Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych
5 maja 2017
Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).
Ogólnym celem tego protokołu jest umożliwienie naukowcom wychwytywania, oddzielania i analizowania natywnych kompleksów białkowych ekstrahowanych z lizatów tkankowych za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Metoda ta może pomóc naukowcom, którzy badają białka, ponieważ jest w stanie ustabilizować labilne asocjacje białek w warunkach zbliżonych do natywnych, umożliwiając ich identyfikację i późniejszą analizę. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona powszechne metody biologiczne, dzięki czemu ma szerokie zastosowanie i może być dostosowana do celów indywidualnego badacza.
Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować się do elektroforezy w postaci niebieskiego natywnego żelu poliakrylamidowego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Podłącz elektrody do źródła zasilania i poddaj elektroforezie białka w żelu pod napięciem 150 woltów, aż pasmo barwnika wsunie się na około dwa centymetry w warstwę rozdzielczą. W tym momencie zatrzymaj się i odłącz zasilanie.
Po zdemontowaniu aparatu do elektroforezy należy oddzielić tafle szkła kasety żelowej. Usuń i wyrzuć warstwę układania. Ostrożnie odetnij żel tuż pod dolną krawędzią frontu barwnika, uważając, aby to cięcie było jak najbardziej gładkie i proste.
Następnie wyrzuć niewykorzystany kawałek żelu. Odetnij wszelkie niewykorzystane części wzdłuż krawędzi paska żelu. Ostrożnie umieść pasek w 10 mililitrach soli fizjologicznej buforowanej fosofanu w małym pojemniku i delikatnie mieszaj przez notację przez 30 minut, aby zrównoważyć.
Po zrównoważeniu wyrzuć i zastąp PBS kolejnymi 10 mililitrami. Odpipetować 500 mikrolitrów 25-milimolowego DSP rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku do PBS i kontynuować mieszanie jak poprzednio przez 30 minut. Po 30 minutach odlej roztwór DSP.
Przy 10 mililitrach 0,375 mola HSCL, pH 8,8, zawierający 2% dodecylosiarczan sodu do wygaszenia nieprzereagowanego DSP. Kontynuuj zapis przez 15 minut. Podczas hartowania paska żelu przygotuj roztwory żelu SDS-PAGE zgodnie ze standardowymi metodami.
Nie dodawać odczynników do polimeryzacji. Po schłodzeniu przywróć niebieski natywny pasek żelowy do temperatury pokojowej i wlej pasek do nowej kasety żelowej. Aby to zrobić, ostrożnie podnieś żel i umieść go na czystej płytce dystansowej kasety żelowej.
Ustaw pasek tak, aby był odwrócony z poprzedniej orientacji, a dolna część przodu barwnika znajdowała się najbliżej górnej części nowej kasety. Umieść pasek tak, aby jego górna krawędź leżała równo z miejscem, w którym będzie znajdować się górna krawędź pokrywy. Upewnij się, że przód barwnika jest równoległy do poziomych krawędzi szklanej płytki.
Dociśnij jedną stronę wyciętego paska do jednej ze ścianek dystansowych, pozostawiając miejsce po drugiej stronie na wylanie żelu i załadowanie wzorca białkowego lub drabinki. Jeśli dolna krawędź paska żelowego zawiera jakiekolwiek postrzępione lub nierówne obszary, ostrożnie je odetnij. Po prawidłowym umieszczeniu paska żelowego połóż płytkę osłonową na płycie dystansowej.
Delikatnie dociśnij, aby wypchnąć uwięzione pęcherzyki powietrza. Kontynuuj montaż urządzenia do nalewania żelu zgodnie z instrukcjami producenta. Pasek żelu czasami przesuwa się podczas umieszczania górnej płyty.
Pomocne jest, aby pasek zwisał nieco z krawędzi górnej płyty, aby można go było wyregulować szpatułką, aby skorygować wszelkie przesunięcia. Dodać odczynniki polimeryzacyjne do rozdzielczego buforu żelowego i wlać go do przygotowanej kasety żelowej za pomocą pipety serologicznej. Napełnij kasetę z żelem do około dwóch centymetrów poniżej wyciętego niebieskiego natywnego paska żelu PAGE, aby pozostawić miejsce na warstwę układania.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów butanolu na wierzch nalanego żelu i odczekaj 30 minut na polimeryzację warstwy rozdzielczej przed wylaniem butanolu. Następnie dodaj odczynniki do polimeryzacji do roztworu żelu do układania w stosy. Za pomocą pipety serologicznej wlej warstwę stosu, aby wypełnić całą pozostałą pustą przestrzeń w kasecie z żelem.
Przechyl kasetę z żelem podczas wylewania warstwy układania w stos, aby wypełniła przestrzeń pod paskiem żelu i nie uwięziły pęcherzyków powietrza. Gdy bufor żelu do układania w stos wypełni pustą przestrzeń pod paskiem żelu, stopniowo przywróć kasetę z żelem do poziomej podstawy. Kontynuuj wypełnianie pustej przestrzeni obok wyciętego paska żelu buforem żelu do układania w stos, aż prawie się przeleje.
Następnie pozwól warstwie układania się polimeryzować przez 30 minut. Po polimeryzacji warstwy układającej należy wyjąć kasetę z żelem z aparatu do nalewania, przepłukać ją wodą destylowaną i zmontować aparat do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta. Całkowicie napełnij komorę wewnętrzną buforem do biegania 1x SDS-PAGE.
Następnie napełnij komorę zewnętrzną do poziomu wskazanego przez producenta. Załaduj przestrzeń obok wyciętego paska żelu za pomocą drabinki o masie cząsteczkowej lub odpowiedniego wzorca białka. Podłącz elektrody do zasilania i poddaj próbki elektroforezie pod napięciem 120 woltów.
Gdy barwnik Coomassie spłynie z żelu, przerwij bieg i odłącz zasilanie. Analizuj żel przy użyciu standardowych metod elektroblottingu i wykrywania białek na bazie przeciwciał. Walidacja multimer-PAGE jest pokazana tutaj za pomocą immunoblot.
Wychwycony kompleks kinezyny jest rozszczepiany przez difio-3-itol, co pokazuje, że agregaty o dużej masie cząsteczkowej są tworzone przez sieciowanie mniejszych podstawników. Przedstawione tutaj lizaty mózgu traktowane rosnącymi stężeniami SDS lub Triton zwiększały wykrywalność monomerycznej alfa-synukleiny, jednocześnie zmniejszając wykrywalność rozpuszczalnego tetromeru oligomerowego. W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne wyniki multimeru-PAGE stosowanego do wychwytywania rozpuszczalnych kompleksów w lizacie mózgu szczura.
Białka wykryto za pomocą immunoblot. Oczekiwana masa monomeryczna każdego białka jest pokazana poniżej pasów. Podobnie pokazano tutaj wychwytywanie kompleksów związanych z błoną.
Multimer-PAGE czasami nie udaje się uchwycić kompleksu, jak pokazano na dwóch plamach kompleksu oddechowego SDHA. Dyskusję na temat możliwych wyjaśnień tego zjawiska można znaleźć w protokole tekstowym. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około osiem godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić sieciowanie natywnych kompleksów białkowych w żelu, a następnie ponowne odlewanie żelu i separację za pomocą wtórnej SDS-PAGE. Nie zapominaj, że praca z akrylamidem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas odlewania żelu należy nosić środki ochrony osobistej. Po tej procedurze wydzielone ustabilizowane kompleksy mogą być eluowane lub wycinane z żelu i mogą być analizowane na wiele sposobów, w tym za pomocą immunodetekcji lub spektrometrii mas w zależności od potrzeb badacza.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę stabilizacji i rozdzielania natywnych kompleksów białkowych z lizatów tkankowych przy użyciu nowatorskiego systemu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Pozwala on na analizę asocjacji białkowych w warunkach zbliżonych do natywnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Proteomika
- Elektroforeza
Wstęp
- Zrozumienie kompleksów białkowych ma kluczowe znaczenie dla wielu badań biologicznych.
- Naturalne powiązania białkowe mogą być niestabilne i trudne do analizy.
- Powszechne metody biologiczne ułatwiają zastosowanie tej techniki.
- Metoda ta pozwala na dostosowanie podejścia do analizy białek.
Cel badania
- Aby wyizolować i przeanalizować natywne kompleksy białkowe z lizatów tkankowych.
- Aby ustabilizować powiązania białkowe w celu ich lepszej identyfikacji.
- Aby dostarczyć szeroko stosowalnej metody dla badaczy.
Zastosowane metody
- Przygotowanie do nieodbarwionej elektroforezy białek w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE).
- Elektroforeza białek przy napięciu 150 V.
- Monitorowanie postępu czoła barwnika w żelu.
- Wykorzystanie białkowego czynnika sieciującego reagującego z grupami aminowymi.
Główne wyniki
- Skuteczna stabilizacja natywnych kompleksów białkowych.
- Efektywna separacja białek w lizatach tkankowych.
- Identyfikacja oddziaływań białkowych w warunkach zbliżonych do natywnych.
Wnioski
- Ta metoda usprawnia analizę kompleksów białkowych.
- Jest ona dostosowana do różnych celów badawczych.
- Wykorzystanie powszechnych metod zwiększa dostępność dla badaczy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda Multimer-PAGE umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym stabilizację i rozdział natywnych kompleksów białkowych z lizatów tkanek w warunkach zbliżonych do naturalnych, co wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach odkrywania leków. Poprzez zachowanie niestabilnych asocjacji białkowych, które często ulegają rozpadowi podczas konwencjonalnego oczyszczania, metoda ta zwiększa wiarygodność predykcyjną analizy szlaków sygnałowych oraz identyfikacji celów terapeutycznych opartych na kompleksach. Podejście to poprawia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania po ocenę przedkliniczną, zapewniając powtarzalne, ilościowe wyniki tworzenia kompleksów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez utrwalanie natywnych oddziaływań białkowych bez zaburzania wiązań niekowalencyjnych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje dostępne techniki Blue Native PAGE oraz SDS-PAGE, znane większości zespołów biologii molekularnej, co ogranicza potrzebę specjalistycznego szkolenia.
- Wartość prognostyczna: Wspiera walidację funkcjonalną celu poprzez stabilizację kompleksów w celu ich późniejszej identyfikacji za pomocą immunoblottingu lub spektrometrii mas.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie rozdzielonych profili kompleksów, które mogą służyć jako ilościowe biomarkery do standaryzacji testów w ramach kampanii przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Opiera się na niedrogich i powszechnie dostępnych odczynnikach oraz sprzęcie, co umożliwia skalowalną implementację w jednostkach centralnych.
- Gotowość testu: Pozwala na otrzymanie kompleksów rozdzielonych metodą SDS-PAGE, kompatybilnych z późniejszymi metodami detekcji, takimi jak immunodetekcja, co wspiera integrację z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi (HCS).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z procesami przedklinicznymi poprzez zachowanie integralności kompleksów w celu ich walidacji w systemach istotnych dla danej choroby.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na ocenę tworzenia się kompleksów w różnych warunkach (np. po ekspozycji na detergenty lub SDS), co dostarcza informacji o stabilności celu.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o stabilność i obfitość kompleksów, co redukuje liczbę niepowodzeń na późniejszych etapach wynikających z niepewności mechanistycznej.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Multimer-PAGE wpisuje się w proces odkrywania leków, od identyfikacji celu po optymalizację kandydata, stanowiąc mechanistyczny pomost do walidacji przedklinicznej dzięki możliwości analizy natywnych kompleksów białkowych w próbkach pochodzenia tkankowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez wychwytywanie endogennych kompleksów z niemodyfikowanych lizatów tkanek.
- Przesiewanie: Umożliwia opracowywanie testów dzięki powtarzalnej separacji i detekcji kompleksów, co ułatwia ocenę wpływu związków na zaangażowanie celu.
- Analityka: Zapewnia ilościową separację kompleksów białkowych za pomocą wtórnego SDS-PAGE, umożliwiając porównanie różnych warunków lub traktowań.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez utrzymanie stabilności kompleksów w celu walidacji w modelach chorobowych, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku platforma, a nie jednorazowy test, będąc adaptowalną do wielu celów i obszarów chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w sieciach oddziaływań białkowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki ustandaryzowanym przepływom pracy opartym na żelach oraz znanym technikom elektroforezy.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka celów, co minimalizuje inwestycje w słabo zwalidowane mechanizmy.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając bezpośrednich dowodów na tworzenie i stabilność kompleksów w warunkach natywnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach native PAGE oraz SDS-PAGE, w tym w odlewie żeli i rozdziałie elektroforetycznym.
- Zależne od dostępu do aparatury elektroforetycznej, zasilaczy oraz standardowych odczynników, takich jak czynnik sieciujący DSP i SDS.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnego wychwytu i detekcji kompleksów w grupach badawczych i przedklinicznych.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne dla różnych typów tkanek i rozmiarów kompleksów, ponieważ wydajność rozdziału może różnić się w zależności od masy cząsteczkowej.
- Ograniczone przez trudności w rozdzielaniu bardzo dużych kompleksów oraz potencjalną zmienność wydajności sieciowania, zgodnie z treścią materiałów źródłowych.
