Pomiar i modelowanie wysuszania kurczliwego w ludzkiej warstwie rogowej naskórka
1 marca 2017
Ten artykuł opisuje metodę ilościowego określania dynamicznego schnięcia i właściwości mechanicznych warstwy rogowej naskórka poprzez pomiar przestrzennie rozdzielczych przemieszczeń suszenia w płaszczyźnie kolistych próbek tkanek przylegających do podłoża elastomerowego. Technika ta może być wykorzystana do pomiaru, w jaki sposób różne zabiegi chemiczne zmieniają właściwości suszenia i mechaniczne tkanek.
Ogólnym celem tej metody jest ilościowe określenie dynamicznej sztywności mechanicznej i narastania naprężeń suszących w próbkach ex vivo ludzkiej warstwy rogowej naskórka, po różnych zabiegach chemicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomechaniki i nauk kosmetycznych, takie jak wpływ na skład warstwy rogowej naskórka lub traktowanie tkanki skórnej za pomocą środków higieny osobistej, jej właściwości mechaniczne i dynamiczne zachowanie podczas suszenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi szybszą alternatywę dla innych metod oceny mechanicznej, wymaga znacznie mniej tkanki skórnej i zapewnia bardziej fizjologicznie istotne suszenie, zapobiegając parowaniu od spodu próbki.
Aby przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte elastomerem, należy najpierw przygotować utwardzacz Sylgard 184 z substancjami stałymi w stosunku podstawy do utwardzacza 55 do jednego, aż do uzyskania jednorodnej konsystencji. W sumie potrzeba sześciu gramów. Następnie odgazuj roztwór.
Następnie użyj roztworu, aby pokryć szkiełka nakrywkowe na powlekarce wirowej. Za pomocą pipety o szerokim otworze upuść jeden mililitr mieszaniny centralnie na szkiełko nakrywkowe. Następnie obracaj szkiełko nakrywkowe z prędkością 2 000 obr./min przez 60 sekund.
W ten sposób należy wykonać pięć lub sześć powlekanych szkiełek nakrywkowych. Aby utwardzić szkiełka nakrywkowe, przechowuj je w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Następnego dnia zmierz grubość folii elastomerowych.
Użyj żyletki, aby podnieść jedną krawędź folii elastomerowej z szkiełka nakrywkowego. Następnie użyj nieusuwalnego markera, aby zaznaczyć górną stronę folii elastomerowej i oznaczyć obrobione szkiełko nakrywkowe pod spodem. Teraz, za pomocą odwróconego mikroskopu, zmierz wysokość Z między płaszczyznami ogniskowymi znaków, aby zmierzyć grubość folii.
Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami, aby przygotować tkankę SC. Aby pobrać próbki, weź stemple o średnicy sześciu milimetrów z SC. Na próbkach umieść znak na środku najbardziej wysuniętej powierzchni za pomocą nieusuwalnego markera. Następnie należy osadzić fluorescencyjne kulki znacznikowe na powierzchni SC, unosząc próbki w 15 mililitrach wody, zawierającej około 90 mikrolitrów koncentratu kulek.
Używaj delikatnego mieszania przez 30 minut i dostosuj stężenie kulek w razie potrzeby. Po zabiegu zanurz każdą próbkę w wodzie, aby zamontować ją na elastomerze. Umieścić powlekane szkiełko nakrywkowe pod płytkim kątem, 15 do 30 stopni pod SC z elastomerem skierowanym w stronę dolnej strony SC. Następnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z wody z przymocowanym SC powyżej, płynnie laminując w ten sposób próbkę SC bez zmarszczek i uwięzionego powietrza.
Następnie wysuszyć zamontowane próbki w warunkach otoczenia przez około godzinę. Po wysuszeniu przenieść próbki do hermetycznie zamkniętej komory zawierającej naczynie z wodą. Pozostawić próbki do wyrównania z wilgotnością przez 24 godziny.
Następnego dnia umieść próbkę w komorze perfuzyjnej w celu przedłużonej sesji obrazowania. Umieść komorę perfuzyjną na podłożu i uszczelnij krawędzie komory perfuzyjnej do elastomeru za pomocą smaru próżniowego. Następnie rejestruj obrazy fluorescencyjne i w świetle przechodzącym z polem widzenia wystarczająco dużym, aby uchwycić pełną próbkę SC.
Przez następne 16 godzin rób zdjęcie co 10 minut. W dygestorium chemicznym załaduj małą plastikową nakrętkę z jednym mililitrem silanu. Przenieść nakrętkę do szczelnie zamkniętego pojemnika z jednym szkiełkiem nakrywkowym wyłożonym elastomerem, bez bezpośredniego kontaktu.
Pozwól im inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć godzin. Czekając, przygotuj 20 mililitrów roztworu kulek zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie wlej go do 10-centymetrowego naczynia. Po pięciu godzinach powoli umieść silanowane podłoża elastomerem do dołu w roztworze kulki.
Załaduj dwa substraty do każdego naczynia i pozwól substratom reagować z kulkami przez 45 minut. Później za pomocą pęsety usuń podłoża i opłucz je w wodzie destylowanej, aby usunąć niezwiązane koraliki. Następnie wysusz je pod delikatnym strumieniem sprężonego powietrza i przechowuj w szczelnym, nieprzezroczystym pudełku.
Stosując wcześniej opisaną technikę, próbki SC należy przenieść na poddane działaniu środka podłoże w kąpieli wodnej. Natychmiast po zamontowaniu SC nałóż na niego pięciomikrolitrową kroplę nierozcieńczonego roztworu kulki markera fluorescencyjnego. Następnie pozostaw SC do wyschnięcia na 60 minut.
Teraz zmierz grubość SC za pomocą mikroskopu z subiektywną soczewką 40x w komorze perfuzyjnej. Zmierz grubość SC w czasie, używając akcesorium do zdalnego ustawiania ostrości, aby zarejestrować różnicę wysokości Z między dwiema warstwami koralików. Jedna warstwa znajduje się na granicy faz podłoża SC, a druga na wierzchu SC. Za pomocą opisanych technik przygotowano próbkę SC i pokryto ją koralikami fluorescencyjnymi.
Po 16 godzinach suszenia, przy wilgotności względnej 25%, zmierzono przemieszczenia. Ze względu na kołową symetrię próbek, przemieszczenia te były uśredniane azymutalnie. Podczas suszenia przemieszczenia azymutalne pozostają niewielkie.
Promieniowe profile przemieszczeń zwiększały się jednak monotonicznie od środka do krawędzi i rosły w wielkości, aż do osiągnięcia równowagi. Profile rejestrowane w odstępach 30-minutowych pokazują ewolucję przemieszczeń w płaszczyźnie w czasie. Średnia grubość SC zmniejszyła się podczas suszenia, głównie w ciągu pierwszych dwóch godzin.
Dynamika suszenia została następnie przeanalizowana poprzez dopasowanie profili przemieszczeń do liniowego, sprężystego modelu kurczliwości przy użyciu podejścia minimalnej metodą najmniejszych kwadratów. Z modelu wyodrębniono umowne naprężenie suszenia, a także moduł sprężystości. Oba parametry gwałtownie wzrosły w ciągu pierwszych dwóch godzin suszenia.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o całkowitym przyklejeniu próbek do podłoża. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie lipidów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób poszczególne zabiegi kosmetyczne zmieniają skład lipidowy tkanek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę ilościowego oznaczania dynamicznej sztywności mechanicznej oraz właściwości schnięcia ludzkiego stratum corneum. Poprzez pomiar przemieszczeń podczas schnięcia próbek tkanki w płaszczyźnie na podłożu elastomerowym, technika ta pozwala ocenić, w jaki sposób zabiegi chemiczne wpływają na właściwości tkanki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biomechanika
- Kosmetologia
Wstęp
- Zrozumienie właściwości mechanicznych warstwy rogiej jest kluczowe dla zastosowań w terapii skóry.
- Obecne metody mogą wymagać większej ilości tkanki lub więcej czasu, niż jest to pożądane.
- Dynamika procesu wysychania może wpływać na skuteczność produktów do pielęgnacji osobistej.
Cel badania
- Ilościowe określenie naprężeń związanych z wysychaniem oraz sztywności mechanicznej w próbkach skóry ex vivo.
- Ocena wpływu różnych zabiegów chemicznych na właściwości skóry.
- Zapewnienie szybkiej alternatywy dla istniejących metod oceny mechanicznej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie szkiełek podstawowych powlekanych elastomerem z użyciem Sylgard 184.
- Pomiar przemieszczeń podczas wysychania z rozdzielczością przestrzenną.
- Ocena właściwości mechanicznych po obróbce.
- Zapobieganie odparowywaniu z dolnej strony próbki w celu zachowania istotności fizjologicznej.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia szybką ocenę właściwości mechanicznych skóry.
- Różne zabiegi chemiczne znacząco zmieniają charakterystykę wysychania.
- W porównaniu z metodami tradycyjnymi wymagana jest mniejsza ilość tkanki.
Wnioski
- Technika ta pogłębia zrozumienie biomechaniki skóry.
- Dostarcza ona informacji na temat wpływu produktów kosmetycznych na skórę.
- Przyszłe zastosowania mogą przyczynić się do udoskonalenia formulacji i skuteczności produktów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia szybką, istotną fizjologicznie ocenę właściwości mechanicznych warstwy rogiej w warunkach wysychania, co wspiera wczesną ewaluację formulacji kosmetycznych i produktów do pielęgnacji osobistej. Poprzez kwantyfikację dynamicznych zmian naprężeń związanych z wysychaniem oraz modułu sprężystości, dostarcza ona prognostycznych informacji na temat funkcji barierowej i odporności tkanki, co ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac w procesach rozwoju produktu. Podejście wysokoprzepustowe, wymagające niewielkiej ilości tkanki, zwiększa wydajność przesiewową i zmniejsza zależność od tradycyjnych testów mechanicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analizuje, w jaki sposób zabiegi kosmetyczne zmieniają właściwości biomechaniczne warstwy rogiej, wspierając testowanie hipotez mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybki screening wpływu formulacji na sztywność tkanki oraz stres związany z wysychaniem przy minimalnym zużyciu próbek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie ilościowych, rozdzielczych przestrzennie profili przemieszczeń, które korelują ze zmianami właściwości mechanicznych podczas suszenia.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek i pomiary za pomocą okrągłych wycinków przyklejonych do elastomeru, co poprawia powtarzalność między grupami badawczymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy zmiany w procesie schnięcia wywołane formulacją z integralnością bariery, co potwierdza znaczenie translacyjne dla wyników zdrowia skóry.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągły odczyt ewolucji mechanicznej w trakcie 16-godzinnych cykli schnięcia, umożliwiając ocenę skuteczności w rozdzielczości czasowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów badawczych, w których wpływ formulacji na biomechanikę skóry jest oceniany przed optymalizacją wiodących związków, stanowiąc pomost pomiędzy screeningiem molekularnym a funkcjonalną oceną tkanki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu produktów do pielęgnacji osobistej na mechanikę warstwy rogowej oraz akumulację naprężeń wywołanych wysychaniem.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowane konstrukty tkanka-elastomer gotowe do analizy, odpowiednie do porównywania wielu warunków w badaniach przesiewowych formulacji.
- Analityka: Pozwala na wyznaczenie naprężeń związanych z wysychaniem oraz modułu sprężystości z dopasowanych profilów przemieszczeń, umożliwiając ilościowe porównanie efektów zabiegów w czasie.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę mechanicznego wysychania z funkcją barierową, co pozwala ocenić znaczenie przedkliniczne interwencji kosmetycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnych substancji aktywnych w kosmetykach, nawilżaczy i środków oczyszczających w kontrolowanych warunkach wysychania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Przewidywalna pewność co do wpływu formulacji na mechaniczną odporność tkanki i związane z barierą zachowanie podczas wysychania.
- Wartość operacyjna: Wysoka przepustowość, niskie zużycie tkanki oraz zapobieganie artefaktom parowania zwiększają niezawodność i skalowalność testu.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wczesną redukcję ryzyka w odniesieniu do kandydatów na formulacje poprzez identyfikację tych, które nasilają stres mechaniczny wywołany wysychaniem.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację składników kosmetycznych z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o kompatybilność biomechaniczną ze stratum corneum.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wiedza specjalistyczna w zakresie modelowania biomechanicznego i analizy obrazu w celu śledzenia przemieszczeń i dopasowywania modelu.
- Dostęp do powlekaczy wirówkowych, komór perfuzyjnych oraz systemów kontroli środowiskowej w celu suszenia z regulowaną wilgotnością.
- Standaryzacja protokołów wykrawania tkanek, znakowania kulek i powlekania elastomerem dla wszystkich użytkowników.
- Uwagi dotyczące adaptacji do różnych grubości tkanek lub podatności podłoża przy rozszerzeniu zastosowań poza ludzką warstwę rogą.
- Ograniczenie praktyczne: Metoda zakłada liniowe zachowanie sprężyste i symetrię kołową, co może nie mieć miejsca w stanach patologicznych lub przy silnie zmienionych stanach tkanek.
