Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym
14 lutego 2017
Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.
Ogólnym celem tego eksperymentu mikroprzepływowego jest jednoczesny pomiar odkładania się płytek krwi w tworzeniu fibryny na powierzchni reaktywnej w warunkach przepływu przy użyciu mikroskopii wideo w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie transfuzjologii dotyczące wpływu preparatu koncentratu płytek krwi na prokoagulacyjny charakter przetoczonej krwi. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia jednoczesną analizę funkcji płytek krwi i krzepnięcia w przepływie, co pozwala na zbadanie wzajemnych zależności między tymi dwoma procesami.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w prokoagulację płytek krwi indukowaną szlakiem kontaktowym, może być również zastosowana do badania szlaku zewnętrznego poprzez pokrycie lipidowym czynnikiem tkankowym. Procedurę zademonstruje Rosalie Devloo, technik z laboratorium. Rozpocznij konfigurację komory przepływowej mikroprzepływów, pipetując 0,8 mikrolitra świeżo odtworzonego kolagenu do pięciu szóstych długości każdego kanału na jednym końcu nowego jednorazowego biochipa mikroprzepływowego z ośmioma prostymi równoległymi kanałami i oznaczając ten koniec mikrochipa jako wylot.
Inkubuj biochip w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny w nawilżonym i szczelnie zamkniętym pojemniku. Pod koniec inkubacji należy wypełnić zakodowane kanały równą liczbą kanałów w kształcie litery Y w biochipie mieszającym z buforem blokującym. Włóż mikroczip do pojemnika na godzinę w temperaturze pokojowej.
Następnie umieść szpilkę na jednym końcu dwóch odcinków rurki o długości ośmiu centymetrów i jednego kawałka rurki o długości dwóch centymetrów oraz na obu końcach jednego kawałka rurki o długości 46 centymetrów dla każdego używanego kanału. Następnie za pomocą oprogramowania Nanopump przepłucz wszystkie płyny pompy w podłączonym wężyku wodą destylowaną i strzykawką w strzykawce, aby napełnić wszystkie inne rurki buforem blokującym. Następnie zamocuj zakodowany biochip na zautomatyzowanym stoliku mikroskopu za pomocą laboratoryjnego podnośnika nożycowego, aby zamocować biochip do mieszania na tej samej wysokości co stolik mikroskopu.
Użyj kołków w ośmiocentymetrowych probówkach, aby przymocować te kawałki rurki do wlotu biochipa do mieszania i umieść wolny koniec każdej probówki w fiolce z buforowaną solą fizjologiczną HEPES. Teraz połącz zakodowany biochip z biochipem mieszającym za pomocą 46-centymetrowego odcinka rurki w elastycznej, ale prostej linii. Przymocuj styk złącza strzykawki do rurki pompy płuczącej kompatybilnej ze złączem Luer.
Następnie podłącz kołek do wolnego końca dwucentymetrowego kawałka rurki i przymocuj drugi koniec rurki do wylotu zakodowanego biochipa. Następnie przepłucz wszystkie rurki i kanały jednym mililitrem HBS. Aby przygotować pompy perfuzyjne, otwórz oprogramowanie sterownika mikroprzepływowej pompy perfuzyjnej i kliknij dwukrotnie ikonę strzykawki, aby zainicjować pompy.
Wybierz typ strzykawki, która będzie używana i odłącz pompę płuczącą oraz podłączone do niej dwucentymetrowe rurki. Podłącz odłączoną dwucentymetrową rurkę za pomocą styku złącza strzykawki do zamka luer kawałka grubościennego przewodu odpływowego i za pomocą strzykawki napełnij grubościenną rurkę standardowym roztworem pepsyny. Następnie zabezpiecz otwarty koniec grubościennej rurki za pomocą zacisku Kocher.
Przypnij rurkę do wylotu zakodowanego biochipa. Odłączyć obie rurki od komory przepływu mieszania i wyrzucić pojemniki HBS. Po uzyskaniu próbki krwi w opróżnionych pojemnikach z cytrynianem sodu, należy odwirować probówki i przenieść osocze bogatopłytkowe do nowej probówki wirówkowej.
Ponownie odkręć pojemniki z osoczem bogatopłytkowym. Następnie przenieść sklarowane osocze ubogie w płytki krwi do innej probówki wirówkowej. Następnie użyj igły o rozmiarze 21, aby przebić dno pojemników z cytrynianem sodu, aby umożliwić nabranie czerwonych krwinek do nowej stożkowej probówki.
Po zebraniu wszystkich upakowanych krwinek czerwonych, delikatnie rozpuść krew, łącząc oddzielone upakowane krwinki czerwone z osoczem ubogim w płytki krwi i dodaj płytki krwi z banku krwi przygotowane do transfuzji, aby uzyskać próbki o stężeniu 40% hematokrytu i 2,5 razy 10 do piątej płytki krwi na mikrolitr do 2,5 mililitra objętości końcowej i uzyskać pełną morfologię krwi. Następnie dodaj 13 mikrolitrów fibrynogenu znakowanego fluoroforem do stożkowej rurki z polistyrenu. Następnie jeden mililitr odtworzonej krwi.
Wymieszaj kolejny mililitr krwi z dwoma mikrolitrami fluorescencyjnego barwnika płytkowego i dodaj do siebie oznaczone próbki krwi. Następnie delikatnie odwróć zmieszane próbki krwi i inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem testu perfuzyjnego należy skoncentrować optykę mikroskopu na włóknach kolagenowych przylegających do dna pierwszego kanału.
Korzystając z oprogramowania do akwizycji, zdefiniuj obszar zainteresowania w wybranym kanale. Załadować jeden mililitr wstępnie podgrzanego buforu krzepnięcia do jednomililitrowej strzykawki i zamontować strzykawkę na pompie perfuzyjnej. Po drugim delikatnym odwróceniu załaduj krew do dwumililitrowej strzykawki i zamontuj strzykawkę na pompie perfuzyjnej.
Następnie użyj kołka łączącego strzykawkę, aby przymocować obie strzykawki do jednego kawałka ośmiocentymetrowej rurki i zalać łączniki i rurki z prędkością 400 mikrolitrów na minutę. Gdy wszystkie rurki zostaną wypełnione buforem krzepnięcia lub krwią, przypnij drugi koniec obu probówek do podzielonych nóżek kanału w kształcie litery Y w biochipie do mieszania. Następnie usunąć zacisk Kochera na wylocie rurki odpływowej i rozpocząć perfuzję z prędkością 4,4 mikrolitra na minutę dla buforu krzepnięcia i 44 mikrolitrów na minutę dla odtworzonej krwi.
Rejestruj obrazy co 10 sekund przez 30 minut w czasie rzeczywistym, kończąc pompy i akwizycję obrazu po 30 minutach lub gdy sygnał zostanie nasycony. Następnie wyrzuć wszystkie rurki i strzykawki jako odpady niebezpieczne biologicznie. Ten film stanowi doskonały przykład nagromadzenia się skrzeplin płytkowych i odkładania się fibryny.
Na początku perfuzji płytki krwi przylegały do powierzchni reaktywnej, co powodowało stały wzrost zarejestrowanej zielonej fluorescencji. Podczas tej fazy adhezji występuje niewielka fioletowa fluorescencja wskazująca, że fibryna jest tylko marginalnie utworzona. Po rozpoczęciu krzepnięcia gwałtownie fluoryzująca fibryna szybko się osadza, a zielona fluorescencja płytek krwi gromadzi się mniej więcej w tym samym tempie.
Moment początku krzepnięcia można zatem ekstrapolować jako wyznacznik potencjału prokoagulacji płytek krwi. Dodanie inhibitora trypsyny kukurydzianej do odtworzonej krwi nie wpływa na adhezję płytek krwi, ale krzepnięcie nie rozpoczyna się przez cały czas trwania eksperymentu perfuzyjnego. Zwiększając liczbę płytek krwi w odtworzonej próbce, szybkość adhezji, akumulacji i krzepnięcia wzrasta liniowo.
Moment wystąpienia jest znacznie skrócony poprzez zwiększenie stężenia płytek krwi, co sugeruje, że do wywołania krzepnięcia wymagana jest progowa liczba aktywowanych zdeponowanych płytek krwi. Ponadto, w sparowanej analizie kanałów pokrytych samym kolagenem lub w połączeniu z rekombinowanym lipidowanym czynnikiem tkankowym, początek krzepnięcia jest znacznie szybszy, chociaż ani ogólna szybkość krzepnięcia, ani akumulacja płytek krwi nie różnią się w zależności od stanu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić eksperyment z mikroprzepływową komorą przepływową z podwójnie znakowaną odtworzoną krwią w celu jednoczesnej analizy funkcji płytek krwi i krzepnięcia.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się medycyną transfuzjologiczną do zbadania interakcji między płytkami krwi a krzepnięciem w przepływie. W tym filmie skupiliśmy się na zademonstrowaniu standardowego eksperymentu. Można jednak wprowadzić zmiany w powłoce powierzchniowej, naprężeniach osłony lub stężeniu wapnia, aby odpowiedzieć na konkretne pytania badawcze.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia model mikrofluidyczny do pomiaru funkcji płytek krwi oraz krzepliwości w czasie rzeczywistym. Metoda ta umożliwia jednoczesną analizę osadzania się płytek krwi i tworzenia fibryny w warunkach przepływu, dostarczając cennych informacji dla medycyny transplantacyjnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hemostaza
- Funkcja płytek krwi
- Koagulacja
Wprowadzenie
- Zrozumienie zachowania płytek krwi jest kluczowe w medycynie transfuzyjnej.
- Koncentraty płytek krwi mogą różnić się właściwościami prokoagulacyjnymi.
- Analiza w czasie rzeczywistym może pomóc w wyjaśnieniu tych właściwości w warunkach przepływu.
- Celem badania jest poprawa wyników transfuzji poprzez analizę oddziaływań płytek krwi.
Cel badania
- Opracowanie modelu do pomiaru dynamiki płytek krwi i krzepnięcia w czasie rzeczywistym.
- Zbadanie wpływu przygotowania koncentratu płytek krwi na skuteczność transfuzji.
- Zbadanie wzajemnych zależności między funkcją płytek krwi a procesami krzepnięcia.
Zastosowane metody
- Konfiguracja mikroprzepływowego biochipu do analizy płytek krwi i fibryny.
- Wideo-mikroskopia w czasie rzeczywistym w celu obserwacji osadzania się płytek krwi.
- Przygotowanie próbek krwi o określonych stężeniach płytek krwi.
- Zastosowanie znakowanego fluorochromem fibrynogenu do wizualizacji.
Główne wyniki
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym wykazało adhezję płytek krwi oraz tworzenie się skrzepu.
- Dynamikę krzepnięcia skutecznie monitorowano w warunkach przepływu.
- Model dostarczył informacji na temat właściwości prokoagulacyjnych koncentratów płytek krwi.
- Wyniki wskazały na istotne oddziaływania między płytkami krwi a fibryną w warunkach przepływu.
Wnioski
- Model mikroprzepływowy jest cennym narzędziem do badania hemostazy.
- Uzyskane informacje mogą wpłynąć na praktyki w medycynie transplantacyjnej i transfuzjologii.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć analizę wpływu różnych preparatów płytkowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Jednoczesny pomiar w czasie rzeczywistym osadzania się płytek krwi i tworzenia fibryny w warunkach przepływu wypełnia krytyczną lukę w ocenie produktów przetoczeniowych oraz funkcji hemostatycznej. Ten model mikroprzepływowy umożliwia prognostyczną ocenę potencjału prokoagulacyjnego płytek krwi, wspierając wczesne etapy ograniczania ryzyka i walidacji celów w badaniach nad hemostazą. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji w zakresie portfolio, dostarczając ustandaryzowanych, ilościowych wyników istotnych dla badań nad transfuzją i krzepnięciem krwi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów krzepnięcia sterowanych przez płytki krwi w warunkach fizjologicznego ścinania.
- Wspiera funkcjonalną walidację przetoczonych koncentratów platelets w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ilościowe powiązanie między stężeniem platelets a początkiem krzepnięcia w celu mechanistycznej oceny ryzyka.
- Ułatwia selekcję potencjalnych interwencji celujących w pierwotną i wtórną hemostazę.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Zapewnia ustandaryzowaną, powtarzalną platformę do równoległej oceny funkcji płytek krwi i krzepnięcia.
- Generuje ilościowe odczyty w czasie rzeczywistym dotyczące adhezji płytek i tworzenia fibryny na potrzeby opracowywania testów.
- Wspiera przesiewowe badanie produktów krwi lub modulatorów pod kątem aktywności prokoagulacyjnej w warunkach kontrolowanego przepływu.
- Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w wielu warunkach eksperymentalnych i z różnymi powłokami powierzchniowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modeluje scenariusze transfuzji poprzez reconstitucję krwi małopłytkowej za pomocą bankowanych płytek krwi.
- Koreluje wyniki in vitro z klinicznymi wyzwaniami transfuzyjnymi poprzez symulację fizjologicznego przepływu i ponownego zwapnienia.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój terapii opartych na płytkach krwi lub strategii przeciwzakrzepowych.
- Zapewnia wgląd mechanistyczny w oddziaływanie szlaków kontaktu i czynnika tkankowego w procesie hemostazy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten mikrofluidyczny test łączy wczesną fazę odkryć, opracowywanie analiz oraz badania translacyjne, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących funkcji płytek krwi i krzepnięcia w ramach jednego procesu roboczego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez mechanistycznych dotyczących krzepnięcia indukowanego przez płytki krwi oraz specyfiki szlaków sygnałowych.
- Przesiew: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki służące do porównywania produktów krwi lub interwencji.
- Analityka: Umożliwia pomiar w czasie rzeczywistym adhezji płytek krwi, odkładania się fibryny oraz początku krzepnięcia.
- Badania translacyjne: Modeluje scenariusze transfuzji i hemostazy istotne w warunkach przedklinicznych i klinicznych.
- Zastosowanie w skali przedsiębiorstwa: Wykorzystuje komercyjnie dostępne narzędzia w celu szerokiego wdrożenia i standaryzacji między badaniami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w ocenie funkcji płytek krwi i krzepnięcia.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy i umożliwia powtarzalne, skalowalne analizy.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu procesu w przypadku produktów przetocznych i interwencji hemostatycznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów ukierunkowanych na hemostazę i skuteczność transfuzji w oparciu o ocenę ryzyka.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy eksperckiej z zakresu mikrofluidyki, mikroskopii fluorescencyjnej i obchodzenia się z krwią.
- Wymaga dostępu do zautomatyzowanych platform obrazowania oraz systemów pomp perfuzyjnych.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji przygotowania próbek i warunków testowych w ramach współpracy międzyzespołowej.
- Możliwość adaptacji do różnych powłok powierzchniowych i parametrów przepływu w zależności od stawianych pytań badawczych.
- Ograniczona koniecznością stosowania świeżych lub dobrze scharakteryzowanych komponentów krwi oraz precyzyjnych protokołów rekalcyfikacji.
