Leczenie konstruktów więzadeł surowicą kondycjonowaną wysiłkowo: translacyjny model inżynierii tkankowej

Ogólnym celem tego modelu jest określenie wpływu ćwiczeń i odżywiania na syntezę i funkcję tkanki łącznej. Technika ta wykorzystuje ludzką surowicę, która jest pobierana przed i po wysiłku w celu leczenia tkanek 3D, dzięki czemu możemy zrozumieć, jak ćwiczenia wpływają na funkcję więzadeł i ścięgien. Zapewnienie tkanek 3D łączy w sobie korzyści płynące z dobrze scharakteryzowanych testów in vitro z funkcją, morfologią i charakterystyką biochemiczną tkanek in vivo.

Po wcześniejszym przygotowaniu 35-milimetrowych płytek pokrytych silikonem zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować formy kotwiące, umieszczając jeden drobny kołek w środku każdej cylindrycznej studzienki w formach. Połącz fosforan beta trójwapniowy i ortofosforowy roztwór kwasu cytrynowego w ilości od jednego do trzech gramów na mililitr w plastikowej łodzi wagowej na lodzie. Użyj plastikowego skrobaka do komórek, aby energicznie wymieszać cement.

Roztarć cement, aby kontynuować mieszanie, i odpipetuj mieszaninę do form, a następnie odwiruj wypełnioną formę z prędkością 2 250 g przez pięć minut. Po odwirowaniu pozwól, aby kotwy z cementu szczotkowego zastygły w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego ranka wyjmij kotwy z formy i przypnij dwie kotwy w odległości 12 milimetrów od siebie w każdej płytce pokrytej silikonem.

Wysterylizuj przypięte płytki, spryskując je 70% etanolem, wypełniając zarówno płytki, jak i pokrywki, a następnie umieść płytki w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub BSC. Po co najmniej 30 minutach odessać płytki i pozwolić im wypróbować w BSC. Załóż pokrywki i przechowuj je w BSC, aż będą potrzebne.

Przestrzegaj lokalnych przepisów dotyczących zagrożeń biologicznych dotyczących prawidłowego użytkowania i utylizacji materiałów niebezpiecznych biologicznie. Utrzymuj sterylność i wykonuj etapy tworzenia konstruktu w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Po przygotowaniu pierwotnych fibroblastów, odczynników i płytek pokrytych silikonem z przypinanymi kotwami szczotkowymi, zgodnie z protokołem tekstowym, hoduj komórki na 15-centymetrowych płytkach do 70% konfluencji.

Następnie przygotuj mieszankę wzorcową składającą się z następujących elementów: 681 mikrolitrów na konstrukt zawiesiny komórek, 29 mikrolitrów na konstrukt trombiny, dwa mikrolitry na konstrukt aprotyniny i dwa mikrolitry na konstrukt kwasu aminoheksanowego. Po dokładnym wymieszaniu roztworu dodaj 714 mikrolitrów do każdej przypiętej płytki w kształcie ósemki wokół kotew cementowych brushite, upewniając się, że mieszanka główna bezpośrednio styka się z bokami kotew. Delikatnie postukaj w każdą płytkę, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę.

Najważniejszym etapem jest uformowanie osadzonego w komórce żelu fibrynowego. Upewnij się, że mieszanka główna do gniazd w komórce bezpośrednio styka się z kotwami i postukaj w płytkę, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę. Na jedną płytkę na raz dodawaj 286 mikrolitrów fibrynogenu kroplami, równomiernie na płytkę.

Natychmiast przesuń płytkę do przodu i do tyłu oraz na boki, aby rozprowadzić fibrynogen w celu utworzenia żeli fibrynowych osadzonych w komórkach, a następnie przejdź do następnej płytki. Umieść konstrukty w sterylnym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i inkubuj je przez co najmniej 15 minut, aby umożliwić polimeryzację fibrynogenu. Przygotuj dwa mililitry na konstrukt pożywki paszowej, uzupełniając pożywkę wzrostową 200 mikromolami kwasu askorbinowego, 50 mikromolami prolenu i pięcioma nanogramami na mililitr TGF beta 1.

Użyj dwóch mililitrów pożywki paszowej, aby przykryć każdy konstrukt i hoduj konstrukty w sterylnym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez łącznie 14 dni lub do pożądanego punktu końcowego, odświeżając pożywkę co drugi dzień dwoma mililitrami pożywki. Aby pobrać ludzką surowicę, pobierz próbkę krwi spoczynkowej zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie poproś uczestników o wykonanie trybu ćwiczeń, który odpowiada Twojemu celowi badawczemu. Pokazano tutaj 30-minutowy atak ćwiczeń oporowych o wysokiej intensywności.

Zbierz próbkę krwi 15 minut po sesji ćwiczeń, a następnie, po umożliwieniu krzepnięcia krwi, obracaj próbkę pod kątem 1 500 g przez 10 minut. W sterylnych warunkach przenieść surowicę do sterylnych probówek w celu przygotowania pożywki. Po przygotowaniu konstrukcji więzadeł należy przeprowadzić próbę rozciągania za pomocą testera rozciągania w kąpieli PBS z odwróconymi formowanymi uchwytami, które są sprzężone z przetwornikiem siły.

To utrzymuje kotwy z cementu szczotkitowego na miejscu podczas testu. Za pomocą suwmiarki cyfrowej określ długość i konstrukcję więzadeł oraz oblicz pole przekroju poprzecznego tkanki. Odpiąć konstrukcję więzadła od płyty i umieścić kotwy w odwróconych formowanych uchwytach, upewniając się, że konstrukcja jest zanurzona w PBS, a następnie dostosuj odległość między uchwytami, ustawiając długość konstrukcji na jej początkową długość.

Rozpocznij test i odcedź konstrukcję do uszkodzenia z szybkością odkształcenia 0,4 milimetra na sekundę lub 3% na sekundę. Po teście przetrzyj tkankę i przeprowadź kwantyfikację kolagenu w zmodyfikowanych więzadłach zgodnie z protokołem tekstowym. Po jednym do dwóch dni w hodowli fibroblasty ACL przyczepiły się do żelu fibrynowego, wydłużyły procesy komórkowe i zaczęły wywierać siły trakcyjne.

Między dwoma punktami kotwiczenia generowane jest napięcie, a komórki ustawiają się równolegle do tej osi i zaczynają odkładać kolagen. Pokazano tutaj reprezentatywny wykres naprężenia i odkształcenia dla więzadła przetestowanego pod kątem uszkodzenia. W tych eksperymentach ludzka surowica została wyizolowana z próbek krwi przed i po wysiłku i użyta zamiast FBS do wytworzenia pożywki wzbogaconej o środowisko biochemiczne wywołane wysiłkiem.

Jak pokazano na tym wykresie, po 14-dniowym okresie posiewu konstrukcje więzadeł wykazały znaczny wzrost zarówno maksymalnego obciążenia rozciągającego, jak i zawartości kolagenu w odpowiedzi na surowicę powysiłkową. Po opanowaniu, konstrukcje więzadeł można wykonać w ciągu dwóch dni i będą one gotowe do prób rozciągania, oznaczania ilościowego zawartości kolagenu i innych analiz biochemicznych w ciągu dwóch tygodni. Ten translacyjny model in vitro in vivo jest częścią szerszej misji, której celem jest zrozumienie, w jaki sposób ćwiczenia poprawiają funkcję więzadeł, ścięgien, a właściwie prawie każdej tkanki w ciele.

Jest to więc naprawdę solidna i silna technika, w której możemy określić zawartość kolagenu i funkcję tkanki łącznej po zabiegach z ćwiczeniami, odżywianiem, obciążeniem, wszelkiego rodzaju czynnikami wzrostu, wszystkimi rodzajami różnych interwencji, które możemy wykonać u ludzi lub zwierząt.