiego napletka.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych komórek Schwanna, keratynocytów i fibroblastów z ludzkiego napletka

Ten protokół opisuje, jak mierzyć kurczliwość u pierwotnych kardiomiocytów dorosłych ludzi z serc dawców za pomocą systemu MyoBLAZER, niezawodnej platformy do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem podczas rozwoju przedklinicznego.

Pomiar kurczliwości serca w izolowanych kardiomiocytach pierwotnych u dorosłych ludzi

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Poznaj metodę pomiaru sztywności mechanicznej i wysychania ludzkiej warstwy rogowej naskórka po zabiegach chemicznych. Technika ta umożliwia szybką ocenę właściwości skóry z mniejszą ilością tkanki.

Pomiar i modelowanie wysuszania kurczliwego w ludzkiej warstwie rogowej naskórka

Przeglądaj więcej filmów