Name: Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj mikroprzepływową metodę analizy odkładania się płytek krwi i tworzenia fibryny w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia jednoczesne badanie funkcji płytek i hemostazy w warunkach przepływu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundację Badań i Rozwoju Belgijskiego Czerwonego Krzyża-Flandryjskiej Służby Krwi. Dziękujemy, że wsparcie finansowe udzielone przez "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF - specjalny fundusz badawczy) z Uniwersytetu w Gandawie zostało udzielone projektowi z numerem umowy BOF30290744.

Ten protokół jest zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi badań na próbkach ludzkich, a od wszystkich zaangażowanych dawców uzyskano świadomą zgodę. Zgodę na opisane tu eksperymenty uzyskano od instytucjonalnej komisji rewizyjnej Szpitala Uniwersyteckiego w Antwerpii (numer zgody 16/10/120).
UWAGA: Wskaźniki temperatury zawsze dotyczą temperatury pokojowej, chyba że jest to określone.
1. Konfiguracja mikrofluidyki
<ol>
	<li>Przygotuj kanały komory przepływu mikroprzepływowego, rurki i kołki łączące
	<ol>
		<li>Zawiesić fiolkę z kolagenem przez mieszanie wirowe, a następnie rozcieńczyć w izotonicznym roztworze glukozy dostarczonym przez producenta do końcowego stężenia 50 μg/mL. 
		UWAGA: Używaj kolagenu ścięgien koni, składającego się głównie z włókien typu I. Kolagen koni typu I jest często określany jako kolagen "Horm" i jest złotym standardem dla tego typu testów, zarówno ze względów historycznych, jak i biologicznych. Można również stosować kolagen ludzki typu III, ale te włókienka gorzej się pokrywają, a odpowiedź płytek krwi nie jest tak silna. Można również stosować inne powierzchnie powłokowe, takie jak czynnik von Willebranda, fibrynogen, fibronektyna, laminina, witronektyna, trombospondyna-1 lub kombinacje tych3.</li>
		<li>Weź nowy, jednorazowy biochip mikroprzepływowy z ośmioma prostymi, równoległymi kanałami i wymiarami w mm 0,4 szer. x 0,1 wys. x 20 l. Odpipeuj 0,8 μl kolagenu do kanału (kanałów) biochipa na jednym końcu i oznacz go jako wylot. Wypełnij tylko 5/6 długości kanału, aby włókna kolagenowe nie były pokryte na wlocie kanału, ponieważ może to spowodować zatkanie, które utrudnia sprawną perfuzję.</li>
		<li>Inkubować biochip w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 godziny w wilgotnym i szczelnie zamkniętym pojemniku.</li>
		<li>Aby zbadać koagulację za pośrednictwem czynnika tkankowego (zewnętrznego) w połączeniu ze szlakiem kontaktowym (wewnętrznym), pokryj kanały kolagenem i rekombinowanym czynnikiem tkanki ludzkiej (rhTF).
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć rhTF w 10 mM soli fizjologicznej buforowanej kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) (HBS; 0,9% (w/v) NaCl, pH 7,4, 1:3,000, stężenie podstawowe: 4,5 nM).</li>
			<li>Usuń roztwór powlekający kolagen przez wylot. Odpipetować 0,8 μl rhTF w HBS (rozcieńczenie 1/500 stężenia podstawowego, stężenie końcowe: 9 pM) do wylotu kanału, wypełniając 5/6 długości kanału, podobnie jak w przypadku strategii powlekania kolagenem.</li>
			<li>Inkubuj biochip przez dodatkowe 30 minut w nawilżonym i szczelnie zamkniętym pojemniku.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wypełnij powleczone kanały buforem blokującym (1,0% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% (w/v) glukozy w HBS), zaczynając od drugiego końca (oznaczonego jako wlot). Wypełnij równą liczbę kanałów w kształcie litery Y tym samym buforem blokującym w biochipie mieszającym.
		<ol>
			<li>Upewnij się, że wszystkie kanały i ramiona kanałów są całkowicie wypełnione buforem blokującym. Inkubuj oba biochipy przez co najmniej 1 godzinę w nawilżonym i szczelnie zamkniętym pojemniku.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dla każdego używanego kanału przygotuj dwie rurki o długości 8 cm, jedną o długości 2 cm i jedną o długości 46 cm. Umieść kołek na jednym końcu z trzech mniejszych rurek i na obu końcach najdłuższej rurki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pompę płuczącą
	<ol>
		<li>Przepłucz wszystkie fluidyki pompy i podłączone rurki wodą destylowaną.</li>
		<li>Odtłuść odlew biochipa za pomocą precyzyjnej chusteczki bezpyłowej i denaturatu, aby usunąć odciski i kurz.</li>
		<li>Napełnij wszystkie rurki buforem blokującym przed podłączeniem ich do biochipów.</li>
		<li>Zamocuj powlekany biochip na stoliku mikroskopu automatycznego. Zamocuj biochip do mieszania na tej samej wysokości co stolik mikroskopu za pomocą laboratoryjnego podnośnika nożycowego.</li>
		<li>Połącz powlekany biochip z biochipem mieszającym za pomocą najdłuższej rurki o długości 46 cm. Upewnij się, że oba biochipy znajdują się w pewnej odległości, tak aby rurki tworzyły elastyczną, ale prostą linię.</li>
		<li>Podłącz strójkę złącza strzykawki do rurki kompatybilnej z Luer pompy płuczącej. Podłącz go do wolnego końca rurki o średnicy 2 cm, a drugi koniec przymocuj do wylotu powlekanego biochipa.</li>
		<li>Przymocuj dwie 8-centymetrowe rurki do wlotu biochipa mieszającego za pomocą jego kołków. Umieścić wolny koniec każdej rurki w fiolce HBS. Przepłukać wszystkie rurki i wszystkie kanały 1 ml HBS. 
		UWAGA: HBS przepływa z fiolki przez 8-centymetrową rurkę do wióra mieszającego i przez 46-centymetrową rurkę do powlekanego wióra (przepływającego od części niepowlekanej do powlekanej) dzięki sile ciągnącej pompy płuczącej. Ten krok usuwa bufor blokujący i słabo przylegający kolagen (lub rhTF w podwójnie powlekanych biochipach).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pompy perfuzyjne
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie sterownika pomp perfuzyjnych. Zainicjuj pompy, klikając dwukrotnie ikonę strzykawki w oprogramowaniu.</li>
		<li>Należy wybrać rodzaj strzykawki, która będzie używana: strzykawki o pojemności 1 ml do buforu krzepnięcia i strzykawki o pojemności 2 ml do krwi rozpuszczonej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłączyć strzykawki do konstrukcji biochipa
	<ol>
		<li>Odłącz pompę płuczącą i wszystkie przewody, z wyjątkiem jednego łączącego dwa biochipy. Odłączony przewód jest ponownie używany w następujących krokach.</li>
		<li>Podłącz 2-centymetrowy przewód ze stykiem złącza strzykawki do zamka Luer grubościennego przewodu odpływowego. Napełnij grubościenny rurkę standardowym roztworem pepsyny za pomocą strzykawki. 
		UWAGA: Dodanie pepsyny do rurki odpływowej hamuje i lizuje krzepnięcie po perfuzji, a tym samym zapobiega zatykaniu się systemu na zapleczu.</li>
		<li>Zabezpiecz otwarty koniec grubościennej rurki za pomocą Kocher clamp. Umieść pod spodem odpowiedni pojemnik na odpady z wybielaczem, aby zebrać przepływ.</li>
		<li>Przymocuj rurkę za pomocą kołka do wylotu powlekanego biochipa.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek krwi
<ol>
	<li>Zbierz krew od zdrowego ochotnika i oddziel jej składniki4
	<ol>
		<li>Zebrać krew do opróżnionego pojemnika z kwasem etylenodiamino-tetraoctowym (EDTA). Próbki tej należy używać wyłącznie do wykonywania pełnej morfologii krwi (CBC) przy użyciu automatycznego analizatora hematologicznego.</li>
		<li>Zbierz krew do opróżnionych pojemników z cytrynianem sodu. Wymagane jest 5 ml krwi na kanał.</li>
		<li>Umieść próbkę(i) na poziomym rotatorze w oczekiwaniu na rozpuszczenie krwi. 
		UWAGA: Test należy wykonać w ciągu 3 godzin od upuszczania krwi. Koncentrat płytek krwi i próbki krwi pełnej są zgodne z grupą krwi ABO/RhD.</li>
		<li>Wirować przez 13 minut przy 250 x g w celu przygotowania osocza bogatopłytkowego (PRP). Nie używaj hamulca wirówki, aby zapobiec zakłóceniu luźno zapakowanego granulatu.</li>
		<li>Przenieś PRP do świeżej stożkowej probówki wirówkowej. Wirować przez 10 minut przy 4 500 x g (z hamulcem) w celu osadzenia płytek krwi i przygotowania osocza ubogiego w płytki krwi (PPP). Wyrzucić osadek płytek krwi. Inkubować PPP w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przenieś upakowane czerwone krwinki do świeżej stożkowej probówki, perforując dno oryginalnej igły 21 G. 
		UWAGA: Resztkowa liczba płytek krwi w upakowanej frakcji krwinek czerwonych wynosi 11 ±4 x 103 na μL (średnia ± SD, n = 10).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odtworzyć krew
	<ol>
		<li>Oznaczyć hematokryt upakowanych krwinek czerwonych przygotowanych w kroku 2.1.6 za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.</li>
		<li>Określ stężenie płytek krwi w koncentracie płytek krwi, który zostanie wykorzystany do analizy, za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.</li>
		<li>Oblicz objętość upakowanych czerwonych krwinek, koncentratu płytek krwi i PPP, które dadzą 40% hematokrytu i 250 x 103 płytki krwi / μl w końcowej objętości 2,5 ml. Wymieszaj je, aby przygotować rozpuszczoną krew i wykonaj morfologię krwi, 
		UWAGA: W zależności od pytania badawczego można użyć innych docelowych mian komórek.</li>
		<li>Przygotować "ślepą" próbkę kontrolną, w której objętość koncentratu płytek krwi jest zastąpiona tą samą objętością soli fizjologicznej w celu określenia stężenia "endogennych" płytek krwi (tj. płytek krwi niepochodzących z banku krwi).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczyć odtworzoną krew pod kątem płytek krwi i fibrynogenu
	<ol>
		<li>Odmierzyć pipetą 13 μl roztworu fibrynogenu znakowanego Alexa Fluor 405 o stężeniu 10,7 mg/ml (końcowe stężenie 70 μg/ml) do probówki i dodać 1 ml odtworzonej krwi. 
		UWAGA: Fibrynogen został oznaczony przy użyciu dostępnego na rynku zestawu zgodnie z instrukcją producenta.</li>
		<li>Wymieszać kolejny 1 ml rozpuszczonej krwi w probówce zawierającej 2 μl 1 mM DiOC6 (1 μM stężenie końcowe) lub zawierające 2 μL 5 mM kalceiny AM (5 μM stężenie końcowe). Dodać go do probówki zawierającej krew z fibrynogenem, uzyskując końcową objętość 2 ml krwi barwionej płytkami krwi i fibrynogenem. 
		UWAGA: Wybór barwnika może zależeć od pytania badawczego lub preferencji badacza5. Należy pamiętać, że wzbudzenie dowolnego barwnika może powodować artefakty fotochemiczne.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj, odwracając. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor do krzepnięcia
	<ol>
		<li>Przygotować bufor krzepnięcia zawierający 10 mM CaCl2 i 3,75 mM MgCl2 w HBS. Przygotować 1 ml buforu krzepnięcia na jeden kanał.</li>
		<li>Przefiltruj i wysterylizuj bufor krzepnięcia przez filtr 0,2 μm. Podgrzej go do 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test perfuzji
<ol>
	<li>Skoncentruj optykę mikroskopu na włóknach kolagenowych przylegających do dna kanału. Użyj kontrastu fazowego lub różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC). Wybierz opcję "Ustaw bieżące Z dla wybranych regionów kafelków" w oprogramowaniu eksperymentalnym, aby cyfrowo ustalić wybrane pole skupienia.</li>
	<li>Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) w wybranym kanale za pomocą oprogramowania do akwizycji mikroskopu. 
	UWAGA: Zwrot z inwestycji może być dowolnym obszarem powierzchni dowolnie wybranym w kanale perfuzyjnym. Zaleca się, aby nie analizować tworzenia się skrzeplin i wytwarzania fibryny w pobliżu wlotu i wylotu, aby uniknąć uzyskania obrazów nierównomiernie rozłożonych skrzeplin. Powierzchnia ROI powinna zawierać znaczną liczbę skrzeplin, aby umożliwić wyrównanie zmienności sygnału przez poszczególne płytki krwi. Lokalizacja ROI w płaszczyźnie xy kanału jest zawsze ustalana i określana przed perfuzją. W razie potrzeby niepowlekana część kanału może zostać uwzględniona w analizie w celu określenia, czy płytki krwi wiążą się niespecyficznie z tworzywem biochipowym.</li>
	<li>Przygotowanie próbek do perfuzji
	<ol>
		<li>Zamontować strzykawkę o pojemności 1 ml zawierającą 1 ml wstępnie podgrzanego buforu krzepnięcia w pompie perfuzyjnej.</li>
		<li>Wymieszać wstępnie podgrzaną rozpuszczoną krew, delikatnie odwracając i wsypać 2 ml do strzykawki o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Upewnij się, że całe powietrze zostało usunięte z obu strzykawek i podłącz każdą z nich do 8-centymetrowego przewodu za pomocą kołka złącza strzykawki.</li>
		<li>Zalać łączniki i rurki obu strzykawek z dużą prędkością (400 μl/min) i zatrzymać, gdy wszystko zostanie wypełnione buforem krzepnięcia lub krwią. 
		UWAGA: Po zalaniu rurki, bufor krzepnięcia i odtworzona krew zostaną natychmiast zmieszane w kanale w kształcie litery Y biochipa mieszającego po rozpoczęciu eksperymentu, unikając wprowadzania powietrza do komór perfuzyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą kołków przymocuj drugi koniec obu rurek do podzielonych nóg kanału w kształcie litery Y w biochipie do mieszania. Dolna część nogi służy do perfuzji buforu krzepnięcia, a górna noga do rekonstytucji krwi.</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment od zainicjowania perfuzji z prędkością 4,4 μl/min dla buforu krzepnięcia i 44 μl/min dla krwi rozpuszczonej. Zdejmij Kocher clamp na wylocie rurki odpływowej, aby umożliwić perfuzję. 
	UWAGA: Natężenie przepływu można zmieniać w zależności od pytania badawczego. Uruchom stoper, aby określić czas między rozpoczęciem eksperymentu a rozpoczęciem akwizycji obrazu w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Rejestruj obrazy co 10 s przez 30 minut w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania do akwizycji i eksperymentowania mikroskopu. Rozpocznij nagrywanie, gdy mieszanina rozpuszczonej krwi i buforu krzepnięcia dostanie się do powlekanego biochipa zamontowanego na stoliku mikroskopowym. 
	UWAGA: W zależności od konfiguracji eksperymentalnej można używać innych szeregów czasowych. Użyj powiększenia 100X (obiektyw 10X i obiektywy 10X).</li>
</ol>
4. Zakończenie eksperymentu
<ol>
	<li>Zakończ pompowanie i akwizycję obrazu po 30 minutach lub wcześniej, jeśli sygnał jest nasycony. Odłącz wszystkie rurki i strzykawki i wyrzuć je jako odpady niebezpieczne biologicznie.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Określ kinetykę wzrostu skrzepliny (zielona fluorescencja) i tworzenia fibryny (fioletowa fluorescencja) za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Następujące polecenia są specyficzne dla używanego tutaj oprogramowania:
	<ol>
		<li>Otwórz wtyczkę Przetwarzanie: zszywanie, aby zszyć obrazy obok siebie w punkcie czasowym.</li>
		<li>Otwórz wtyczkę Analiza obrazu, aby określić pokrycie powierzchni płytek krwi.</li>
		<li>Otwórz wtyczkę Measure. Zdefiniuj ROI, rysując obszar prostokąta zawierający wszystkie włókna skrzeplin i fibryny; w tym protokole ROI to prostokąt o wymiarach 637 mm2, 
		Wybierz kartę Wszystkie widoki, aby uwzględnić wszystkie zarejestrowane punkty czasowe.</li>
		<li>Użyj narzędzia Utwórz tabele, aby automatycznie wygenerować arkusz kalkulacyjny, który będzie zawierał średnią wartość intensywności fluorescencji wybranego obszaru prostokąta w każdym punkcie czasowym.</li>
		<li>Zapisz arkusze kalkulacyjne w formacie xml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz arkusz kalkulacyjny w programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych w celu przeprowadzenia dalszych obliczeń.
	<ol>
		<li>Odejmij wartość początkową (tło) wszystkich danych.</li>
		<li>Wykreślić sygnał fluorescencyjny jako funkcję czasu perfuzji zarówno dla barwników zielonych (płytki krwi), jak i fioletowych (fibryna). 
		UWAGA: Weź pod uwagę czas między inicjalizacją pompy a faktycznym punktem początkowym akwizycji obrazu. Tworzenie skrzepliny jest na ogół procesem dwuetapowym w tym modelu: (1) "powolna" adhezja płytek krwi (tj. adhezja) do unieruchomionego kolagenu, a następnie (2) wzrost skrzepliny spowodowany krzepliną z "szybkim" wzrostem zarówno wiązania płytek krwi (tj. akumulacji), jak i odkładania się fibryny (tj. krzepnięcia) (ryc. 1).</li>
		<li>Obliczyć nachylenie adhezji i akumulacji płytek krwi za pomocą regresji liniowej; nachylenie to daje kinetykę wzrostu skrzepliny płytkowej w każdej fazie jej powstawania.</li>
		<li>Oblicz nachylenie krzepnięcia fibryny i ekstrapoluj tę linię, aby przeciąć oś X, określając moment wystąpienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Levi, M., Hunt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+point-of-care+coagulation+testing+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients.</a> J. Thromb. Haemost. 13 (11), 1960-1967 (2015).</li>
<li>Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Flow+Chambers+Using+Reconstituted+Blood+to+Model+Hemostasis+and+Platelet+Transfusion+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro.</a> J. Vis. Exp. (109), e53823(2016).</li>
<li>Witt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+platelet+function+defects+by+multi-parameter+assessment+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation.</a> Nat. Commun. 5, 4257(2014).</li>
<li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).</li>
<li>Roest, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber-based+assays+to+measure+thrombus+formation+in+vitro%3A+requirements+for+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization.</a> J. Thromb. Haemost. 9 (11), 2322-2324 (2011).</li>
<li>Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-protein+interactions+in+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipid-protein interactions in blood coagulation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1376 (3), 433-453 (1998).</li>
<li>Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+contact+factor+activation+improves+measurement+of+platelet-dependent+thrombin+generation+by+calibrated+automated+thrombography+at+low-concentration+tissue+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor.</a> J. Thromb. Haemost. 4 (5), 1160-1161 (2006).</li>
<li>Bevers, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Ca%282%2B%29-induced+microvesiculation+and+deficient+expression+of+procoagulant+activity+in+erythrocytes+from+a+patient+with+a+bleeding+disorder%3A+a+study+of+the+red+blood+cells+of+Scott+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome.</a> Blood. 79 (2), 380-388 (1992).</li>
<li>Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+prothrombin-converting+activity+and+the+exposure+of+phosphatidylserine+at+the+outer+surface+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets.</a> Eur. J. Biochem. 122 (2), 429-436 (1982).</li>
<li>Muller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+polyphosphates+are+proinflammatory+and+procoagulant+mediators+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo.</a> Cell. 139 (6), 1143-1156 (2009).</li>
<li>Smith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+modulates+blood+coagulation+and+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (4), 903-908 (2006).</li>
<li>Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Transfusions+in+Acute+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet Transfusions in Acute Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. 375 (1), 96-97 (2016).</li>
<li>Deckmyn, H., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/voxs.12053/pdf">Assays for quality control of platelets for transfusion.</a> ISBT Science Series. 8 (1), 221-224 (2013).</li>
<li>Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+platelet+adhesion+to+artery+subendothelium+is+mediated+by+factor+VIII-Von+Willebrand+factor+bound+to+the+subendothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium.</a> Nature. 279 (5714), 636-638 (1979).</li>
<li>Alevriadou, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+shear-dependent+thrombus+formation+and+its+blockade+by+inhibitors+of+von+Willebrand+factor+binding+to+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets.</a> Blood. 81 (5), 1263-1276 (1993).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat. Med. 15 (6), 665-673 (2009).</li>
<li>Stalker, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+in+the+hemostatic+response+and+its+relationship+to+the+platelet-signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network.</a> Blood. 121 (10), 1875-1885 (2013).</li>
<li>Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-limiting+roles+of+the+tenase+complex+of+factors+VIII+and+IX+in+platelet+procoagulant+activity+and+formation+of+platelet-fibrin+thrombi+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow.</a> Haematologica. 100 (6), 748-756 (2015).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li>
<li>Gutierrez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+studies+of+shear-dependent+platelet+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion.</a> Lab. Chip. 8 (9), 1486-1495 (2008).</li>
<li>Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciding+whether+to+go+with+the+flow%3A+evaluating+the+merits+of+flow+reactors+for+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (33), 7502-7519 (2011).</li>
<li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.bloodjournal.org/content/early/2016/07/18/blood-2016-02-696898?sso-checked=true">Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting</a>. , Blood. (2016).</li>
<li>Der Meijden, P. E. V. an, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-+and+erythrocyte-derived+microparticles+trigger+thrombin+generation+via+factor+XIIa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa.</a> J. Thromb. Haemost. 10 (7), 1355-1362 (2012).</li>
<li>Nickel, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polyphosphate-factor+XII+pathway+drives+coagulation+in+prostate+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis.</a> Blood. 126 (11), 1379-1389 (2015).</li>
<li>Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+surface+tissue+factor+thresholds+that+trigger+coagulation+at+venous+and+arterial+shear+rates%3A+amplification+of+100+fM+circulating+tissue+factor+requires+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow.</a> Blood. 111 (7), 3507-3513 (2008).</li>
<li>Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+response+of+initiation+of+blood+coagulation+by+tissue+factor+in+patterned+microfluidic+capillaries+is+controlled+by+shear+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (11), 2035-2041 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Transfuzja koncentratów płytek krwi jest przepisywana pacjentowi z małopłytkowością w celu zapobieżenia lub zatrzymania krwawienia. Jej wpływ kliniczny został niedawno podkreślony w historycznym przeglądzie ostrej białaczki12, przypominając, że zwiększone wskaźniki przeżycia pacjentów pediatrycznych w latach sześćdziesiątych i siedemdziesiątych można było w dużej mierze przypisać poprawie w medycynie transfuzji (płytek krwi). Koncentraty płytek krwi są również stosowane do tamowania krwawienia w ostrym urazie lub podczas operacji. W tych warunkach preferowane są płytki krwi o doskonałych właściwościach prokoagulacyjnych, które szybko inicjują hemostazę, ale koncentraty płytek krwi są przygotowywane z dawców dobrowolnych i, w przeciwieństwie do leków farmakologicznych, są standaryzowane tylko przez przygotowanie, a nie przez skład (chemiczny). W związku z tym kilka pytań w dziedzinie bankowania krwi pozostaje bez odpowiedzi, w tym te dotyczące optymalnych metod dawstwa, warunków przechowywania i praktyk transfuzjologicznych. W dziedzinie biologii płytek krwi (transfuzji) wiele pytań dotyczących usuwania komórek z krążenia, udziału przetoczonych płytek krwi w hemostazie lub ich immunologii również pozostaje bez odpowiedzi.
Dostępnych jest wiele technik laboratoryjnych do analizy funkcji płytek krwi, ale dotyczą one głównie pojedynczego aspektu funkcji płytek krwi, takiego jak agregacja lub degranulacja13. Aby szeroko ocenić płytki krwi i koncentraty płytek krwi, niezbędne są kompleksowe modele hemostazy, które muszą obejmować hydrodynamikę. Reologia krwi ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji zachowania płytek krwi podczas hemostazy14,15 lub zakrzepicy16, nawet jeśli antykoagulacja uniemożliwia udział Ca2+ i / lub trombiny w obecności cytrynianu lub heparyny, odpowiednio2. Aby zbadać wzajemne oddziaływanie między krzepnięciem a funkcją płytek krwi w przepływie17,18, wymagane jest normalne wytwarzanie trombiny, a zatem również wolnego Ca2+. Konfiguracja eksperymentalna do badania hemostazy w tych warunkach jest złożona, ponieważ środki zapobiegające "artefaktowi" lub niekontrolowanej aktywacji krzepnięcia powinny być podejmowane w jak największym stopniu. Ponadto wiele wyspecjalizowanych grup badawczych korzysta ze sprzętu wykonanego na zamówienie19,20, co powoduje znaczną zmienność międzylaboratoryjną5. Typowymi ograniczeniami tego podejścia są stosowanie naczyń prostokątnych, niepulsacyjne profile przepływu oraz powłoki powierzchniowe niepochodzące od człowieka5. Opisany przez nas test wykorzystuje dostępne na rynku narzędzia i dlatego może nadawać się do standaryzacji.
Ponieważ reakcja kaskadowa krzepnięcia jest łatwo aktywowana, gdy krew nie jest zawarta w ludzkim ciele, kontrolowane ponowne zwapnienie jest kluczowym krokiem. Aby to osiągnąć, dodanie Ca2 + należy odłożyć na chwilę przed perfuzją na reaktywnej powierzchni kolagenu, ponieważ gdy bufor Ca2 + jest dostarczany luzem do krwi statycznej, nieuchronnie dochodzi do koagulacji, ostatecznie zatykając rurkę i zniekształcając interpretację danych (dane nie pokazane). Rozwiązaniem tego problemu jest oddzielne pompowanie buforu Ca2+ i krwi, co pozwala na mieszanie sił konwekcyjnych i dyfuzyjnych podczas perfuzji w drodze do komory analitycznej. Pełne wymieszanie uzyskuje się w 46-centymetrowym segmencie rurki między komorą mieszania i analizy. Długość ta została obliczona dla optymalnego czasu przebywania odczynników do wymieszania w oparciu o podstawowe prawa masy i transportu konwekcyjnego21 podczas perfuzji przy zastosowanym natężeniu przepływu (1000 s-1). Podejście to okazało się możliwe do kontrolowania i powtarzalności.
Kontaktowa aktywacja krzepnięcia jest czasami postrzegana jako artefakt prostego pobierania próbek krwi i należy jej unikać podczas interpretacji czasów krzepnięcia. Dlatego wykazaliśmy, że przy braku inhibitorów krzepnięcie wywołane kontaktem rozpoczyna się po 16,7 min (±3,7 min) perfuzji. W obecności CTI hamującego aktywację kontaktową za pośrednictwem FXIIa, krzepnięcie nie jest inicjowane podczas dowolnie określonego przebiegu eksperymentu (30 min). To okno eksperymentów jest wystarczająco długie, aby dostrzec próbki, które są pro- lub przeciwzakrzepowe. Mimo że krzepnięcie przez aktywację kontaktową może być niepożądaną konsekwencją kontaktu krwi ze sztucznymi powierzchniami, nasze dane wskazują na wyraźny wpływ płytek krwi na dawkę biologiczną. Może to być ważne dla medycyny transfuzjologicznej, ponieważ ostatnie odkrycia dotyczące FXII, polifosforanów płytek krwi10, dystrybucji fosfatydyloseryny22 i mikrocząstek płytek krwi23 faktycznie przewartościowały krzepnięcie szlaku kontaktowego jako ważny czynnik przyczyniający się do hemostazy, zwłaszcza w kontekście zakrzepicy24. Na przykład zmienna wydajność transfuzji płytek krwi u pacjentów lub zmienna ekspresja fosfatydyloseryny w bankowanych płytkach krwi może zatem powodować zmienność skuteczności terapeutycznej, jeśli okaże się, że skuteczna krzepnięcie zależy od tych czynników.
Poprzez komobilizację lipidowanego rhTF z kolagenem, zewnętrzna droga krzepnięcia lub szlak TF jest aktywowany podczas odkładania się płytek krwi na kolagenie. Rozszerza to test do najbardziej wszechstronnego trybu, jako modelu urazów, które powodują kontakt krwi z komórkami i tkankami zawierającymi TF. Nasze dane pokazują, że komobilizacja kolagenu i TF zmniejsza moment wystąpienia krzepnięcia, ale nie zmienia szybkości krzepnięcia. Warto zauważyć, że ilość rhTF unieruchomionej na powierzchni jest ważną zmienną w tym modelu25,26 i powinna być ustandaryzowana w ramach danego badania. W obecności CTI, szlak TF może być badany wyłącznie (nie pokazany), ponieważ zapobiega się aktywacji kontaktu.
Podsumowując, nasz układ eksperymentalny łączy model transfuzji przez rozpuszczenie krwi małopłytkowej z bankowanymi płytkami krwi oraz model hemostazy przez zależne od wapnia odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny pod wpływem przepływu hydrodynamicznego. Test ten zostanie wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące prokoagulacyjnego charakteru nasypanych płytek krwi i wpływu technik przygotowania koncentratu płytek krwi na to.

Hemostaza pierwotna i wtórna były pierwotnie konceptualizowane jako dwa względnie rozdzielne procesy biochemiczne. Hemostaza pierwotna była postrzegana jako główny czynnik przyczyniający się do warunków przepływu tętniczego, z kluczową rolą dla płytek krwi, podczas gdy hemostaza wtórna dominowała nad krzepnięciem pod wpływem przepływu krwi żylnej, umożliwiając kaskadzie proteazy tworzenie nierozpuszczalnej fibryny. Ostatnie kilka dekad znacznie zmieniło ten tradycyjny pogląd, uznając, że aktywacja i krzepnięcie płytek krwi są współzależne i są równie ważnymi procesami podczas fizjologicznej i patologicznej hemostazy we wszystkich (nieekstremalnych) środowiskach hydrodynamicznych. Pogląd ten został przeniesiony do kliniki, gdzie coraz częściej stosuje się testy opracowane w celu kompleksowego pomiaru krzepnięcia krwi pełnej, choć pozostaje wiele pytań dotyczących istotności, stosowalności i użyteczności1.
Niedawno opublikowaliśmy analizę funkcjonalną koncentratów płytek krwi przy użyciu mikroprzepływowych komór przepływowych pokrytych fibrylarnym kolagenem w modelu transfuzji in vitro2, z próbkami zawierającymi normalne ilości czerwonych krwinek, osocza i płytek krwi. Metoda ta wykorzystuje krew przeciwzakrzepową heparyną lub hirudyną, co oznacza brak lub ograniczony udział hemostazy wtórnej, która jest zależna od wytwarzania trombiny i zjonizowanego wapnia (Ca2+). Aby wspomóc tworzenie trombiny, a tym samym objąć wszystkie aspekty hemostazy przepływem mikroprzepływowym, opracowaliśmy metodę uzupełniającą na tej samej platformie technicznej, teraz obejmującą wolny Ca2+. W ten sposób można badać odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny, ponownie w modelu transfuzji płytek krwi, w celu oceny jakości koncentratu płytek krwi.
W tej metodzie, płytki krwi i fibrynogen są znakowane fluoroforami, które mają całkowicie oddzielone widma emisyjne. Dwukolorowa mikroskopia wideo w czasie rzeczywistym pozwala następnie na analizę pierwotnej adhezji płytek krwi, a także inicjacji krzepnięcia i odkładania fibryny. Ważną zmienną w tego typu testach jest ponowne zwapnienie, ponieważ dodanie Ca2+ do krwi statycznej przed perfuzją nieuchronnie spowoduje koagulację w pojemniku zainicjowaną kontaktowo. Ta inicjacja spowoduje odchylenie odczytu z powodu zatkania rurek i wlotów biochipów przed perfuzją. Dlatego w naszej metodzie krew przeciwzakrzepowa cytrynianem i bufor zawierający Ca2 + są pompowane oddzielnie przez górne nogi komory wlotowej w kształcie litery Y. Składniki są mieszane podczas perfuzji przed wprowadzeniem do komory analitycznej pokrytej samym kolagenem lub w połączeniu z rekombinowanym czynnikiem tkanki ludzkiej (rhTF). Dostosowując prędkości przepływu oddzielnych pomp i stężenie Ca2+ w buforze, następuje 10% rozcieńczenie końcowej próbki krwi.
Korzystając z tego rozszerzonego protokołu, pokazujemy udział czynnika krzepnięcia XII (FXII) i stężenia płytek krwi w inicjacji szlaku kontaktowego pod przepływem. Nasze dane pokazują również, że poprzez powlekanie rhTF kolagenem, szlak czynnika tkankowego może być mierzony jednocześnie.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>A00434</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 2 ml</td><td>BD</td><td>307727</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405</td><td>Life Technologies</td><td>A30100</td><td>Postępowano zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą etykietowania wakutainera fibrynogenu</td></tr><tr><td>BD Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>Igła do pobierania krwi z fabrycznie przymocowanym uchwytem</td></tr><tr><td>Rurka próżniowa BD z EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>probówkę próżniową BD z cytrynianem sodu</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td>w przygotowaniu domowym</td><td>w przygotowaniu domowym</td><td>1,0% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% (w/v) glukozy w HBS</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Sondy molekularne</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Bufor krzepnięcia</td><td>w przygotowaniu domowym</td><td>przygotowanie we własnym zakresie</td><td>10 mM CaCl2 i 3,75&nbsp; mM MgCl2 w HBS</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny kukurydzianej (CTI)</td><td>Laboratoria Badań Enzymatycznych</td><td>CTI</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol denaturowany</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td>Jodek 3,3&prime;-dihexyloxacarbocyjaniny - roztwór 1 mM w</td></tr><tr><td>pompie mikroprzepływowej DMSO Exigo</td><td>Cellix</td><td>EXIGO-PC-FS7.0-MF</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3879</td><td>Oznakowany we własnym zakresie z AF 405 - stężenie zapasowe 10,7&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>Analizator hematologiczny</td><td>Sysmex</td><td>pocH-100i</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sól fizjologiczna buforowana (HBS)</td><td>w domu przygotowanie</td><td>w domu preparat</td><td>10 mM 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy kwas (HEPES) buforowany sól fizjologiczna (0,9% (w/v) NaCl), pH 7,4</td></tr><tr><td>Horm Collagen</td><td>Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Natywny kolagen ścięgien koni (typ I) Izotoniczny roztwór glukozy do rozcieńczania kolagenu to uzupełnione</td></tr><tr><td>Skrzynka nawilżana</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Inkubacyjna łaźnia wodna</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>wyposażony w kamerę colibri-LED i CCD o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td> z pipetą <td>Multiflow8</td></tr><tr><td></td><td>Marka</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 100-1000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 1-10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 2-200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna z koncentratem płytek krwi</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki precyzyjne</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pepsyny&nbsp;</td><td>Instrument Hanna</td><td>HI7073L&nbsp;</td><td>2 g pepsyny na 75 ml roztworu, Białkowy roztwór czyszczący z pepsyną</td></tr><tr><td>Rekombinowany czynnik tkankowy Innovin</td><td>Dade Berhing</td><td>B4212-40</td><td>rhTF z syntetycznymi fosfolipidami</td></tr><tr><td>Mikroskop programowy&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>Sterylne urządzenie dokujące</td><td>Wirówka stołowa Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>Wałek rurowy</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz do rur</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 złącze strzykawki pin</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Powlekany biochip</td></tr><tr><td>Vena8 Igły</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Rurka Cellix</td><td></td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td></td></tr><tr><td>VenaDelta Y1 Biochips</td><td>Cellix</td><td>VDY1-400-100-01-02</td><td>Mieszalnik do biochipów</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>ZEN2012 oprogramowanie</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Mikroprzepływowe modele hemostazy oceniają funkcję płytek krwi w warunkach hydrodynamicznego ścinania, ale w obecności antykoagulantów, ta analiza jest ograniczona tylko do odkładania płytek krwi. Skomplikowany związek między zależnym od Ca2+ krzepnięciem a funkcją płytek krwi wymaga starannego i kontrolowanego ponownego zwapnienia krwi przed analizą. Nasza konfiguracja wykorzystuje kanał mieszający w kształcie litery Y, który dostarcza skoncentrowany bufor Ca2 + / Mg2 + do przepływającej krwi tuż przed perfuzją, umożliwiając szybkie ponowne zwapnienie bez zastoju próbki. Dziesięciokrotna różnica prędkości przepływu między oboma zbiornikami minimalizuje rozcieńczenie. Ponownie zwapniona krew jest następnie perfundowana w komorze analitycznej pokrytej kolagenem, a znakowanie różnicowe umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym zarówno osadzania się płytek krwi, jak i fibryny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii wideo. System korzysta wyłącznie z dostępnych na rynku narzędzi, co zwiększa szanse na standaryzację. Rekonstytucja krwi małopłytkowej z płytkami krwi z bankowanych koncentratów ponadto modeluje transfuzję płytek krwi, udowadniając jej zastosowanie w tej dziedzinie badań. Przykładowe dane wykazały, że początek krzepnięcia i odkładanie fibryny były liniowo zależne od stężenia płytek krwi, co potwierdza związek między hemostazą pierwotną i wtórną w naszym modelu. W przedziale czasowym 16 minut perfuzji aktywacja kontaktowa nie nastąpiła, pomimo ponownego zwapnienia do normalnych poziomów Ca2+ i Mg2+. Gdy czynnik krzepnięcia XIIa był hamowany przez inhibitor trypsyny kukurydzianej, ten przedział czasowy był jeszcze dłuższy, co wskazuje na znaczny zakres dynamiczny, w którym można ocenić zmiany w prokoagulacyjnym charakterze płytek krwi. Koimmobilizacja czynnika tkankowego z kolagenem znacznie skróciła czas do wystąpienia krzepnięcia, ale nie jego tempo. Możliwość badania czynnika tkankowego i/lub ścieżki kontaktowej zwiększa wszechstronność i użyteczność testu.

Analiza surowych danych w czasie rzeczywistym została przedstawiona na Rysunku 1. Najpierw płytki krwi przylegają do powierzchni reaktywnej, co skutkuje stałym wzrostem rejestrowanej zielonej fluorescencji (Rysunek 1A, i), określanym jako adhezja. W tej fazie występuje niewielka fluorescencja fioletowa, co wskazuje, że fibryna nie tworzy się lub tworzy się w stopniu minimalnym (Rysunek 1B). Po zainicjowaniu koagulacji następuje szybkie osadzanie się wykazującej fioletową fluorescencję fibryny (iii), a w tym samym czasie zielona fluorescencja płytek krwi wzrasta w podobnym tempie, co określono tutaj jako akumulację płytek krwi (ii). Pojedynczy eksperyment dostarcza zatem trzech wartości szybkości wzrostu fluorescencji (i, ii i iii), które służą jako marker zastępczy dla prędkości osadzania się płytek krwi i fibryny w tym modelu. Ponadto ekstrapolowany jest moment rozpoczęcia krzepnięcia (moment-of-onset (iv)), który jest wyznacznikiem potencjału prokoagulacyjnego płytek krwi.
W przypadku braku TF inicjacja krzepnięcia przebiega powoli i odbywa się głównie poprzez szlak kontaktu, w którym wewnątrzpochodny kompleks tenazy aktywuje FX poprzez bezpośrednią aktywację FIX6 przez FXI i/lub FXII. Aby wykazać zależność od FXII, w celu zahamowania aktywnego FXII (FXIIa)7 dodano 4 µM inhibitora trypsyny kukurydzianej (CTI). Hamowanie to nie wpłynęło na adhezję płytek krwi (Rycina 2A), jednak krzepnięcie nie rozpoczęło się w ciągu dowolnie określonego całkowitego czasu trwania eksperymentu perfuzyjnego (Rycina 2B oraz Wideo uzupełniające 1).
In vitro droga kontaktu może zostać zainicjowana przez materiały obce, takie jak szkło, lub w testach klinicznych z wykorzystaniem materiałów mineralnych, np. kaolinu. In vivo aktywowane płytki krwi zapewniają ładunek ujemny8 poprzez ekspozycję błonową kwaśnych fosfolipidów9, takich jak fosfatydyloseryna, i/lub poprzez uwalnianie polifosforanów (polyP)10,11. Nasz mikrofluidyczny test w czasie rzeczywistym naśladuje ten drugi mechanizm, ponieważ w określonym zakresie stężeń płytek krwi reakcja hemostatyczna była zależna od liczby płytek (Rysunek 3). Wraz ze zwiększeniem liczby płytek we zrekonstytuowanej próbce, szybkość adhezji (Rysunek 3A), akumulacji (Rysunek 3B, kolor zielony) oraz krzepnięcia (Rysunek 3B, kolor fioletowy) wzrastała liniowo. Moment rozpoczęcia procesu uległ znacznemu skróceniu (Rysunek 3C) przy zwiększeniu stężenia płytek, co sugeruje, że do wywołania krzepnięcia wymagana jest progowa liczba osadzonych (aktywowanych) płytek krwi.
Jednakże w przypadku uszkodzenia tkanek in vivo, komórki wykazujące ekspresję TF inicjują krzepnięcie krwi poprzez zewnętrzny kompleks tenazy FVIIa-TF w obecności Ca2+. W naszym układzie eksperymentalnym proces ten symulowano poprzez pokrycie komór perfuzyjnych zawierających kolagen lipidowanym rhTF. W analizie porównawczej kanałów pokrytych samym kolagenem lub kolagenem w połączeniu z rhTF, początek krzepnięcia nastąpił znacznie szybciej (Rycina 4A). Szybkość adhezji płytek krwi nie była liniowa, w związku z czym nie przeprowadzono regresji liniowej (dane nie zostały przedstawione). Zarówno szybkość krzepnięcia, jak i akumulacja płytek krwi nie różniły się między badanymi warunkami (Rycina 4B-4C, Film uzupełniający 2).
<img alt="Wykres natężenia fluorescencji w funkcji czasu; analiza danych z wyników wzbudzenia optycznego." src="/files/ftp_upload/55351/55351fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Analiza regresji adhezji i koagulacji płytek krwi w mikrofluidycznych komorach perfuzyjnych. Rysunek ten wyjaśnia parametry wyprowadzone z surowych danych fluorescencji w czasie rzeczywistym, pozyskanych podczas przepływu rekalcyfikowanej krwi nad powierzchnią reaktywną. (A) Średnie natężenie zielonej fluorescencji pokazuje osadzanie się płytek krwi w funkcji czasu perfuzji. Krzywa opisuje proces bimodalny, rozpoczynający się od (i) powolnej, liniowo zwiększającej się adhezji płytek, po której następuje (ii) szybko rosnąca liniowa akumulacja. Obie liniowe części krzywej poddano regresji, a ich nachylenie opisuje dwa tempo tworzenia zakrzepu na podstawie fluorescencji płytek: (i) adhezję i (ii) akumulację. (B) Średnie natężenie fioletowej fluorescencji pokazuje osadzanie się fibryny w funkcji czasu. Podczas adhezji płytek fluorescencja fioletowa jest w zasadzie nieobecna, natomiast szybko rozwija się po rozpoczęciu koagulacji. (iv) Moment rozpoczęcia jest definiowany jako punkt przecięcia z osią x ekstrapolowanej regresji liniowej (iii) drugiej fazy tworzenia zakrzepu na podstawie fluorescencji fibryny, określonej tutaj jako koagulacja. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza szybkości adhezji, kontrola vs. CTI na wykresie słupkowym, moment wystąpienia na wykresie punktowym." src="/files/ftp_upload/55351/55351fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wobec braku TF, krzepnięcie w komorach przepływowych pokrytych kolagenem zależy od FXIIa. Przeprowadzono mikroprzepływową perfuzję zrekonstytuowanej krwi zawierającej CTI lub bufor kontrolny (CONTROL) przy szybkości ścinania 1,000 s-1 przez łącznie 30 min. (A) Szybkość adhezji płytek krwi (s-1) nie była zależna od CTI. (B) Moment wystąpienia dla próbek traktowanych CTI wykraczał poza 30-minutowy limit eksperymentu (zaznaczony linią przerywaną), co wykazuje zależność tego parametru od FXIIa. Słupki i kropki przedstawiają wartości średnie, wąsy oznaczają odchylenie standardowe. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą parowego testu t. (NS = brak istotności, n ≥3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy stężenia płytek krwi w funkcji szybkości; adhezja, koagulacja, moment rozpoczęcia; analiza danych z słupkami błędów." src="/files/ftp_upload/55351/55351fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Koagulacja w przepływie zależy od liczby płytek krwi. Eksperymenty z perfuzją mikrofluidyczną przeprowadzono w komorach powlekanych kolagenem przy użyciu zrekonstytuowanej krwi w obecności Ca2+ i przy różnych stężeniach płytek krwi (n ≥3). (A) Szybkość adhezji płytek krwi, (B) szybkość akumulacji płytek (kolor zielony) i koagulacji (kolor fioletowy) oraz (C) moment rozpoczęcia procesu przedstawiono jako funkcje stężeń płytek krwi w zrekonstytuowanej krwi. Kropki reprezentują wartości średnie, wąsy reprezentują odchylenia standardowe. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Badanie krzepnięcia krwi; A-C: moment rozpoczęcia, akumulacja, szybkość krzepnięcia; wykresy słupkowe, znaczniki statystyczne." src="/files/ftp_upload/55351/55351fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Aktywacja zarówno TF, jak i kontaktu w kaskadzie krzepnięcia znacząco skraca czas do rozpoczęcia krzepnięcia. Rekonstytuowaną krew, w obecności Ca2+, przepuszczano przez komory pokryte samym kolagenem lub kolagenem i rhTF, aby zbadać samą drogę kontaktu lub kombinację dróg kontaktu i TF. (A) Czas do rozpoczęcia krzepnięcia jest znacząco krótszy w komorach przepływowych zawierających TF. (B) Szybkość akumulacji płytek krwi podczas krzepnięcia oraz (C) szybkość krzepnięcia nie różnią się istotnie pomiędzy komorami przepływowymi pokrytymi samym kolagenem a tymi pokrytymi kolagenem i rhTF. Słupki i kropki przedstawiają wartości średnie; wąsy oznaczają odchylenia standardowe. Analiza statystyczna została przeprowadzona za pomocą testu t dla prób zależnych. (NS = brak istotności, *P &lt;0.05, n ≥3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiający analizę ekspresji białek w próbkach tkanek w skali 200 μm." src="/files/ftp_upload/55351/55351vid1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Wideo 1"> 
Wideo uzupełniające 1: Wobec braku TF krzepnięcie w komorach perfuzyjnych pokrytych kolagenem zależy od FXIIa. Rola szlaku kontaktowego jest określana w komorach perfuzyjnych pokrytych kolagenem. (A) Sekwencja nałożonych obrazów fluorescencyjnych osadzania płytek krwi (zielony) i fibryno(genu) (fioletowy) w obecności CTI. (B) Ta sama sekwencja co w panelu A, ale z wyłączonym kanałem zielonym. (C) Sekwencja nałożonych obrazów fluorescencyjnych osadzania płytek krwi (zielony) i fibryno(genu) (fioletowy) w obecności CTI. (D) Ta sama sekwencja co w panelu C, ale z wyłączonym kanałem zielonym. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pokazujące odpowiedź komórkową; znakowanie białek, sygnał GFP, obrazowanie w odstępach czasu." src="/files/ftp_upload/55351/55351vid2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Wideo 2"> 
Wideo uzupełniające 2: Aktywacja zarówno TF, jak i drogi kontaktowej znacznie skraca czas rozpoczęcia krzepnięcia.W celu zbadania roli TF wykorzystano komory przepływowe pokryte samym kolagenem lub kolagenem i rhTF. (A) Nałożona sekwencja obrazów fluorescencyjnych przedstawiająca odkładanie się płytek krwi (zielony) i fibryno(genu) (fioletowy) w komorach przepływowych pokrytych tylko kolagenem. (B) Ta sama sekwencja co w panelu A, ale z wyłączonym kanałem zielonym. (C) Nałożona sekwencja obrazów fluorescencyjnych przedstawiająca odkładanie się płytek krwi (zielony) i fibryno(genu) (fioletowy) w komorach przepływowych pokrytych zarówno kolagenem, jak i rhTF. (D) Ta sama sekwencja co w panelu C, ale z wyłączonym kanałem zielonym. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_2.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Ogólnym celem tego eksperymentu mikroprzepływowego jest jednoczesny pomiar osadzania się płytek krwi oraz tworzenia fibryny na powierzchni reaktywnej w warunkach przepływu z wykorzystaniem wideomikroskopii w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny transfuzjologicznej dotyczące wpływu przygotowania koncentratu krwinek płytkowych na naturę prokoagulacyjną przetoczonej krwi. Główną zaletą tej techniki jest ułatwienie jednoczesnej analizy funkcji płytek krwi oraz krzepnięcia w przepływie, co pozwala na zbadanie wzajemnego oddziaływania obu tych procesów.Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat prokoagulacji płytek krwi indukowanej drogą kontaktu, można ją również zastosować do badania drogi zewnętrznej poprzez powlekanie lipidowanym czynnikiem tkankowym. Procedurę zaprezentuje Rosalie Devloo, technik z laboratorium. Rozpocznij konfigurację komory przepływowej mikrofluidycznej, pipetując 0,8 µL świeżo zrekonstytuowanego kolagenu na pięć szóstych długości każdego kanału na jednym końcu nowego jednorazowego biochipu mikrofluidycznego z ośmioma prostymi równoległymi kanałami i oznaczając ten koniec mikrochipu jako wylot.Inkubować biochip w temperaturze 4 °C przez co najmniej cztery godziny w nawilżonym i szczelnie zamkniętym pojemniku. Po zakończeniu inkubacji wypełnić buforem blokującym zakodowane kanały w równej liczbie kanałów w kształcie litery Y w biochipie mieszającym. Przenieść mikrochip z powrotem do pojemnika na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie, w każdym z wykorzystywanych kanałów umieść pinezkę w jednym końcu dwóch odcinków rurek o długości 8 cm oraz jednego odcinka o długości 2 cm, a także w obu końcach jednego odcinka rurki o długości 46 cm. Następnie, używając oprogramowania Nanopump, przepłucz cały układ hydrauliczny pompy w podłączonych rurkach wodą destylowaną, a za pomocą strzykawki w pinie łączniku strzykawki wypełnij pozostałe rurki buforem blokującym. Następnie przymocuj zakodowany biochip do stolika automatycznego mikroskopu, używając laboratoryjnego podnośnika nożycowego, aby ustawić biochip mieszający na tej samej wysokości co stolik mikroskopu.Użyj pinów w rurkach o długości ośmiu centymetrów, aby przymocować te fragmenty rurek do wlotu biochipu mieszającego i umieść wolny koniec każdej rurki w fiolce z roztworem soli buforowanej HEPES. Następnie połącz biochip kodujący z biochipem mieszającym za pomocą 46 centymetrowego fragmentu rurki, tworząc elastyczną, ale prostą linię. Przymocuj pin łącznika strzykawki do rurki kompatybilnej z systemem Luer w pompie płuczącej.Następnie podłącz pinezkę do wolnego końca dwucentymetrowego odcinka rurki, a drugi koniec rurki zamocuj do wylotu kodowanego biochipu. Następnie przemyj wszystkie rurki i kanały 1 ml HBS. Aby przygotować pompy perfuzyjne, uruchom oprogramowanie Microfluidic Perfusion Pump Driver i dwukrotnie kliknij ikonę strzykawek, aby zainicjować pompy.Wybierz rodzaj strzykawki, która będzie używana, a następnie odłącz pompę płuczącą oraz podłączony do niej dwucentymetrowy przewód. Podłącz odłączony dwucentymetrowy przewód za pomocą jego wkładki złączy strzykawki do luer locka grubościennego przewodu odpływowego i za pomocą strzykawki napełnij grubościenny przewód standardowym roztworem pepsyny. Następnie zabezpiecz otwarty koniec grubościennego przewodu zaciskiem Kochera.Przymocuj rurkę do wylotu zakodowanego biochipa. Odłącz obie rurki od komory mieszania przepływowego i wyrzuć pojemniki z HBS. Po pobraniu próbki krwi do próżniowych probówek z cytrynianem sodu, odwiruj rurki w wirówce i przenieś osocze bogate w płytki do nowej probówki do wirowania.Ponownie odwiruj pojemniki z osoczem bogatopłytkowym. Następnie przenieś supernatant w postaci osocza ubogopłytkowego do innej probówki wirówkowej. W kolejnym kroku użyj igły o rozmiarze 21 G, aby przebić dno pojemników z cytrynianem sodu, umożliwiając spłynięcie upakowanych erytrocytów do nowej probówki stożkowej.Po zebraniu wszystkich upakowanych erytrocytów, należy delikatnie zrekonstytuować krew, łącząc oddzielone upakowane erytrocyty z osoczem ubogim w płytki krwi, a następnie dodać płytki krwi z banku krwi przygotowane do transfuzji, aby uzyskać próbki o hematokrycie 40% i stężeniu płytek krwi 2,5 × 10⁵ na microliter w końcowej objętości 2,5 milliliter, a następnie wykonać morfologię krwi. Następnie do stożkowej probówki polistyrenowej należy dodać 13 microliters fibrynogenu znakowanego fluorochromem, a po nim jeden milliliter zrekonstytuowanej krwi.Wymieszaj kolejny 1 mL krwi z 2 µL fluorescencyjnego barwnika do płytek krwi, a następnie połącz oznakowane próbki krwi. Następnie delikatnie odwróć wymieszane próbki krwi i inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Przed rozpoczęciem testu perfuzyjnego ustaw ostrość optyki mikroskopu na włókna kolagenu przytwierdzone do dna pierwszego kanału.Używając oprogramowania do akwizycji, zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) w wybranym kanale. Nalej 1 mL uprzednio ogrzanego buforu krzepnięcia do strzykawki o pojemności 1 mL i zamocuj strzykawkę w pompie perfuzyjnej. Po ponownym delikatnym odwróceniu, pobierz krew do strzykawki o pojemności 2 mL i zamocuj strzykawkę w pompie perfuzyjnej.Następnie, używając pinów łączników strzykawek, podłącz obie strzykawki do jednego odcinka rurki o długości 8 cm i odpowietrz łączniki oraz rurki z przepływem 400 µL/min. Gdy cała rurka zostanie wypełniona buforem do koagulacji lub krwią, podłącz drugi koniec obu rurek do rozdzielnych odnog w kanale w kształcie litery Y w biochipie do mieszania. Następnie zdejmij zacisk Kochera z wylotu rurki odpływowej i rozpocznij perfuzję z przepływem 4,4 µL/min dla buforu do koagulacji oraz 44 µL/min dla zrekonstytuowanej krwi.Rejestruj obrazy co 10 sekund przez 30 minut w czasie rzeczywistym, zatrzymując pompy oraz akwizycję obrazu po 30 minutach lub w momencie nasycenia sygnału. Następnie zutylizuj wszystkie rurki i strzykawki jako odpady biologiczne. Ten film stanowi doskonały przykład narastania zakrzepów płytkowych i odkładania się fibryny.Na początku perfuzji płytki krwi przyległy do reaktywnej powierzchni, co doprowadziło do stałego wzrostu rejestrowanej zielonej fluorescencji. W fazie adhezji występuje niewielka fluorescencja fioletowa, co wskazuje na to, że fibryna tworzy się jedynie w niewielkim stopniu. Po zainicjowaniu krzepnięcia fioletowo fluorescencyjna fibryna szybko osadza się, podczas gdy zielona fluorescencja płytek krwi gromadzi się w podobnym tempie.Moment rozpoczęcia krzepnięcia można zatem ekstrapolować jako wyznacznik prokoagulacyjnego potencjału płytek krwi. Dodatek inhibitora trypsyny kukurydzianej do zrekonstytuowanej krwi nie wpływa na adhezję płytek, jednak krzepnięcie nie rozpoczyna się przez cały czas trwania eksperymentu perfuzyjnego. Wraz ze zwiększeniem liczby płytek w zrekonstytuowanej próbce, tempo adhezji, akumulacji i krzepnięcia wzrasta liniowo.Moment rozpoczęcia procesu jest znacząco skrócony przy zwiększeniu stężenia płytek krwi, co sugeruje, że do wywołania krzepnięcia wymagana jest progowa liczba aktywowanych i osadzonych płytek. Co więcej, w analizie porównawczej kanałów powlekanych wyłącznie kolagenem lub w kombinacji z rekombinowanym lipidowanym czynnikiem tkankowym, rozpoczęcie krzepnięcia następuje znacznie szybciej, choć ani całkowita szybkość krzepnięcia, ani akumulacja płytek nie różnią się pomiędzy tymi warunkami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić eksperyment w mikrofluidycznej komorze przepływowej z użyciem dwuczłonowo znakowanej krwi rekonstytuowanej w celu jednoczesnej analizy funkcji płytek krwi i krzepnięcia.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny medycyny transfuzjologicznej do zgłębiania interakcji między płytkami krwi a krzepnięciem w warunkach przepływu. W tym filmie skupiliśmy się na zaprezentowaniu zstandaryzowanego eksperymentu. Można jednak wprowadzić zmiany w powłoce powierzchniowej, naprężeniach ścinających lub stężeniu wapnia, aby odpowiedzieć na konkretne pytania badawcze.

a-microfluidic-flow-chamber-model-for-platelet-transfusion-hemostasis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w warunkach przepływu ścinającego, co jest czynnikiem pomijanym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi wykorzystujący mikrofluidyczny format płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Techniki mikroskopii poklatkowej i przetwarzania obrazów zostały użyte do obserwacji i analizy zagęszczenia żelu za pośrednictwem fibroblastów i wyrównania włókien fibryny w bioreaktorze kontrolowanym przez środowisko przez okres 48 godzin.

Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Omawiane są protokoły badania tworzenia się biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym, które naśladuje porowate media. Urządzenie mikroprzepływowe składa się z szeregu mikrofilarów i badane jest tworzenie biofilmu przez Pseudomonas fluorescens w tym urządzeniu.

Protokół tworzenia strumienia biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrofilarami

Prezentujemy metodę mikroprzepływowego osadzania wzorzystej genipiny i fibronektyny na podłożach PDMS, pozwalając na przedłużoną żywotność tkanek gęstych od komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Ta metoda wytwarzania tkanek jest połączona z poprzednią technologią cienkich warstw naczyń mięśniowych w celu pomiaru kurczliwości naczyń w czasie istotnym dla choroby.

Technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych

Tworzenie funkcjonalnych mikrotkanek w urządzeniach mikroprzepływowych wymaga stabilizacji fenotypów komórek poprzez dostosowanie tradycyjnych technik hodowli komórkowych do ograniczonych wymiarów przestrzennych w mikrourządzeniach. Modyfikacja kolagenu umożliwia osadzanie się warstwa po warstwie ultracienkich zespołów kolagenowych, które mogą stabilizować komórki pierwotne, takie jak hepatocyty, jako mikroprzepływowe modele tkankowe.

Osadzanie kolagenu warstwa po warstwie w urządzeniach mikroprzepływowych do stabilizacji mikrotkanek

Fibryna bogata w leukocyty-płytki krwi (L-PRF) reprezentuje zatwierdzony przez FDA preparat autologicznych koncentratów płytkowych, który posiada unikalną architekturę fibryny, wzbogacone płytki krwi i obfite czynniki wzrostu. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania L-PRF po stronie fotela, a także oceniamy jego właściwości mechaniczne, w tym testy jednoosiowe i testy wytrzymałości na utrzymanie szwów.

Charakterystyka fibryny bogatopłytkowej leukocytów, nowego biomateriału

Poznaj mikroprzepływową metodę analizy odkładania się płytek krwi i tworzenia fibryny w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia jednoczesne badanie funkcji płytek i hemostazy w warunkach przepływu.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów