Metoda mieszadła magnetycznego do wykrywania larw włośni w próbkach mięśniowych

Ogólnym celem tej metody diagnostycznej jest identyfikacja mięsa lub produktów mięsnych zakażonych zoonotycznym pasożytem przenoszonym z żywnością z rodzaju Trichinella. Metoda ta stanowi złoty standard bezpośredniego wykrywania larw Trichinella w mięsie. Główną zaletą tej techniki jest łatwość wykonania oraz brak konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ nie można stosować kontroli wewnętrznych, a w trakcie całego testu należy stosować rygorystyczne zarządzanie jakością. Procedurę zaprezentuje Nora Thaben, technik z mojego laboratorium. Witam! Aby przygotować próbkę mięśnia do trawienia, należy umieścić 100 g próbki w blenderze lub młynku.

Następnie należy dodać 2 ml podgrzanej wody, aby ułatwić mieszanie. Blendować na maksymalnych obrotach przez 2-3 sekundy. Przed drugim blendowaniem należy otworzyć blender i przenieść wszelkie próbki mięśni znajdujące się przy górnej krawędzi naczynia blendera na dół.

Powtórz blendowanie, kontynuując proces w seriach po dwie do trzech sekund, aż do momentu, gdy nie będą widoczne żadne kawałki mięsa. Przed rozpoczęciem tej procedury przygotuj płyn trawienny w zlewce o pojemności trzech litrów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieś jeden litr podgrzanego płynu trawiennego do kolby.

Przenieś zmielone mięso do zlewki. Następnie za pomocą łyżki lub widelca rozmieść mięso w płynie trawiennym. Dokładnie wypłucz kielich blendera, pokrywę, noże oraz widelec, używając pozostałej ilości płynu trawiennego.

Umieść zlew na płycie grzewczej, aby utrzymać stałą temperaturę od 44 do 46 °C, monitorując ją za pomocą termometru. Następnie przykryj zlew folią aluminiową. Mieszaj płyn trawienny przez 30 minut, tworząc głęboki wir bez rozbryzgiwania, aż do momentu całkowitego rozpadu cząsteczek mięsa.

Po trawieniu próbki mięśnia należy przefiltrować ciecz z trawienia i określić ilość nietrawionej tkanki. Wyzerować wagę, zważyć czyste sito o oczkach 180 µm i zapisać jego masę. Sprawdzić, czy rozdzielacz jest ustawiony pionowo.

Aby zapewnić prawidłowe sedymentowanie larw, szerokość szklanego lejka separacyjnego nie powinna przekraczać 55% jego długości. Ostrożnie wlej płyn trawienny przez sito do szklanego lejka separacyjnego, unikając przelewania. Aby uniknąć utraty czułości, dokładnie wypłucz zlewkę szklaną oraz sito około 200 mililitrów wody z kranu.

Następnie należy przenieść wodę płuczącą do rozdzielacza szklanego. Podnieść sito i dokładnie wypłukać obszar pod nim za pomocą butelki zmywaka. Woda płucząca powinna zostać również zebrana w rozdzielaczu szklanym.

Pozostaw sito na lejku rozdzielczym w celu osuszenia przez cały czas trwania procedury sedymentacji. Aby rozpocząć procedurę sedymentacji, pozostaw przefiltrowany płyn trawienny w lejku rozdzielczym przez 30 minut, aby larwy Trichinella opadły na dno lejka. Po zakończeniu sedymentacji całkowicie otwórz kurek lejka rozdzielczego, aby pozwolić co najmniej 20 mililitrów płynu trawiennego szybko spłynąć do cylindra mierniczego.

Następnie całkowicie otwórz kurek w przeciwnym kierunku, aby przepuścić 10 mililitrów płynu trawiennego. Na koniec ponownie otwórz kurek w przeciwnym kierunku, aby kolejne 10 mililitrów przedostało się do cylindra mierniczego. Pozostaw 40 mililitrów płynu trawiennego w cylindrze na 10 minut, aby larwy mogły ososiąść.

Następnie należy określić ilość niestrawionych tkanek. Wyjmij sito z lejka sedymentacyjnego i osusz je ręcznikiem papierowym. Odjmij masę sita przed filtracją od masy sita z niestrawionymi tkankami.

Proces trawienia uznaje się za satysfakcjonujący, jeśli na sicie pozostaje nie więcej niż 5% początkowej masy próbki. Jeśli ilość nietrawionej tkanki przekracza 5%, należy powtórzyć trawienie, wykorzystując świeże próbki mięśni. W przypadku braku dostępności świeżych próbek, należy ponownie poddać trawieniu pozostały materiał.

Po pozostawieniu płynu trawiennego w cylindrze przez 10 minut, odessać 30 mililitrów supernatantu za pomocą pipety, nie naruszając 10-mililitrowego osadu. Aby zmniejszyć ilość włókien tkankowych w próbce, dodać do osadu 30 mililitrów wody z kranu i pozostawić na kolejne 10 minut. Powtarzać to płukanie do momentu, aż ciecz stanie się klarowna.

Gdy ciecz stanie się klarowna, usuń nadsącz i przenieś 10 ml wypłukanego osadu do siatkowego naczynia Petriego. Przepłucz cylindra 10 ml wody z kranu i dodaj wodę do wypłukanego osadu. Bezpośrednio po etapach płukania przebadaj próbki za pomocą trichinoskopu lub stereomikroskopu z regulowanym źródłem światła przechodzącego pod stolikiem.

Przy powiększeniu od 15 do 20x należy systematycznie zbadać szalkę Petriego, przesuwając się pole po polu. Jeśli nie zostaną znalezione żadne podejrzane struktury, należy delikatnie poruszyć płyn w szalce po okręgu, aby umożliwić ewentualnym przeoczonym larwom Trichinella zgromadzenie się w centrum naczynia. Następnie należy powtórzyć badanie.

Jeśli zostanie znaleziona podejrzana struktura, zwiększyć powiększenie do 40–100x. Usunąć larwy Trichinella z naczynia za pomocą pipety i zebrać je do pojemnika. Po zbadaniu całego naczynia powtórzyć procedurę badania mikroskopowego, zaczynając od delikatnego wstrząśnięcia naczynia.

Powtórz procedurę co najmniej trzy razy lub do momentu, gdy nie zostaną znalezione żadne kolejne larwy. Wyznacz liczbę larw na gram tkanki mięśniowej.

Jeśli w płynie trawiennym znajduje się zbyt wiele larw, aby wiarygodnie określić ich liczbę, należy przelać płyn z larwami z powrotem do cylindra miarowego. Przepłukać naczynie wodą z kranu za pomocą butelki z myjką i pozwolić larwom opaść na dno. Po 10 minutach sedymentacji należy zmniejszyć objętość płynu trawiennego do określonej wartości, przenosząc larwy z dna cylindra miarowego do nowego cylindra w odstępach 1 ml.

Jednorodne zawieszenie larw w 10 mililitrach uzyskano poprzez energiczne wstrząsanie. Podczas wstrząsania za pomocą pipety naniesiono 12 kropli po 20 mikrolitrów zawiesiny larw na szalkę Petriego. Każdą 20-mikrolitrową kroplę zbadano pod mikroskopem, a następnie obliczono całkowitą liczbę larw zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przed badaniem mikroskopowym larw Trichinella ważne jest odpowiednie przemycie każdej próbki w celu usunięcia zanieczyszczeń, które mogłyby uniemożliwić identyfikację larw. Larwy Trichinella mają długość od 0,7 do 1,5 mm i szerokość około 0,3 mm. Przełyk jest wąski z lekko zaokrąglonym końcem.

Stychosom jest strukturą znajdującą się w przedniej połowie jamy ciała, składającą się z długiej, smukłej rurki otoczonej rzędem od 45 do 55 dużych komórek. Odbyt jest również zaokrąglony, bez jakichkolwiek wypustek lub wyrostków. Po trawieniu kształt zakaźnych larw mięśniowych może być zmienny, co utrudnia ich identyfikację.

Typowe formy obejmują larwy ruchome, zwinięte ciasno lub luźno, larwy w kształcie litery C lub całkowicie rozwinięte. Po trawieniu mięśni można zidentyfikować struktury inne niż larwy *Trichinella*. Przykłady przypadkowych znalezisk u dzika obejmują włosowatą szczeczkę dżdżownicy, trematodę *Alaria alata*, włókno mięśniowe, nicienia z rodzaju *Metastrongylus*, włókno roślinne oraz larwy nicienia *Toxocara*.

Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać przeprowadzona w około dwie godziny, pod warunkiem jej prawidłowego wykonania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat wykrywania larw Trichinella w mięsie metodą mieszadła magnetycznego, z uwzględnieniem najważniejszych krytycznych punktów kontrolnych.