Izolowanie i analiza komórek mezenchymy trzustki za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mezenchymalnych komórek trzustki w celu analizy ich ekspresji genów i markerów powierzchniowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju trzustki, takie jak to, jakie sygnały są wyrażane przez komórki mezenchymalne i jak wpływają one na rozwój nabłonka. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta i szybka oraz pozwala na dobrą wydajność posortowanych komórek.

Rozpocznij od umieszczenia narządów wewnętrznych w naczyniu hodowlanym zawierającym HBSS i umieszczeniu szalki pod mikroskopem stereoskopowym. Odłącz wątrobę i nerki, aby odsłonić trzustkę, używając cienkich kleszczy, aby usunąć trzustkę z żołądka, dwunastnicy i śledziony. Po pobraniu każdej trzustki przenieś tkankę do stożkowej rurki zawierającej świeżo przygotowany bufor trawienny i umieść rurkę na lodzie.

Po pobraniu całej trzustki przenieś tkanki do bloku grzewczego o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut z mieszaniem przy 700 obr./min, ręcznie odwracając probówki trzy do czterech razy po 15 minutach. Jeśli duże kawałki trzustki są nadal obecne po pierwszej połowie trawienia, należy odwracać rurkę co pięć minut przez ostatnie 15 minut i inkubować tkankę przez dodatkowe pięć do 10 minut, jeśli to konieczne. Pod koniec mineralizacji umieść probówki na lodzie i dodaj 10 mililitrów zimnego HBSS do każdej próbki.

Zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w dwóch mililitrach świeżego PBS. Następnie przefiltruj komórki przez sitka o grubości 35 mikronów do pięciu mililitrowych probówek do zbierania polistyrenu o okrągłym dnie i umyj probówki do wytrawiania dwoma mililitrami świeżego PBS, przecedzając popłuczyny do odpowiednich probówek zbiorczych. Następnie ponownie odwirować komórki i ostrożnie zassać supernatanty, nie naruszając osadów.

Ponownie zawiesić komórki w buforze sortującym w zależności od wieku zwierząt i przefiltrować je przez nowe sitka do komórek o średnicy 35 mikronów do nowych pięciomililitrowych probówek zbiorczych. Porcjować od 50 do 100 mikrolitrów objętości komórek do nowych probówek FACS do kontroli barwienia, w tym probówkę dla każdego fluoroforu, barwnika żywotności, białek fluorescencyjnych i niebarwionej kontroli. Przemyć każdą probówkę do czterech mililitrów buforu sortującego, a następnie odwirować.

Następnie ponownie zawieś granulki w świeżym buforze do sortowania w zależności od wieku zwierząt. Następnie wybarwić komórki barwnikiem żywotności. W przypadku sortowania komórek przed ekstrakcją RNA, bezpośrednio przed rozpoczęciem sortowania, należy pokryć sterylną probówkę o pojemności 1,5 mililitra jednym mililitrem buforu sortującego zawierającego inhibitor RNAzy.

Po pięciu minutach przekręć rurkę zbiorczą i usuń płyn. Wykonaj wir pierwszej kontroli barwienia i załaduj probówkę do cytometru przepływowego, aby rozpocząć określanie parametrów sortowania. Po ustawieniu wszystkich parametrów sortowania załaduj próbki i posortuj komórki do probówek zbiorczych o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie zbierz posortowane komórki przez odwirowanie. Odessać supernatant do osadu i wyekstrahować RNA zgodnie ze standardowymi protokołami ekstrakcji RNA. Tutaj pokazano izolowany cały przewód pokarmowy, w tym żołądek, śledzionę, jelito i trzustkę zarodka embrionalnego w dniu 15,5 i młodego w czwartym dniu po urodzeniu.

Analiza cytometryczna przepływowa pojedynczych komórek z embrionalnych, noworodkowych i dorosłych tkanek trzustki wyizolowanych, jak właśnie wykazano, ujawnia, że transgeniczne tkanki trzustki ze wszystkich analizowanych grup wiekowych zawierają odrębne populacje komórek znakowanych YFP. Po posortowaniu te komórki mezenchymalne można hodować w celu ustanowienia linii komórkowej dla co najmniej pięciu pasaży. Zwróć uwagę na zwłóknieniową morfologię hodowanych komórek typową dla komórek mezenchymalnych.

Posortowane komórki wyrażają marker panmezenchymalny żyłynę, analizowany za pomocą qPCR po ekstrakcji RNA i syntezie cDNA. Co więcej, ekspresja markera powierzchni izolowanej komórki trzustki wskazuje, że wszystkie fluorescencyjnie znakowane komórki w transgenicznej trzustce YFP wyrażają CD9, glikoproteinę na powierzchni komórki, która podobno ulega ekspresji przez fibroblasty. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji genów komórek mezenchymalnych.