Preparacja, tomografia komputerowa i analizy morfometryczne baculum
19 marca 2017
Wiele struktur biologicznych nie ma łatwo definiowalnych punktów orientacyjnych, co utrudnia zastosowanie nowoczesnych metod morfometrycznych. Tutaj ilustrujemy metody badania baculum myszy (kości w penisie), w tym sekcję i skanowanie mikrotomografią komputerową, a następnie metody obliczeniowe do definiowania półpunktów orientacyjnych, które są używane do ilościowego określania zmienności rozmiaru i kształtu.
Ogólnym celem tej dyssekcji i analizy morfometrycznej jest zilustrowanie niezawodności naszej metodologii morfometrycznej w badaniu struktur o złożonych kształtach, takich jak kość prącia myszy. Pomysł na to badanie pojawił się, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że istniejące metody pomiaru zmienności baculum, takie jak określanie długości i szerokości, pomijają wszelkie informacje o krzywiźnie i złożoności kształtu; opracowaliśmy zatem tę metodę, aby ilościowo określić zmienność rozmiaru i kształtu dowolnej kości lub interesującej nas struktury w trzech wymiarach. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie nowoczesnej morfometrii do struktur pozbawionych punktów charakterystycznych.
Powinno to przyczynić się do rozwoju dziedziny poprzez zapewnienie ulepszonych, powtarzalnych pomiarów złożonych struktur. Umieść uśpionego, osiągłego samca myszy w pozycji na plecach i wysuń prącie, wywierając kciukiem nacisk bocznie od otworu napletka. Po wysunięciu prącia wyciągnij tkankę przez napletek tak daleko, jak to możliwe.
Następnie, używając nożyczek, odetnij trzon prącia proksymalnie względem żołędzi, w miejscu, w którym znajduje się baculum, oddzielając prącie. Następnie całkowicie zanurz prącie w około 200 µL wody z kranu w probówce do mikrowirówki. Aby zmiękczyć tkankę, inkubuj ją w temperaturze około 50 °C przez okres od trzech do pięciu dni.
Zmiękczanie tkanek zmniejsza ryzyko złamania kości podczas ekstrakcji. Po inkubacji, przy użyciu mikroskopu sekcyjnego i pincety, należy usunąć większość tkanek otaczających baculum. Po sekcji wstępnej należy delikatnie spryskać kość 70% etanolem, aby usunąć pozostałe tkanki i oczyścić kość.
Następnie umieść wypreparowane baculum w nowej probówce do mikrowirówki i pozostaw kość do wyschnięcia w temperaturze pokojowej z otwartą zakrętką. Na początek przygotuj materiał, w którym zostanie umieszczona kość. Wciśnij cylindryczny uchwyt do tomografii komputerowej (CT) w kostkę gąbki florystycznej.
Następnie wyjmij powstały cylinder pianki i wytnij plastry o grubości od dwóch do pięciu centymetrów. Teraz wciśnij od 10 do 15 wysuszonych bacula w piankę florystyczną wokół obwodu pojedynczego plastra, aby zminimalizować zakłócenia podczas skanowania. Odnotuj dokładną orientację kości w celu jej późniejszej identyfikacji.
Następnie ostrożnie umieść kości w piance w uchwycie do mikro-tomografii komputerowej i wprowadź uchwyt do skanera micro CT 50. Skonfiguruj skaner micro CT 50 w następujący sposób. Użyj napięcia 90 kV, rozmiaru woksela 155 Å, filtra aluminiowego 5 mm, 750 projekcji na 180 stopni oraz czasu ekspozycji 500 ms.
Następnie należy przystąpić do skanowania preparatu. Kości baculum zostały wypreparowane, przygotowane i zeskanowane zgodnie z opisanym protokołem. Wiele kości można umieścić w ramach jednego skanowania CT.
Obrazy zostały następnie przetworzone z wykorzystaniem geometrii obliczeniowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ten proces obrazowania powinien znaleźć zastosowanie w badaniach szerokiego spektrum kości oraz innych obiektów zainteresowania. Analiza dostarcza szczegółowych informacji na temat cech punktów charakterystycznych obiektu i jest w dużym stopniu zautomatyzowana.
Proces ten wymagał jedynie około 10 ręcznych korekt podczas analizy 369 bacula. Co istotne, nasze metody mogą zostać zastosowane do szerokiej gamy złożonych struktur. Metody te pozwoliły nam na ilościowe określenie rozmiaru i kształtu baculum w trzech wymiarach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia solidną metodologię morfometryczną analizy baculum u myszy — kości prącia, która nie posiada łatwo definiowalnych punktów orientacyjnych. Poprzez zastosowanie sekcji oraz skanowania mikroCT, badanie kwantyfikuje zmienność rozmiaru i kształtu z wykorzystaniem półpunktów orientacyjnych, co pozwala na lepsze zrozumienie złożonych struktur biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Morfometria
Wstęp
- Baculum myszy stanowi wyzwanie ze względu na swój złożony kształt.
- Tradycyjne metody pomiarowe nie pozwalają na uchwycenie krzywizny i złożoności kształtu.
- Nowoczesne techniki morfometryczne mogą poprawić dokładność pomiarów.
- Celem niniejszego badania jest rozwój dziedziny morfometrii.
Cel badania
- W celu przedstawienia metody ilościowego określania zmienności rozmiaru i kształtu baculum myszy.
- W celu dostarczenia ram badawczych do analizy innych złożonych struktur biologicznych.
- W celu zwiększenia powtarzalności i dokładności pomiarów morfometrycznych.
Zastosowane metody
- Wypreparowanie baculum myszy od uśpionego, dojrzale płciowo samca myszy.
- Skanowanie mikro-tomografią komputerową (microCT) w celu uzyskania szczegółowych informacji strukturalnych.
- Metody obliczeniowe służące do zdefiniowania półpunktów orientacyjnych do analizy.
- Ilościowa analiza zmienności rozmiaru i kształtu w trzech wymiarach.
Główne wyniki
- Zastosowana metodologia pozwoliła na skuteczną kwantyfikację różnic w rozmiarze i kształcie baculum.
- Wyniki wskazały na znaczną krzywiznę oraz złożoność kształtu, które były pomijane w tradycyjnych metodach.
- Podejście to można zastosować do innych struktur pozbawionych wyraźnych punktów orientacyjnych.
- Otrzymane wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia analizy morfometrycznej.
Wnioski
- Badanie przedstawia nową metodę analizy złożonych struktur biologicznych.
- Podkreśla ono znaczenie nowoczesnej morfometrii w badaniach biologicznych.
- Podejście to może zwiększyć dokładność pomiarów w różnych dziedzinach.
Najczęściej zadawane pytania
Przemysłowe zastosowanie w praktyce
Ilościowa analiza morfometryczna złożonych struktur biologicznych, takich jak baculum myszy, wypełnia istotną lukę w procesach wczesnego odkrywania, umożliwiając precyzyjne pomiary w sytuacjach, gdy brakuje tradycyjnych punktów orientacyjnych. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w przesiewaniu fenotypowym i wspiera rzetelną walidację celów poprzez dostarczanie powtarzalnych, wysokorozdzielczych danych dotyczących kształtu i rozmiaru. Podejście to znajduje szerokie zastosowanie w procesach badawczo-rozwojowych wymagających zestandaryzowanych, ilościowych ocen morfologicznych dla różnorodnych próbek biologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną weryfikację hipotez poprzez ilościowe określanie zmienności morfologicznej w strukturach pozbawionych wyraźnych punktów orientacyjnych.
- Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka dzięki powtarzalnym, trójwymiarowym pomiarom kształtu i wielkości.
- Ułatwia walidację celów funkcjonalnych poprzez rejestrowanie subtelnych różnic fenotypowych, niewykrywalnych przy użyciu tradycyjnych metod pomiarowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane modele 3D do późniejszego przesiewu fenotypowego i badań porównawczych.
- Standaryzuje gromadzenie danych morfometrycznych, poprawiając powtarzalność i niezawodność analizy.
- Generuje ilościowe wyniki odpowiednie do analiz wysokoprzepustowych i porównań międzybadawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica kwantyfikację morfologiczną z odkrywaniem biomarkerów translacyjnych w przypadkach, gdy zmienność kształtu ma znaczenie dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od wczesnego etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez umożliwienie stosowania spójnych protokołów pomiarowych.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach przedklinicznych, dostarczając szczegółowych danych strukturalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten potok morfometryczny integruje procesy od wczesnego etapu odkrywania po identyfikację wiodących związków, wspierając zarówno badania oparte na hipotezach, jak i skalowalne przepływy pracy w badaniach przesiewowych.
- Biologia odkrywcza: usprawnia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie pomiaru złożonych kształtów bez konieczności stosowania tradycyjnych punktów orientacyjnych.
- Screening: dostarcza reprodukowalne, ilościowe dane morfometryczne służące do wiarygodnej oceny związków chemicznych.
- Analityka: zapewnia pomiary 3D o wysokiej rozdzielczości oraz wyniki statystyczne pozwalające na rzetelne porównywanie warunków.
- Badania translacyjne: wspiera dopasowanie biomarkerów w sytuacjach, gdy cechy morfologiczne są powiązane z modelami chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: oferuje szeroko stosowalny, zautomatyzowany schemat pracy dla różnorodnych struktur biologicznych wykraczający poza początkowy przypadek użycia.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach morfologicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność analiz morfometrycznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki dostarczeniu solidnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów na etapie odkrywania.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu morfometrii, geometrii obliczeniowej oraz obrazowania microCT.
- Wymagany jest dostęp do skanerów microCT i infrastruktury do analizy obliczeniowej.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów rozmieszczania punktów orientacyjnych (landmarks) i półorientacyjnych (semi-landmarks) pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych systemów modelowych przy zastosowaniu odpowiednich korekt obliczeniowych.
- Interwencja manualna jest minimalna, ale może być konieczna w celu kontroli jakości w przypadku dużych zbiorów danych.
