Modelowanie wielokomórkowego zachowania sferoidalnego raka jajnika w dynamicznym mikrourządzeniu otrzewnowej 3D

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie dynamicznej platformy do kohodowli opartej na mikroprzepływach, która będzie emulować środowisko wewnątrzotrzewnowe z komponentami komórkowymi i mechanicznymi, w których występują przerzuty raka jajnika. Korzystając z tego mikro dla tej platformy, pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii raka, takie jak mikrośrodowisko rozsiewu otrzewnowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że kohodowla 3D w precyzyjnie kontrolowanym swobodnym przepływie lepiej naśladuje komunikację in vivo między komórkami raka jajnika a komórkami methothedia, która zachodzi w jamie otrzewnej.

Po zaprojektowaniu i narysowaniu wzoru kanału mikroprzepływowego i wyprodukowaniu go zgodnie z protokołem tekstowym, należy odwirować warstwę SU82075 Photoresist na płytce silikonowej z prędkością wirowania 1800 obr./min. Piecz wafel pokryty fotorezystem bezpośrednio na gorącej płycie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. A następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 25 minut, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika.

Odwiruj drugą warstwę SU82075 Photoresist na płytce, aby uzyskać ostateczną grubość 250 mikrometrów. Umieść wafel pokryty fotorezystem bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 65 stopni Celsjusza na siedem minut, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie powoli schładzaj wafel do temperatury pokojowej. Następnie wyrównaj i umieść maskę fotograficzną bezpośrednio na płytce.

Następnie wystaw go na działanie światła UV przez 20 sekund, aby przeciąć wzór. Na gorącej płycie piecz powlekaną wafel w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut i 95 stopni Celsjusza przez 12 minut, aby usunąć rozpuszczalnik do wstępnej limeryzacji. Usuń fotorezystor o długości niekrzyżowej, zanurzając płytkę w wywoływaczu SU8 na 25 minut.

Następnie za pomocą izopropanalu opłucz wafel i użyj sprężonego powietrza, aby go wysuszyć. Połączyć bazę polidimetylosiloksanu lub PDMS i utwardzacz w stosunku masowym 10 do jednego i użyć mieszalnika odśrodkowego pod funkcją mieszania i odgazowania do wymieszania roztworu. Powoli wylej mieszaninę PDMS na wafel na wysokość około pięciu milimetrów.

Odgazować PDMS w eksykatorze próżniowym przez 40 minut. Następnie utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Ostrożnie oderwij płytę PDMS od urządzenia głównego i przytnij PDMS wzdłuż kanałów, aż osiągnie rozmiar szklanego szkiełka.

Następnie za pomocą jednomilimetrowego stempla biopsyjnego przebij PDMS, aby utworzyć wloty i wyloty urządzenia. Użyj sprężonego powietrza do oczyszczenia powierzchni PDMS, a następnie za pomocą taśmy klejącej usuń kurz i zanieczyszczenia PDMS. Teraz umieść płytę PDMS stroną kanału skierowaną do góry w myjce plazmowej.

Następnie umieść czysty szkiełko w myjce plazmowej obok płyty PDMS. Traktuj PDMS i szkiełko pod plazmą powietrzną o wysokiej częstotliwości radiowej lub poziomie RF przez jedną minutę. Następnie, po wyjęciu próbek z myjki plazmowej, zwiąż PDMS ze szkiełkiem, aby utworzyć nieodwracalne wiązanie kowalencyjne.

Umieść chip PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 150 stopni Celsjusza na jedną godzinę, aby zwiększyć siłę wiązania i przywrócić hydrofobowość PDMS przed użyciem. Aby pokryć kanały mikroprzepływowe fibronektyną, zacznij od użycia 30 mikrolitrów 75% etanolu do sterylizacji kanałów. Usuń etanol i użyj PBS do dwukrotnego przepłukania kanałów.

Następnie dokładnie odessać PBS z kanałów. Przygotuj 10 mikrogramów na mililitr roztworu fibronektyny w pożywce bez surowicy M199MCDB105 z 30 mikrolitrami roztworu, powoli wypełnij kanały i użyj taśmy do ich uszczelnienia. Następnie inkubuj chip w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Aby wysadzić pierwotne komórki międzybłonki otrzewnowej lub HPMC do kanałów mikroprzepływowych, po wypłukaniu hodowanych komórek zgodnie z protokołem tekstowym, użyj dwóch mililitrów 10% pożywki hodowlanej FBS, aby ponownie zawiesić HPMC. Za pomocą hemocytometru policz komórki i dostosuj stężenie komórek do 3,5 razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Przed użyciem ogrzej chip mikroprzepływowy pokryty fibronektyną w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie całkowicie odessać roztwór fibronektyny i powoli pipetować 30 mikrolitrów zawiesiny HPMC do każdego kanału. Użyj taśmy, aby uszczelnić kanały i umieść urządzenie w inkubatorze CO2 na noc. Aby wywołać tworzenie się sferoidów raka jajnika, rozpuść 0,5% agarozy w wysterylizowanej wodzie.

Dozować 50 mikrolitrów roztworu agarozy do dołków z 96 dołkami. Po zliczeniu wcześniej hodowanych ludzkich komórek raka nabłonka, ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej 5% FBS o gęstości 5 000 komórek na mililitr. Przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki pokrytej agarozą.

I hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2 przez 48 godzin. Przenieś sferoidy raka do 50-mililitrowej probówki wirówkowej zwilżonej jednym mililitrem pożywki bez surowicy i wiruj sferoidy z prędkością 750 razy G przez pięć minut. Po przygotowaniu 2,5 mikrograma na mililitr roztworu CMFDA w pożywce bez surowicy M199MCDB105

Ponownie zawiesić sferoidy raka w jednym mililitrze roztworu i inkubować sferoidy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie policz liczbę sferoidalną i użyj pożywki bez surowicy, aby dostosować stężenie do 2 000 sferoid na mililitr. Przed obciążeniem sferoidowym należy powoli wstrzyknąć 100 mikrolitrów pożywki do M199MCDB105 bez surowicy, aby zmyć nieprzylegające komórki mezobłonka znajdujące się w kanałach.

Załaduj 30 mikrolitrów fluorescencyjnie znakowanej zawiesiny sferoidalnej do każdego kanału. Następnie umieść chip mikroprzepływowy w inkubatorze CO2. Zbuduj platformę obfitościową, podłączając strzykawkę wypełnioną świeżą pożywką M199MCDB105 bez surowicy do rurki o długości jednego metra.

Umieścić strzykawkę na pompie strzykawkowej i zabezpieczyć tłok oraz korpus strzykawki. Następnie zainstaluj pompę strzykawkową w pozycji poziomej na tej samej wysokości, co chip mikroprzepływowy wewnątrz inkubatora. Szybko napełnij całą probówkę medium, naciskając i przytrzymując przycisk szybkiego przewijania do przodu, aż medium przeleje się w rurce.

Następnie uruchom wtrysk z żądanym natężeniem przepływu. Podłącz rurkę do wlotu kanału zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie użyj rurki o krótkim wyjściu, aby podłączyć wylot kanału do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby zebrać wypływające medium.

Na koniec użyj jasnego pola lub mikroskopu fluorescencyjnego, aby obserwować HPMC i sferoidy nowotworowe. Korzystając z platformy mikroprzepływowej opisanej w tym filmie, sferoidy raka jajnika zostały zamodelowane za pomocą komórek międzybłonka w warunkach hydrodynamicznych. Jak pokazano na tym rysunku, komórki międzybłonka, które były hodowane w mikrourządzeniu przez 16 godzin, z powodzeniem utworzyły monowarstwę HPMC.

W tym eksperymencie wielokomórkowe sferoidy o średnicy około 100 mikrometrów, które są podobne pod względem wielkości do tych znalezionych w społeczeństwach pacjentów, zostały oznaczone zielonym barwnikiem fluorescencyjnym CMFDA. Sferoidy zostały następnie przeniesione do kanałów mikroprzepływowych pokrytych HPMC i pozostały w zawiesinie, a morfologie komórek zostały wychwycone. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Jeden na 10 w tej procedurze należy pamiętać o unikaniu wprowadzania pęcherzyków powietrza do kanałów mikroprzepływowych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak leczenie farmakologiczne, testy adhezyjne, testy usuwania międzybłonki, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ mikrośrodowiska śródotrzewnowego na progresję raka. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią nowotworów do zbadania mestazy otrzewnej u ludzi.

Po obejrzeniu tego filmu powinnaś dobrze zrozumieć, jak wygenerować mikrourządzenie otrzewnowe z przepływem płynowym, aby rozpocząć zachowanie raka jajnika w jamie otrzewnej. Nie zapominaj, że praca z siarkami organicznymi, takimi jak aceton, jako wywoływacz i cyklina, może być bardzo niebezpieczna. Ostrzeżenia MP, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego, należy zawsze podejmować przy pierwszym wykonywaniu tej procedury.

Wszystkie procedury związane z tym urzędem powinny być wykonywane w ścisłej tajemnicy.