Name: Leczenie konstruktów więzadeł surowicą kondycjonowaną wysiłkowo: translacyjny model inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metodę leczenia konstruktów więzadeł surowicą kondycjonowaną wysiłkowo w celu analizy zawartości kolagenu i właściwości mechanicznych. Model ten pozwala badać wpływ ćwiczeń na syntezę tkanki łącznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez stypendium podoktorskie NSERC (DWDW), stypendium Fundacji ARCS (AL) oraz grant UC Davis College of Biological Sciences (KB).

<ol><li>West, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exercise-induced+biochemical+milieu+enhances+collagen+content+and+tensile+strength+of+engineered+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments.</a> J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).</li>
<li>Booth, F. W., Laye, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+adequate+appreciation+of+physical+exercise%27s+complexities+can+pre-empt+appropriate+design+and+interpretation+in+scientific+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lack of adequate appreciation of physical exercise's complexities can pre-empt appropriate design and interpretation in scientific discovery.</a> J Physiol. 587 (Pt 23), 5527-5539 (2009).</li>
<li>Booth, F. W., Hargreaves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+multi-organ+pathology+from+insufficient+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Understanding multi-organ pathology from insufficient exercise.</a> J Appl Physiol (1985). 111 (4), 1199-1200 (2011).</li>
<li>Shearn, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+tissue+engineering%3A+progress%2C+challenges%2C+and+translation+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">Tendon tissue engineering: progress, challenges, and translation to the clinic.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 163-173 (2011).</li>
<li>Liu, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+should+know+before+using+tissue+engineering+techniques+to+repair+injured+tendons%3A+a+developmental+biology+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective.</a> Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).</li>
<li>Vunjak-Novakovic, G., Altman, G., Horan, R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of ligaments.</a> Annu Rev Biomed Eng. 6, 131-156 (2004).</li>
<li>Bayer, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+of+embryonic-like+collagen+fibrillogenesis+by+adult+human+tendon+fibroblasts+when+cultured+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The initiation of embryonic-like collagen fibrillogenesis by adult human tendon fibroblasts when cultured under tension.</a> Biomaterials. 31 (18), 4889-4897 (2010).</li>
<li>Guerquin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+EGR1+directs+tendon+differentiation+and+promotes+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair.</a> J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+engineered+bone-ligament-bone+constructs+for+anterior+cruciate+ligament+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional engineered bone-ligament-bone constructs for anterior cruciate ligament replacement.</a> Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 103-116 (2012).</li>
<li>Hagerty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+growth+factors+on+both+collagen+synthesis+and+tensile+strength+of+engineered+human+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of growth factors on both collagen synthesis and tensile strength of engineered human ligaments.</a> Biomaterials. 33 (27), 6355-6361 (2012).</li>
<li>Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+an+intermittent+stretch+paradigm+using+ERK1%2F2+phosphorylation+results+in+increased+collagen+synthesis+in+engineered+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments.</a> Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).</li>
<li>Safdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+rescues+progeroid+aging+and+induces+systemic+mitochondrial+rejuvenation+in+mtDNA+mutator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).</li>
<li>Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscles%2C+exercise+and+obesity%3A+skeletal+muscle+as+a+secretory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ.</a> Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).</li>
<li>Crane, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-stimulated+interleukin-15+is+controlled+by+AMPK+and+regulates+skin+metabolism+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging.</a> Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).</li>
<li>Rao, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meteorin-like+is+a+hormone+that+regulates+immune-adipose+interactions+to+increase+beige+fat+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis.</a> Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).</li>
<li>Aswad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+participate+in+the+alteration+of+muscle+homeostasis+during+lipid-induced+insulin+resistance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice.</a> Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).</li>
<li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), advance online publication 504-517 (2016).</li>
<li>Maling, H. M., Stern, D. N., Altland, P. D., Highman, B., Brodie, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiologic+role+of+the+sympathetic+nervous+system+in+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">The physiologic role of the sympathetic nervous system in exercise.</a> J Pharmacol Exp Ther. 154 (1), 35-45 (1966).</li>
<li>Pritzlaff, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+acute+exercise+intensity+on+pulsatile+growth+hormone+release+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Impact of acute exercise intensity on pulsatile growth hormone release in men.</a> J Appl Physiol (1985). 87 (2), 498-504 (1999).</li>
<li>Creemers, L. B., Jansen, D. C., van Veen-Reurings, A., van den Bos, T., Everts, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microassay+for+the+assessment+of+low+levels+of+hydroxyproline%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline.</a> Biotechniques. 22 (4), 656-658 (1997).</li>
<li>Neuman, R. E., Logan, M. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15421999">The determination of hydroxyproline.</a> J Biol Chem. 184 (1), 299-306 (1950).</li>
<li>Paxton, J. Z., Donnelly, K., Keatch, R. P., Baar, K., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+longevity+and+strength+in+an+in+vitro+model+of+the+bone-ligament+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the longevity and strength in an in vitro model of the bone-ligament interface.</a> Ann Biomed Eng. 38 (6), 2155-2166 (2010).</li>
<li>Woessner, J. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+hydroxyproline+in+tissue+and+protein+samples+containing+small+proportions+of+this+imino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid.</a> Arch Biochem Biophys. 93, 440-447 (1961).</li>
<li>Paxton, J. Z., Wudebwe, U. N., Wang, A., Woods, D., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+sinew+contraction+during+formation+of+tissue-engineered+fibrin-based+ligament+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring sinew contraction during formation of tissue-engineered fibrin-based ligament constructs.</a> Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1596-1607 (2012).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+inhibits+lysyl+oxidase+and+decreases+mechanical+function+in+engineered+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Estrogen inhibits lysyl oxidase and decreases mechanical function in engineered ligaments.</a> J Appl Physiol (1985). 118 (10), 1250-1257 (2015).</li>
<li>Paxton, J. Z., Grover, L. M., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+in+vitro+model+of+a+functional+ligament+from+bone+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineering an in vitro model of a functional ligament from bone to bone.</a> Tissue Eng Part A. 16 (11), 3515-3525 (2010).</li>
<li>Heinemeier, K., Langberg, H., Kjaer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+changes+in+circulating+levels+of+transforming+growth+factor-beta-1+in+humans%3A+methodological+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced changes in circulating levels of transforming growth factor-beta-1 in humans: methodological considerations.</a> Eur J Appl Physiol. 90 (1-2), 171-177 (2003).</li>
<li>Mackey, A. L., Heinemeier, K. M., Koskinen, S. O., Kjaer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+adaptation+of+tendon+and+muscle+connective+tissue+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic adaptation of tendon and muscle connective tissue to mechanical loading.</a> Connect Tissue Res. 49 (3), 165-168 (2008).</li>
<li>Psychogios, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+serum+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The human serum metabolome.</a> PLoS One. 6 (2), e16957(2011).</li>
<li>Nguyen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+resting+and+exercise+serum+from+children+with+cystic+fibrosis+on+C2C12+myoblast+proliferation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">The effects of resting and exercise serum from children with cystic fibrosis on C2C12 myoblast proliferation in vitro.</a> Physiol Rep. 2 (6), e12042(2014).</li>
<li>Joyner, M. J., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+questions+about+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ten questions about systems biology.</a> J Physiol. 589 (Pt 5), 1017-1030 (2011).</li>
<li>Joyner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+sucking+sound%3A+can+physiology+fill+the+intellectual+void+left+by+the+reductionists%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Giant sucking sound: can physiology fill the intellectual void left by the reductionists?</a> J Appl Physiol (1985). 111 (2), 335-342 (2011).</li>
<li>Benjamin, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16637873">Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load.</a> J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).</li>
<li>Arruda, E. M., Calve, S., Dennis, R. G., Mundy, K., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+of+tibialis+anterior+tendon+mechanics+is+lost+following+denervation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Regional variation of tibialis anterior tendon mechanics is lost following denervation.</a> J Appl Physiol (1985). 101 (4), 1113-1117 (1985).</li>
<li>Arendt, E., Dick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knee+injury+patterns+among+men+and+women+in+collegiate+basketball+and+soccer.+NCAA+data+and+review+of+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Knee injury patterns among men and women in collegiate basketball and soccer. NCAA data and review of literature.</a> Am J Sports Med. 23 (6), 694-701 (1995).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Niniejszy manuskrypt opisuje model tkanki więzadła, który jest użyteczną platformą eksperymentalną dla badaczy o szerokim spektrum tematów badawczych, od rozwoju tkanek po pytania translacyjne/kliniczne. Opisany tutaj model więzadłowy oparty jest na wszechstronnym protokole, który można dostosować w różnych momentach całego przepływu pracy (rysunek 1 i sekcja dyskusji). Co więcej, z natury redukcjonistyczny charakter środowiska in vitro może być przybliżony do sfery fizjologicznej poprzez uzupełnienie pożywek paszowych kondycjonowaną surowicą ludzką lub zwierzęcą.
Konstrukty mogą być tworzone przy użyciu fibroblastów z różnych źródeł Podczas gdy przedstawiona tutaj metodologia i reprezentatywne wyniki opierają się na użyciu pierwotnych fibroblastów ACL, protokół izolacji komórek można dostosować do zbierania innych typów pierwotnych fibroblastów. Jak opisano na rycinie 4, zmodyfikowane więzadła utworzone z komórek pierwotnych wyizolowanych od młodych ludzkich dawców wykazują niską zmienność dawcy. Komórki pierwotne są ograniczone przez początkową izolację i ograniczenie przejścia; Wykorzystanie linii komórkowych może poprawić odtwarzalność eksperymentów. Stosowanie innych typów komórek może wymagać modyfikacji pożywek do hodowli komórkowych i preparatu żelu fibrynowego. Na przykład zaobserwowaliśmy, że ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) nie są w stanie tworzyć liniowych tkanek między kotwicami cementu szczotkitowego w ciągu 2 tygodni, podczas gdy fibroblasty ścięgien zginaczy palców koni górnych, komórki zrębu szpiku kostnego koni, fibroblasty ścięgien zarodkowych piskląt i mysie C3H10T1/2 MSC szybko kurczą się i trawią żel fibrynowy, tworząc tkankę liniową (niepublikowane obserwacje). Kontrast ten może być konsekwencją różnic w kurczliwości komórek, proliferacji i produkcji enzymów fibrynolitycznych.
Zastosowanie stymulacji chemicznej i mechanicznej W opisanej tu metodzie tkanka na bazie fibryny tworzy się wokół kotew z cementu szczotkowego, co pozwala na zastosowanie stymulacji mechanicznej za pomocą bioreaktora rozciągającego11, a także na próbę rozciągania w punkcie końcowym. Obecność granicy między cementem szczotkowym a tkanką miękką (przyczepy ścięgniste) również stanowi okazję do dalszych badań i ulepszeń22,26 (patrz sekcja Zastosowania kliniczne poniżej). W tym środowisku in vitro można łatwiej zidentyfikować wpływ czynników chemicznych i mechanicznych; Przykład tego pokazano na rycinie 5, gdzie wpływ środowiska surowicy po wysiłku został oddzielony od bodźców mechanicznych związanych z wysiłkiem. Badania pilotażowe mogą być konieczne w celu określenia ram czasowych interwencji eksperymentalnych, składu leczenia i odpowiednich punktów końcowych, aby oczekiwać obserwowalnej zmiany. Na przykład w badaniu1 surowicy po wysiłku długość eksperymentalnego leczenia była ograniczona przez dostarczanie surowicy używanej do uzupełniania pożywki, z której konstrukty podawano co drugi dzień. Ponadto, w drugim tygodniu hodowli, pożywki hodowlane uzupełniono surowicą spoczynkową lub powysiłkową z kwasem askorbinowym i L-proliną, utrzymując się, podczas gdy TGF-β1 został usunięty. TGF-β1 jest znanym pro-zwłóknieniowym czynnikiem wzrostu, który zwiększa się w surowicy po wysiłku27. Dlatego, aby uniknąć zaciemnienia związanych z TGF-β1 efektów surowicy powysiłkowej, cytokina ta nie była utrzymywana w pożywkach hodowlanych.
Ten zmodyfikowany model więzadła może być również używany do testowania wpływu rozciągania mechanicznego. Poprzez inżynierię odwróconych modelowanych uchwytów do przytrzymywania końców kotew z cementu szczotkowego (podobnie jak jednoosiowy tester rozciągania przedstawiony na rysunku 1), bioreaktory rozciągane można zaprojektować tak, aby pomieścić więzadła inżynieryjne. Nasze laboratorium wcześniej wykorzystywało ten model do badania odpowiedzi sygnalizacji molekularnej zmodyfikowanych więzadeł na jednoosiowe rozciąganie w specjalnie wykonanym bioreaktorze11 , co zapewni lepsze zrozumienie racjonalnego projektowania paradygmatu rozciągania in vitro , a nawet, potencjalnie, zastosowań rozciągliwych/aktywności/terapeutycznych in vivo.
Ocena więzadeł inżynieryjnych Podobnie jak w przypadku tradycyjnej hodowli jednowarstwowej, konstrukty 3D mogą być testowane pod kątem ekspresji genów/białek; ponadto ich morfologia 3D daje również możliwość oceny zmian funkcjonalnych i morfologicznych, a konstrukty mogą być utrzymywane w kulturze do długoterminowych badań (ryc. 3). Chociaż zmodyfikowane więzadła nie są równoważne z natywnymi, dojrzałymi więzadłami, są podobne do rozwijających się ścięgien / więzadeł i zachowują się podobnie do tkanki natywnej w odpowiedzi na składniki odżywcze26, czynniki wzrostu10, hormony25 i ćwiczenia11,28. Tak więc, chociaż należy zachować ostrożność przed dokonaniem szerokich uogólnień na podstawie jakiegokolwiek modelu in vitro, wyniki testów konstrukcji więzadeł mogą ujawnić lub poinformować o określonym mechanizmie fizjologicznym, który w przeciwnym razie mógłby być niemożliwy do zbadania in vivo.
Uzupełniające podłoże paszowe z kondycjonowaną surowicą dla elastycznego i dynamicznego modelu o szerokim zastosowaniu Metabolom ludzkiej surowicy to środowisko ~ 4,500 związków, w tym między innymi glikoprotein, lipoproteiny, pochodne lipidów, substraty energetyczne, metabolity, witaminy, enzymy, hormony, neuroprzekaźniki i mnóstwo bloków budulcowych / półproduktów. 29 Dalsza kontrola metabolomu surowicy ludzkiej według klas związków29 ujawnia dodatkowe korzyści płynące z włączenia surowicy doświadczalnej do doświadczeń in vitro. Oznacza to, że większość z ~4500 związków w surowicy jest hydrofobowa lub pochodząca z lipidów, co podkreśla znaczenie białek wiążących do transportu/rozpuszczania. Wynika z tego, że eksperymentalne podsumowanie endogennej dynamiki transportu związków, a co za tym idzie biodostępności i interakcji związek-cel, byłoby prawie niemożliwe. Tak więc surowica eksperymentalna jest szczególnie skuteczna w badaniu związków, o których wiadomo, że zależą od cząsteczek pomocniczych do rozpuszczania, transportu, wiązania celu i mechanizmu działania.
Nasze laboratorium od dawna interesuje się korzyściami zdrowotnymi płynącymi z ćwiczeń. Ćwiczenia poprawiają funkcjonowanie komórek i narządów w różnych tkankach w całym ciele12, efekt, który można przypisać różnym czynnikom (np. IL-613, IL-1514, Meteoryny15, egzosomy16,17), które są uwalniane do krążenia ogólnoustrojowego. Środowisko biochemiczne po wysiłku fizycznym odzwierciedla czynniki uwalniane zarówno w wyniku skurczu hormonów reagujących na wysiłek mięśni szkieletowych, jak i czynników, które są uwalniane w wyniku stymulacji gruczołów wydzielniczych przez współczulny układ nerwowy (np. kortyzol i katecholaminy z nadnerczy18 oraz hormon wzrostu z przedniej części przysadki mózgowej19). Niedawno użyliśmy modelu surowicy przed i po wysiłku, aby zbadać wpływ środowiska biochemicznego wywołanego wysiłkiem fizycznym na zmodyfikowane tkanki. 1 Chociaż pozostaje wiele ważnych pytań badawczych związanych z ćwiczeniami, model nie jest w żaden sposób ograniczony. Na przykład surowicę można uzyskać ze źródeł zwierzęcych lub ludzkich, po interwencjach dietetycznych lub farmakologicznych, lub z różnych grup wiekowych lub populacji klinicznych30. W ten sposób egzogenne lub endogenne związki będące przedmiotem zainteresowania będą obecne w surowicy i pożywkach zabiegowych, w ilościach biodostępnych i będą wchodzić w interakcje z tkanką docelową w porozumieniu ze środowiskiem endogennym (tj. w bardziej fizjologicznym kontekście). Podejście to jest dynamiczne, ponieważ istnieje duże prawdopodobieństwo, że dana interwencja wywrze efekt wielonarządowy (i wieloskładnikowy), a tym samym środowisko fizjologiczne będzie współmodyfikowane. Chociaż podejście to wiąże się z pewnymi wyzwaniami, ponieważ wiele systemowych zmiennych biochemicznych jest zmienianych jednocześnie, jest to podejście, które może pomóc przezwyciężyć wady czysto redukcjonistycznej metodologii eksperymentalnej31,32. Podsumowując, wdrożenie kondycjonowanej surowicy wraz z tkanką zmodyfikowaną tkankowo (biomimetycznie in vitro) może być wykorzystane jako narzędzie do badań klinicznych w zakresie fizjologii, odżywiania i badań klinicznych.
Zastosowań klinicznych jest wiele Przedstawiony tutaj model inżynierii tkankowej może być wykorzystany do zbadania anatomicznych i klinicznych pytań badawczych, których tradycyjne modele in vitro nie są w stanie rozwiązać. Więzadło lub ścięgno in vivo zawiera obszar przejściowy tkanki miękkiej do twardej zwany przyczepem ścięgnistym. Przyczep ścięgnisty, który jest podatny na urazy związane ze stresem mechanicznym33, można badać w przekroju za pomocą technik mikroskopii histochemicznej i elektronowej 22,26. Ten unikalny interfejs jest podwójnie ważny dla osób o niskiej lub ograniczonej mobilności, ponieważ brak aktywności fizycznej upośledza zdolność tkanki łącznej do przenoszenia obciążenia do obszarów o niskiej lub wysokiej podatności34, co ostatecznie prowadzi do ogólnego spadku podatności tkanek i zwiększonego ryzyka urazów.
Nasze laboratorium wykorzystało ostatnio ten model inżynierii tkankowej25 do modelowania innej populacji, sportsmenek, które są narażone na urazy tkanki łącznej: częstość występowania uszkodzeń ACL jest około pięciokrotnie większa niż u mężczyzn35. Potencjalne mechanizmy leżące u podstaw tej rozbieżności w urazach związanych z płcią zbadano poprzez leczenie konstruktów więzadeł fizjologicznymi stężeniami żeńskiego hormonu płciowego, estrogenu, w stężeniach naśladujących etapy cyklu miesiączkowego. Co ciekawe, wysokie stężenia estrogenu hamowały ekspresję genów i aktywność oksydazy lizylowej, głównego enzymu odpowiedzialnego za tworzenie wiązań krzyżowych lizyna-lizyna w macierzy kolagenowej więzadeł i ścięgien. Co ważne, 48 godzin wysokiego estrogenu (w celu symulacji fazy folikularnej) zmniejszyło sztywność konstrukcji więzadeł bez zmiany gęstości kolagenu w konstruktach. Z fizjologicznego punktu widzenia sugeruje to, że wzrost wiotkości więzadeł u kobiet może być spowodowany, przynajmniej częściowo, zmniejszonym tworzeniem usieciowania. Z perspektywy eksperymentalnej odkrycia te25 podkreślają użyteczność modelu konstrukcji 3D, który pozwolił na zbadanie funkcjonalnej aktywności sieciowania. Z klinicznego punktu widzenia model ten może być teraz wykorzystany do szybkiego badania przesiewowego pod kątem interwencji, które mogą zapobiec negatywnym skutkom estrogenu na funkcję więzadeł.
Uwagi końcowe W tym miejscu przedstawiliśmy szczegółową metodykę tworzenia więzadeł inżynieryjnych i ich użyteczność jako model tkankowy 3D in vitro . Model można w dużym stopniu dostosować do szerokiego zakresu celów, zapewniając elastyczność w zakresie typu komórki, interwencji i miar wyników. Uzupełnienie pożywek paszowych kondycjonowaną surowicą dodaje kontekst fizjologiczny, którego nie można osiągnąć w tradycyjnym środowisku in vitro , poprawiając modelowanie fizjologii in vivo . Krótko mówiąc, uważamy, że jest to model o szerokim zastosowaniu, który może mieć ekscytujące implikacje dla rozwoju zarówno dziedzin fizjologii, jak i inżynierii tkankowej.

Urazy ścięgien i więzadeł są powszechne i mogą mieć destrukcyjne konsekwencje dla normalnej mobilności i jakości życia. Interwencja chirurgiczna jest często konieczna, ale może mieć ograniczony i zróżnicowany sukces4,5. Obecna wiedza na temat tego, jak ścięgna i więzadła rozwijają się, dojrzewają i reagują na urazy, jest niekompletna, dlatego potrzebne są skuteczne modele badawcze, które zapewnią wgląd w rozwój skuteczniejszych metod leczenia5. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, można wykorzystać modele zwierzęce, ale badania in vivo są z natury skomplikowane i mają trudności z kontrolowaniem środowiska i bezpośrednim ukierunkowaniem interwencji na zamierzoną tkankę. W przeciwieństwie do tego, środowisko eksperymentalne może być łatwo kontrolowane i monitorowane in vitro za pomocą tradycyjnej jednowarstwowej hodowli komórkowej. Jednak technika ta może nadmiernie uprościć środowisko chemiczne i mechaniczne, a tym samym może nie odzwierciedlać zachowania komórek in vivo. Inżynieria tkankowa jest w stanie połączyć zalety złożonego środowiska in vivo w modelach zwierzęcych z kontrolą środowiska in vitro i zapewnia dodatkowe narzędzie do badania fizjologii. Ponadto, dzięki lepszemu zrozumieniu rozwoju więzadeł, inżynieria tkankowa może również stanowić źródło przeszczepu tkanki, gdy wymagana jest rekonstrukcja chirurgiczna6. W ten sposób opisana tutaj metoda weryfikuje tkankę inżynieryjną 3D in vitro, którą można wykorzystać do badania funkcji więzadeł i morfologii.
Konstrukty ścięgien lub więzadeł oparte na fibrynie zostały użyte jako model in vitro do badania procesów fizjologicznych, w tym fibrylogenezy kolagenu7 i rozwoju ścięgien8, a także aplikacji translacyjnych, w których ich użyteczność jako tkanki do przeszczepu została oceniona w owczym modelu rekonstrukcji więzadła krzyżowego przedniego (ACL) u owiec9. Nasze laboratorium wcześniej stworzyło model więzadłowy 3D obejmujący dwa szczotkyty, materiał zastępujący kości fosforan wapnia, kotwy cementowe. Model ten można z łatwością poddać różnym warunkom eksperymentalnym, po prostu uzupełniając pożywkę biologiczną czynnikami biologicznymi10 lub stosując stymulację mechaniczną11. Co ważne, ten model więzadła kostno-kostnego pozwala na dogłębną analizę przyczepu ścięgnistego, czyli granicy faz między elementami kostnymi i ścięgnistymi, która jest podatna na urazy.
W badaniu wyróżnionym1 tutaj, aby przedstawić tę metodologię, byliśmy zainteresowani wpływem wywołanych ćwiczeniami zmian w środowisku biochemicznym na funkcję więzadeł. Ćwiczenia poprawiają funkcjonowanie komórek i narządów w różnych tkankach w całym ciele2,3,12, efekt, który można przypisać uwolnieniu różnych znanych (np. IL-613, IL-1514, Meteorin-like15, exosomes16,17) i inne nieznane, biochemiczne czynniki uwalniane do krążenia ogólnoustrojowego. Ponadto środowisko biochemiczne po wysiłku jest wzbogacone o hormony reagujące na wysiłek fizyczny, których uwalnianie jest stymulowane przez stymulację współczulnego układu nerwowego gruczołów wydzielniczych (np. kortyzol i katecholaminy z nadnerczy18, oraz hormon wzrostu z przedniego płata przysadki mózgowej19). Jednakin vivo niemożliwe jest odróżnienie skutków bodźca mechanicznego związanego z wysiłkiem fizycznym od zmian biochemicznych wywołanych wysiłkiem fizycznym. Podczas gdy niektóre badania charakteryzowały oczekiwany wzrost niektórych krążących hormonów i cytokin w odpowiedzi na ćwiczenia, jak wspomniano powyżej, istnieje zbyt wiele czynników, zarówno znanych, jak i nieznanych, aby wiernie podsumować in vitro. Oznacza to, że wyizolowanie kilku czynników w badaniu in vitro w niewystarczający sposób rozwiązuje problem złożoności odpowiedzi biochemicznej. W tym badaniu zbadaliśmy, w jaki sposób zmiany w środowisku biochemicznym surowicy, wywołane ćwiczeniami, wpływają na zmodyfikowaną funkcję więzadeł. Aby wyizolować skutki zmian biochemicznych, uzyskaliśmy surowicę od uczestników przed i po treningu oporowym i zastosowaliśmy ją do leczenia więzadeł 3D utworzonych przy użyciu ludzkich fibroblastów więzadła krzyżowego przedniego (ACL). Korzystając z tego modelu, możemy uzyskać dane funkcjonalne, w tym wpływ na właściwości mechaniczne i zawartość kolagenu, a także określić ilościowo wpływ na sygnalizację molekularną.

<table><tbody><tr><td>Austerlitz Szpilki do owadów, stal nierdzewna minutien, rozmiar 0,20</td><td>Entomoravia</td><td>N/A</td><td>Do kotew cementowych brushite</td></tr> <tr><td>i beta-fosforanu trójwapniowego</td><td>Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, Wielka Brytania)</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do kotew cementowych szczotkitowych</td></tr><tr><td>Kwas o-fosforowy, 85% (w/w)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX0995</td><td>Do kotew cementowych</td></tr><tr><td>brushite Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500g</td><td>Do kotew cementowych</td></tr><tr><td>szczotkowych Falcon 35 mm Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td>Do płyt pokrytych silikonem</td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>Do płyt pokrytych silikonem</td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>Do izolacji i ekspansji komórek</td></tr><tr><td>100x antybiotyk/ roztwór przeciwgrzybiczy</td><td>VWR</td><td>45000-616</td><td>Do izolacji komórek</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>Do izolacji komórek</td></tr><tr><td>100x roztwór penicyliny/streptomycyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Do izolacji komórek</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0,22&nbsp; &mikro; m pore, polieterosulfon, napromieniowany</td><td>promieniami gamma EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Do sterylizacji odczynnikami</td></tr><tr><td>DMEM wysoka glukoza z pirogronianem sodu i L-glutaminą</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>Do hodowli komórkowych i tkankowych</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Biosurowica</td><td>FBS2000</td><td>Składnik pożywki do trawienia tkanek i pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>Penicylina G Sól potasowa</td><td>MP Biomedicals</td><td>0219453680 - 100 MU</td><td>Składnik pożywki wzrostowej. Rozpuścić w wodzie do 100 000 U/ml, wysterylizować filtrem, porcjować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Polistyrenowe szalki do hodowli tkankowych CELLSTAR (145 mm x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>82050-598</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Do izolacji komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>Do hodowli komórkowych. Rozcieńczyć do 0,05% w PBS</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>Do pożywek do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Kriogeniczny pojemnik do zamrażania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Czerwony plastik 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>367820</td><td>Do zbierania surowicy</td></tr><tr><td>ludzkiej Cewniki Bound Tree Insyte Autoguard IV, igła</td> <td>22 G x 1 calFisher Scientific</td><td>354221</td><td>Do pobierania surowicy ludzkiej</td></tr><tr><td>Trombina, pochodzenia bydlęcego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648-1KU</td><td>Do inżynieryjnego tworzenia więzadeł. Rozpuścić w stężeniu 200 j./ml w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Filtruj przy 0,22 &mu; m, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Fibrynogen pochodzenia bydlęcego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>Do inżynieryjnego tworzenia więzadeł. Rozpuścić w stężeniu 20 mg/ml w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Filtruj przy 0,22 &mu; m, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Aprotynina z płuc bydlęcych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428</td><td>Do inżynieryjnego tworzenia więzadeł. Rozpuścić w stężeniu 10 mg/ml w wodzie. Filtruj przy 0,22 &mu; m, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kwas 6-aminoheksanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>07260-100g</td><td>Do tworzenia więzadeł inżynieryjnych. Rozpuścić w 0,1 g/ml w wodzie. Filtruj przy 0,22 &mu; m, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy, 2-fosforan sól seskwimagnezowa, hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td>Składnik pożywek paszowych. Rozpuścić w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy w stężeniu 50 mM. Filtruj przy 0,22 &mu; m i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Składnik pożywek paszowych. Rozpuścić w PBS w stężeniu 50 mM. Filtruj przy 0,22 &mu; m i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Transformujący czynnik wzrostu-&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>Składnik pożywek paszowych. Rozpuścić zgodnie z instrukcjami producenta w stężeniu 10 &mu; g/ml. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0,22&nbsp; &mikro; M, polieterosulfon, 250&nbsp; mL, sterylizowany radioaktywnie</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>Do sterylizacji odczynnikami</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Rozcieńczyć w wodzie do 6 M</td></tr><tr><td>4-Dimetyloaminobenzaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39070-50g</td><td>Do oznaczania hydroksyproliny</td></tr><tr><td>Trójwodny chloramina-T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402869-100g</td><td>Do oznaczania</td></tr> <tr><td>hydroksyprolinytrans-4-Hydroxy-L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H54409-100g</td><td>Do oznaczania hydroksyproliny</td></tr><tr><td>1-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>279544-1L</td><td>Do oznaczania hydroksyproliny</td></tr><tr><td>Kwas nadchlorowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421-250ml</td><td>Do oznaczania hydroksyproliny</td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0073-9</td><td>Do testu hydroksyproliny</td></tr><tr><td>Wodorotlenek</td> <td>soduFisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>Do oznaczania hydroksyproliny</td></tr><tr><td>Toluen, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-1L</td><td>Do oznaczania hydroksyproliny</td></tr><tr><td>Corning Costar Przezroczyste 96-dołkowe płytki z polistyrenu</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-656</td><td>Do testu hydroksyproliny</td></tr></tbody></table>

leczenie konstruktów więzadeł surowicą kondycjonowaną wysiłkowo: translacyjny model inżynierii tkankowej

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Eksperymenty in vitro są niezbędne do zrozumienia mechanizmów biologicznych; jednak różnica między jednowarstwową hodowlą tkanek a fizjologią człowieka jest duża, a tłumaczenie wyników jest często słabe. W związku z tym istnieje wiele możliwości dla alternatywnych podejść eksperymentalnych. Tutaj przedstawiamy podejście, w którym ludzkie komórki są izolowane z resztek tkanki ludzkiego więzadła krzyżowego przedniego, namnażane w hodowli i wykorzystywane do tworzenia zmodyfikowanych więzadeł. Ćwiczenia zmieniają środowisko biochemiczne we krwi w taki sposób, że poprawia się funkcjonowanie wielu tkanek, narządów i procesów zachodzących w organizmie. W tym eksperymencie pożywki hodowlane konstruujące więzadła zostały uzupełnione eksperymentalną ludzką surowicą, która została "uwarunkowana" przez ćwiczenia. W związku z tym interwencja jest bardziej istotna z biologicznego punktu widzenia, ponieważ tkanka doświadczalna jest wystawiona na działanie pełnego endogennego środowiska biochemicznego, w tym białek wiążących i związków pomocniczych, które mogą być zmieniane w tandemie z aktywnością nieznanego czynnika będącego przedmiotem zainteresowania. Po leczeniu zmodyfikowane więzadła można przeanalizować pod kątem funkcji mechanicznych, zawartości kolagenu, morfologii i biochemii komórkowej. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją cztery główne zalety przedstawionego tutaj modelu fizjologicznego tkanki więzadłowej w porównaniu z tradycyjną hodowlą jednowarstwową i modelami zwierzęcymi. Po pierwsze, konstrukcje więzadłowe są trójwymiarowe, co pozwala na ilościowe określenie właściwości mechanicznych (tj. funkcji), takich jak końcowe naprężenie rozciągające, maksymalne obciążenie rozciągające i moduł. Po drugie, przyczep ścięgnisty, czyli interfejs między elementami kostnymi i ścięgnistami, może być badany szczegółowo i w kontekście funkcjonalnym. Po trzecie, przygotowanie pożywki z surowicą powysiłkową pozwala na bezstronne zbadanie wpływu środowiska biochemicznego wywołanego wysiłkiem fizycznym, które jest odpowiedzialne za szeroki zakres korzyści zdrowotnych płynących z ćwiczeń. Wreszcie, ten eksperymentalny model naprzód badania naukowe w sposób humanitarny i etyczny, zastępując wykorzystywanie zwierząt, co jest podstawowym mandatem National Institutes of Health, Center for Disease Control oraz Food and Drug Administration.

Prezentujemy model tkanki więzadła, w którym trójwymiarowe konstrukty są traktowane ludzką surowicą kondycjonowaną wysilaniem i analizowane pod kątem zawartości kolagenu, funkcji i biochemii komórkowej.

Leczenie konstruktów więzadeł surowicą kondycjonowaną wysiłkowo: translacyjny model inżynierii tkankowej

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Ogólnym celem tego modelu jest określenie wpływu ćwiczeń fizycznych i odżywiania na syntezę i funkcję tkanki łącznej. Technika ta wykorzystuje surowicę ludzką pobraną przed i po wysiłku fizycznym do traktowania tkanek 3D, co pozwala zrozumieć, w jaki sposób ćwiczenia wpływają na funkcję więzadeł i ścięgien. Zastosowanie tkanek 3D łączy zalety dobrze scharakteryzowanych testów in vitro z funkcją, morfologią i charakterystyką biochemiczną tkanek in vivo.Po wcześniejszym przygotowaniu płytek 35-milimetrowych powlekanych silikonem zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować formy kotwiczące, umieszczając jeden pin minutien w centrum każdej cylindrycznej studzienki w formach. Połączyć beta-fosforan trójwapniowy i roztwór kwasu ortofosforowo-cytrynowego w stężeniu od 1 do 3 g/ml w plastikowej łódzce wagowej na lodzie. Użyć plastikowego skrobaka do komórek, aby energicznie wymieszać cement.Utrzeć cement, aby kontynuować mieszanie, a następnie nanieść mieszaninę pipetą do form i odwirować wypełnioną formę z prędkością 2 250 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu pozostawić kotwice z cementu brushitowego do stwardnienia w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego dnia rano wyjąć kotwice z formy i przymocować dwie kotwice w odstępach 12 mm w każdej płytce powlekanej silikonem.Zdezynfekuj przypięte płytki, spryskując je 70% etanolem tak, aby wypełnić zarówno płytki, jak i ich pokrywki, a następnie umieść płytki w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Po upływie co najmniej 30 minut odessij ciecz z płytek i pozostaw je do wyschnięcia w BSC. Załóż pokrywki i przechowuj płytki w BSC do momentu ich użycia.Należy przestrzegać lokalnych przepisów dotyczących zagrożeń biologicznych w zakresie prawidłowego użytkowania i utylizacji materiałów biologicznie niebezpiecznych. Należy zachować jałowość i przeprowadzać etapy formowania konstruktu w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Po przygotowaniu pierwotnych fibroblastów, odczynników oraz płytek powlekanych silikonem z osadzonymi kotwicami z brushitu, zgodnie z protokołem tekstowym, należy hodować komórki na płytkach 15 cm aż do osiągnięcia 70% konfluencji.Następnie przygotować mieszaninę główną (master mix) składającą się z następujących składników: 681 µL zawiesiny komórkowej na konstrukt, 29 µL trombiny na konstrukt, 2 µL aprotininy na konstrukt oraz 2 µL kwasu aminonoksanoowego na konstrukt. Po dokładnym wymieszaniu roztworu, dodać 714 µL do każdej płytki z pinami, nakładając mieszaninę w kształcie ósemki wokół kotwic z cementu brushytowego, tak aby master mix bezpośrednio stykał się z bokami kotwic. Delikatnie postukać każdą płytkę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę.Najbardziej krytycznym krokiem jest utworzenie żelu fibrynowego z osadzonymi komórkami. Należy upewnić się, że mieszanina główna do osadzania komórek ma bezpośredni kontakt z kotwicami, a następnie lekko opukać płytkę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę. Do każdej płytki, po jednej, należy dodawać po 286 µL fibrynogenu, nakraplając go równomiernie na całą powierzchnię płytki.Natychmiast przesuń płytkę w przód i w tył oraz na boki, aby rozprowadzić fibrynogen i utworzyć żele fibrynowe z zatopionymi komórkami, a następnie przejdź do następnej płytki. Umieść konstrukty w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide, a następnie inkubuj je przez co najmniej 15 minut, aby umożliwić polimeryzację fibrynogenu. Przygotuj 2 mL na każdy konstrukt pożywki do karmienia, uzupełniając pożywkę wzrostową o 200 µM kwasu askorbinowego, 50 µM Prolene oraz 5 ng/mL TGF beta 1.Użyj dwóch mililitrów pożywki do pokrycia każdego konstruktu, a następnie inkubuj konstrukty w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez łącznie 14 dni lub do osiągnięcia pożądanego punktu końcowego, odnawiając pożywkę co drugi dzień poprzez dodanie dwóch mililitrów pożywki. Aby pobrać ludzką surowicę, pobierz próbkę krwi w spoczynku zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie poproś uczestników o wykonanie rodzaju ćwiczeń odpowiadającego Twojemu celowi badawczemu. Przedstawiono tutaj 30-minutową serię wysokointensywnych ćwiczeń oporowych.Pobrać próbkę krwi 15 minut po sesji ćwiczeń, a następnie, po dopuszczeniu do skrzepnięcia krwi, wirować próbkę z prędkością 1 500 ×g przez 10 minut. W warunkach sterylnych przenieść surowicę do sterylnych probówek w celu przygotowania pożywek. Po przygotowaniu konstruktów więzadłowych przeprowadzić badanie rozciągania przy użyciu maszyny do prób rozciągania w kąpieli z PBS, stosując uchwyty z odwróconym kształtem, które są sprzężone z przetwornikiem siły.Służy to do unieruchomienia kotwic z cementu brushytowego podczas testu. Za pomocą suwmiarki cyfrowej zmierz długość i szerokość konstruktów więzadła, a następnie oblicz pole przekroju poprzecznego tkanki. Odepnij konstrukt więzadła od płytki i umieść kotwice w uchwytach formowanych odwrotnie, upewniając się, że konstrukt jest zanurzony w PBS, a następnie dostosuj odległość między uchwytami, ustawiając długość konstruktu na jego długość początkową.Rozpocznij test i poddawaj konstrukt rozciąganiu do momentu zerwania z prędkością odkształcenia 0,4 millimeters per second, czyli 3%per second. Po zakończeniu testu opracuj tkankę i przeprowadź ilościowe oznaczenie kolagenu w wyhodowanych więzadłach zgodnie z protokołem tekstowym. Po jednym lub dwóch dniach hodowli fibroblasty ACL przyczepiły się do żelu fibrynowego, wytworzyły wypustki komórkowe i zaczęły wywierać siły trakcyjne.Między dwoma punktami zakotwiczenia wytwarzane jest naprężenie, w wyniku czego komórki ustawiają się równolegle do tej osi i zaczynają odkładać kolagen. Przedstawiono tutaj reprezentatywny wykres naprężenie-odkształcenie dla więzadła poddanego badaniu do momentu zerwania. W tych eksperymentach ludzkie serum izolowano z próbek krwi pobranych przed i po wysiłku fizycznym i stosowano zamiast FBS w celu przygotowania pośrodka wzbogaconego o biochemiczne środowisko indukowane wysiłkiem.Jak pokazano na tym wykresie, po 14-dniowym okresie hodowli konstrukty więzadłowe wykazały znaczący wzrost zarówno maksymalnego obciążenia rozciągającego, jak i zawartości kolagenu w odpowiedzi na surowicę po wysiłku fizycznym. Po opanowaniu metody konstrukty więzadłowe mogą być przygotowane w ciągu dwóch dni i będą gotowe do testów rozciągania, ilościowego oznaczania zawartości kolagenu oraz innych analiz biochemicznych w ciągu dwóch tygodni. Ten translacyjny model in vitro i in vivo jest częścią szerszej misji mającej na celu zrozumienie, w jaki sposób wysiłek fizyczny poprawia funkcję więzadeł, ścięgien i w rzeczywistości niemal każdej tkanki w organizmie.Jest to niezwykle solidna i skuteczna metoda, która pozwala nam określić zawartość kolagenu oraz funkcję tkanki łącznej po zastosowaniu ćwiczeń, żywienia, obciążeń, różnych czynników wzrostu oraz wszelkich innych rodzajów interwencji, jakie możemy przeprowadzić u ludzi lub zwierząt.

treatment-ligament-constructs-with-exercise-conditioned-serum

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Do przyszłych zastosowań jako łatka do naprawy częściowych zerwań więzadła krzyżowego przedniego (ACL), ludzkie komórki pochodzące z ACL zostały wyizolowane z tkanki uzyskanej podczas procedur rekonstrukcyjnych, namnażone in vitro i wyhodowane na rusztowaniach inżynierii tkankowej. Następnie przeprowadzono adhezję komórkową i morfologię, aby potwierdzić biokompatybilność na powierzchni rusztowania.

Chirurgiczne pobieranie, izolacja i ekspansja in vitro ludzkich komórek pochodzących z więzadła krzyżowego przedniego do zastosowań w inżynierii tkankowej

Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami do oceny przeszczepów wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej. W pracy przedstawiono protokół przygotowania elektroprzędzonego biodegradowalnego przeszczepu polimerowego do zastosowania w inżynierii tkankowej więzadła krzyżowego przedniego, a także protokół chirurgiczny implantacji w modelu szczurzym.

Atymiczny model szczura do oceny zmodyfikowanych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

W tym artykule prezentujemy protokół in vitro i in situ do naprawy szczeliny ścięgna do 1,5 cm poprzez wypełnienie jej zmodyfikowanym przeszczepem kolagenu. Osiągnięto to poprzez opracowanie zmodyfikowanej techniki szwów, która przejmie obciążenie mechaniczne do momentu, gdy przeszczep dojrzeje do tkanki gospodarza.

Nowatorska technika szwów tenorrhaphy z przeszczepem kolagenu modyfikowanym tkankowo w celu naprawy dużych ubytków ścięgien

Trójwymiarowy jednoosiowy system bioreaktora do stymulacji mechanicznej jest idealnym bioreaktorem do specyficznego dla tenogenicznego różnicowania komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien i tworzenia neościęgien.

Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien

Tutaj prezentujemy system modeli assembloid, który naśladuje przesłuch komórkowy ścięgien między tkanką rdzenia ścięgna nośnego a zewnętrznym przedziałem zawierającym populacje komórek aktywowane przez chorobę i uraz. Jako ważny przypadek użycia pokazujemy, w jaki sposób system może zostać wykorzystany do badania istotnej z chorobą aktywacji zewnętrznych komórek śródbłonka.

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Tutaj demonstrujemy trzyetapowy model organoidów (dwuwymiarowa ekspansja [2D], stymulacja 2D, trójwymiarowe dojrzewanie [3D]), oferujący obiecujące narzędzie do podstawowych badań nad ścięgnami i potencjalną metodę inżynierii tkanek ścięgien bez rusztowań.

Demonstracja samoorganizującej się hodowli arkuszy komórkowych i ręcznego generowania organoidu 3D przypominającego ścięgno/więzadło przy użyciu ludzkich fibroblastów skórnych

Przedstawiamy tutaj zintegrowany protokół generowania kontrolowanych zmian kostnych-chondralnych u kolan owiec, aby ustanowić eksperymentalny model odpowiedni do badań regeneracji tkanek kości i chrząstki. Protokół określa metodę wywołania pełnogrubego ubytku kości kostnodzielnej w kłykciu udowym, wykorzystując techniki minimalizujące wpływ na dobrostan zwierząt oraz zmienność wyników.

Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

Poznaj metodę leczenia konstruktów więzadeł surowicą kondycjonowaną wysiłkowo w celu analizy zawartości kolagenu i właściwości mechanicznych. Model ten pozwala badać wpływ ćwiczeń na syntezę tkanki łącznej.

Leczenie konstruktów więzadeł surowicą kondycjonowaną wysiłkowo: translacyjny model inżynierii tkankowej

Przeglądaj więcej filmów