Name: Modelowanie wielokomórkowego zachowania sferoidalnego raka jajnika w dynamicznym mikrourządzeniu otrzewnowej 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Poznaj dynamiczną platformę mikroprzepływową do badania przerzutów raka jajnika w środowisku otrzewnowym. Model 3D z komórkami mezotelialnymi pozwala precyzyjnie analizować interakcje komórkowe in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Hong Kong Research Grant Council (granty 17122014, C1013-15G, 719813E i 17304514). A. S. T. Wong jest laureatem stypendium Croucher Senior Research Fellowship.

1. Projektowanie i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Projekt matrycy mikrofluidycznej
	<ol>
		<li>Zaprojektować i narysować wzór kanału mikrofluidycznego przy użyciu dowolnego oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). 
		UWAGA: Zazwyczaj rysunek CAD można wysłać do firmy produkującej fotomaski w celu wykonania fotomaski. Projekt mikrofluidyczny składa się z trzech identycznych równoległych kanałów, z których każdy ma następujące wymiary: 4 mm × 25 mm × 250 µm (szerokość × długość × wysokość) i są one rozmieszczone w odstępach 2 mm. Oba końce kanału zaprojektowano pod kątem 127°, aby ułatwić dopływ i odpływ cieczy (Rycina 1B). Kanał użyty w niniejszym protokole został opisany w poprzedniej publikacji13.</li>
		<li>Umyć wafle krzemowy w myjce ultradźwiękowej (500 W/42 kHz) w acetonie, izopropanolu i wodzie dejonizowanej przez 15 min w każdym z tych mediów. Wysuszyć wafle strumieniem sprężonego azotu. Podgrzać wafle krzemowy na płycie grzejnej w temperaturze 250 °C przez 15 min, aby całkowicie go wysuszyć.</li>
		<li>Nanieść warstwę fotorezystu SU-8 2075 (grubość 125 µm) na wafle krzemowy metodą spin-coatingu przy prędkości wirowania 1 800 rpm. Wygrzać pokryty fotorezystem wafle bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C, a następnie w 95 °C, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika, odpowiednio przez 5 i 25 min (zgodnie z instrukcją produktu SU-8).</li>
		<li>Powtórzyć krok 3 i nanieść kolejną warstwę fotorezystu SU-8 2075, aby uzyskać końcową grubość 250 µm. Wygrzać pokryty fotorezystem wafle bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 7 min, a następnie w 95 °C przez 30 min. Powoli schłodzić wafle do temperatury pokojowej. Nie chłodzić sprężonym powietrzem.</li>
		<li>Wyrównać i umieścić fotomaskę bezpośrednio na wafelku. Naświetlać światłem UV przez 20 s, aby sieciować wzór.</li>
		<li>Wygrzać wafle z fotorezystem w temperaturze 65 °C i 95 °C na płycie grzejnej odpowiednio przez 5 i 12 min, aby usunąć rozpuszczalnik do polimeryzacji (zgodnie z instrukcją produktu SU-8). Następnie schłodzić wafle do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Usunąć nienasieciowany fotorezyst poprzez zanurzenie wafla w wywoływaczu SU-8 na 25 min. Przepłukać wafle izopropanolem i wysuszyć sprężonym powietrzem. 
		UWAGA: Jeśli podczas płukania izopropanolem zaobserwowano mętny roztwór, co wskazuje na niepełne wywołanie, ponownie zanurzyć wafle w wywoływaczu SU-8 na dłuższy czas wywoływania.</li>
		<li>Umieścić wafle na płycie grzejnej w temperaturze 180 °C na 10 min, aby usunąć ewentualne pęknięcia we wzorze. Wyłączyć płytę grzejną i powoli schłodzić wafle do temperatury pokojowej, pozostawiając go na płycie.</li>
		<li>Dodać kilka kropli trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silanu do zakrętki fiolki. Umieścić zakrętkę w eksykatorze próżniowym. Umieścić wafle obok zakrętki, aby przeprowadzić silanizację wafla przez 10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie chipa PDMS
	<ol>
		<li>Owinąć wafle folią aluminiową, aby stworzyć uchwyt.</li>
		<li>Zmieszać bazę polidimetylosiloksanu (PDMS) i czynnik sieciujący w stosunku masowym 10:1 za pomocą mieszalnika odśrodkowego z funkcją mieszania i odgazowywania. Powoli wlać mieszaninę PDMS na wafle do wysokości około 5 mm. Odgazować PDMS w próżni przez 40 min. Utwardzić PDMS w piekarniku w temperaturze 65 °C przez 2 h.</li>
		<li>Ostrożnie oddzielić blok PDMS od matrycy i przyciąć go wzdłuż kanałów, aż osiągnie rozmiar szkiełka podstawowego. Wyciąć w PDMS otwory za pomocą wycinaka do biopsji o średnicy 1 mm, aby stworzyć wloty i wyloty urządzenia.</li>
		<li>Oczyścić powierzchnię PDMS sprężonym powietrzem i taśmą klejącą, aby usunąć kurz i resztki PDMS.</li>
		<li>Umieścić blok PDMS stroną z kanałami skierowaną do góry w urządzeniu do plazmowania. Obok bloku PDMS umieścić w urządzeniu czyste szkiełko podstawowe.</li>
		<li>Poddać PDMS i szkiełko podstawowe działaniu plazmy powietrznej przy wysokim poziomie RF przez 1 min. Połączyć PDMS ze szkiełkiem podstawowym, aby stworzyć nieodwracalne wiązanie kowalencyjne.</li>
		<li>Umieścić chip PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 150 °C na 1 h, aby zwiększyć wytrzymałość wiązania i przywrócić hydrofobowość PDMS przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wysiewanie pierwotnych komórek mezohelialnych otrzewnej (HPMCs) na chip mikrofluidyczny
<ol>
	<li>Powlekanie kanałów mikrofluidycznych fibronektyną
	<ol>
		<li>Zsterylizuj kanał mikrofluidyczny za pomocą 30 µL 75% etanolu. Usuń etanol i przepłucz dwukrotnie 30 µL sterylizowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) za pomocą końcówki pipety. Dokładnie odessij PBS z kanałów. 
		UWAGA: Aby zminimalizować ryzyko kontaminacji, hodowla komórkowa w układzie mikrofluidycznym powinna być prowadzona w rygorystycznych warunkach aseptycznych przy użyciu komory z laminarnym przepływem powietrza.</li>
		<li>Przygotuj roztwór fibronektyny o stężeniu 10 µg/mL w bezzserwatkowym medium M199:MCDB105 (1:1). Pipetuj roztwór w górę i w dół, zachowując szczególną ostrożność, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Nie używaj miksera vortex.</li>
		<li>Powoli wypełnij każdy kanał 30 µL roztworem fibronektyny. Uszczelnij kanały taśmą i inkubuj chip przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew komórek HPMC do kanałów mikrofluidycznych
	<ol>
		<li>Hoduj komórki HPMC w medium hodowlanym z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (M199:MCDB105 uzupełnione o 10% FBS oraz 100 U/mL penicyliny/streptomycyny) w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C do osiągnięcia 80% konfluencji.</li>
		<li>Przepłucz komórki HPMC 3 mL PBS i poddaj trypsynizacji za pomocą 2 mL 0,05% roztworu trypsyny/0,01% EDTA (TE) przez 30 s. Zneutralizuj roztwór 4 mL medium hodowlanego z 10% FBS i odwiruj komórki z prędkością 1 000 x g przez 5 min.</li>
		<li>Resuspenduj komórki HPMC w 2 mL medium hodowlanego z 10% FBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj ich stężenie do poziomu 3,5×106/mL.</li>
		<li>Przed użyciem ogrzej powlekony fibronektyną chip mikrofluidyczny w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 5 min. Całkowicie odessij roztwór fibronektyny.</li>
		<li>Powoli nanieś pipetą 30 µL zawiesiny HPMC do każdego kanału. Uszczelnij kanały taśmą i umieść urządzenia w inkubatorze CO2 na noc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Tworzenie sferoidów raka jajnika i kokultura
<ol>
	<li>Tworzenie sferoidów raka jajnika
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem eksperymentów hodować linię komórkową raka nabłonkowego jajnika człowieka SKOV-3 w pożywce z 5% FBS (M199:MCDB105 z 5% FBS i 100 U/mL penicyliny/streptomycyny) w warunkach 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rozpuścić 0,5% agarozy w sterylnej wodzie poprzez gotowanie. Rozdzielić 50 µL roztworu agarozy do każdego dołka płytek 96-dołkowych. Pozostawić płytki w komorze z laminarem na 20 min, aby agaroza stężała; stężała warstwa agarozy pokrywająca dołki zapobiega adhezji komórek i wskazuje, że płytki są gotowe do użycia.</li>
		<li>Przepłukać komórki SKOV-3 3 mL PBS. Trypsynizować 2 mL roztworem TE przez 3 min. Zneutralizować 4 mL pożywki z 5% FBS i odwirować komórki przy 1 000 x g przez 5 min.</li>
		<li>Policzyć komórki SKOV-3 za pomocą hemocytometru i resuspendować je w pożywce z 5% FBS do zagęszczenia 5 000 komórek/mL. Przenieść 200 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka pokrytego agarozą i hodować w warunkach 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 48 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie sferoidów nowotworowych
	<ol>
		<li>Przenieść sferoidy nowotworowe do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL, uprzednio zwilżonej 1 mL pożywki bez surowicy, i odwirować przy 750 x g przez 5 min. 
		UWAGA: Uprzednio zwilżone końcówki pipet i probówki wirówkowe mogą zapobiegać niepożądanemu przywieraniu sferoidów do ścianek probówek.</li>
		<li>Przygotować roztwór 2,5 µg/mL 5-chlorometylofluoresceiny diadestryczanu (CMFDA) w pożywce M199:MCDB105 bez surowicy. Resuspendować sferoidy nowotworowe w 1 mL roztworu CMFDA i inkubować w 37 °C przez 30 min. Wirować przy 750 x g przez 5 min.</li>
		<li>Przepłukać sferoidy nowotworowe 2 mL pożywki bez surowicy i wirować przy 750 x g przez 5 min. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, aby usunąć pozostały barwnik fluorescencyjny z pożywki. 
		UWAGA: Sygnał fluorescencyjny może utrzymywać się w sferoidach przez ponad 96 h.</li>
		<li>Resuspendować sferoidy nowotworowe w pożywce M199:MCDB105 bez surowicy i policzyć liczbę sferoidów za pomocą hemocytometru. Dostosować stężenie do 2 000 sferoidów/mL za pomocą pożywki bez surowicy.</li>
		<li>Przed ładowaniem sferoidów powoli wstrzyknąć 100 µL pożywki M199:MCDB105 bez surowicy, aby wypłukać nieprzylegające komórki mezohelialne z wnętrza kanałów. 
		UWAGA: Szybka injekcja, aspiracja lub powstanie pęcherzyka powietrza doprowadzi do odklejenia monowarstwy mezohelialnej.</li>
		<li>Załadować 30 µL zawiesiny sferoidów znakowanych fluorescencyjnie do każdego kanału. Umieścić chip mikroprzepływowy w inkubatorze CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż platformy perfuzyjnej i kokultura
	<ol>
		<li>Podłączyć strzykawkę wypełnioną świeżą pożywką M199:MCDB105 bez surowicy do rurki o długości 1 m.</li>
		<li>Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej i zabezpieczyć tłok oraz korpus strzykawki. Zainstalować pompę strzykawkową w pozycji poziomej, na tej samej wysokości co chip mikroprzepływowy wewnątrz inkubatora. 
		UWAGA: Liczba i rozmiar strzykawek zależą od liczby użytych kanałów i czasu trwania eksperymentu.</li>
		<li>Szybko napełnić całą rurkę pożywką, naciskając i przytrzymując przycisk szybkiego przesuwania do przodu, aż pożywka wypłynie z rurki.</li>
		<li>Uruchomić infuzję z żądaną prędkością przepływu. Oszacować naprężenie ścinające przy ściankach, korzystając z następującego równania: 
		<img alt="Wzór na naprężenie ścinające τ=6Qμ/h²w do analizy przepływu cieczy w fizyce." src="/files/ftp_upload/55337/eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		gdzie τ oznacza naprężenie ścinające przy ściankach wewnątrz komory, Ǫ = prędkość przepływu, μ = lepkość (0,01 g cms-1); h = wysokość komory przepływowej, a w = szerokość komory przepływowej.</li>
		<li>Podłączyć rurkę do wlotu kanału. Umieścić nadmiar rurki wlotowej w inkubatorze, aby zapewnić ogrzanie pożywki przed wstrzyknięciem do kanałów. W celu ułatwienia połączenia rurki z kanałem można dobrać odpowiednie złączki. UWAGA: Należy uważać, aby do strzykawki, rurek i połączeń nie dostały się pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Podłączyć wylot kanału do stożkowej probówki 50-mL za pomocą krótkiej rurki wyjściowej w celu zbierania wypływającej pożywki. 
		UWAGA: Kompletny dynamiczny system kokultury przedstawiono na Rysunku 1D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obserwacja HPMC i sferoidów nowotworowych po perfuzji
<ol>
	<li>Obserwuj HPMC oraz sferoidy nowotworowe za pomocą mikroskopu w świetle przechodzącym lub fluorescencyjnym i wykonaj zdjęcia po 1 h perfuzji.</li>
</ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21296855">Global cancer statistics.</a> CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).</li>
<li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li>
<li>Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Kit+mediates+chemoresistance+and+tumor-initiating+capacity+of+ovarian+cancer+cells+through+activation+of+Wnt%2Fbeta-catenin-ATP-binding+cassette+G2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling.</a> Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).</li>
<li>Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+overexpression+contributes+to+the+acquired+apoptotic+resistance+of+nonadherent+ovarian+cancer+cells+through+a+cross+talk+mediated+by+phosphatidylinositol+3-kinase+and+extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2.</a> Neoplasia. 12, 128-144 (2010).</li>
<li>Ksiazek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+peritoneal+mesothelial+cells+promote+ovarian+cancer+cell+adhesion%3A+the+role+of+oxidative+stress-induced+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin.</a> Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).</li>
<li>Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+Fibrin+Derivatives+and+Fibronectin+in+Ascitic+Fluid+from+Patients+with+Ovarian-Cancer+Compared+to+Ascitic+Fluid+in+Liver-Cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis.</a> Thromb Res. 35, 53-64 (1984).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).</li>
<li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+tumor+vasculature%3A+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307, 58-62 (2005).</li>
<li>Chang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+cycle+arrest+induced+by+shear+stress%3A+Roles+of+integrins+and+Smad%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+driving+force+for+change%3A+interstitial+flow+as+a+morphoregulator%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator.</a> Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).</li>
<li>Rizvi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+cellular+heterogeneity+and+biomarker+modulation+in+3D+ovarian+cancer+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).</li>
<li>Ip, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+chemoresistance+in+epithelial+ovarian+carcinoma+cells+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress.</a> Sci. Rep. 6, 26788(2016).</li>
<li>Avraham-Chakim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid-flow+induced+wall+shear+stress+and+epithelial+ovarian+cancer+peritoneal+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading.</a> PloS one. 8, e60965(2013).</li>
<li>Burkhalter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/26/1_Supplement/656.11">Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer.</a> Faseb Journal. 26, (2012).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+assessment+of+three-dimensional+cell+aggregation+in+rotating+wall+vessel+bioreactors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).</li>
<li>Ismadi, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+characterization+of+a+spinner+flask+for+induced+pluripotent+stem+cell+culture+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application.</a> PloS one. 9, e106493(2014).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one.+9%22%5BJournal%5D)">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PloS one. 9. 9, e89966(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test ten oferuje elastyczny i fizjologicznie istotny model, który można włączyć do różnych testów biochemicznych i komórkowych, w tym między innymi testów adhezji, testów klirensu międzybłonka i badań przesiewowych leków. Może być stosowany do oceny wpływu mikrośrodowiska wewnątrzotrzewnowego na progresję nowotworu. Jednak kilka warunków eksperymentalnych może wymagać optymalizacji, w zależności od celów projektu (np. liczba HPMC i sferoidów nowotworowych wysiewanych na kanał, czas kohodowli itp.). Inne...

Rak jajnika jest najbardziej śmiertelnym nowotworem ginekologicznym i charakteryzuje się rozległym rozprzestrzenianiem się otrzewnej oraz powstawaniem złośliwych wodobrzuszy1. To rozległe przerzuty do otrzewnej stanowią poważne wyzwanie kliniczne i wiążą się ze złymi wynikami klinicznymi. W przeciwieństwie do większości raków litych, które dają przerzuty przez krew, rak jajnika rozprzestrzenia się głównie w obrębie jamy otrzewnej. Komórki nowotworowe istnieją jako wielokomórkowe agregaty/sferoidy podczas procesu przerzutów2. Fakt, że hodowla zawiesiny może wzbogacić komórki macierzyste/inicjujące nowotwór raka jajnika, sugeruje, że te sferoidy mogą być związane zarówno z agresywnością guza, jak i zwiększoną odpornością na chemoodporność3,4. Istnieją różnice w odpowiedzi na leki między kulturami 2D i 3D, które przypuszczalnie mają różne mechanizmy molekularne5.
Podstawowa interakcja z mezotelium tworzy podstawowe mikrośrodowisko dla progresji guza jajnika. Te komórki międzybłonka leżą na macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), gdzie fibronektyna jest wszechobecnym składnikiem. Wykazano związek między zwiększoną ekspresją fibronektyny pochodzącej z komórek międzybłonka a progresją nowotworu. Fibronektyna jest obficie obecna w złośliwym wodobrzuszu6,7. Komórki raka jajnika są również zdolne do indukowania wydzielania fibronektyny z komórek międzybłonka w celu promowania wczesnych przerzutów raka jajnika8.
Pojawiające się dowody wskazują, że bodźce mechaniczne, w tym naprężenia ścinające, mogą modulować morfologię komórek, ekspresję genów, a tym samym fenotypy komórek nowotworowych9,10,11. Ponieważ złośliwe wodobrzusze rozwija się i gromadzi podczas progresji guza, komórki nowotworowe jajnika są narażone na przepływ płynu i wynikające z tego naprężenia ścinające. Wiele grup, w tym nasza, wykazało wpływ stresu ścinającego na progresję raka jajnika, w tym modyfikacje cytoszkieletu, przejścia nabłonkowe do mezenchymalnych i macierzystość raka12,13,14,15. W związku z tym fizjologicznie istotne mikrośrodowisko jest ważne dla badania przerzutów guza otrzewnej. Jednak obecne systemy hodowli hydrodynamicznej in vitro mają ograniczenia w naśladowaniu i kontrolowaniu stałego, niskiego, fizjologicznie istotnego naprężenia ścinającego16,17,18,19. Konwencjonalne podejścia in vitro koncentrujące się na środowisku komórkowym lub mechanicznym są nadal ograniczone w naśladowaniu złożoności mikrośrodowiska wewnątrzotrzewnowego z odpowiednim znaczeniem fizjologicznym.
Tutaj, w celu opracowania nowego modelu otrzewnej, aby przezwyciężyć ograniczenia konwencjonalnych strategii i przyspieszyć badania przedziału wewnątrzotrzewnowego w przerzutach raka, zaprojektowano platformę mikroprzepływową 3D z kontrolowanym przepływem płynu. W tym modelu sferoidy raka jajnika były hodowane wspólnie z pierwotnymi ludzkimi komórkami międzybłonka otrzewnej w chipach mikroprzepływowych pod ciągłym przepływem płynu (ryc.1A). Komórki międzybłonka poszczepiono fibronektyną. Nieprzylegające sferoidy raka jajnika zostały wysiane do kanałów mikroprzepływowych z pożywką o ciągłym przepływie, ukrwioną za pomocą pompy strzykawkowej. Zarówno środowisko 3D, jak i dynamiczne siły mechaniczne są bardzo ważnymi czynnikami kaskady przerzutowej. Platforma ta może być wykorzystywana do badania mikrośrodowiska wewnątrzotrzewnowego pod kątem złożonych interakcji komórkowych i kokulturowych, a także w odniesieniu do dynamicznych sygnałów mechanicznych.

<table><tbody><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>Wafel uniwersytecki</td>#<td>1196</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>SU-8 2075 fotorezystor&nbsp;</td>Deweloper <td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8&nbsp;</td><td>Microchem</td><td>108-65-6</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silan</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td>Polidimetylosiloksan (PDMS) + zestaw utwardzacza</td></tr><tr><td>do biopsji&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>33-31AA</td><td>Średnica 1 mm</td></tr><tr><td>Myjka plazmowa</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>SCI</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0,86 mm (średnica wewnętrzna)</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Dłuższa pompa precyzyjna&nbsp;</td><td>&nbsp; LSP01-2A</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td>Dodać 2,2 g/L wodorowęglanu sodu</td></tr><tr><td>MCDB 105 Medium</td><td>Sigma</td><td>M6395</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30068.02</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA, roztwór&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0,05% Trypsyna - 0,01% EDTA, czerwień fenolowa</td></tr><tr><td>Fibronektyna ludzka</td><td></td><td>BD 354008</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Dioctan 5-chlorometylofluoresceiny</td> Life <td>technologies</td><td>C7025</td><td>Zielony inkubator CMFDA</td></tr><tr><td>CO2</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Hitachi</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td></td><td>Model: 80i lub ECLIPSE Ti; oprogramowanie: SPOT</td></tr><tr><td>SKOV-3& nbsp;</td><td></td><td></td><td>Prezent od dr N. Auersperga (Uniwersytet Kolumbii Brytyjskiej)</td></tr></tbody></table>

modelowanie wielokomórkowego zachowania sferoidalnego raka jajnika w dynamicznym mikrourządzeniu otrzewnowej 3d

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Rak jajnika charakteryzuje się rozległymi przerzutami do otrzewnej, z kulami nowotworowymi powszechnie występującymi w złośliwym wodobrzuszu. Wiąże się to ze słabymi wynikami klinicznymi i obecnie nie ma skutecznego leczenia. Zarówno środowisko trójwymiarowe (3D), jak i dynamiczne siły mechaniczne są bardzo ważnymi czynnikami w tej kaskadzie przerzutowej. Jednak tradycyjne hodowle komórkowe nie są w stanie odtworzyć tego naturalnego mikrośrodowiska guza. W związku z tym oczywiste znaczenie mają modele podobne do in vivo, które mogą naśladować środowisko wewnątrzotrzewnowe. W tym badaniu stworzono nową platformę mikroprzepływową otrzewnej, aby naśladować sytuację sferoid raka jajnika w jamie otrzewnej podczas przerzutów. Sferoidy raka jajnika powstałe w warunkach nieprzylegających do zachorowań hodowano w kanałach mikroprzepływowych pokrytych komórkami międzybłonka otrzewnej poddanymi fizjologicznie istotnemu naprężeniu ścinającemu. Podsumowując, ta dynamiczna platforma mikroprzepływowa 3D raka jajnika i mezotelium może dostarczyć nowej wiedzy na temat podstawowej biologii nowotworów i służyć jako platforma do potencjalnych badań przesiewowych i opracowywania leków.

Zastosowano ten protokół do stworzenia platformy mikroprzepływowej w celu modelowania sferoidów raka jajnika z komórkami mezoteliowymi w warunkach hydrodynamicznych. Pierwotne ludzkie komórki mezoteliowe otrzewnej (HPMCs) hodowano w urządzeniu mikroprzepływowym przez 16 h i obserwowano pod mikroskopem w świetle przechodzącym. Jak pokazano na Rysunku 2A, dno kanału zostało pomyślnie pokryte monowarstwą HPMCs. Należy zauważyć, że powstanie pęcherzyków powietrza podczas wzor...

Aby zbadać progresję guza jajnika w fizjologicznie istotnym modelu, wielokomórkowe sferoidy zostały wyhodowane w mikrourządzeniu pod symulowanym przepływem płynu. Ten dynamiczny model 3D emuluje środowisko wewnątrzotrzewnowe z komponentami komórkowymi i mechanicznymi, w których dochodzi do przerzutów raka jajnika.

Modelowanie wielokomórkowego zachowania sferoidalnego raka jajnika w dynamicznym mikrourządzeniu otrzewnowej 3D

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie dynamicznej platformy do kokultury opartej na mikrofluidyce, która emuluje środowisko wewnątrzbrzuszne wraz z komponentami komórkowymi i mechanicznymi, w których dochodzi do przerzutowania raka jajnika. Wykorzystanie tej mikroplatformy pomaga w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii nowotworów, takie jak kwestia mikrośrodowiska rozsiewu otrzewnowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że kokultura 3D w warunkach precyzyjnie kontrolowanego swobodnego przepływu lepiej naśladuje komunikację in vivo między komórkami raka jajnika a komórkami otoczenia, która zachodzi w jamie otrzewnej.Po zaprojektowaniu i narysowaniu wzoru kanałów mikrofluidycznych oraz jego wykonaniu zgodnie z protokołem tekstowym, należy nanieść warstwę fotorezystu SU82075 na wafelek krzemowy metodą spin-coatingu przy prędkości obrotowej 1800 RPM. Wafelek pokryty fotorezystem należy wyprać bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez pięć minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 25 minut, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika.Nanieś drugą warstwę fotorezystu SU82075 na podłoże krzemowe metodą spin coatingu, aby uzyskać końcową gr

modeling-ovarian-cancer-multicellular-spheroid-behavior-dynamic-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisany tutaj test oczyszczania mezotelium wykorzystuje komórki znakowane fluorescencyjnie oraz mikroskopię wideo poklatkową do wizualizacji i ilościowego pomiaru interakcji między wielokomórkowymi sferoidami raka jajnika a monowarstwami komórek mezoteliów. Test ten modeluje wczesne etapy przerzutowania raka jajnika.

Test oczyszczania mezotelialnego in vitro modelujący wczesne etapy przerzutowania raka jajnika

Opisujemy metodologie tworzenia heterotypowych trójwymiarowych modeli in vitro, składających się z fibroblastów jajnika oraz prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omówiono zastosowanie tych modeli do badania oddziaływań stroma-nabłonek, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

W tym filmie demonstrujemy rozwój trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej. Ta kultura organotypowa może pomóc w badaniu adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie przerzutów raka jajnika w błonie śluzowej jamy otrzewnej: metoda tworzenia modelu 3D wyściółki otrzewnej in vitro

W tym filmie tworzymy ex vivo hodowlę narządów omentalnych pokrytą komórkami raka jajnika wykazującymi ekspresję GFP, aby zbadać kolonizację raka jajnika w obrębie eksplantatu jajnika. Protokół ten analizuje struktury komórek odpornościowych w sieci znane jako mleczne plamki, które sprzyjają przerzutom.

Modelowanie kolonizacji komórek raka jajnika sieci komórkowej: metoda ex vivo do ustalenia kolonizacji plamki mlecznej znakowanych fluorescencyjnie komórek raka jajnika w mysich eksplantatach sieci

Inwazja komórek raka jajnika w błonie międzybłonkowej otrzewnej jest procesem dynamicznym w czasie. Wykorzystując analizator w czasie rzeczywistym, zdolność inwazyjną komórek raka jajnika w modelu kohodowli komórek sferoidalnych i międzybłonka można określić ilościowo w dłuższych okresach czasu, zapewniając wgląd w czynniki regulujące proces przerzutowy.

Ocena przyczepu sferoidalnego raka jajnika i inwazji komórek międzybłonka w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół do budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej, składającego się z pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka i fibroblastów pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

Ten protokół opisuje ustanowienie trójwymiarowego (3D) modelu ex vivo interakcji komórka rakowa - sieć komórkowa. Model ten stanowi platformę do wyjaśnienia mechanizmów pronowotworowych w niszy tkanki tłuszczowej oraz do testowania nowych terapii.

Model ex vivo przerzutów do otrzewnej raka jajnika z wykorzystaniem ludzkiej sieci

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj dynamiczną platformę mikroprzepływową do badania przerzutów raka jajnika w środowisku otrzewnowym. Model 3D z komórkami mezotelialnymi pozwala precyzyjnie analizować interakcje komórkowe in vivo.

Modelowanie wielokomórkowego zachowania sferoidalnego raka jajnika w dynamicznym mikrourządzeniu otrzewnowej 3D

Przeglądaj więcej filmów