Name: Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metodę Multimer-PAGE do wychwytywania i rozdzielania natywnych kompleksów białkowych z lizatów tkankowych. Technika stabilizuje nietrwałe asocjacje białkowe w warunkach zbliżonych do natywnych, umożliwiając ich analizę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obsługiwane przez NIH/NIDA DA034783. Dziękujemy Bryanowi A. Killingerowi za pomoc techniczną przy tworzeniu multimer-PAGE.

1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml 4x BN-PAGE bufor do próbek (200 mM Bis(2-hydroksyetylo)amino-tris(hydroksymetylo)metanu (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w/v glicerolu, 0,004% Pąs, pH 7,2). 
	UWAGA: Ten roztwór podstawowy może być przygotowany wcześniej i przechowywany w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć 250 μl 4x buforu próbki w 750 μL dH2O zawierającym 1x komercyjny koktajl inhibitorów proteazy. Wiruj i schładzaj na lodzie.</li>
	<li>Homogenizować 20 mg tkanki docelowej w 1 ml 1x lodowato zimny bufor do próbek BN-PAGE za pomocą 30 pociągnięć czystego homogenizatora z dounce. 
	UWAGA: W tym eksperymencie demonstracyjnym tkanką docelową jest cała tkanka mózgowa szczura. Po homogenizacji próbki można poddać działaniu łagodnego detergentu, takiego jak 2% digitonina, w celu rozpuszczenia i umożliwienia elektroforezy białek błonowych.</li>
	<li>Przenieś homogenat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 14 000 x g przez 30 minut, aby uzyskać nierozpuszczalną zawartość komórkową. Po odwirowaniu zdekantować supernatant do czystej probówki na lodzie.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby zmierzyć stężenie białka sklarowanego nad osadem za pomocą kwasu bicinchoninowego (BCA) lub podobnego testu ilościowego białka.</li>
	<li>Jeśli próbka homogenatu zawiera detergent, dodać 5% Coomassie Blue G-250 do roztworu wodnego wystarczającą do doprowadzenia roztworu homogenatu do 0,25% Coomassie.</li>
</ol>
2. BN-PAGE
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 25 ml 20x niebieski natywny (BN) bufor do elektroforezy (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricine, pH 6,8) w 475 ml dH2O zawierającym 0,002% Coomassie Blue, aby uzyskać 500 ml 1x działającego buforu.
	<ol>
		<li>Jeśli próbki zawierają detergent, zamiast tego przygotuj 250 ml 1x buforu biegowego zawierającego 0,02% Coomassie i kolejne 250 ml nie zawierającego żadnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schłodzić bufor(-y) do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Wyczyść i zmontuj kasetę do nalewania żelu poliakryloamidowego zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wlać żel poliakrylamidowy BN (3% warstwy układającej T, warstwa rozdzielcza 6% T) zgodnie ze standardową recepturą7, i umieścić grzebień studzienki.</li>
	<li>Po polimeryzacji żeli przepłukać kasetędH2Oi zmontować aparat do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wyjmij grzebień studzienki i napełnij studzienki buforem roboczym 1x BN-PAGE. Unikaj napełniania całej komory wewnętrznej buforem do czasu załadowania próbek.
	<ol>
		<li>Jeśli próbki zawierają detergent, napełnij studzienki buforem zawierającym 0,02% Coomassie Blue. 
		UWAGA: Wykonaj kroki 2.7-2.9 w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą końcówek do ładowania żelem odpipetować objętość homogenatu zawierającego 20 μg białka do żądanych studzienek. Odpipetować równoważną objętość 1x bufor próbki BN-PAGE do wszystkich nieużywanych studzienek. 
	UWAGA: Użyj stężenia białka określonego na podstawie testu BCA, aby obliczyć odpowiednią objętość homogenatu do dodania do studzienek.</li>
	<li>Po załadowaniu próbek napełnij komorę wewnętrzną buforem roboczym 1x BN-PAGE. Upewnij się, że żel jest całkowicie zanurzony w buforze. Następnie należy napełnić komorę zewnętrzną buforem roboczym 1x do poziomu wskazanego przez producenta.
	<ol>
		<li>Jeśli próbki zawierają detergent, napełnij komorę wewnętrzną 1x buforem zawierającym 0,02% Coomassie Blue, a komorę zewnętrzną 1x bezbarwnym buforem do biegania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz elektrody do zasilania i elektroforezuj białka w żelu pod napięciem 150 V, aż pasmo barwnika przejdzie ~2 cm do warstwy rozdzielczej. Zatrzymaj i odłącz zasilanie.</li>
</ol>
3. Sieciowanie krzyżowe
UWAGA: Wykonaj kroki 3.1-3.6 w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Zdemontuj aparat do elektroforezy i oddziel tafle szkła kasety żelowej. Usuń i wyrzuć warstwę układania.</li>
	<li>Ostrożnie przetnij żel tuż pod dolną krawędzią frontu barwnika. Uważaj, aby to cięcie było tak gładkie i proste, jak to tylko możliwe, a następnie wyrzuć niewykorzystany kawałek żelu. Spowoduje to pozostawienie poziomego paska żelu poliakrylowomidowego o szerokości ~2 cm, który będzie zawierał całe białko w jednorodnej próbce.</li>
	<li>Odetnij wszelkie niewykorzystane części wzdłuż krawędzi paska żelu.</li>
	<li>Ostrożnie umieść pasek w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w małym pojemniku i delikatnie mieszaj przez nutację przez 30 minut, aby zrównoważyć.</li>
	<li>Po zrównoważeniu wyrzuć i zastąp PBS innymi 10 ml. Odpipetować 500 μl 25 mM DSP rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku do PBS i kontynuować mieszanie jak powyżej (krok 3.4) przez 30 minut.</li>
	<li>Odlej roztwór DSP. Dodać 10 ml 0,375 M chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl) o pH 8,8, zawierającego 2% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w celu wygaszenia nieprzereagowanego DSP. Kontynuuj nutację przez 15 minut.</li>
</ol>
4. STRONA SDS
<ol>
	<li>Podczas hartowania paska żelu przygotuj roztwory żelu SDS-PAGE zgodnie ze standardowymi metodami9. Nie dodawać odczynników do polimeryzacji.</li>
	<li>Po schłodzeniu przywróć pasek żelu ΒΝ do temperatury pokojowej i wlej pasek do nowej kasety żelowej.
	<ol>
		<li>Aby to zrobić, ostrożnie podnieś żel i umieść go na czystej płytce dystansowej kasety żelowej.</li>
		<li>Ustaw pasek tak, aby dolna część przodu barwnika znajdowała się jak najbliżej górnej części nowej kasety (tj. strona, która przesunęła się najdalej podczas BN-PAGE, powinna znajdować się najbliżej górnej części nowej kasety; pasek żelu powinien zostać odwrócony z poprzedniej orientacji). Zobacz rysunek 3.</li>
		<li>Umieść pasek w taki sposób, aby jego górna krawędź leżała równo z miejscem, w którym będzie znajdować się górna krawędź płytki osłonowej (tj. będzie znajdować się na górze nowego żelu). Upewnij się, że przód barwnika jest równoległy do poziomych krawędzi szklanej płytki.</li>
		<li>Dociśnij jedną stronę wyciętego paska do jednej ze ścianek dystansowych, pozostawiając miejsce po drugiej stronie na wylanie żelu i załadowanie wzorca białkowego lub drabiny.</li>
		<li>Jeśli dolna krawędź paska żelowego zawiera jakiekolwiek postrzępione lub nierówne obszary, ostrożnie je odetnij. Jeśli są obecne, będą zatrzymywać pęcherzyki podczas nalewania żelu.</li>
		<li>Po prawidłowym umieszczeniu paska żelowego połóż płytkę osłonową na płycie dystansowej. Delikatnie dociśnij, aby wypchnąć uwięzione pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Kontynuuj montaż urządzenia do nalewania żelu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać odczynniki polimeryzacyjne do rozdzielczego buforu żelowego i wlać go do przygotowanej kasety żelowej za pomocą pipety serologicznej. Napełnij kasetę z żelem do ~2 cm poniżej wyciętego paska żelu BN-PAGE, aby pozostawić miejsce na warstwę do układania.</li>
	<li>Dodaj 100 μl butanolu na wierzch wlanego żelu i odczekaj 30 minut na polimeryzację warstwy rozdzielczej. Odlej butanol.</li>
	<li>Dodać odczynniki polimeryzacyjne do roztworu żelu do układania. Za pomocą pipety serologicznej wlej warstwę stosu, aby wypełnić całą pozostałą pustą przestrzeń w kasecie z żelem.
	<ol>
		<li>Przechyl kasetę z żelem podczas wylewania warstwy układania w stos, tak aby wypełniła przestrzeń pod paskiem żelu, a pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione.</li>
		<li>Gdy bufor żelu do układania w stos wypełni pustą przestrzeń pod paskiem żelu, stopniowo przywróć kasetę z żelem do poziomej podstawy.</li>
		<li>Kontynuuj wypełnianie pustej przestrzeni obok wyciętego paska żelu buforem żelu do układania w stos, aż prawie się przeleje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostawić warstwę układającą do polimeryzacji przez 30 min. 
	UWAGA: Wykonaj 10x bufor do pracy SDS-PAGE (250 mM tris(hydroksymetylo)aminometan (tris), 1,9 M glicyny, 1% SDS) podczas polimeryzacji żelu. Można to również zrobić wcześniej i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć 50 ml buforu do biegania 10X SDS-PAGE w 450 ml dH2O, aby uzyskać 1x bufor roboczy.</li>
	<li>Po polimeryzacji warstwy układającej należy wyjąć kasetę z żelem z aparatu do nalewania, spłukaćdH2Oi zmontować aparat do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Napełnij całkowicie komorę wewnętrzną buforem biegowym 1x SDS-PAGE, a następnie napełnij komorę zewnętrzną do poziomu wskazanego przez producenta.</li>
	<li>Załaduj przestrzeń obok wyciętego paska żelu drabinką o masie cząsteczkowej lub odpowiednim wzorcem białka.</li>
	<li>Podłącz elektrody do zasilacza i poddaj próbki elektroforezie pod napięciem 120 V. Gdy barwnik Coomassie spłynie z żelu, zatrzymaj się i odłącz zasilanie.</li>
	<li>Przeanalizuj żel przy użyciu standardowych metod elektroblottingu i wykrywania białek za pomocą wiązania przeciwciał10.</li>
</ol>

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+as+a+collection+of+protein+machines%3A+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li>
<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).</li>
<li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+methods+for+detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).</li>
<li>Ho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry.</a> Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Beisiegel, U. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.1150070102/abstract">Protein Blotting.</a> Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).</li>
<li>Killinger, B. A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+alpha-Synuclein+Multimer+Stoichiometry+in+Complex+Biological+Samples+by+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis.</a> Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).</li>
<li>Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein.</a> PLoS One. 8 (11), e81314(2013).</li>
<li>Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWong%2C+SS+%22Chemistry+of+protein+conjugation+and+cross-linking%22">Chemistry of protein conjugation and cross-linking</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+proteins+in+detergent+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane proteins in detergent solutions.</a> Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).</li>
<li>Peters, K., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking%3A+reagents+and+problems+in+studies+of+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure.</a> Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).</li>
<li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+of+extended+biological+structures%3A+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+%5B35S%5Ddithiobis%28succinimidyl+propionate%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate).</a> J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).</li>
<li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mitochondrial+respiratory+membrane+protein+complex+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II.</a> Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Interakcje białko-białko są ważne dla każdego zadania wykonywanego przez żywe organizmy. Z tego powodu są one przedmiotem intensywnych analiz i badań. Multimer-PAGE to nowatorska metoda wychwytywania, rozdzielania i analizowania szerokiej gamy kompleksów białkowych. Wcześniej wykazaliśmy jego przydatność do badania oligimeryzacji białka związanego z chorobą α-synukleiny11. Jest jednak rozszerzalny na wiele kompleksów białkowych, jak pokazano na rysunku 2. W porównaniu z innymi met...

Normalna funkcja komórkowa zależy od interakcji białko-białko1,2. W rezultacie, choroby ludzkie są często naznaczone zaburzeniami w składaniu i zachowaniu różnych kompleksów białkowych3. Zdolność do scharakteryzowania takich interakcji ma zatem kluczowe znaczenie. Obecne sposoby wykrywania tych interakcji wymagają oczyszczenia z białek docelowych, a następnie często ściągania ich oddziałujących partnerów. Konwencjonalne oczyszczanie odbywa się poprzez różnicowe wirowanie, wytrącanie i/lub chromatografię4. Metody te są czasochłonne, muszą być modyfikowane dla każdego białka docelowego i często skutkują niskimi plonami. Nowoczesne metody oczyszczania polegają na fuzji znaczników peptydowych z białkami docelowymi, a następnie immunoprecypitacji lub ekstrakcji na kolumnach załadowanych kulkami związanymi z cząsteczką wychwytującą5,6. Chociaż jest to rozszerzalne na wiele białek, wymaga modyfikacji sekwencji celu, co potencjalnie prowadzi do powstania konstruktów, które różnią się powinowactwem do swoich zwykłych partnerów wiążących. Delikatna natura niektórych interakcji białko-białko oznacza, że metoda ta może nie mieć zastosowania w wielu scenariuszach. Ponadto testy typu pull-down stosowane do mapowania interakcji białko-białko mogą nie uchwycić dokładnego obrazu komórkowego ze względu na ograniczone stopnie swobody i nienatywne poziomy białka przynęty.
Idealnie, kompleksy białkowe mogłyby być wykrywane w ich rodzimych stanach, bez potrzeby oczyszczania czy ściągania. Niebieska natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) została opracowana jako mniej denaturująca alternatywa dla elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) i pozwala na oddzielenie niektórych białek i kompleksów od próbek biologicznych7. Jednak białka w BN-PAGE rozdzielają się na podstawie dużej liczby zmiennych, w tym rozmiaru, ładunku, trójwymiarowej struktury i asocjacji z innymi cząsteczkami. Interakcje tych czynników często skutkują koseparacją białek, tworzeniem agregatów i słabą rozdzielczością pasm białkowych. Dwuwymiarowa elektroforeza w natywnym żelu poliakrylamidowym rozwiązuje niektóre, ale nie wszystkie, z tych problemów8.
Aby obejść komplikacje związane z natywną separacją, niektórzy autorzy używają odczynników sieciujących aminy, takich jak dithiobis(propionian sukcynimidylu) (DSP), do wychwytywania kompleksów białkowych w lizatach tkankowych4. Te poddane działaniu substancji lizaty mogą być następnie denaturowane i rozdzielane za pomocą SDS-PAGE, przy jednoczesnym zachowaniu natywnej wielkości i składu kompleksów białkowych. Ponieważ jednak odczynniki sieciujące reagują w zależności od bliskości jednej cząsteczki do drugiej, a białka w lizatach tkankowych mają wiele stopni swobody i mogą oddziaływać stochastycznie, sieciowanie w tle niespecyficznym może być wysokie, szczególnie w skoncentrowanych próbkach. Może to prowadzić do trudnych do interpretacji wyników.
Tutaj demonstrujemy użycie hybrydowej metody BN-PAGE/SDS-PAGE, określanej jako elektroforeza w żelu multimerowo-poliakrylamidowym (multimer-PAGE), do rozdzielania i wykrywania zespołów białkowych w złożonych mieszaninach. Początkowo lizat komórkowy jest zawieszony w żelu poliakrylamidowym za pośrednictwem BN-PAGE. Żel zawierający lizat jest następnie poddawany reakcji z odczynnikiem sieciującym DSP. Pseudo-unieruchomione i lekko oddzielone na żelu białka są znacznie mniej podatne na niespecyficzne reakcje, co oznacza, że reaktywność sieciowania tła jest zmniejszona. Po usieciowaniu opaski żelowe są wycinane i oddzielane za pomocą SDS-PAGE. Otrzymany żel może być następnie analizowany za pomocą dowolnych środków zwykle związanych z elektroforezą w żelu poliakrylamidowym. Metoda ta pozwala na separację i detekcję natywnych kompleksów białkowych w niemodyfikowanym lizacie tkankowym, bez konieczności dodatkowego oczyszczania lub ściągania.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&epsilon;-Kwas aminokapronowy</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>Toksyczny.</td></tr><tr><td>Akrylamid/bisakryloamid 37,5:1 (40% T roztwór podstawowy)</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>Toksyczny.</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anty królik IgG-HRP z kozy</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kwasu bicunchoninowego</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw podłoża chemiluminescencyjnego</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blue G-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiobis (sukcynimidylopropionian)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>Suche mleko beztłuszczowe</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów</td> <td>proteazy haltThermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>Do miareczkowania. Kaustyczny.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>Do aktywacji membrany PVDF. Toksyczny.</td></tr><tr><td>Monoklonalna anty &alfa;-synukleina IgG z królika</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-metylenobisakryloamid</td><td>Acros Organics</td><td>16479</td><td>Toksyczny.</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (tween-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Membrany transferowe z polifluorku winylidenu</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu monobasic</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór SDS (10% w/v)</td><td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (0,5 M bufor, pH 6,8)</td><td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1,5 M bufor, pH 8,8)</td><td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td> Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 czytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + Stojak</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Microfuge 22R Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml homogenizator</td><td></td><td></td><td></td>z beczki</tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy homogenizator tkanek</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

multimer-page: metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Istnieje wiele dobrze rozwiniętych metod oczyszczania i badania pojedynczych białek i peptydów. Jednak większość funkcji komórkowych jest realizowana przez sieci oddziałujących kompleksów białkowych, które często są trudne do zbadania, ponieważ ich wiązanie jest niekowalencyjne i łatwo zaburzone przez techniki oczyszczania. W pracy opisano metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z tkanki niemodyfikowanej za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Lizat tkankowy jest ładowany na niedenaturujący się natywny dla niebieskiego żelu poliakrylamidowego, a następnie podawany jest prąd elektryczny, aż białko przeniesie się na niewielką odległość do żelu. Pasek żelu zawierający migrowane białko jest następnie wycinany i inkubowany z odczynnikiem sieciującym aminy dithiobis (propionian sukcynimidylu), który kowalencyjnie stabilizuje kompleksy białkowe. Pasek żelu zawierający usieciowane kompleksy jest następnie wlewany do żelu poliakryloamidowego z dodecylosiarczanem sodu, a kompleksy są całkowicie oddzielane. Metoda opiera się na technikach i materiałach znanych większości biologów molekularnych, co oznacza, że jest niedroga i łatwa do nauczenia. Chociaż jej zdolność do odpowiedniego oddzielania ekstremalnie dużych kompleksów jest ograniczona i nie odniosła uniwersalnego sukcesu, metoda ta była w stanie uchwycić szeroką gamę dobrze zbadanych kompleksów i prawdopodobnie ma zastosowanie w wielu systemach będących przedmiotem zainteresowania.

W tym eksperymencie demonstracyjnym przeprowadzono multimer-PAGE na lizacie całego mózgu szczura. Rozdzielone w ten sposób białka przeniesiono na błony z polifluorku winylidenu (PVDF), a następnie poddano analizie z użyciem przeciwciał przeciwko białkom znanym z tworzenia kompleksów. Rysunek 1 przedstawia walidację protokołu za pomocą dwóch metod. Po pierwsze, wykazano, że białka sieciowane ulegają rozszczepieniu po dodaniu czynnika redukującego, co oznacza, że zaobserwow...

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest umożliwienie badaczom wychwytywania, rozdzielania i analizowania natywnych kompleksów białkowych ekstrahowanych z lizatów tkanek przy użyciu elektroforezy w żelach poliakrylamidowych. Metoda ta może pomóc naukowcom badającym białka, ponieważ pozwala na stabilizację w przeciwnym razie labilnych asocjacji białkowych w warunkach zbliżonych do natywnych, co umożliwia ich identyfikację i późniejszą analizę. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie powszechnych metod biologicznych, dzięki czemu jest ona szeroko stosowalna i może być dostosowana do celów poszczególnych badaczy.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować elektroforezę w natywnym żelu poliakrylamidowym z użyciem niebieskiego barwnika (blue native polyacrylamide gel electrophoresis) zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Podłącz elektrody do zasilacza i prowadź elektroforezę białek w żelu przy napięciu 150 V, aż prążek barwnika przesunie się o około dwa centymetry do warstwy rozdzielczej. W tym momencie należy przerwać proces i odłączyć zasilacz.Po rozmontowaniu aparatury do elektroforezy rozdziel szklane płytki kasety z żelem. Usuń i wyrzuć warstwę zagęszczającą. Ostrożnie przetnij żel tuż poniżej dolnej krawędzi frontu barwnika, dbając o to, aby cięcie było jak najgładsze i najprostsze.Następnie należy usunąć niewykorzystany fragment żelu. Odciąć wszelkie niewykorzystane części wzdłuż krawędzi paska żelu. Ostrożnie umieścić pasek w 10 mililitrach soli buforowej z fosforanem (PBS) w małym pojemniku i delikatnie mieszać przez 30 minut w celu równoważenia.Po wyrównaniu stężeń odlać PBS i zastąpić go kolejnymi 10 mililitrami. Pipetować 500 mikrolitrów 25 milimolowego DSP rozpuszczonego w dimetylosulfoksydzie do PBS i kontynuować mieszanie w ten sam sposób przez 30 minut. Po 30 minutach odlać roztwór DSP.Dodaj 10 mililitrów 0,375 molarnego HSCL o pH 8,8 zawierającego 2% sodium dodecyl sulfate w celu zneutralizowania niezareagowanego DSP. Kontynuuj inkubację przez 15 minut. Podczas neutralizacji paska żelowego przygotuj roztwory do żelu SDS-PAGE zgodnie ze standardowymi metodami.Nie dodawać odczynników do polimeryzacji. Po zatrzymaniu reakcji doprowadzić pasek żelu blue native do temperatury pokojowej i odlać go w nowej kasie do żelu. W tym celu ostrożnie podnieść żel i umieścić go na czystej płytce dystansowej kasety do żelu.Zorientuj pasek tak, aby był odwrócony względem poprzedniego położenia, a dolna krawędź czoła barwnika znajdowała się najbliżej górnej części nowej kasety. Umieść pasek w taki sposób, aby jego górna krawędź znajdowała się na równi z miejscem, w którym znajdzie się górna krawędź płytki przykrywki. Upewnij się, że czoło barwnika jest równoległe do poziomych krawędzi płytki szklanej.Docisnąć jeden bok wyciętego paska do jednej ze ścianek dystansu, pozostawiając miejsce z drugiej strony na wylanie żelu oraz nałożenie standardu białek lub drabinki. Jeśli dolna krawędź paska żelu posiada poszarpane lub nierówne fragmenty, należy je ostrożnie odciąć. Po prawidłowym ustawieniu paska żelu, położyć płytkę przykrywkową na płytce z dystansem.Należy delikatnie docisnąć, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza. Dalszy montaż aparatury do odlewania żelu należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta. Pasek żelu może czasem przesunąć się podczas nakładania górnej płyty.Warto pozwolić, aby pasek lekko zwisał poza krawędź górnej płyty, co umożliwia jego skorygowanie za pomocą szpatułki w przypadku przesunięcia. Do buforu żelu rozdzielającego należy dodać odczynniki polimeryzacyjne, a następnie przelać go do przygotowanej kasety żelowej za pomocą pipety serologicznej. Należy wypełnić kasetę żelową do poziomu około dwóch centymetrów poniżej wyciętego paska żelu blue native PAGE, aby pozostawić miejsce na warstwę koncentrującą.Następnie na powierzchnię wlanego żelu nanieś 100 µL butanolu i odczekaj 30 minut do spolimeryzowania się warstwy rozdzielczej, po czym zlej butanol. W kolejnym kroku dodaj odczynniki polimeryzacyjne do roztworu żelu zgrupującego. Za pomocą pipety serologicznej wlej warstwę zgrupującą, aby wypełnić całą pozostałą wolną przestrzeń w kasecie żelowej.Przechyl kasetę do żelu podczas wlewania warstwy kondensującej, aby wypełniła ona przestrzeń poniżej paska żelu i aby nie uwięzły w niej pęcherzyki powietrza. W miarę jak bufor żelu kondensującego wypełnia pustą przestrzeń pod paskiem żelu, stopniowo przywróć kasecie poziome ustawienie. Kontynuuj wypełnianie pustej przestrzeni obok wyciętego paska żelu buforem żelu kondensującego, aż prawie zacznie on przelewać się przez krawędź.Następnie pozostaw warstwę stosującą do polimeryzacji na 30 minut. Po spolimeryzowaniu warstwy stosującej wyjmij kasetę z żelem z urządzenia do odlewania, wypłucz ją wodą destylowaną i złóż aparat do elektroforezy zgodnie z instrukcją producenta. Całkowicie wypełnij wewnętrzną komorę buforem do prowadzenia SDS-PAGE 1x.Następnie należy wypełnić zewnętrzną komorę do poziomu wskazanego przez producenta. W przestrzeni obok wyciętego paska żelu należy umieścić marker masy cząsteczkowej lub odpowiedni standard białkowy. Podłączyć elektrody do zasilacza i przeprowadzić elektroforezę próbek przy napięciu 120 V.Gdy barwnik Coomassie spłynie z żelu, należy przerwać elektroforezę i odłączyć zasilacz. Żel należy przeanalizować przy użyciu standardowych metod elektrotransferu oraz detekcji białek z wykorzystaniem przeciwciał. Walidacja techniki multimer-PAGE została tutaj przedstawiona za pomocą immunoblottingu.Uchwycony kompleks kinezyny zostaje rozszczepiony przez diphyo-3-itol, co wykazuje, że agregaty o wysokiej masie cząsteczkowej powstają poprzez sieciowanie mniejszych składników. Przedstawiono tutaj lizaty mózgu traktowane zwiększającymi się stężeniami SDS lub Tritonu, co zwiększyło detekcję monomerycznej alfa-synukleiny, jednocześnie zmniejszając detekcję rozpuszczalnego oligomeru tetrameru. Tutaj przedstawiono reprezentatywne wyniki multimer-PAGE wykorzystanej do uchwycenia rozpuszczalnych kompleksów w lizacie mózgu szczura.Białka wykryto za pomocą immunoblottingu. Przewidywana masa cząsteczkowa monomeru każdego białka jest podana pod torami. Analogicznie przedstawiono tutaj wychwyt kompleksów związanych z błoną.Metoda Multimer-PAGE okazjonalnie nie pozwala na uchwycenie kompleksu, co pokazano na obrazie kompleksu oddechowego dwa SDHA. Omówienie możliwych wyjaśnień tego zjawiska znajduje się w protokole tekstowym. Po opanowaniu techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura ta zajmuje około ośmiu godzin.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić sieciowanie w żelu natywnych kompleksów białkowych, a następnie ponowne odlewanie żelu i rozdzielanie za pomocą wtórnej elektroforezy SDS-PAGE. Pamiętaj, że praca z akrylamidem może być niezwykle niebezpieczna i podczas odlewania żelu należy stosować środki ochrony osobistej. Po wykonaniu tej procedury rozdzielone ustabilizowane kompleksy mogą zostać eluowane lub wycięte z żelu, a następnie poddane analizie różnymi metodami, w tym immunodetekcji lub spektrometrii mas, w zależności od potrzeb badacza.

multimer-page-method-for-capturing-resolving-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Ten film opisuje multimeryczną STRONĘ do oddzielania natywnych kompleksów białkowych od homogenatów tkankowych. Technika ta jest hybrydą niebieskich technik native-page i SDS-PAGE. Oddzielone kompleksy można scharakteryzować i zbadać pod kątem ich roli w funkcjonowaniu komórki.

Multimer-PAGE do separacji natywnych kompleksów białkowych: hybrydowa technika separacji składająca się z Blue native-PAGE i SDS-PAGE w celu oddzielenia nienaruszonych białek multimerycznych od lizatu tkankowego

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Ten protokół łączy masową fotometrię z nowatorskim systemem mikroprzepływowym do badania interakcji białko-białko o niskim powinowactwie. Podejście to opiera się na szybkim rozcieńczaniu silnie skoncentrowanych kompleksów w roztworze, co umożliwia pomiary o niskim powinowactwie i rozszerza zastosowanie fotometrii masowej.

Analiza tworzenia kompleksów białkowych w stężeniach mikromolowych poprzez sprzężenie mikrofluidyki z fotometrią masową

Poznaj metodę Multimer-PAGE do wychwytywania i rozdzielania natywnych kompleksów białkowych z lizatów tkankowych. Technika stabilizuje nietrwałe asocjacje białkowe w warunkach zbliżonych do natywnych, umożliwiając ich analizę.

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Przeglądaj więcej filmów