Name: Metoda mieszadła magnetycznego do wykrywania larw włośni w próbkach mięśniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę mieszadła magnetycznego do wykrywania larw Trichinella w próbkach mięśniowych. Ta technika stanowi złoty standard diagnostyczny w badaniach pasożytniczych i bezpieczeństwie żywności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uprzejmie dziękujemy Sabine Reckinger za doskonałą pomoc techniczną i wsparcie.

1. Przygotowania
<ol>
	<li>Pobieranie próbek 
	Uwaga: Metoda mieszadła magnetycznego może być stosowana do pojedynczych lub zbiorczych próbek mięśni.
	<ol>
		<li>Zbierz próbki z odpowiednich miejsc predylekcji i w odpowiedniej ilości9. Zapoznaj się z wymaganiami krajowymi lub zaleceniami ICT, OIE lub ISO.
		<ol>
			<li>Na przykład w przypadku Unii Europejskiej należy pobrać próbkę o wadze 1 g ze słupka membranowego w miejscu przejścia do części ścięgnistej świń domowych. Upewnij się, że wszystkie próbki mięśni są wolne od tłuszczu i powięzi.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Jeśli język jest testowany, usuń warstwę wierzchnią przed badaniem.</li>
		<li>Należy zachować ostrożność w przypadku zamrożenia próbek, ponieważ większość larw włośni nie jest odporna na zamarzanie i rozwija się po śmierci, jest mniej odporna na trawienie i ma tendencję do przyklejania się do ścianek pojemnika, co skutkuje zmniejszoną czułością testu. 
		Uwaga: W przypadku zamrożenia należy co najmniej podwoić wielkość próbki i wydłużyć czas sedymentacji (patrz poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płynu wytrawiającego
	<ol>
		<li>Dodać 25% HCl (16 ± 0,5 ml) do 2 l wody z kranu podgrzanej w temperaturze 46 - 48 °C do szklanej zlewki o pojemności 3 l. Zbyt niska temperatura powoduje niepełne trawienie; Zbyt wysoka temperatura dezaktywuje właściwości enzymatyczne pepsyny.</li>
		<li>Umieścić pręt mieszający w zlewce i wymieszać roztwór na rozgrzanej płytce (46 - 48 °C).</li>
		<li>Dodać 10 ± 0,2 g pepsyny (1:10 000 NF, 1:12 500 BP, 2 000 FIP) do kwaśnego roztworu. 
		Uwaga: Jakość pepsyny ma ogromne znaczenie, a aktywność enzymatyczna musi być certyfikowana przez producenta. Ze względów bezpieczeństwa laboratoryjnego oraz w celu utrzymania aktywności pepsyny należy przestrzegać kolejności dodawania składników płynu wytrawiającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki mięśniowej
	<ol>
		<li>Posiekaj do 100 g próbek mięśni w blenderze lub młynku. Aby ułatwić mieszanie, dodaj do próbek 2 ml podgrzanej wody i miksuj z maksymalną prędkością przez 2-3 s.</li>
		<li>Przed drugim miksowaniem otwórz blender i przenieś dowolną próbkę mięśni z górnej krawędzi miski do miksowania na dół i powtórz miksowanie. Kontynuuj miksowanie seriami 2-3 s, aż nie pozostaną żadne widoczne kawałki mięsa. 
		Uwaga: Zbyt małe mieszanie może spowodować niepełne trawienie, podczas gdy zbyt duże mieszanie może uszkodzić larwy włosienia obecne w próbkach6.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Procedura
<ol>
	<li>Trawienie próbki mięśniowej
	<ol>
		<li>Przenieść 1 l płynu wytrawiającego do cylindra. Zmielone mięso przełożyć do zlewki i rozprowadzić w płynie wytrawiającym za pomocą łyżki lub widelca. Dokładnie wypłukać pokrywę blendera, ostrze i miskę miksera z 500 ml podgrzanego płynu wytrawiającego do 3-litrowej zlewki. 
		Uwaga: Niepełne płukanie może spowodować utratę wrażliwości.</li>
		<li>Przykryć zlewkę folią aluminiową i utrzymywać stałą temperaturę 44–46 °C, a następnie monitorować za pomocą termometru.</li>
		<li>Mieszaj płyn wytrawiający przez 30 minut, aby stworzyć głęboki wir bez rozpryskiwania, aż znikną cząstki mięsa. W zależności od rodzaju badanego mięsa (np. mięso dzikich zwierząt) należy wydłużyć czas trawienia maksymalnie do 60 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Filtracja i sedymentacja płynu wytrawiającego
	<ol>
		<li>Aby określić ilość niestrawionej tkanki, ustaw wagę do zera, zważ sito przed użyciem i zanotuj jego wagę. Sito powinno być czyste i pozbawione jakichkolwiek cząstek tkanki, które mogłyby utrudnić larwom włośni dotarcie do lejka sedymentacyjnego. Sprawdź, czy lejek separacyjny jest wypoziomowany w pionie.</li>
		<li>Po wytrawieniu ostrożnie przelać płyn wytrawiający przez sito 180 μm do szklanego lejka do separacji. Szerokość szklanego lejka separacyjnego nie powinna być większa niż 55% długości, aby umożliwić dobrą sedymentację larw. Uważaj, aby nie dopuścić do przepełnienia.</li>
		<li>Aby uniknąć utraty wrażliwości, dokładnie wypłukać szklaną zlewkę i sito około 200 ml wody z kranu z wyciśniętej butelki do mycia i przenieść wodę z płukania do lejka do osadnika. Należy dokładnie opłukać brzegi zlewki o pojemności 3 l. Podnieś sitko i dokładnie spłucz obszar pod sitkiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie ilości niestrawionych tkanek 
	Uwaga: Z powodu błędów w wykonaniu metody na sicie może pozostać tkanka mięśniowa, a także powięź i tkanka łączna, które są niestrawne. Ilość niestrawionej tkanki określa się podczas pierwszego 10-minutowego etapu sedymentacji (patrz 2.5). Dzięki temu sito może wyschnąć po około 30 minutach, ponieważ resztki wody mogą wpływać na określoną masę niestrawionej tkanki.
	<ol>
		<li>Połóż ręcznik papierowy na wadze i zważ sito z niestrawionymi tkankami.</li>
		<li>Odejmij masę sita przed filtracją od masy sita z niestrawionymi tkankami. Proces trawienia uważa się za zadowalający, jeżeli na sicie nie pozostaje więcej niż 5 % wyjściowej masy próbki (tj. 5 g/100 g materiału wyjściowego).</li>
		<li>Jeśli ilość niestrawionej tkanki przekracza 5%, powtórz test, używając świeżych próbek mięśni. Jeżeli pozostała tkanka składa się głównie z niestrawionej tkanki mięśniowej, a świeże próbki nie są dostępne, należy ponownie strawić niestrawione resztki i zbadać je dodatkowo z oryginalnymi próbkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sedymentacja płynu wytrawiającego
	<ol>
		<li>Przefiltrowany płyn wytrawiający należy przechowywać w rozdzielaczu przez 30 minut. Pozostawione w spokoju larwy włośni osiądą na dnie lejka.</li>
		<li>Jeżeli stosuje się próbki zamrożone, należy wydłużyć czas sedymentacji do maksymalnie 60 minut.</li>
		<li>Po zakończeniu sedymentacji całkowicie otwórz kurek rozdzielacza separatora, aby co najmniej 40 ml płynu wytrawiającego szybko spłynęło do cylindra miarowego (80 ml, jeśli próbki mięśni zostały wcześniej zamrożone).</li>
		<li>Najpierw wpuść połowę płynu do cylindra, a następnie całkowicie otwórz kran w przeciwnym kierunku, aby umożliwić przepływ 10 ml płynu wytrawiającego. Na koniec otwórz kran w przeciwnym kierunku na kolejne 10 ml. Procedura ta zapewnia, że larwy włosienia nie zostaną uwięzione w kurku. 
		Uwaga: Potrzebna jest wystarczająca prędkość, aby larwy nie pozostały w rozdzielaczu, zmniejszając czułość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sedymentacja płynu wytrawiającego w cylindrze
	<ol>
		<li>Pozostaw osad w cylindrze na 10 minut, aby larwy mogły się osadzić. Usunąć 30 ml supernatantu przez odsysanie pipetą, nie naruszając 10 ml osadu.</li>
		<li>Aby zmniejszyć ilość włókien tkankowych w próbce, dodaj 30 ml wody z kranu do osadu i pozostaw na kolejne 10 minut. Powtarzaj, aż płyn będzie klarowny.</li>
		<li>Usunąć supernatant i przenieść 10 ml przemytego osadu do płytki Petriego z siatką lub ryniecki do liczenia larw. Przepłukać cylinder 10 ml wody z kranu, a następnie dodać wodę do próbki. 
		Uwaga: Ponieważ duże ilości zanieczyszczeń w próbce mogą uniemożliwić identyfikację larw włośni (rysunek 1), w razie potrzeby należy przeprowadzić dalsze czynności myjące.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie mikroskopowe
	<ol>
		<li>Użyć trychinoskopu lub stereomikroskopu z podstopniowym źródłem światła przechodzącego o regulowanym natężeniu przy powiększeniu od 15 do 20 razy, aby zbadać próbki bezpośrednio po etapach mycia.</li>
		<li>Po przelaniu próbki na siatkowaną szalkę Petriego, należy systematycznie badać naczynie/miskę kratka po siatce. Jeśli nie zostaną znalezione żadne podejrzane struktury, delikatnie przesunąć płyn na siatkowej szalce Petriego lub w mieniu do liczenia larw w sposób okrężny, aby umożliwić larwy włośni, które mogły zostać przeoczone, zgromadzić się w środku szalki Petriego. Powtórz badanie.</li>
		<li>Jeśli zostanie znaleziona podejrzana struktura, zwiększ powiększenie do 40 - 100X. Usuń larwy włośni z naczynia/miski za pomocą pipety i zbierz w probówce z 90% etanolem.</li>
		<li>Po zbadaniu całego naczynia powtórz procedurę, zaczynając od delikatnego potrząśnięcia naczyniem/miską. Powtórz procedurę co najmniej trzy razy lub do momentu, gdy nie zostanie znalezionych więcej larw.</li>
		<li>Policz liczbę larw. Korelują z ilością tkanki mięśniowej badanej i obecnej w postaci larw na gram (lpg).</li>
		<li>Jeśli w płynie trawiennym znajduje się zbyt wiele larw, aby wiarygodnie określić liczbę larw, należy zwrócić płyn zawierający larwy do cylindra miarowego, spłukać wodą z kranu z wyciśniętej butelki do płukania i pozostawić larwy do osiadania na dnie.</li>
		<li>Po 10 minutach sedymentacji zredukować supernatant do określonej objętości (np. 10 ml). Aby określić dokładną objętość, przenieś supernatant do nowego cylindra za pomocą pipety.</li>
		<li>Zawiesić larwy jednorodnie w płynie przez energiczne potrząsanie. Podczas wytrząsania dodać 12 kropli 20 μl zawiesiny larwalnej na szalkę Petriego.</li>
		<li>Zbadaj każdą kroplę pod mikroskopem. Określić liczbę larw w 240 μl i usunąć najwyższą i najniższą liczbę. Ekstrapolować liczbę larw na całkowitą objętość (np. 10 ml) supernatantu. 
		Uwaga: Jakość stereomikroskopu ma ogromne znaczenie dla identyfikacji larw włosienia.</li>
		<li>Po zebraniu larw do probówki za pomocą pipety, należy dokładnie sprawdzić, czy larwy nie przykleiły się do ścianki pipety, ale zostały przeniesione do probówki. 
		Uwaga: Dodatnie wyniki badań na obecność włośni w próbkach pobranych w puli muszą być prześledzone wstecz od próbki zbiorczej do tuszy pochodzenia. W tym przypadku wielkość puli powinna być stopniowo zmniejszana, aż do momentu zidentyfikowania tuszy z wynikiem dodatnim. Podczas tego procesu można również zwiększyć wielkość próbki, aby zwiększyć czułość. W przypadku gdy badanie próbki zbiorczej daje wynik dodatni lub niepewny, od każdej świni pobiera się kolejne 20 g próbki. Próbki o wadze 20 g pobrane od pięciu świń łączy się i bada przy użyciu opisanej metody. W ten sposób przebadane zostaną próbki z 20 grup po pięć świń. W przypadku wykrycia włośni w próbce zbiorczej pobranej od pięciu świń, pobiera się 20 g próbek od poszczególnych świń w grupie i każda z nich jest badana oddzielnie aż do momentu wykrycia dodatniej tuszy pochodzenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gottstein, B., Pozio, E., Nöckler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+Diagnosis%2C+Treatment%2C+and+Control+of+Trichinellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, Diagnosis, Treatment, and Control of Trichinellosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 22, 127-145 (2009).</li>
<li>Pozio, E., Murrell, D. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17134656">Systematics and epidemiology of Trichinella.</a> Adv. Parasitol. 63, 367-439 (2006).</li>
<li>OIE World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. OIE Terrestrial Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://wahis2-devt.oie.int/fileadmin/Home/fr/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf">http://wahis2-devt.oie.int/fileadmin/Home/fr/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf</a> 1-16 (2013).</li>
<li>European Commission. Commission Implementing Regulation (EU) 2015/1375 of 10 August 2015 laying down specific rules on official controls for Trichinella in meat. Off. J. EU. 212, Available from:
 <a target="_blank" href="http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=celex%3A32015R1375">http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=celex%3A32015R1375</a> 7-34 (2015).</li>
<li>United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service. 9 CFR Part 318.10 - Prescribed treatment of pork and products containing pork to destroy trichinae. U.S. Government Publishing Office. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2016-title9-vol2/pdf/CFR-2016-title9-vol2-sec318-10.pdf">https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2016-title9-vol2/pdf/CFR-2016-title9-vol2-sec318-10.pdf</a> (2012).</li>
<li>Gamble, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Commission+on+Trichinellosis%3A+recommendations+on+methods+for+the+control+of+Trichinella+in+domestic+and+wild+animals+intended+for+human+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">International Commission on Trichinellosis: recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals intended for human consumption.</a> Vet. Parasitol. 93 (3-4), 393-408 (2000).</li>
<li>Gajadhar, A. A., Forbes, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internationally+recognized+quality+assurance+system+for+diagnostic+parasitology+in+animal+health+and+food+safety%2C+with+example+data+on+trichinellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">An internationally recognized quality assurance system for diagnostic parasitology in animal health and food safety, with example data on trichinellosis.</a> Vet. Parasitol. 103, 133-140 (2002).</li>
<li>ISO. Microbiology of the food chain -- Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method 18743. ISO. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.iso.org/">http://www.iso.org/</a> (2015).</li>
<li>Nöckler, K., Kapel, C. M. O. Chapter 3, Detection and surveillance for Trichinella: meat inspection and hygiene, and legislation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%B6ckler%2C+K+%22FAO%2FWHO%2FOIE+Guidelines+for+the+surveillance%2C+management%2C+prevention+and+control+of+trichinellosis%22">FAO/WHO/OIE Guidelines for the surveillance, management, prevention and control of trichinellosis</a>. , World Organization for Animal Health (OIE). Paris. 69-98 (2007).</li>
<li>Boch, J., Schnieder, T., Supperer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoch%2C+J+%22Veterin%C3%A4rmedizinische+Parasitologie%22">Veterinärmedizinische Parasitologie</a>. , Parey Verlag. Stuttgart. 6. Aufl (2006).</li>
<li>Despommier, D. D., Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stichosome+and+its+secretion+granules+in+the+mature+muscle+larva+of+Trichinella+spiralis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The stichosome and its secretion granules in the mature muscle larva of Trichinella spiralis.</a> J. Parasitol. 62 (5), 775-785 (1976).</li>
<li>Marucci, G., Interisano, M., La Rosa, G., Pozio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+nematode+larvae+different+from+those+of+the+Trichinella+genus+detected+by+muscle+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of nematode larvae different from those of the Trichinella genus detected by muscle digestion.</a> Vet Parasitol. 194, 117-120 (2013).</li>
<li>Forbes, L. B., Gajadhar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+Trichinella+digestion+assay+and+an+associated+sampling+and+quality+assurance+system+for+use+in+testing+pork+and+horse+meat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A validated Trichinella digestion assay and an associated sampling and quality assurance system for use in testing pork and horse meat.</a> J. Food Prot. 62, 1308-1313 (1999).</li>
<li>Malakauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Trichinella+spp.+in+three+Baltic+countries%3A+Lithuania%2C+Latvia%2C+and+Estonia%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Trichinella spp. in three Baltic countries: Lithuania, Latvia, and Estonia.</a> Parasitol. Res. 100 (4), 687-693 (2007).</li>
<li>Kapel, C. M., Webster, P., Gamble, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+distribution+of+sylvatic+and+domestic+Trichinella+larvae+in+production+animals+and+wildlife%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Muscle distribution of sylvatic and domestic Trichinella larvae in production animals and wildlife.</a> Vet. Parasitol. 132 (1-2), 101-105 (2005).</li>
<li>Interisano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+latex+agglutination+test+for+the+detection+of+Trichinella+infections+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Validation of a latex agglutination test for the detection of Trichinella infections in pigs.</a> Vet. Parasitol. 194, 121-124 (2013).</li>
<li>Pozio, E., La Rosa,, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-derived+methods+for+the+identification+of+Trichinella+parasites+from+animal+and+human+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">PCR-derived methods for the identification of Trichinella parasites from animal and human samples.</a> Methods Mol. Biol. 216, 299-309 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Chociaż metoda mieszadła magnetycznego może być łatwa do wykonania, nieścisłe przestrzeganie szczegółów technicznych prowadzi do niewystarczającej czułości, zagrażając w ten sposób zdrowiu konsumentów. Krytyczne punkty kontrolne zostały wyróżnione w powyższym tekście. Ponadto kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku testu ma użycie odpowiedniego sprzętu. Wszystkie naczynia powinny być wykonane ze szkła, a końcówki pipet pokryte silikonem, aby zmniejszyć przyleganie larw do powierzchni.
Czułość metody trawienia zależy od gęstości larw w mięśniach i ilości badanej próbki mięśniowej. Dla zagęszczenia larw tkanek mięśniowych wynoszącej 3 - 5 lpg stwierdzono czułość na poziomie 100%, ale poniżej 1 lpg czułość spadła do 40%13. W zależności od badanego gatunku zwierzęcia żywiciela, czułość testu można poprawić poprzez zwiększenie ilości używanej próbki. Obciążenie infekcjami u dzikich zwierząt jest zwykle niskie, dlatego stosuje się większe rozmiary próbek14. Miejsca predylekcji różnią się również wśród zwierząt gospodarzy. W tym przypadku należy wziąć pod uwagę niższą strawność niektórych tkanek mięśniowych, takich jak język, co może również skutkować większymi rozmiarami prób15.
Ponadto ważne jest, aby zrozumieć, że metoda mieszadła magnetycznego nie obejmuje kontroli wewnętrznych. W związku z tym zarządzanie zapewnieniem jakości, od pobierania próbek po dokumentację, jest niezbędne do uzyskania dokładnych i precyzyjnych wyników. Jakość wyników badań laboratoryjnych w zakresie wykrywania larw włosienia w próbkach mięśniowych powinna być monitorowana poprzez regularny udział każdego analityka w testach biegłości.
Kolejnym ograniczeniem metody jest to, że końcowy etap identyfikacji larw mięśniowych za pomocą mikroskopii jest wysoce subiektywny i w dużym stopniu zależy od wiedzy badającego analityka na temat morfologii larw.
Interesującą alternatywną metodą obejścia tego problemu jest metoda mieszadła magnetycznego / izolacja filtra, a następnie wykrywanie larw za pomocą testu aglutynacji lateksowej. Jednak zgodnie z prawodawstwem UE metoda ta jest uważana za równoważną jedynie w przypadku badania mięsa świń domowych, ale nie w przypadku zwierząt, które są bardziej narażone na zakażenie, takich jak dziki4. Identyfikacja antygenu larwalnego z przeciwciałami monoklonalnymi czyni test bardziej obiektywnym, ale pozbawia laboratorium możliwości określenia liczby larw na gram mięsa16.
Inne odmiany metody mieszadła magnetycznego obejmują metodę mechanicznie wspomaganej mineralizacji próbki zbiorczej/technikę sedymentacji, metodę mechanicznie wspomaganej mineralizacji próbki zbiorczej/technikę izolacji na filtrze oraz metodę automatycznego trawienia dla próbek zbiorczych o masie do 35 g. Wszystkie te techniki opierają się na sztucznym trawieniu mięsa oraz wizualizacji i liczeniu larw włośni , ale różnią się sprzętem używanym do etapów filtracji i sedymentacji.
Wyizolowane larwy można dodatkowo zidentyfikować na poziomie gatunku za pomocą testu molekularnego (np. multiplex PCR)17. Zgodnie z prawodawstwem UE wszystkie dodatnie próbki muszą zostać przekazane do krajowego laboratorium referencyjnego lub do EURLP w celu określenia gatunku włosienia .

Nicienie z rodzaju Trichinella można wykryć w mięśniach poprzecznie prążkowanych ssaków, ptaków i na całym świecie. Te nicienie odzwierzęce mogą dotrzeć do ludzi, gdy spożywane jest surowe lub półsurowe mięso oraz produkty mięsne pochodzące od świń, koni i zwierząt łownych. Ta choroba odzwierzęca może być poważną chorobą u ludzi, charakteryzującą się patognomonicznymi oznakami i objawami, np. biegunką, gorączką, obrzękiem okołooczodołowym i bólem mięśni oraz możliwymi powikłaniami, takimi jak zapalenie mięśnia sercowego, choroba zakrzepowo-zatorowa i zapalenie mózgu1.
Trichinella spiralis jest najbardziej rozpowszechnionym czynnikiem etiologicznym infekcji włośni u dzikich i domowych zwierząt i powoduje większość infekcji u ludzi na całym świecie. W Europie, Afryce Północnej i Zachodniej oraz Azji Zachodniej Trichinella britovi jest kolejnym źródłem zakażeń u ludzi. Ponadto dziesięć innych taksonów jest rzadziej opisywanych jako czynniki wywołujące chorobę u ludzi i występuje w różnych regionach świata, zwykle u dzikich zwierząt2. Oprócz dzikich zwierząt, takich jak dziki, niedźwiedzie, morsy i borsuki, wieprzowina stanowi najważniejsze źródło infekcji u ludzi na całym świecie.
Najlepszym sposobem zapobiegania włośnicy jest powstrzymanie się od jedzenia surowych produktów mięsnych i gotowanie jakiegokolwiek mięsa, zwłaszcza dziczyzny, do bezpiecznej temperatury (> 65 °C przez 1 minutę, >tj. zmiana koloru mięsa z różowego na brązowy w środku produktu mięsnego)3. Unia Europejska i USDA określiły czas i temperaturę zamrażania i gotowania dla produktów wieprzowych, które mogą być używane do zabijania larw T. spiralis w mięsie4,5. Ponadto zalecenia dotyczące inaktywacji włośni w mięsie i produktach mięsnych zostały opublikowane przez Międzynarodową Komisję ds. Włośnicy6. W Europie, oprócz wprowadzenia kontrolowanych warunków przetrzymywania w komercyjnych stadach trzody chlewnej, w których ryzyko zakażenia włośniem jest znikome, zapobieganie włośni u ludzi opiera się na badaniu laboratoryjnym próbek mięśni zwierząt wrażliwych4.
Dla celów bezpieczeństwa żywności, testy trawienia są jedynymi wiarygodnymi procedurami bezpośredniego wykrywania larw włosienia w mięsie3,7. Nawet jeśli istnieje kilka wariantów testu trawienia, metoda mieszadła magnetycznego jest akceptowaną na całym świecie metodą referencyjną3,4,7. Test ten opiera się na wykrywaniu larw włosienia w tkankach mięśni prążkowanych. Po enzymatycznym trawieniu próbek mięśniowych i następujących po nim etapach filtracji i sedymentacji, larwy włośni są identyfikowane za pomocą mikroskopii. W zależności od zobowiązań handlowych i ustawodawstwa krajowego istnieje wiele niewielkich różnic w ogólnym protokole metody mieszadła magnetycznego. Szczegóły techniczne są oparte na wymaganiach UE4, ISO specifications8, ICT guidelines6 oraz doświadczeniach Laboratorium Referencyjnego Unii Europejskiej ds. Pasożytów (EURLP) i Niemieckiego Laboratorium Referencyjnego ds. Włośnicy.

<table><tbody><tr><td>Nóż, nożyczki, pęseta</td><td></td><td></td><td>Cięcie próbek i usuwanie niestrawnych tkanek</td></tr><tr><td>Blender&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Z ostrym ostrzem do siekania</td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td></td><td></td> magnetyczne <td>Z termostatycznie sterowaną płytą grzewczą</td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td></td><td></td><td>Pokryte teflonem, o długości około 5 cm</td></tr><tr><td>Stożkowy szklany rozdzielacz</td><td></td><td></td><td>Pojemność co najmniej 2 l, najlepiej wyposażone w teflonowe korki bezpieczeństwa. Szerokość nie powinna być większa niż 55% długości, aby umożliwić dobrą sedymentację larw.</td></tr><tr><td>Stojaki, pierścienie i zaciski</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sito</td><td></td><td></td><td>Rozmiar oczek 180 mikronów, średnica zewnętrzna 11 cm, z siatką ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Lejek Średnica</td><td></td><td></td><td>wewnętrzna nie mniejsza niż 12&nbsp; cm, do podparcia sit</td></tr><tr><td>Zlewka</td><td></td><td></td> szklana <td>Pojemność 3 L</td></tr><tr><td>Szklany cylinder</td><td></td><td></td> miarowy <td>Pojemność od 50 do 100 ml lub probówka wirówkowa</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> stereoskopowy <td>Z podstopniowym źródłem światła przechodzącego o regulowanym natężeniu lub trychinoskopem ze stołem poziomym</td></tr><tr><td>Szalki</td><td></td><td></td> <td>Petriegoo średnicy 9 cm, oznaczone na ich spodniej stronie 10 i razy; Kwadratowe obszary badania 10 mm za pomocą spiczastego narzędzia lub miski do liczenia larw do trykotkopu</td></tr><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td>aluminiowa Alternatywnie pokrywka do przykrycia zlewek</td></tr><tr><td>25% kwas</td><td></td><td></td><td></td>solny</tr><tr>Moc<td>pepsyny</td><td></td><td></td><td>: 1:10 000 NF (Narodowy Receptariusz USA) odpowiadający 1:12 500 BP (Farmakopea Brytyjska) i 2 000 FIP (F&eacute; d&eacute; ration internationale de pharmacie) lub stabilizowaną pepsynę płynną o minimalnej zawartości 660 jednostek Farmakopei Europejskiej/ml</td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>70-90% alkoholu etylowego</td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td>z kranu</td><td>Podgrzana do 46-48 &deg; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Waga</td><td></td><td></td><td>Dokładność co najmniej 0,1 g</td></tr><tr><td>Metalowa taca</td><td></td><td></td><td>Pojemność 10 do 15 l, do zebrania pozostałego soku trawiennego</td></tr><tr><td>Pipety i uchwyt</td><td></td><td></td> na pipety <td>Różne rozmiary (1, 10 i 25 ml)</td></tr><tr><td>Termometr</td><td></td><td></td><td>Dokładność do 0,5 &deg; C, zakres temperatur co najmniej od 20 & deg; C do 70&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Syfon</td><td></td><td></td><td>Do wody z kranu</td></tr></tbody></table>

metoda mieszadła magnetycznego do wykrywania larw włośni w próbkach mięśniowych

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Włośnica jest wyniszczającą chorobą u ludzi i jest spowodowana spożyciem surowego lub niedogotowanego mięsa zwierząt zarażonych larwami nicieni z rodzaju Trichinella. Najważniejszymi źródłami zakażeń ludzi na całym świecie są dziczyzna oraz wieprzowina lub produkty wieprzowe. W wielu krajach zapobieganie włośni u ludzi opiera się na identyfikacji zakażonych zwierząt poprzez sztuczne trawienie próbek mięśni z podatnych tusz zwierzęcych.
Istnieje kilka metod opartych na trawieniu mięsa, ale metoda z mieszadłem magnetycznym jest uważana za złoty standard. Metoda ta pozwala na wykrycie larw włośni za pomocą mikroskopii po enzymatycznym trawieniu próbek mięśniowych, a następnie etapach filtracji i sedymentacji. Chociaż ta metoda nie wymaga specjalnego i drogiego sprzętu, nie można stosować kontroli wewnętrznych. W związku z tym podczas całego badania należy stosować rygorystyczne zarządzanie jakością. Celem niniejszej pracy jest dostarczenie analitykom szczegółowych instrukcji postępowania i krytycznych punktów kontroli metody, w oparciu o doświadczenia Laboratorium Referencyjnego Unii Europejskiej ds. Pasożytów oraz Krajowego Laboratorium Referencyjnego Niemiec ds. Włośni.

Po trawieniu kształt zakaźnych larw mięśniowych może być zmienny, co utrudnia ich identyfikację. Typowe formy obejmują larwy ściśle zwinięte, lekko zwinięte, w kształcie litery C lub całkowicie rozwinięte (Ryciny 2B - 2C). Liczba larw znaleziona w jednym gramie może znacznie się różnić i wynosić od jednej do kilkuset larw.
Morfologia zakaźnej larwy mięśniowej przedstawiona jest na Rysunku 2A. Larwy Trichinella mają od 0,7 do 1,5 mm długości i około 0,3 mm szerokości. Przełyk jest wąski i ma lekko zaokrąglony koniec. Kutykula jest gładka. W przedniej połowie jamy ciała można zaobserwować stichosom – strukturę składającą się z długiej, cienkiej rurki otoczonej rzędem od 45 do 55 dużych komórek (stichocytów). Odbytnica jest również zaokrąglona, bez jakichkolwiek wypustek lub wyrostków10,11.
Po trawieniu mięśni można znaleźć inne struktury niż larwy Trichinella. Niektóre przykłady przedstawiono na rycinach 3A – 3F. Dzikie zwierzęta są często zainfekowane innymi pasożytami lub próbki mięśni przeznaczone do badań zostają zanieczyszczone podczas procesu wypatroszenia przez ożywione lub nieożywione struktury/organizmy. Długość larw, wygląd końców przedniego i tylnego oraz obecność stichosomu pomagają w rozróżnieniu różnych rodzajów nicieni12.
<img alt="Obserwacja larw Trichinella; analiza mikroskopowa; panele A i B przedstawiają szczegóły morfologii larw." src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Badanie mikroskopowe larw Trichinella po (A) niewystarczających i (B) wystarczających etapach płukania. Paski skali oznaczają 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Anatomia nicienia, stichosom i przełyk na obrazie mikroskopowym; szczegóły w skali 100 µm." src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Morfologia zakaźnych larw Trichinella przedstawiająca odbyt, stichosom i przełyk larwy (A). Możliwe kształty larw mięśniowych po trawieniu przedstawiające (B) larwy poruszające się ciasno i luźno zwinięte oraz (C) larwy rozwinięte. Paski skali wskazują 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa; helminty; identyfikacja pasożytów; organizm w ogniskowej; badanie robaków pasożytniczych." src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykłady znalezisk przypadkowych po trawieniu próbek mięśni metodą z mieszadłem magnetycznym. (A) szczecinkowy włos dżdżownicy znaleziony u dzika; (B) Alaria alata z dzika; (C) włókno mięśniowe z dzika; (D) Metastrongylus sp. z dzika; (E) włókno roślinne znalezione u dzika (F): larva Toxocara sp. z dzika. Paski skali oznaczają 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Zapobieganie ludzkiej włośni w wielu krajach na całym świecie opiera się na laboratoryjnym badaniu próbek mięśni od wrażliwych zwierząt za pomocą metod trawienia, których metoda mieszadła magnetycznego jest uważana za złoty standard.

Metoda mieszadła magnetycznego do wykrywania larw włośni w próbkach mięśniowych

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Ogólnym celem tej metody diagnostycznej jest identyfikacja mięsa lub produktów mięsnych zakażonych zoonotycznym pasożytem przenoszonym z żywnością z rodzaju Trichinella. Metoda ta stanowi złoty standard bezpośredniego wykrywania larw Trichinella w mięsie. Główną zaletą tej techniki jest łatwość wykonania oraz brak konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ nie można stosować kontroli wewnętrznych, a w trakcie całego testu należy stosować rygorystyczne zarządzanie jakością. Procedurę zaprezentuje Nora Thaben, technik z mojego laboratorium. Witam! Aby przygotować próbkę mięśnia do trawienia, należy umieścić 100 g próbki w blenderze lub młynku.Następnie należy dodać 2 ml podgrzanej wody, aby ułatwić mieszanie. Blendować na maksymalnych obrotach przez 2-3 sekundy. Przed drugim blendowaniem należy otworzyć blender i przenieść wszelkie próbki mięśni znajdujące się przy górnej krawędzi naczynia blendera na dół.Powtórz blendowanie, kontynuując proces w seriach po dwie do trzech sekund, aż do momentu, gdy nie będą widoczne żadne kawałki mięsa. Przed rozpoczęciem tej procedury przygotuj płyn trawienny w zlewce o pojemności trzech litrów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieś jeden litr podgrzanego płynu trawiennego do kolby.Przenieś zmielone mięso do zlewki. Następnie za pomocą łyżki lub widelca rozmieść mięso w płynie trawiennym. Dokładnie wypłucz kielich blendera, pokrywę, noże oraz widelec, używając pozostałej ilości płynu trawiennego.Umieść zlew na płycie grzewczej, aby utrzymać stałą temperaturę od 44 do 46 °C, monitorując ją za pomocą termometru. Następnie przykryj zlew folią aluminiową. Mieszaj płyn trawienny przez 30 minut, tworząc głęboki wir bez rozbryzgiwania, aż do momentu całkowitego rozpadu cząsteczek mięsa.Po trawieniu próbki mięśnia należy przefiltrować ciecz z trawienia i określić ilość nietrawionej tkanki. Wyzerować wagę, zważyć czyste sito o oczkach 180 µm i zapisać jego masę. Sprawdzić, czy rozdzielacz jest ustawiony pionowo.Aby zapewnić prawidłowe sedymentowanie larw, szerokość szklanego lejka separacyjnego nie powinna przekraczać 55% jego długości. Ostrożnie wlej płyn trawienny przez sito do szklanego lejka separacyjnego, unikając przelewania. Aby uniknąć utraty czułości, dokładnie wypłucz zlewkę szklaną oraz sito około 200 mililitrów wody z kranu.Następnie należy przenieść wodę płuczącą do rozdzielacza szklanego. Podnieść sito i dokładnie wypłukać obszar pod nim za pomocą butelki zmywaka. Woda płucząca powinna zostać również zebrana w rozdzielaczu szklanym.Pozostaw sito na lejku rozdzielczym w celu osuszenia przez cały czas trwania procedury sedymentacji. Aby rozpocząć procedurę sedymentacji, pozostaw przefiltrowany płyn trawienny w lejku rozdzielczym przez 30 minut, aby larwy Trichinella opadły na dno lejka. Po zakończeniu sedymentacji całkowicie otwórz kurek lejka rozdzielczego, aby pozwolić co najmniej 20 mililitrów płynu trawiennego szybko spłynąć do cylindra mierniczego.Następnie całkowicie otwórz kurek w przeciwnym kierunku, aby przepuścić 10 mililitrów płynu trawiennego. Na koniec ponownie otwórz kurek w przeciwnym kierunku, aby kolejne 10 mililitrów przedostało się do cylindra mierniczego. Pozostaw 40 mililitrów płynu trawiennego w cylindrze na 10 minut, aby larwy mogły ososiąść.Następnie należy określić ilość niestrawionych tkanek. Wyjmij sito z lejka sedymentacyjnego i osusz je ręcznikiem papierowym. Odjmij masę sita przed filtracją od masy sita z niestrawionymi tkankami.Proces trawienia uznaje się za satysfakcjonujący, jeśli na sicie pozostaje nie więcej niż 5% początkowej masy próbki. Jeśli ilość nietrawionej tkanki przekracza 5%, należy powtórzyć trawienie, wykorzystując świeże próbki mięśni. W przypadku braku dostępności świeżych próbek, należy ponownie poddać trawieniu pozostały materiał.Po pozostawieniu płynu trawiennego w cylindrze przez 10 minut, odessać 30 mililitrów supernatantu za pomocą pipety, nie naruszając 10-mililitrowego osadu. Aby zmniejszyć ilość włókien tkankowych w próbce, dodać do osadu 30 mililitrów wody z kranu i pozostawić na kolejne 10 minut. Powtarzać to płukanie do momentu, aż ciecz stanie się klarowna.Gdy ciecz stanie się klarowna, usuń nadsącz i przenieś 10 ml wypłukanego osadu do siatkowego naczynia Petriego. Przepłucz cylindra 10 ml wody z kranu i dodaj wodę do wypłukanego osadu. Bezpośrednio po etapach płukania przebadaj próbki za pomocą trichinoskopu lub stereomikroskopu z regulowanym źródłem światła przechodzącego pod stolikiem.Przy powiększeniu od 15 do 20x należy systematycznie zbadać szalkę Petriego, przesuwając się pole po polu. Jeśli nie zostaną znalezione żadne podejrzane struktury, należy delikatnie poruszyć płyn w szalce po okręgu, aby umożliwić ewentualnym przeoczonym larwom Trichinella zgromadzenie się w centrum naczynia. Następnie należy powtórzyć badanie.Jeśli zostanie znaleziona podejrzana struktura, zwiększyć powiększenie do 40–100x. Usunąć larwy Trichinella z naczynia za pomocą pipety i zebrać je do pojemnika. Po zbadaniu całego naczynia powtórzyć procedurę badania mikroskopowego, zaczynając od delikatnego wstrząśnięcia naczynia.Powtórz procedurę co najmniej trzy razy lub do momentu, gdy nie zostaną znalezione żadne kolejne larwy. Wyznacz liczbę larw na gram tkanki mięśniowej.Jeśli w płynie trawiennym znajduje się zbyt wiele larw, aby wiarygodnie określić ich liczbę, należy przelać płyn z larwami z powrotem do cylindra miarowego. Przepłukać naczynie wodą z kranu za pomocą butelki z myjką i pozwolić larwom opaść na dno. Po 10 minutach sedymentacji należy zmniejszyć objętość płynu trawiennego do określonej wartości, przenosząc larwy z dna cylindra miarowego do nowego cylindra w odstępach 1 ml.Jednorodne zawieszenie larw w 10 mililitrach uzyskano poprzez energiczne wstrząsanie. Podczas wstrząsania za pomocą pipety naniesiono 12 kropli po 20 mikrolitrów zawiesiny larw na szalkę Petriego. Każdą 20-mikrolitrową kroplę zbadano pod mikroskopem, a następnie obliczono całkowitą liczbę larw zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przed badaniem mikroskopowym larw Trichinella ważne jest odpowiednie przemycie każdej próbki w celu usunięcia zanieczyszczeń, które mogłyby uniemożliwić identyfikację larw. Larwy Trichinella mają długość od 0,7 do 1,5 mm i szerokość około 0,3 mm. Przełyk jest wąski z lekko zaokrąglonym końcem.Stychosom jest strukturą znajdującą się w przedniej połowie jamy ciała, składającą się z długiej, smukłej rurki otoczonej rzędem od 45 do 55 dużych komórek. Odbyt jest również zaokrąglony, bez jakichkolwiek wypustek lub wyrostków. Po trawieniu kształt zakaźnych larw mięśniowych może być zmienny, co utrudnia ich identyfikację.Typowe formy obejmują larwy ruchome, zwinięte ciasno lub luźno, larwy w kształcie litery C lub całkowicie rozwinięte. Po trawieniu mięśni można zidentyfikować struktury inne niż larwy *Trichinella*. Przykłady przypadkowych znalezisk u dzika obejmują włosowatą szczeczkę dżdżownicy, trematodę *Alaria alata*, włókno mięśniowe, nicienia z rodzaju *Metastrongylus*, włókno roślinne oraz larwy nicienia *Toxocara*.Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać przeprowadzona w około dwie godziny, pod warunkiem jej prawidłowego wykonania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat wykrywania larw Trichinella w mięsie metodą mieszadła magnetycznego, z uwzględnieniem najważniejszych krytycznych punktów kontrolnych.

magnetic-stirrer-method-for-detection-trichinella-larvae-muscle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiono protokół wykrywania trichotecenów (mykotoksyn stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi) z wykorzystaniem nowo opracowanej metody przesiewowej, opartej na konkurencyjnej metodzie immunochemicznej oraz końcowej detekcji elektrochemicznej.

Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

Zakażenie *Trichuris muris* jest jelitowym modelem odporności Th2, w którym myszy oporne generują ochronną odpowiedź Th2, natomiast myszy podatne generują patologiczną odpowiedź Th1.

Infekcja Trichuris muris: Model odporności typu 2 i stanu zapalnego w jelitach

Analiza tkanek mięśni szkieletowych w celu określenia właściwości strukturalnych, funkcjonalnych i biochemicznych jest znacznie ułatwiona dzięki odpowiedniemu przygotowaniu.  Protokół ten opisuje odpowiednie metody przygotowania tkanki mięśni szkieletowych do szerokiego zakresu badań fenotypowania.

Klasyfikacja i zamrażanie tkanek w modelach chorób mięśni szkieletowych

Skuteczność domięśniowego wychwytu i wstecznego transportu cząsteczek do odpowiednich neuronów ruchowych zależy od lokalizacji miejsc wstrzyknięć w stosunku do płytek końcowych silnika (MEP). W tym miejscu opisujemy, jak zlokalizować MEP na mięśniach szkieletowych, aby zoptymalizować wsteczny transport znaczników do neuronów ruchowych.

Iniekcje domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika: minimalnie inwazyjne podejście do przenoszenia znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych

Badania morfogenezy neuronów za pomocą neuronów dendrytycznych larw Drosophila korzystają z wizualizacji in situ białek neuronalnych i naskórkowych za pomocą immunofluorescencji. Opisujemy procedurę, która poprawia analizę immunofluorescencyjną neuronów da i otaczających komórek naskórka poprzez usunięcie tkanki mięśniowej ze ściany ciała larwy.

Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka

Aktywna autofagia jest związana z produktywną regeneracją mięśni, która jest niezbędna do aktywacji komórek macierzystych mięśni (MuSC). W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania in situ LC3, markera autofagii w MyoD-dodatnich MuSC skrawków tkanki mięśniowej od myszy kontrolnych i rannych.

In Situ Barwienie immunofluorescencyjne autofagii w komórkach macierzystych mięśni

Precyzyjna identyfikacja komórek satelitarnych jest niezbędna do badania ich funkcji w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. W artykule przedstawiono protokół identyfikacji komórek satelitarnych na wycinkach dorosłych mięśni szkieletowych za pomocą barwienia opartego na immunofluorescencji.

Identyfikacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami Pax7 i Laminin

Opisany tutaj jest protokół bezpośredniego znakowania immunologicznego martwiczych włókien mięśniowych w kriosekcjach mięśni. Komórki martwicze są przepuszczalne dla białek surowicy, w tym immunoglobuliny G (IgG). Ujawnienie wychwytu IgG przez włókna mięśniowe umożliwia identyfikację i ilościowe określenie włókien mięśniowych, które ulegają martwicy niezależnie od stanu mięśni.

Znakowanie immunologiczne zwyrodnienia włókien mięśniowych w biopsjach mięśni

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Ten protokół ma na celu izolację i oczyszczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych (SkM-EVs) z tkanek mięśni gryzoni poprzez mechaniczne oderwanie, dysocjację enzymatyczną, filtrację i ultrawirowanie różnicowe. Świadczy o spójności i niezawodności. Wyizolowane SkM-EV dostarczają informacji na temat homeostazy i chorób mięśni, z potencjalnymi zastosowaniami jako biomarkery diagnostyczne lub nośniki terapeutyczne.

Enzymatyczna izolacja śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych

Poznaj metodę mieszadła magnetycznego do wykrywania larw Trichinella w próbkach mięśniowych. Ta technika stanowi złoty standard diagnostyczny w badaniach pasożytniczych i bezpieczeństwie żywności.

Metoda mieszadła magnetycznego do wykrywania larw włośni w próbkach mięśniowych

Przeglądaj więcej filmów