Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest umożliwienie badaczom wychwytywania, rozdzielania i analizowania natywnych kompleksów białkowych ekstrahowanych z lizatów tkanek przy użyciu elektroforezy w żelach poliakrylamidowych. Metoda ta może pomóc naukowcom badającym białka, ponieważ pozwala na stabilizację w przeciwnym razie labilnych asocjacji białkowych w warunkach zbliżonych do natywnych, co umożliwia ich identyfikację i późniejszą analizę. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie powszechnych metod biologicznych, dzięki czemu jest ona szeroko stosowalna i może być dostosowana do celów poszczególnych badaczy.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować elektroforezę w natywnym żelu poliakrylamidowym z użyciem niebieskiego barwnika (blue native polyacrylamide gel electrophoresis) zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Podłącz elektrody do zasilacza i prowadź elektroforezę białek w żelu przy napięciu 150 V, aż prążek barwnika przesunie się o około dwa centymetry do warstwy rozdzielczej. W tym momencie należy przerwać proces i odłączyć zasilacz.

Po rozmontowaniu aparatury do elektroforezy rozdziel szklane płytki kasety z żelem. Usuń i wyrzuć warstwę zagęszczającą. Ostrożnie przetnij żel tuż poniżej dolnej krawędzi frontu barwnika, dbając o to, aby cięcie było jak najgładsze i najprostsze.

Następnie należy usunąć niewykorzystany fragment żelu. Odciąć wszelkie niewykorzystane części wzdłuż krawędzi paska żelu. Ostrożnie umieścić pasek w 10 mililitrach soli buforowej z fosforanem (PBS) w małym pojemniku i delikatnie mieszać przez 30 minut w celu równoważenia.

Po wyrównaniu stężeń odlać PBS i zastąpić go kolejnymi 10 mililitrami. Pipetować 500 mikrolitrów 25 milimolowego DSP rozpuszczonego w dimetylosulfoksydzie do PBS i kontynuować mieszanie w ten sam sposób przez 30 minut. Po 30 minutach odlać roztwór DSP.

Dodaj 10 mililitrów 0,375 molarnego HSCL o pH 8,8 zawierającego 2% sodium dodecyl sulfate w celu zneutralizowania niezareagowanego DSP. Kontynuuj inkubację przez 15 minut. Podczas neutralizacji paska żelowego przygotuj roztwory do żelu SDS-PAGE zgodnie ze standardowymi metodami.

Nie dodawać odczynników do polimeryzacji. Po zatrzymaniu reakcji doprowadzić pasek żelu blue native do temperatury pokojowej i odlać go w nowej kasie do żelu. W tym celu ostrożnie podnieść żel i umieścić go na czystej płytce dystansowej kasety do żelu.

Zorientuj pasek tak, aby był odwrócony względem poprzedniego położenia, a dolna krawędź czoła barwnika znajdowała się najbliżej górnej części nowej kasety. Umieść pasek w taki sposób, aby jego górna krawędź znajdowała się na równi z miejscem, w którym znajdzie się górna krawędź płytki przykrywki. Upewnij się, że czoło barwnika jest równoległe do poziomych krawędzi płytki szklanej.

Docisnąć jeden bok wyciętego paska do jednej ze ścianek dystansu, pozostawiając miejsce z drugiej strony na wylanie żelu oraz nałożenie standardu białek lub drabinki. Jeśli dolna krawędź paska żelu posiada poszarpane lub nierówne fragmenty, należy je ostrożnie odciąć. Po prawidłowym ustawieniu paska żelu, położyć płytkę przykrywkową na płytce z dystansem.

Należy delikatnie docisnąć, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza. Dalszy montaż aparatury do odlewania żelu należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta. Pasek żelu może czasem przesunąć się podczas nakładania górnej płyty.

Warto pozwolić, aby pasek lekko zwisał poza krawędź górnej płyty, co umożliwia jego skorygowanie za pomocą szpatułki w przypadku przesunięcia. Do buforu żelu rozdzielającego należy dodać odczynniki polimeryzacyjne, a następnie przelać go do przygotowanej kasety żelowej za pomocą pipety serologicznej. Należy wypełnić kasetę żelową do poziomu około dwóch centymetrów poniżej wyciętego paska żelu blue native PAGE, aby pozostawić miejsce na warstwę koncentrującą.

Następnie na powierzchnię wlanego żelu nanieś 100 µL butanolu i odczekaj 30 minut do spolimeryzowania się warstwy rozdzielczej, po czym zlej butanol. W kolejnym kroku dodaj odczynniki polimeryzacyjne do roztworu żelu zgrupującego. Za pomocą pipety serologicznej wlej warstwę zgrupującą, aby wypełnić całą pozostałą wolną przestrzeń w kasecie żelowej.

Przechyl kasetę do żelu podczas wlewania warstwy kondensującej, aby wypełniła ona przestrzeń poniżej paska żelu i aby nie uwięzły w niej pęcherzyki powietrza. W miarę jak bufor żelu kondensującego wypełnia pustą przestrzeń pod paskiem żelu, stopniowo przywróć kasecie poziome ustawienie. Kontynuuj wypełnianie pustej przestrzeni obok wyciętego paska żelu buforem żelu kondensującego, aż prawie zacznie on przelewać się przez krawędź.

Następnie pozostaw warstwę stosującą do polimeryzacji na 30 minut. Po spolimeryzowaniu warstwy stosującej wyjmij kasetę z żelem z urządzenia do odlewania, wypłucz ją wodą destylowaną i złóż aparat do elektroforezy zgodnie z instrukcją producenta. Całkowicie wypełnij wewnętrzną komorę buforem do prowadzenia SDS-PAGE 1x.

Następnie należy wypełnić zewnętrzną komorę do poziomu wskazanego przez producenta. W przestrzeni obok wyciętego paska żelu należy umieścić marker masy cząsteczkowej lub odpowiedni standard białkowy. Podłączyć elektrody do zasilacza i przeprowadzić elektroforezę próbek przy napięciu 120 V.

Gdy barwnik Coomassie spłynie z żelu, należy przerwać elektroforezę i odłączyć zasilacz. Żel należy przeanalizować przy użyciu standardowych metod elektrotransferu oraz detekcji białek z wykorzystaniem przeciwciał. Walidacja techniki multimer-PAGE została tutaj przedstawiona za pomocą immunoblottingu.

Uchwycony kompleks kinezyny zostaje rozszczepiony przez diphyo-3-itol, co wykazuje, że agregaty o wysokiej masie cząsteczkowej powstają poprzez sieciowanie mniejszych składników. Przedstawiono tutaj lizaty mózgu traktowane zwiększającymi się stężeniami SDS lub Tritonu, co zwiększyło detekcję monomerycznej alfa-synukleiny, jednocześnie zmniejszając detekcję rozpuszczalnego oligomeru tetrameru. Tutaj przedstawiono reprezentatywne wyniki multimer-PAGE wykorzystanej do uchwycenia rozpuszczalnych kompleksów w lizacie mózgu szczura.

Białka wykryto za pomocą immunoblottingu. Przewidywana masa cząsteczkowa monomeru każdego białka jest podana pod torami. Analogicznie przedstawiono tutaj wychwyt kompleksów związanych z błoną.

Metoda Multimer-PAGE okazjonalnie nie pozwala na uchwycenie kompleksu, co pokazano na obrazie kompleksu oddechowego dwa SDHA. Omówienie możliwych wyjaśnień tego zjawiska znajduje się w protokole tekstowym. Po opanowaniu techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura ta zajmuje około ośmiu godzin.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić sieciowanie w żelu natywnych kompleksów białkowych, a następnie ponowne odlewanie żelu i rozdzielanie za pomocą wtórnej elektroforezy SDS-PAGE. Pamiętaj, że praca z akrylamidem może być niezwykle niebezpieczna i podczas odlewania żelu należy stosować środki ochrony osobistej. Po wykonaniu tej procedury rozdzielone ustabilizowane kompleksy mogą zostać eluowane lub wycięte z żelu, a następnie poddane analizie różnymi metodami, w tym immunodetekcji lub spektrometrii mas, w zależności od potrzeb badacza.