Zastosowanie klasycznego warunkowania śladowego mrugnięcia okiem do oceny dysfunkcji hipokampa w szczurzym modelu zaburzeń ze spektrum alkoholowych płodów

Ogólnym celem tego eksperymentu jest pokazanie, w jaki sposób klasyczne warunkowanie śladowe mrugania okiem, forma uczenia się asocjacyjnego, może pomóc w wykryciu dysfunkcji hipokampa w szczurzym modelu płodowych zaburzeń ze spektrum alkoholowego. Nowonarodzone szczenięta szczurów są poddawane dużej dawce alkoholu, stężeniu 11,9% objętości alkoholu w sposób przypominający upijanie się. W odpowiedniku trzeciego trymestru u ludzi w odniesieniu do wzrostu mózgu.

Ten wzorzec ekspozycji na alkohol i dawki są kluczowymi czynnikami powodującymi deficyty mózgu w ciągu życia, naśladując przypadki FASD u ludzi. Ważnym obszarem mózgu, który jest zagrożony przez wczesną ekspozycję na alkohol, jest hipokamp. Po tym, jak szczury dorosną jako dorosłe, są badane pod kątem dysfunkcji hipokampa za pomocą klasycznego warunkowania śladowego mrugnięcia.

Jest to forma uczenia się asocjacyjnego wysokiego rzędu, która opiera się na integralności hipokampa. W dniach po urodzeniu od czwartego do dziewiątego młode szczurów są ważone każdego ranka i rejestrowana jest ich waga. Objętości karmienia są następnie uzyskiwane z wcześniej wydrukowanej tabeli w oparciu o masę ciała.

Roztwór alkoholu o objętości 11,9% objętości jest dostarczany szczeniętom szczurów w ciągu dwóch karmień, które są oddzielone od siebie o dwie godziny. Całkowita dzienna dawka alkoholu wynosi 5,25 grama na kilogram dziennie. Ten paradygmat ekspozycji na napady objadania się dostarcza 0278 milili alkoholu na gram masy ciała na karmienie w roztworze mlecznym.

Ekstrahować mleko zawierające alkohol za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra. Następnie wypchnij nadmiar roztworu, aby uzyskać dokładnie taką ilość, jaka jest potrzebna. Zanurz końcówkę rurki PE-10 w świeżym oleju kukurydzianym.

Ułatwia to wkładanie. Zmierz długość rurki PE-10 od pyska szczeniaka do jego żołądka. W razie potrzeby wyreguluj ogranicznik PE-50 tak, aby działał jako wizualna prowadnica punktu zatrzymania.

Ostrożnie włóż rurkę PE-10 do pyska szczeniaka. Zazwyczaj napotkasz pewien opór, gdy końcówka styka się z gardłem. Manewruj rurką, aż końcówka zagnie się w wejściu do przełyku.

Staraj się, aby rurka nie zsunęła się do tyłu, ponieważ może być śliska z olejem. Idź w dół przełyku, a gdy końcówka przejdzie przez zwieracz przełyku, wejdzie do żołądka. Zatrzymaj się w tym momencie, ustabilizuj pompę i dostarcz roztwór.

Należy to robić w powolnym tempie. Ostrożnie wyjmij rurkę PE-10 i sprawdź, czy pup nie ma wstecznego płukania roztworu, krwi lub obrażeń fizycznych. Zamień szczenię na jego kolegów z miotu, jeśli wszystko jest w porządku.

Zapoznaj się z pisemnym protokołem i listą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi instrumentami stosowanymi w zabiegu chirurgii powiek. Wysterylizuj pole operacyjne zatwierdzonym środkiem dezynfekującym i zawczasu sterylizuj w autoklawie wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne. Po wywołaniu odpowiedniego znieczulenia u szczura izofluranem, należy ogolić jego głowę za pomocą trymera do futra, odsłaniając wystarczającą ilość skóry na miejsce nacięcia i lewą powiekę.

Jego skóra jest sterylizowana poprzez wykonanie trzech naprzemiennych peelingów z udziałem 70% alkoholu izopropylowego i jodowidonu. Postępuj zgodnie ze standardową procedurą mocowania szczura do urządzenia stereotaktycznego za pomocą nauszników. Kontynuuj operację, gdy szczur wykaże odpowiednią płaszczyznę znieczulenia.

Użyj ostrza skalpela, aby wykonać przednie tylne nacięcie na linii środkowej. To nacięcie powinno odsłonić wystarczający obszar z przodu oczu i nieco z tyłu do linii lambda sutoralnej. Użyj ostrza skalpela, aby zeskrobać okostną na wierzchu czaszki, ostrożnie, aby nie spowodować nadmiernego krwawienia.

Zetrzyj nadmiar tkanki łącznej i krwi wacikiem z bawełnianą końcówką i spłucz obszar sterylną solą fizjologiczną między zadrapaniami. Wywierć otwór zaczynający się bezpośrednio za szwem koronalnym na jednej kości ciemieniowej. Usuń wszelkie resztki krwi i kości za pomocą wacika z bawełnianą końcówką.

Użyj kleszczy do odłamków, aby chwycić 0 80. Użyj śrubokręta jubilerskiego, aby przymocować do otworu, dokręć na tyle, nie uszkadzając tkanki mózgowej kory mózgowej, zwykle trzy do czterech pełnych obrotów. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, aby zabezpieczyć pozostałe.

Powinny być dwie zabezpieczone obustronnie za szwem koronalnym i jedna na prawej kości ciemieniowej, przed szwem lambda. Chwyć górną część skóry w miejscu nacięcia lewego oka czterocalowymi kleszczami opatrunkowymi i skieruj trzycalowe kleszcze opatrunkowe w kierunku kącika tego oka. Weź jedną igłę 3/8 cala o rozmiarze 26 i włóż ją przez kącik powieki.

Obrócić igłę tak, aby skośna strona była skierowana do góry. Włóż drugą igłę na środek powieki. Użyj cienkich kleszczy, aby chwycić drut 3T i włóż go do jednej z igieł.

Nie musisz wkładać go do końca. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla drugiego przewodu 3T. Chwyć obie igły jedną ręką, a drugą ręką chwytając stopień głowy.

Jednym ciągłym ruchem odciągnij igły od powieki, prowadząc stopień głowy w tym samym kierunku. Trzymając jedną ręką stopień głowy EMG, drugą ręką użyj trzycalowych kleszczy opatrunkowych, aby owinąć drut 10T wokół jednej lub obu po prawej stronie. Schowaj ten drut tak, aby nie wystawał ze.

Stopień głowy EMG powinien być wyśrodkowany przed przejściem do następnego kroku. Użyj czterocalowych kleszczy opatrunkowych, aby utworzyć małą kieszeń, oddzielając skórę, czyli powierzchowną powięź od mięśnia skroniowego. Po utworzeniu kieszeni użyj nożyczek do tęczówki, aby odciąć więcej tkanki łącznej, kierując się w stronę kącika lewego oka.

Uważaj, aby nie wchodzić zbyt głęboko ani nie przecinać naczyń krwionośnych. Weź elektrodę bipolarną i ukształtuj przewód drutowy tak, aby można je było dopasować wzdłuż krzywizny mięśnia skroniowego. Dwa zęby będą umieszczone z tyłu lewego oka, a dolny koniec elektrody bipolarnej będzie umieszczony prosto na szczycie czaszki.

Wymieszaj proszek Ortho Jet z płynnymi składnikami, aby uzyskać płynną konsystencję. Nałóż pastę mikroszpatułką wokół miejsca nacięcia. Uważaj, aby nie upuścić pasty na oczy szczura i trzymaj ją w zamknięciu.

Pozwól Ortho Jet osiągnąć stan półsuchy, a następnie użyj kleszczyków do odłamków, aby usunąć nadmiar akrylu ze stopnia głowicy EMG. I gwinty elektrody bipolarnej. Odetnij nadmiar drutu 3T, pozostawiając kilka centymetrów do pracy.

Ostrożnie usuń osłonę PTFE z każdego przewodu 3T za pomocą mikrokleszczy preparacyjnych. Pozwala im to na nawiązanie kontaktu z mięśniem okrężnym oka. Użyj mikro kleszczy preparacyjnych, aby utworzyć haczyki na każdym końcu drutów 3T.

Odetnij nadmiar drutu, uważając, aby nie odciąć go tak bardzo, aby pozostały drut cofnął się z powrotem do powieki. Okablowanie jest wykonane we własnym zakresie. Biała wtyczka bipolarna jest podłączana jako pierwsza, co umożliwia dostarczenie bodźca szokowego US.

Następnie podłącza się pomarańczową wtyczkę stopnia głowicy EMG. Rejestruje aktywność elektromiograficzną, gdy szczur mruga. Obie wtyczki prowadzą do okrągłego komutatora w górnej części ramienia, który utrzymuje ciągłość sygnału, gdy szczur porusza się swobodnie.

Izolator bodźca jest włączany i dokonywane są końcowe kontrole sprzętu. Obejmuje to dostosowanie linii bazowej EMG do poziomu, który jest widoczny na ekranie komputera. W pierwszej sesji intensywność wstrząsu jest najpierw ustawiana na 4 miliampery i będzie zwiększana w jednostkach wzmacniacza 4 mil co dwie próby.

Ta procedura stopniowego wprowadzania pozwala szczurowi przyzwyczaić się do bodźca szokowego. W ósmym badaniu intensywność wstrząsu utrzymuje się na poziomie 1,6 miliampera przez całą tę sesję i wszystkie kolejne sesje. Na oddzielnym komputerze znajduje się czterokanałowy oscyloskop cyfrowy, który pozwala nam na diagnostykę sygnału w czasie rzeczywistym.

Zwróć uwagę na mrugnięcie oczami, które zostało wyemitowane przez szczura w pudełku pierwszym. Oscyloskop wskazuje również, że podstawowy sygnał EMG jest stosunkowo czysty z niskim poziomem szumów. Kamery internetowe pozwalają nam również monitorować każdego szczura.

To jest zrzut ekranu z oprogramowania blink w wersji 4.0, który pokazuje epokę próbną trwającą 1400 milisekund. W ciągu pierwszych 280 milisekund nie są prezentowane żadne bodźce, które pozwoliłyby na uzyskanie miary wyjściowej aktywności EMG. Żółta linia wskazuje linię progową, w której każda odpowiedź EMG, która przekracza 4 wolty powyżej średniej wartości wyjściowej sprzed CS, będzie kwalifikować się jako odpowiedź na mrugnięcie okiem.

Bodziec tonalny o natężeniu 85 decybeli jest dostarczany w punkcie czasowym 280 milisekund. Dźwięk pozostaje włączony przez 380 milisekund, co odpowiada punktowi czasowemu 660 milisekund. Po wyłączeniu następuje 500-milisekundowy interwał, w którym nie są prezentowane żadne bodźce Nazywa się to okresem śladu, w którym szczur musi rozwiązać przesunięcie tonu CS wraz z nadejściem wstrząsu US, który nadal nie został dostarczony po znaku 1160 milisekund.

Szok US trwa 100 milisekund. Naturalnie, szok US wywołuje defensywną reakcję mrugnięcia znaną jako reakcja bezwarunkowa lub UR, która jest mierzona w 140-milisekundowym oknie czasowym. Jedna sesja treningowa składa się ze 100 prób.

Istnieje 90 prób, w których CS i US są sparowane, a w co dziesiątej próbie dostarczany jest tylko CS. W każdej sesji odbywa się 10 prób tylko CS. Badania te pozwalają nam zbadać, czy dowiedzieliśmy się o stowarzyszeniu CS US.

W postaci reakcji warunkowych lub CR jest wyrażany, gdy szok US nie występuje. Interwał między próbami jest uśredniony na 30 sekund, tak aby początek każdej próby nie był przewidywalny. W każdym badaniu szczur może mrugać w dowolnym momencie, a jego EMG zostanie zarejestrowane przez oprogramowanie.

Każde dyskretne mrugnięcie okiem, które przekroczy linię progową, będzie uważane za odpowiedź w jednej z czterech kategorii w zależności od tego, kiedy wystąpi i epoki badania. Jeśli szczur mruga w ciągu pierwszych 80 milisekund po rozpoczęciu sygnału CS, reakcja jest uważana za reakcję zaskoczenia lub SR. Jest to reakcja nieasocjacyjna, która wskazuje na sprawność motoryczną czuciową, ale nie na uczenie się skojarzenia CS US jako takiego. Jeśli po okresie SR, ale przed dostarczeniem wstrząsu US, oznacza to, że wyemitował warunkową odpowiedź.

Jak wspomniano wcześniej, CR jest podstawową miarą uczenia się asocjacyjnego. Oczekuje się, że CR nie rozwinie się we wczesnych fazach treningu, ale wraz z postępem treningu w wielu próbach i sesjach, tego typu reakcje stają się częstsze, mają wyższą amplitudę i mogą być lepiej zsynchronizowane w czasie. Dzielimy CR na dwa typy, całkowite CR i CR adaptacyjne.

Całkowite CR odzwierciedlają ogólną zdolność uczenia się, podczas gdy adaptacyjne CRS odzwierciedlają zdolność zwierzęcia do dobrego wyczucia czasu mrugnięcia. Bezpośrednio przed wystąpieniem wstrząsu, jako sposób na przygotowanie się, adaptacyjny okres CR wynosi 200 milisekund przed wystąpieniem wstrząsu w USA. U ssaków z nienaruszonym hipokampem ekspresja adaptacyjnych CR odzwierciedla wysoki poziom zaangażowania hipokampa w prawidłowe wyczucie czasu mrugania w odniesieniu do dostarczania dwóch bodźców.

Ze względu na swoją naturę, warunkowanie klasyczne z mrugnięciem śladowym jest znacznie trudniejsze do zdobycia niż warunkowanie klasyczne z opóźnionym mrugnięciem okiem, w którym ton CS i szok US nakładają się na siebie w czasie. Chociaż ekspresja CR może się różnić w zależności od pacjenta i może być poważnie uzależniona od wyzwań związanych z dyskretnymi obwodami mózgowymi, oczekuje się, że UR będzie emitowany podczas każdej sparowanej próby CS US. W związku z tym miara ta odzwierciedla sprawność sensoryczną motoryczną i, podobnie jak reakcje zaskoczenia, nie wskazuje na uczenie się stowarzyszenia CS US jako takiego.

W poniższej serii klipów wideo zobaczysz konfigurację oprogramowania i początek treningu mrugania oczami. Oprogramowanie blink jest aktywowane, a dwa odpowiednie pliki są rekrutowane. Plik rat zawierający dane podmiotu oraz plik warunkowania śledzenia mrugnięcia.

Program jest realizowany do momentu rozpoczęcia treningu. Po rozpoczęciu treningu zwróć uwagę, że w prawym dolnym rogu ekranu znajduje się licznik czasu, który odlicza czas do następnej próby. Oto nagranie wideo na żywo z pierwszej sesji, próby 15, w której emitowany jest UR, ale nie rozwinęły się jeszcze żadne CR.

Oto powtórka z jedną trzecią prędkości. W poniższej serii klipów zobaczysz zrzuty ekranu z tym samym niezaintubowanym szczurem kontrolnym, który przechodzi przez sześć sesji treningowych. Ostatecznie emituje zarówno całkowite CR, jak i adaptacyjne CR.

Oto klip wideo na żywo z sesji szóstej, próby 96, w której emitowane są dwa mrugnięcia oczami, jedno adaptacyjne CR, a drugie UR. Oto powtórka z jedną trzecią prędkości. W tym ostatnim klipie zobaczysz wideo na żywo zaintubowanego szczura z alkoholem podczas ostatniej próby szóstej sesji, próby tylko CS, nawet po 600 próbach treningu, nie emituje niezawodnie adaptacyjnego CR. Po zebraniu danych są one sprawdzane pod kątem złych prób, składających się z artefaktów o wysokim poziomie szumu i nietypowej aktywności EMG przed CS przy użyciu wbudowanego algorytmu błędów do wykrywania wartości odstających.

Dobre próby, które są przechowywane, są dalej analizowane pod kątem SR, UR, całkowitych CR i adaptacyjnych CR w odniesieniu do procentu odpowiedzi, amplitudy, opóźnienia i innych krytycznych miar. Średnie adaptacyjne CR w sześciu sesjach treningowych są pokazane w tym pierwszym zestawie wyników. Zarówno miary procentowe, jak i amplitudy były statystycznie istotne między grupą zaintubowaną alkoholem a dwiema grupami kontrolnymi od sesji drugiej do szóstej.

Wskazuje to, że częstość i siła adaptacyjnych CR były upośledzone u szczurów narażonych na alkohol we wczesnym okresie rozwoju. Średnie odpowiedzi bezwarunkowe są pokazane w tym drugim zestawie wyników. Zarówno pomiary częstości, jak i amplitudy nie różniły się statystycznie w żadnej z grup.

Wyniki te wskazują, że wczesna ekspozycja na alkohol nie upośledzała zdolności szczurów do mrugania do bezwarunkowego bodźca, ale że upośledzenie, które wykazywały, było spowodowane niepowodzeniem w prawidłowym kojarzeniu CS i US podczas nabywania. W tym eksperymencie zbadaliśmy związek zachowania mózgu, określając, czy rozwojowa ekspozycja na alkohol, która jest dostarczana w sposób podobny do napadów, wpływa na hipokamp, co znajduje odzwierciedlenie w deficytach i klasycznym warunkowaniu mrugania oczami. Rzeczywiście, warunkowanie klasyczne mrugnięcia okiem jest użytecznym narzędziem do oceny neurobehawioralnych konsekwencji związanych z ekspozycją na alkohol podczas rozwoju mózgu.

Jest bardzo wszechstronny, ponieważ poprzez zmianę parametrów bodźca lub wymagań dotyczących uczenia się asocjacyjnego można również ocenić funkcjonalną integralność różnych systemów mózgowych poza hipokampem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć zawiłości związane z podawaniem alkoholu nowonarodzonym szczeniętom szczurów, wszczepianiem elektrod i przeprowadzaniem procedury testowania mrugnięcia. Dziękujemy za obejrzenie tego filmu.