Metoda mieszadła magnetycznego do wykrywania larw włośni w próbkach mięśniowych

Ogólnym celem tej metody diagnostycznej jest identyfikacja mięsa lub produktów mięsnych, które są zarażone odzwierzęcym pasożytem Trichinella przenoszonym przez żywność. Metoda ta jest złotym standardem w bezpośrednim wykrywaniu larw włośni w mięsie. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do wykonania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które nie mają doświadczenia w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ nie można stosować kontroli wewnętrznych, a podczas całego testu należy stosować rygorystyczne zarządzanie jakością. Procedurę zademonstruje Nora Thaben, technik z mojego laboratorium. Witam! Aby przygotować próbkę mięśni do trawienia, umieść 100 gramów próbki w blenderze lub młynku.

I dodaj dwa mililitry podgrzanej wody, aby ułatwić miksowanie. Miksuj z maksymalną prędkością przez dwie do trzech sekund. Przed drugim miksowaniem otwórz blender i przenieś dowolną próbkę mięśni z górnej krawędzi miski miksującej na dół.

Powtórz miksowanie i kontynuuj miksowanie w seriach od dwóch do trzech sekund, aż nie pozostaną żadne widoczne kawałki mięsa. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować płyn wytrawiający w trzylitrowej zlewce, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieść jeden litr podgrzanego płynu wytrawiającego do kolby.

Zmielone mięso przełożyć do zlewki. I użyj łyżki lub widelca, aby rozprowadzić mięso w płynie trawiennym. Dokładnie opłucz miskę blendera, pokrywę, ostrza i widelec pozostałym płynem wytrawiającym.

Umieść zlewkę na płycie grzejnej, aby utrzymać stałą temperaturę od 44 do 46 stopni Celsjusza podczas monitorowania za pomocą termometru. A następnie przykryj zlewkę folią aluminiową. Mieszaj płyn wytrawiający przez 30 minut, aby stworzyć głęboki wir bez rozpryskiwania, aż znikną cząstki mięsa.

Po strawieniu próbki mięśniowej płyn wytrawiający musi zostać przefiltrowany i określona jest ilość niestrawionej tkanki. Ustaw wagę na zero, zważ czyste sito o długości 180 mikrometrów i zanotuj jego wagę. Sprawdź, czy lejek separacyjny jest wypoziomowany w pionie.

Aby umożliwić dobrą sedymentację larw, szerokość szklanego lejka separacyjnego nie powinna być większa niż 55% jego długości. Ostrożnie przelej płyn wytrawiający przez sito do szklanego lejka do separacji, unikając przelania. Aby uniknąć utraty wrażliwości, dokładnie wypłucz szklaną zlewkę i sito około 200 mililitrami wody z kranu.

I przenieś wodę do płukania do szklanego lejka do separacji. Podnieś sitko i dokładnie opłucz obszar pod sitkiem za pomocą wyciskanej butelki. Woda do płukania powinna być również zebrana w szklanym lejku do separacji.

Pozostawić sito na lejku rozdzielającym do wyschnięcia przez cały czas trwania procedury sedymentacji. Aby rozpocząć procedurę sedymentacji, należy przechowywać przefiltrowany płyn wytrawiający w lejku separacyjnym przez 30 minut, aby larwy włośni osiadły na dnie lejka. Po zakończeniu sedymentacji całkowicie otwórz kran lejka rozdzielającego, aby co najmniej 20 mililitrów płynu wytrawiającego szybko spłynęło do cylindra miarowego.

Następnie całkowicie otwórz kran w przeciwnym kierunku, aby przepuścić 10 mililitrów płynu wytrawiającego. Na koniec otwórz kran w przeciwnym kierunku, aby kolejne 10 mililitrów przeszło do cylindra miarowego. Pozostaw 40 mililitrów płynu wytrawiającego w cylindrze na 10 minut, aby larwy mogły się osadzić.

Przystąp do określenia ilości niestrawionych tkanek. Wyjmij sito z lejka sedymentacyjnego i osusz je ręcznikiem papierowym. Odejmij masę sita przed filtracją od masy sita z niestrawionymi tkankami.

Proces trawienia uważa się za zadowalający, jeżeli na sicie nie pozostaje więcej niż 5 % początkowej masy próbki. Jeśli ilość niestrawionej tkanki przekracza 5%, powtórz trawienie, używając świeżych próbek mięśni. Jeżeli świeże próbki nie są dostępne, należy ponownie przetrawić pozostały materiał.

Po 10 minutach przebywania płynu wytrawiającego w cylindrze należy usunąć 30 mililitrów supernatantu, odsysając pipetą, nie naruszając 10-mililitrowego osadu. Aby zmniejszyć ilość włókien tkankowych w próbce, dodaj 30 mililitrów wody z kranu do osadu i pozostaw na kolejne 10 minut. Powtarzaj to pranie, aż płyn będzie klarowny.

Gdy ciecz będzie klarowna, usuń supernatant i przenieś 10 mililitrów przemytego osadu na szalkę Petriego z siatką. Wypłucz cylinder 10 mililitrami wody z kranu i dodaj wodę do przemytego osadu. Bezpośrednio po etapach mycia należy zbadać próbki za pomocą trychinoskopu lub mikroskopu stereoskopowego z podstopniowym źródłem światła przepuszczanego przez stopień o regulowanym natężeniu.

Używając powiększenia od 15 do 20x, badaj szalkę Petriego systematycznie, siatka po siatce. Jeśli nie zostaną znalezione żadne podejrzane struktury, delikatnie przesuń płyn w naczyniu w sposób okrężny, aby larwy włośni, które mogły zostać przeoczone, mogły zgromadzić się w środku naczynia. Powtórz badanie.

Jeśli zostanie znaleziona podejrzana struktura, zwiększ powiększenie do 40 do 100x. Usuń larwy włosienia z naczynia za pomocą pipety i zbierz do naczynia. Po zbadaniu całej potrawy powtórz procedurę badania mikroskopowego, zaczynając od delikatnego potrząśnięcia naczyniem.

Powtórz procedurę co najmniej trzy razy. Lub do momentu, gdy nie zostaną znalezione żadne larwy. Określ liczbę larw na gram tkanki mięśniowej.

Jeśli w płynie wytrawiającym znajduje się zbyt wiele larw, aby wiarygodnie określić liczbę larw, należy zwrócić płyn zawierający larwy do cylindra miarowego. Opłucz naczynie wodą z kranu z wyciśniętej butelki do mycia i pozostaw larwy do opadnięcia na dno. Po 10-minutowym czasie sedymentacji zmniejsz płyn wytrawiający do określonej objętości, przenosząc larwy z dna cylindra miarowego w odstępach co jeden mililitr do nowego cylindra.

Zawiesić larwy jednorodnie w 10 mililitrach przez energiczne potrząsanie. Podczas wytrząsania odpipetować 12 kropli po 20 mikrolitrów zawiesiny larwalnej na szalkę Petriego. Zbadaj każdą kroplę o pojemności 20 mikrolitrów pod mikroskopem i oblicz całkowitą liczbę larw zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przed przystąpieniem do badania mikroskopowego larw włośni ważne jest, aby odpowiednio umyć każdą próbkę, aby usunąć zanieczyszczenia, które mogłyby uniemożliwić identyfikację larw. Larwy włośni mają od 0,7 do 1,5 milimetra długości i około 0,3 milimetra szerokości. Przełyk jest wąski z lekko zaokrąglonym końcem.

Stichosom to struktura w przedniej połowie jamy ciała, złożona z długiej, smukłej rurki otoczonej rzędem od 45 do 55 dużych komórek. Odbytnica jest również zaokrąglona, bez żadnych występów ani wyrostków. Po strawieniu kształt zakaźnych larw mięśni może się różnić, co utrudnia identyfikację.

Typowe formy obejmują ciasno zwinięte i lekko zwinięte ruchome larwy lub larwy w kształcie litery C lub całkowicie rozwinięte. Inne struktury oprócz larw włośni można znaleźć po trawieniu mięśni. Przykłady przypadkowych znalezisk u dzika obejmują szczeciniasty włos dżdżownicy, przywręcę Alaria alata, włókno mięśniowe, nicienie z rodzaju Metastrongylus, włókno roślinne i larwy glisty Toxocara.

Po opanowaniu techniki można ją wykonać w około dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykryć larwy włośni w mięsie metodą mieszadła magnetycznego. Biorąc pod uwagę najważniejsze krytyczne punkty kontroli.