Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych
May 5th, 2017
Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).
Ogólnym celem tego protokołu jest umożliwienie naukowcom wychwytywania, oddzielania i analizowania natywnych kompleksów białkowych ekstrahowanych z lizatów tkankowych za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Metoda ta może pomóc naukowcom, którzy badają białka, ponieważ jest w stanie ustabilizować labilne asocjacje białek w warunkach zbliżonych do natywnych, umożliwiając ich identyfikację i późniejszą analizę. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona powszechne metody biologiczne, dzięki czemu ma szerokie zastosowanie i może być dostosowana do celów indywidualnego badacza.
Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować się do elektroforezy w postaci niebieskiego natywnego żelu poliakrylamidowego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Podłącz elektrody do źródła zasilania i poddaj elektroforezie białka w żelu pod napięciem 150 woltów, aż pasmo barwnika wsunie się na około dwa centymetry w warstwę rozdzielczą. W tym momencie zatrzymaj się i odłącz zasilanie.
Po zdemontowaniu aparatu do elektroforezy należy oddzielić tafle szkła kasety żelowej. Usuń i wyrzuć warstwę układania. Ostrożnie odetnij żel tuż pod dolną krawędzią frontu barwnika, uważając, aby to cięcie było jak najbardziej gładkie i proste.
Następnie wyrzuć niewykorzystany kawałek żelu. Odetnij wszelkie niewykorzystane części wzdłuż krawędzi paska żelu. Ostrożnie umieść pasek w 10 mililitrach soli fizjologicznej buforowanej fosofanu w małym pojemniku i delikatnie mieszaj przez notację przez 30 minut, aby zrównoważyć.
Po zrównoważeniu wyrzuć i zastąp PBS kolejnymi 10 mililitrami. Odpipetować 500 mikrolitrów 25-milimolowego DSP rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku do PBS i kontynuować mieszanie jak poprzednio przez 30 minut. Po 30 minutach odlej roztwór DSP.
Przy 10 mililitrach 0,375 mola HSCL, pH 8,8, zawierający 2% dodecylosiarczan sodu do wygaszenia nieprzereagowanego DSP. Kontynuuj zapis przez 15 minut. Podczas hartowania paska żelu przygotuj roztwory żelu SDS-PAGE zgodnie ze standardowymi metodami.
Nie dodawać odczynników do polimeryzacji. Po schłodzeniu przywróć niebieski natywny pasek żelowy do temperatury pokojowej i wlej pasek do nowej kasety żelowej. Aby to zrobić, ostrożnie podnieś żel i umieść go na czystej płytce dystansowej kasety żelowej.
Ustaw pasek tak, aby był odwrócony z poprzedniej orientacji, a dolna część przodu barwnika znajdowała się najbliżej górnej części nowej kasety. Umieść pasek tak, aby jego górna krawędź leżała równo z miejscem, w którym będzie znajdować się górna krawędź pokrywy. Upewnij się, że przód barwnika jest równoległy do poziomych krawędzi szklanej płytki.
Dociśnij jedną stronę wyciętego paska do jednej ze ścianek dystansowych, pozostawiając miejsce po drugiej stronie na wylanie żelu i załadowanie wzorca białkowego lub drabinki. Jeśli dolna krawędź paska żelowego zawiera jakiekolwiek postrzępione lub nierówne obszary, ostrożnie je odetnij. Po prawidłowym umieszczeniu paska żelowego połóż płytkę osłonową na płycie dystansowej.
Delikatnie dociśnij, aby wypchnąć uwięzione pęcherzyki powietrza. Kontynuuj montaż urządzenia do nalewania żelu zgodnie z instrukcjami producenta. Pasek żelu czasami przesuwa się podczas umieszczania górnej płyty.
Pomocne jest, aby pasek zwisał nieco z krawędzi górnej płyty, aby można go było wyregulować szpatułką, aby skorygować wszelkie przesunięcia. Dodać odczynniki polimeryzacyjne do rozdzielczego buforu żelowego i wlać go do przygotowanej kasety żelowej za pomocą pipety serologicznej. Napełnij kasetę z żelem do około dwóch centymetrów poniżej wyciętego niebieskiego natywnego paska żelu PAGE, aby pozostawić miejsce na warstwę układania.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów butanolu na wierzch nalanego żelu i odczekaj 30 minut na polimeryzację warstwy rozdzielczej przed wylaniem butanolu. Następnie dodaj odczynniki do polimeryzacji do roztworu żelu do układania w stosy. Za pomocą pipety serologicznej wlej warstwę stosu, aby wypełnić całą pozostałą pustą przestrzeń w kasecie z żelem.
Przechyl kasetę z żelem podczas wylewania warstwy układania w stos, aby wypełniła przestrzeń pod paskiem żelu i nie uwięziły pęcherzyków powietrza. Gdy bufor żelu do układania w stos wypełni pustą przestrzeń pod paskiem żelu, stopniowo przywróć kasetę z żelem do poziomej podstawy. Kontynuuj wypełnianie pustej przestrzeni obok wyciętego paska żelu buforem żelu do układania w stos, aż prawie się przeleje.
Następnie pozwól warstwie układania się polimeryzować przez 30 minut. Po polimeryzacji warstwy układającej należy wyjąć kasetę z żelem z aparatu do nalewania, przepłukać ją wodą destylowaną i zmontować aparat do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta. Całkowicie napełnij komorę wewnętrzną buforem do biegania 1x SDS-PAGE.
Następnie napełnij komorę zewnętrzną do poziomu wskazanego przez producenta. Załaduj przestrzeń obok wyciętego paska żelu za pomocą drabinki o masie cząsteczkowej lub odpowiedniego wzorca białka. Podłącz elektrody do zasilania i poddaj próbki elektroforezie pod napięciem 120 woltów.
Gdy barwnik Coomassie spłynie z żelu, przerwij bieg i odłącz zasilanie. Analizuj żel przy użyciu standardowych metod elektroblottingu i wykrywania białek na bazie przeciwciał. Walidacja multimer-PAGE jest pokazana tutaj za pomocą immunoblot.
Wychwycony kompleks kinezyny jest rozszczepiany przez difio-3-itol, co pokazuje, że agregaty o dużej masie cząsteczkowej są tworzone przez sieciowanie mniejszych podstawników. Przedstawione tutaj lizaty mózgu traktowane rosnącymi stężeniami SDS lub Triton zwiększały wykrywalność monomerycznej alfa-synukleiny, jednocześnie zmniejszając wykrywalność rozpuszczalnego tetromeru oligomerowego. W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne wyniki multimeru-PAGE stosowanego do wychwytywania rozpuszczalnych kompleksów w lizacie mózgu szczura.
Białka wykryto za pomocą immunoblot. Oczekiwana masa monomeryczna każdego białka jest pokazana poniżej pasów. Podobnie pokazano tutaj wychwytywanie kompleksów związanych z błoną.
Multimer-PAGE czasami nie udaje się uchwycić kompleksu, jak pokazano na dwóch plamach kompleksu oddechowego SDHA. Dyskusję na temat możliwych wyjaśnień tego zjawiska można znaleźć w protokole tekstowym. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około osiem godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić sieciowanie natywnych kompleksów białkowych w żelu, a następnie ponowne odlewanie żelu i separację za pomocą wtórnej SDS-PAGE. Nie zapominaj, że praca z akrylamidem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas odlewania żelu należy nosić środki ochrony osobistej. Po tej procedurze wydzielone ustabilizowane kompleksy mogą być eluowane lub wycinane z żelu i mogą być analizowane na wiele sposobów, w tym za pomocą immunodetekcji lub spektrometrii mas w zależności od potrzeb badacza.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia metodę stabilizacji i separacji rodzimych kompleksów białkowych z lizatów tkankowych z wykorzystaniem nowej, dwuwymiarowej elektroforezy poliakrylamidowej (PAGE). Umożliwia analizę interakcji białkowych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Biochemia
- Proteomika
- Elektroforeza
Tło
- Zrozumienie kompleksów białkowych jest kluczowe dla wielu badań biologicznych.
- Rodzime interakcje białkowe mogą być niestabilne i trudne do analizy.
- Powszechne metody biologiczne ułatwiają zastosowanie tej techniki.
- Ta metoda umożliwia dostosowanie podejścia do analizy białek.
Cel Badania
- Uchwycenie i analiza rodzimych kompleksów białkowych z lizatów tkankowych.
- Stabilizacja interakcji białkowych w celu lepszej identyfikacji.
- Zapewnienie szeroko dostępnej metody dla badaczy.
Metody Użyte
- Przygotowanie do blue native polyacrylamide gel electrophoresis.
- Elektroforeza białek przy 150 woltach.
- Monitorowanie postępu pasma barwnika w żelu.
- Wykorzystanie aminoreaktywnego usieczniacza białek.
Główne Wyniki
- Pomyślna stabilizacja rodzimych kompleksów białkowych.
- Skuteczna separacja białek w lizatach tkankowych.
- Identyfikacja interakcji białkowych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.
Wnioski
- Ta metoda wzmacnia analizę kompleksów białkowych.
- Można ją dostosować do różnych celów badawczych.
- Wykorzystanie powszechnych metod zwiększa dostępność dla badaczy.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Multimer-PAGE enables biopharma R&D teams to stabilize and resolve native protein complexes from tissue lysates under near-native conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By preserving labile protein associations that are often lost in conventional purification, the method improves predictive confidence in pathway analysis and complex-based drug target identification. This approach enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation by providing reproducible, quantitative readouts of complex formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing native protein interactions without perturbing non-covalent bindings.
- Operational Value: Uses accessible blue-native and SDS-PAGE techniques familiar to most molecular biology teams, reducing specialized training needs.
- Predictive Value: Supports functional target validation by stabilizing complexes for downstream identification via immunoblot or mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates resolved complex profiles that can serve as quantitative biomarkers for assay standardization across screening campaigns.
- Operational Value: Relies on inexpensive, widely available reagents and equipment, enabling scalable implementation in core facilities.
- Assay Readiness: Produces SDS-PAGE-separated complexes compatible with downstream detection methods like immunodetection, supporting high-content screening integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving complex integrity for validation in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of complex formation under varying conditions (e.g., detergent or SDS exposure), informing target robustness.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on complex stability and abundance, reducing late-stage attrition due to mechanistic uncertainty.
Pipeline & Workflow Integration
Multimer-PAGE fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing a mechanistic bridge to preclinical validation by enabling analysis of native protein complexes in tissue-derived samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing endogenous complexes from unmodified tissue lysates.
- Screening: Enables assay development through reproducible complex separation and detection, facilitating compound effect evaluation on target engagement.
- Analytics: Delivers quantitative separation of protein complexes via secondary SDS-PAGE, allowing comparison of conditions or treatments.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining complex stability for validation in disease models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability rather than a single-use assay, adaptable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction networks.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized gel-based workflows and familiar electrophoresis techniques.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, minimizing investment in poorly validated mechanisms.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of complex formation and stability in native contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE and SDS-PAGE techniques, including gel casting and electrophoretic separation.
- Depends on access to electrophoresis apparatus, power supplies, and standard reagents such as DSP crosslinker and SDS.
- Necessitates cross-team standardization for consistent complex capture and detection across discovery and preclinical groups.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and complex sizes, as separation efficiency may vary with molecular weight.
- Limited by challenges in resolving extremely large complexes and potential variability in crosslinking efficiency, as noted in source material.
