Name: Preparacja, tomografia komputerowa i analizy morfometryczne baculum (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Poznaj metodę morfometryczną analizy baculum myszy przy użyciu mikrotomografii komputerowej i półznaczników. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary złożonych struktur biologicznych bez wyraźnych punktów orientacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tim Daley i Andrew Smith dostarczyli wielu użytecznych dyskusji obliczeniowych w początkowym okresie; Tim Daley napisał program, rotate_translate_cylindrical niezbędny do Protokołu 5. Zasoby obliczeniowe zostały dostarczone przez High Performance Computing Cluster na Uniwersytecie Południowej Kalifornii. Prace te były wspierane przez NIH grant #GM098536 (MDD).

Wszystkie procedury i personel zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Kalifornii (IACUC), protokół #11394.
1. Sekcja i przygotowanie baculum
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji dojrzałego płciowo samca myszy poprzez nadmierną ekspozycję na dwutlenek węgla, zgodnie z protokołami określonymi przez odpowiedni Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC).</li>
	<li>Połóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i wysuń penisa, wywierając nacisk kciukami bocznie do otworu napletka.</li>
	<li>Gdy penis jest przedłużony, rozciągnij tkankę przez napletek tak daleko, jak to możliwe.</li>
	<li>Nożyczkami przetnij ciało prącia prącia proksymalnie do żołędzi prącia, w którym znajduje się baculum.</li>
	<li>Przenieś wypreparowanego penisa do probówki o pojemności 1,7 ml i dodaj 200 μl wody z kranu. Upewnij się, że penis jest całkowicie zanurzony w płynie.</li>
	<li>Inkubować tkankę w wodzie o temperaturze ~50 °C przez 3-5 dni.</li>
	<li>Po prawidłowej inkubacji należy usunąć otaczającą tkankę z baculum za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym. Delikatnie spryskaj 70% etanolem, aby odepchnąć pozostałą tkankę i oczyścić kość.</li>
	<li>Umieść wypreparowaną baculum w nowej probówce do mikrowirówki z otwartą nakrętką. Pozostaw nakrętkę otwartą O/N, aby wysuszyć kość.</li>
</ol>
2. Skanowanie mikrotomografią komputerową
<ol>
	<li>Wciśnij cylindryczny uchwyt do skanowania mikrotomografii komputerowej w cegiełkę pianki florystycznej, aby utworzyć cylinder z pianki florystycznej.</li>
	<li>Wyjmij cylinder pianki florystycznej i pokrój plastry o grubości ~2-5 cm.</li>
	<li>Wepchnij wysuszoną baculę do pianki florystycznej, na obrzeżach pojedynczego plasterka, aby zminimalizować zakłócenia podczas skanowania. W protokole 4 należy zwrócić uwagę na dokładne ułożenie kości, co pozwoli na właściwą identyfikację poszczególnych okazów.</li>
	<li>Delikatnie umieść plaster z osadzonymi kośćmi w uchwycie mikrotomografii komputerowej.</li>
	<li>Uzyskaj skany mikrotomografii komputerowej. W przypadku mysiego bacula14 użyliśmy skanera uCT50 (Scanco Medical AG, Bruttisellen, Szwajcaria) w Centrum Obrazowania Molekularnego USC przy następujących ustawieniach: 90 kVp, 155 μA, filtr Al 0,5 mm, 750 projekcji na 180 (pokrycie 360), czas naświetlania 500 ms i rozmiar woksela 15,5 mm.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie MicroCT: Konwersja pliku . Stos DCM do pojedynczego pliku .xyz
UWAGA: Każdy skan mikrotomografu komputerowego wytwarza stos . DCM lub "dicom", pliki reprezentujące wycinki obrazu wykonane przez obiekt. Cała dalsza geometria obliczeniowa wymaga płaskich plików .xyz, które są po prostu plikiem tekstowym zawierającym cztery kolumny – współrzędne x, y i z każdego piksela oraz intensywność piksela w zakresie od -5 000 () do +5 000 (biały). Próg pikseli powyżej 3 000 zazwyczaj dobrze sprawdza się jako próg do definiowania kości.
<ol>
	<li>Zainstaluj język Python (www.python.org) i moduły PYTHON COMMANDS, DICOM, PYLAB, SYS i NUMPY.</li>
	<li>Otwórz "01_process_dicom.py"{Figshare} za pomocą dowolnego edytora tekstu. W sekcji Zmienne zmień odpowiednio ścieżkę, progi pikseli i nazwy katalogów.</li>
	<li>Uruchom "python 01_process_dicom.py". Postęp zostanie wydrukowany na ekranie. W każdym katalogu wymienionym w kroku 3.2 tworzony jest nowy plik o nazwie; Na przykład directory_name. PT3000.xyz, gdzie PT3000 wskazuje próg pikseli wskazany w kroku 3.2.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie mikrotomografii komputerowej: Segmentacja indywidualnych próbek .xyz Pliki .xyz
<ol>
	<li>Zainstaluj język R (https://www.r-project.org/) z biblioteką RGL.</li>
	<li>Otwórz plik '02_segment_dicoms.r'{Figshare} za pomocą dowolnego edytora tekstu. W sekcji Zmienne zmień nazwę ścieżki tak, aby wskazywała plik .xyz utworzony w protokole 3 powyżej.</li>
	<li>Z poziomu R uruchom polecenie "source('02_segment_dicoms.r')" (bez podwójnych cudzysłowów).</li>
	<li>Po wyświetleniu trójwymiarowego obrazu pliku .xyz utworzonego w protokole 3 wprowadź liczbę próbek w całym pliku .xyz. Następnie oznacz i wybierz punkty z każdej próbki za pomocą funkcji przewijania i powiększania. 
	UWAGA: W tle zostaną utworzone osobne pliki .xyz dla każdego próbnika. Pojawiają się one w katalogu o nazwie na przykład XYZ_FILES_PT3000, gdzie PT3000 wskazuje używany próg pikseli.</li>
</ol>
5. "Wyrównywanie" plików .xyz próbek do wspólnych współrzędnych.
<ol>
	<li>Otwórz skrypt Pythona "03_transform.py"{Figshare}, który wymaga dodatkowego modułu mattdean_modules.py{Figshare}, a także dwóch samodzielnych aplikacji: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) i "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm), które są używane przez ten skrypt.</li>
	<li>W sekcji Zmienne zidentyfikuj pełne nazwy ścieżek do mattdean_modules.py, rotate_path i qconvex_dir. Ponadto zidentyfikuj pełną ścieżkę do katalogu zawierającego poszczególne pliki .xyz utworzone w kroku 4.</li>
	<li>Uruchom polecenie 03_transform.py, które tworzy nowy plik dla każdej próbki z sufiksem . TRANSFORMED.xyz.</li>
</ol>
6. "Krojenie" wyrównanych plików .xyz próbek w celu identyfikacji pół-punktów orientacyjnych.
<ol>
	<li>Otwórz i uruchom skrypt Pythona "04_identify_landmarks.py"{Figshare}. W sekcji Zmienne zidentyfikuj pełne nazwy ścieżek do katalogu zawierającego pliki .TRANSFORMED.xyz. Ten skrypt identyfikuje 802 półpunkty orientacyjne, które można wykorzystać do ilościowego określenia rozmiaru i kształtu struktury.</li>
</ol>

<ol><li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.anthro.34.081804.120613">Geometrics morphometrics.</a> Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).</li>
<li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlice%2C+DE+%22Modern+morphometrics+in+physical+anthropology%22">Modern morphometrics in physical anthropology</a>. 6, Springer. (2005).</li>
<li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZelditch%2C+ML+%22Geometric+morphometrics+for+biologists%3A+a+primer%22">Geometric morphometrics for biologists: a primer</a>. , 2nd, Elsevier. (2012).</li>
<li>Bookstein, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBookstein%2C+F+%22Morphometric+tools+for+landmark+data%3A+geometry+and+biology%22">Morphometric tools for landmark data: geometry and biology</a>. , Cambridge University Press. (1991).</li>
<li>Rohlf, F. J., Marcus, L. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21236128">A Revolution in Morphometrics.</a> Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).</li>
<li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZelditch%2C+ML+%22Geometric+morphometrics+for+biologists%3A+a+primer%22">Geometric morphometrics for biologists: a primer</a>. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Rohlf, F. J., Slice, D. E. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2992207">Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks.</a> Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).</li>
<li>Gunz, P., Mitteroecker, P. <a target="_blank" href="http://www.italian-journal-of-mammalogy.it/article/view/6292">Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces.</a> Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).</li>
<li>Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+bony+labyrinth+reconsidered%2C+introducing+a+comprehensive+geometric+morphometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach.</a> J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).</li>
<li>Mitteroecker, P., Gunz, P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11692-009-9055-x">Advances in geometric morphometrics.</a> Evol. Biol. 36 (2), 235-247 (2009).</li>
<li>Bookstein, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landmark+methods+for+forms+without+landmarks%3A+morphometrics+of+group+differences+in+outline+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Im.+Anal%22%5BJournal%5D)">Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape.</a> Med. Im. Anal. 1 (3), 225-243 (1997).</li>
<li>Gunz, P., Mitteroecker, P., Bookstein, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGunz%2C+P+%22Modern+morphometrics+in+physical+anthropology%22">Modern morphometrics in physical anthropology</a>. Slice, D. E. , Kluwer Press. 73-98 (2005).</li>
<li>Oxnard, C., O'Higgins, P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1162/biot.2009.4.1.84">Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology?</a> Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).</li>
<li>Schultz, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+baculum+size+and+shape+variation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of baculum size and shape variation in mice.</a> G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).</li>
<li>Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculum+was+gained+and+lost+multiple+times+during+mammalian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution.</a> Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).</li>
<li>Dines, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+selection+targets+cetacean+pelvic+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Sexual selection targets cetacean pelvic bones.</a> Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).</li>
<li>Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/2041-210X.12035/abstract">geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data.</a> Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Krytyczne kroki w powyższym protokole to: 1) wypreparowanie bacula, 2) zebranie obrazów mikroCT, 3) konwersja danych wyjściowych mikroCT na płaski plik współrzędnych x-y-z, 4) segmentacja chmury punktów każdej próbki, 5) przekształcenie każdej próbki do znormalizowanego układu współrzędnych oraz 6) zdefiniowanie półpunktów orientacyjnych. Te kroki można łatwo zmodyfikować, aby dostosować je do różnych obiektów.
Metody te można prawdopodobnie zastosować do każdego obiektu, który jest zasadniczo...

Dziedzina morfometrii obejmuje różnorodność metod ilościowego określania wielkości i kształtu formy biologicznej, co jest fundamentalnym krokiem w badaniach naukowych1,2,3,4,5,6. Tradycyjnie, analiza statystyczna rozmiaru i kształtu rozpoczyna się od zidentyfikowania punktów orientacyjnych w strukturze biologicznej, a następnie pomiaru odległości liniowych, kątów i stosunków, które można analizować w ramach wielowymiarowych. Morfometria geometryczna oparta na punktach orientacyjnych to podejście, które zachowuje przestrzenne położenie punktów orientacyjnych, zachowując informacje geometryczne z gromadzenia danych poprzez analizę i wizualizację5. Uogólniona analiza prokrustowa (GPA) może być zastosowana do usunięcia różnic w lokalizacji, skali i obrocie punktów orientacyjnych, aby uzyskać wyrównanie między próbkami, które minimalizuje ich kwadratowe różnice - to, co pozostaje, to odmienność kształtu7.
Ważnym pojęciem każdej analizy morfometrycznej jest homologia, czyli idea, że można wiarygodnie zidentyfikować punkty orientacyjne reprezentujące biologicznie znaczące i dyskretne cechy, które odpowiadają między próbkami lub strukturami. Na przykład ludzkie czaszki mają wyrostki homologiczne, otwory, szwy i przewody, które mogą umożliwić analizy morfometryczne. Niestety, identyfikacja odpowiadających im punktów orientacyjnych jest trudna w przypadku wielu struktur biologicznych, zwłaszcza tych o gładkich powierzchniach lub krzywych8,9,10.
Podchodzimy do tego problemu poniżej, używając geometrii obliczeniowej. Ogólny przepływ pracy polega na wygenerowaniu trójwymiarowego skanu obiektu, który można przedstawić jako chmurę punktów, a następnie obróceniu i przekształceniu tej chmury punktów tak, aby wszystkie próbki były zorientowane we wspólnym układzie współrzędnych. Następnie matematycznie definiujemy półpunkty orientacyjne z konkretnych regionów obiektu. Dyskretne półpunkty orientacyjne umieszczone w takich regionach są biologicznie arbitralne11. Przeprowadzanie GPA i późniejszych analiz statystycznych może prowadzić do powstania niepożądanych artefaktów8,12, ponieważ arbitralnie rozmieszczone punkty orientacyjne mogą nie być biologicznie homologiczne. Dlatego pozwalamy tym pół-punktom orientacyjnym matematycznie się "ślizgać". Ta procedura minimalizuje różnicę potencjałów między konstrukcjami. Jak argumentowano w innym miejscu, zastosowany tutaj algorytm przesuwania jest odpowiedni do ilościowego określania podobnych obszarów anatomicznych, w których brakuje łatwych do zidentyfikowania odpowiednich punktów orientacyjnych3,6,8,10,11,12. Te metody mają swoje ograniczenia13, ale powinny być przystosowane do obiektów o różnych rozmiarach i kształtach.
Tutaj ilustrujemy, jak ta metoda została zastosowana w niedawnym badaniu myszy baculum14, kości w penisie, która została zdobyta i utracona wiele niezależnych razy podczas ewolucji ssaków15. Omawiamy sekcję i przygotowanie określonej kości, baculum (Protokół 1), generowanie obrazów mikroCT (Protokół 2) oraz konwersję tych obrazów do formatu, który umożliwia całą dalszą geometrię obliczeniową (Protokoły 3 i 4). Po tych krokach każdy okaz jest reprezentowany przez ~100K współrzędnych x-y-z. Następnie przechodzimy przez serię transformacji, które skutecznie wyrównują wszystkie próbki do wspólnej orientacji (Protokół 5), a następnie definiujemy półpunkty orientacyjne z wyrównanych próbek (Protokół 6). Protokoły 1-4 powinny być podobne niezależnie od analizowanego obiektu. Protokoły 5 i 6 zostały zaprojektowane specjalnie dla baculum, ale mamy nadzieję, że poprzez wyszczególnienie tych kroków, badacze będą w stanie wyobrazić sobie modyfikacje, które byłyby istotne dla ich obiektu zainteresowania. Na przykład, modyfikacje tych metod zostały zastosowane do badania kości miednicy i żeber wielorybów16.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>VWR</td><td>470106-338</td><td>Większość rozmiarów powinna działać</td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne, cienka końcówka, zakrzywiona</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 1,7 ml</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>Do rozcieńczenia do 70% do rozwarstwienia</td></tr><tr><td>Pianka kwiatowa</td><td>Hurtownia kwiatowa</td><td>6002-48-07</td><td></td></tr><tr><td>Skaner uCT50&nbsp;</td><td>Scanco Medical AG, Bruttisellen, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparacja, tomografia komputerowa i analizy morfometryczne baculum

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Nowoczesna morfometria dostarcza potężnych metod do ilościowego określania zmienności rozmiaru i kształtu. Podstawowym wymaganiem jest lista współrzędnych, które definiują punkty orientacyjne; Jednak takie współrzędne muszą reprezentować struktury homologiczne w różnych próbkach. Podczas gdy wiele obiektów biologicznych składa się z łatwych do zidentyfikowania punktów orientacyjnych, aby spełnić założenie o homologii, wielu z nich brakuje takich struktur. Jednym z potencjalnych rozwiązań jest matematyczne umieszczenie na obiekcie półpunktów orientacyjnych, które reprezentują ten sam region morfologiczny we wszystkich próbkach. W tym miejscu ilustrujemy niedawno opracowany potok do matematycznego definiowania półpunktów orientacyjnych z baculum myszy (kości penisa). Nasze metody powinny mieć zastosowanie do szerokiego zakresu obiektów.

Współrzędne x-y-z półpunktów orientacyjnych (semi-landmarks) wygenerowane w Protokole 6 można bezpośrednio zaimportować do dowolnej analizy geometrycznej morfometrii opartej na punktach orientacyjnych17. Powyższy schemat obliczeniowy został zastosowany do badania baculum myszy14, a także kości miednicy i żeber wieloryba16. Więcej szczegółów na temat obliczeniowej definicji półpunktów orientacyjnych przedstawiono tutaj...

Wiele struktur biologicznych nie ma łatwo definiowalnych punktów orientacyjnych, co utrudnia zastosowanie nowoczesnych metod morfometrycznych. Tutaj ilustrujemy metody badania baculum myszy (kości w penisie), w tym sekcję i skanowanie mikrotomografią komputerową, a następnie metody obliczeniowe do definiowania półpunktów orientacyjnych, które są używane do ilościowego określania zmienności rozmiaru i kształtu.

Preparacja, tomografia komputerowa i analizy morfometryczne baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Ogólnym celem tej dyssekcji i analizy morfometrycznej jest zilustrowanie niezawodności naszej metodologii morfometrycznej w badaniu struktur o złożonych kształtach, takich jak kość prącia myszy. Pomysł na to badanie pojawił się, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że istniejące metody pomiaru zmienności baculum, takie jak określanie długości i szerokości, pomijają wszelkie informacje o krzywiźnie i złożoności kształtu; opracowaliśmy zatem tę metodę, aby ilościowo określić zmienność rozmiaru i kształtu dowolnej kości lub interesującej nas struktury w trzech wymiarach. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie nowoczesnej morfometrii do struktur pozbawionych punktów charakterystycznych.Powinno to przyczynić się do rozwoju dziedziny poprzez zapewnienie ulepszonych, powtarzalnych pomiarów złożonych struktur. Umieść uśpionego, osiągłego samca myszy w pozycji na plecach i wysuń prącie, wywierając kciukiem nacisk bocznie od otworu napletka. Po wysunięciu prącia wyciągnij tkankę przez napletek tak daleko, jak to możliwe.Następnie, używając nożyczek, odetnij trzon prącia proksymalnie względem żołędzi, w miejscu, w którym znajduje się baculum, oddzielając prącie. Następnie całkowicie zanurz prącie w około 200 µL wody z kranu w probówce do mikrowirówki. Aby zmiękczyć tkankę, inkubuj ją w temperaturze około 50 °C przez okres od trzech do pięciu dni.Zmiękczanie tkanek zmniejsza ryzyko złamania kości podczas ekstrakcji. Po inkubacji, przy użyciu mikroskopu sekcyjnego i pincety, należy usunąć większość tkanek otaczających baculum. Po sekcji wstępnej należy delikatnie spryskać kość 70% etanolem, aby usunąć pozostałe tkanki i oczyścić kość.Następnie umieść wypreparowane baculum w nowej probówce do mikrowirówki i pozostaw kość do wyschnięcia w temperaturze pokojowej z otwartą zakrętką. Na początek przygotuj materiał, w którym zostanie umieszczona kość. Wciśnij cylindryczny uchwyt do tomografii komputerowej (CT) w kostkę gąbki florystycznej.Następnie wyjmij powstały cylinder pianki i wytnij plastry o grubości od dwóch do pięciu centymetrów. Teraz wciśnij od 10 do 15 wysuszonych bacula w piankę florystyczną wokół obwodu pojedynczego plastra, aby zminimalizować zakłócenia podczas skanowania. Odnotuj dokładną orientację kości w celu jej późniejszej identyfikacji.Następnie ostrożnie umieść kości w piance w uchwycie do mikro-tomografii komputerowej i wprowadź uchwyt do skanera micro CT 50. Skonfiguruj skaner micro CT 50 w następujący sposób. Użyj napięcia 90 kV, rozmiaru woksela 155 Å, filtra aluminiowego 5 mm, 750 projekcji na 180 stopni oraz czasu ekspozycji 500 ms.Następnie należy przystąpić do skanowania preparatu. Kości baculum zostały wypreparowane, przygotowane i zeskanowane zgodnie z opisanym protokołem. Wiele kości można umieścić w ramach jednego skanowania CT.Obrazy zostały następnie przetworzone z wykorzystaniem geometrii obliczeniowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ten proces obrazowania powinien znaleźć zastosowanie w badaniach szerokiego spektrum kości oraz innych obiektów zainteresowania. Analiza dostarcza szczegółowych informacji na temat cech punktów charakterystycznych obiektu i jest w dużym stopniu zautomatyzowana.Proces ten wymagał jedynie około 10 ręcznych korekt podczas analizy 369 bacula. Co istotne, nasze metody mogą zostać zastosowane do szerokiej gamy złożonych struktur. Metody te pozwoliły nam na ilościowe określenie rozmiaru i kształtu baculum w trzech wymiarach.

dissection-microct-scanning-and-morphometric-analyses-of-the-baculum

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikrodysekcja jest szeroko stosowana do badania DNA, RNA i białek w tkance.   Mikroskopia laserowa (LCM) jest najczęściej stosowaną metodą, ale od niedawna dostępna jest nowa technika mielenia, mezodysekcja.  Pokazujemy ekstrakcję RNA z mezorozpreparowanych szkiełek tkankowych zatopionych w parafinie w formalinie ziarniniaków Mycobacterium tuberculosis.

Nowatorskie podejście do mikrodysekcji w celu odzyskania specyficznych transkryptów Mycobacterium tuberculosis z ziarniniaków płuc zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie

Celem tego protokołu jest wygenerowanie modelu złamania kompresyjnego kręgów związanego z osteoporozą u nagich szczurów, który może być oceniany in vivo za pomocą półautomatycznej ilościowej analizy strukturalnej opartej na mikrotomografii komputerowej.

Półautomatyczna ilościowa analiza strukturalna oparta na mikrotomografii komputerowej nagiego szczura Model złamania kręgów związanego z osteoporozą

Ten manuskrypt przedstawia metody analizy zmian morfometrycznych i komórkowych w obrębie kłykcia żuchwy gryzoni.

Metoda analizy morfometrycznej i komórkowej mysiego kłykcia żuchwy

Mikroglej to komórki odpornościowe mózgu, które badają i reagują na zmienione fizjologie mózgu poprzez zmiany morfologiczne, które mogą być oceniane ilościowo. Protokół ten przedstawia protokół analizy oparty na ImageJ, aby przedstawić morfologię mikrogleju jako ciągłe dane zgodnie z takimi wskaźnikami, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt.

Kwantyfikacja morfologii mikrogleju na podstawie mikrofotografii immunohistochemicznej tkanki przygotowanej za pomocą ImageJ

Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.

Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Ten protokół opisuje kanoniczną metodę zrozumienia krytycznych genów kontrolujących aktywność osteoklastów in vivo. Metoda ta wykorzystuje transgeniczny model myszy i niektóre techniki kanoniczne do analizy fenotypu szkieletu.

Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) jest stosowana do obrazowania i analizy kolców dendrytycznych w mysim hipokampie.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

Ten protokół przedstawia ekonomiczną i efektywną metodę ilościowej oceny mikroarchitektury kości w mysim modelu osteoporozy poprzez połączenie barwienia Hematoxylin-Eosin (HE) i technik mikrotomografii komputerowej (Micro-CT).

Ocena mikroarchitektury kości beleczkowej w mysim modelu osteoporozy

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę, która opiera się na mikrotomografii komputerowej, do segmentacji i pomiaru modeli 3D kości czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy, dla lepszej oceny rozwoju kości czaszkowo-szczękowo-twarzowej u myszy niż jest to możliwe przy użyciu obecnych metod.

Analiza malformacji czaszkowo-szczękowo-twarzowych u myszy za pomocą trójwymiarowej mikrotomografii komputerowej

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Poznaj metodę morfometryczną analizy baculum myszy przy użyciu mikrotomografii komputerowej i półznaczników. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary złożonych struktur biologicznych bez wyraźnych punktów orientacyjnych.

Preparacja, tomografia komputerowa i analizy morfometryczne baculum

Przeglądaj więcej filmów