Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego
18 lipca 2017
Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.
Ogólnym celem tej techniki mikrochirurgicznej jest wstrzyknięcie komórek guza jelita grubego do ściany jelita ślepego w celu wywołania powtarzalnych i przerzutowych guzów jelita grubego u myszy. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii krążących komórek nowotworowych, jej głównymi zaletami są wysoce powtarzalne i jednolite nowotwory, umożliwiające wiarygodne przewidywanie stadium i przewidywanie krążących komórek nowotworowych. Zacznij od użycia atraumatycznych kleszczy, aby ostrożnie usunąć jelito ślepe sześcio- lub ośmiotygodniowej myszy z obniżoną odpornością.
Umieszczenie ślepego końca jelita ślepego na brzuchu tak, aby worek był skierowany w stronę czaszki. Do wstrzyknięcia dojelitowego należy zamontować standardową strzykawkę o pojemności jednego mililitra wyposażoną w canellę o rozmiarze 30 i załadować ją wraz z komórkami nowotworowymi do pompy mikroiniekcyjnej, która jest zamontowana na mikromanipulatorze. Następnie użyj atraumatycznych kleszczy, aby ostrożnie chwycić czubek jelita ślepego i użyj drugich kleszczy, zwilżonych ciepłą solą fizjologiczną, aby delikatnie wygładzić jelito ślepe ruchami w dół.
Teraz przenieś zwierzę pod dwuoczny mikroskop chirurgiczny i z canella bezpośrednio równolegle do i nad jelitem ślepym, użyj dwóch atraumatycznych kleszczy, aby ostrożnie rozciągnąć tkankę na obu końcach zewnętrznego końca jelita ślepego. Powoli przeciągnij jelito ślepe nad kancelarią, uważając, aby nie przebić całego pasa ściany lub błony surowiczej poza początkowy punkt penetracji i umieść canellę nad naczyniami krwionośnymi i pod cienką półprzezroczystą błoną wewnątrz pasa ściany. Gdy canella jest na miejscu, użyj przełącznika nożnego, aby wstrzyknąć 20 mikrolitrów komórek w ciągu 20 sekund.
Pomiędzy cienką półprzezroczystą błoną surowiczą, nad śródściennymi naczyniami krwionośnymi a mięśniami. Po wstrzyknięciu wszystkich komórek ostrożnie usuń canellę i umieść suchą wymianę pod jelitem ślepym. Aby zapobiec sztucznemu rozsiewaniu się otrzewnej, należy poddać lizie wszelkie wyciekające komórki za pomocą dokładnego płukania wodą destylowaną i delikatnie przywrócić jelito ślepe do jamy brzusznej.
Zamknij ścianę brzucha szybko wchłaniającymi się szwami biegowymi, w skórze za pomocą klipsów chirurgicznych. Następnie umieść mysz na macie grzewczej ustawionej na 38 stopni Celsjusza z monitorowaniem aż do pełnego leżenia. Aby wyizolować krążące komórki nowotworowe, w odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym napełnij 15-mililitrowe stożkowe probówki pięcioma mililitrami pożywki gradientu gęstości na probówkę i ostrożnie przenieś próbki krwi pełnej pobrane od zwierząt z nowotworem na warstwy gradientu gęstości.
Oddzielić komórki przez odwirowanie i ostrożnie odzyskać granicę faz zawierającą komórki jednojądrzaste. Odpipetować komórki jednojądrzaste do nowej 15-mililitrowej probówki w celu drugiego odwirowania. Następnie mycie rurką w PBS.
Po drugim przemyciu ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach PBS, uzupełnionych EDTA i dodać cztery mikrolitry przeciwciała anty amp camp do każdej próbki na 20 minut inkubacji na lodzie w ciemności. Następnie za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj około jednego centymetra okręgu na jednej sterylnej sześciocentymetrowej szalce Petriego na próbkę i dodaj 700 mikrolitrów buforu do każdego koła, a następnie 50 mikrolitrów zawiesiny komórek. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić gęstość komórek i pozwól próbkom osiąść przez około pięć minut.
Następnie przesiewaj krople komórek pod kątem dodatniego wpływu amp campu i użyj mikromanipulatora, aby przenieść interesujące komórki do 15 mikrolitrów odpowiedniego buforu w celu zamierzonej późniejszej analizy. Zastosowanie komórek jelita grubego w tym modelu niezawodnie skutkuje większą liczbą myszy w ciągu 35 dni od wstrzyknięcia komórek nowotworowych, z guzami pierwotnymi mierzącymi około 10 milimetrów wielkości oraz z przerzutami do wątroby i płuc oraz krążącymi komórkami nowotworowymi, prawie zawsze obecnymi. Co więcej, krążące komórki nowotworowe można łatwo wyizolować do dalszej analizy.
Po opanowaniu i prawidłowym wykonaniu technikę tę można wykonać w ciągu 10 minut, ułatwiając tworzenie jednolitych i przerzutowych guzów, które można wykorzystać zarówno do badań terapeutycznych, jak i molekularnych. Ograniczenia modelu obejmują jego zależność od lizy komórkowej, które mają swoje własne ograniczenia, a także niedobór odporności myszy, z których oba można przezwyciężyć za pomocą zmutowanych komórek raka jelita grubego. Ze względu na swoją prostotę, model ten może być cennym uzupełnieniem obecnie dostępnych modeli raka jelita grubego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje mikrosurgicalną technikę tworzenia ortotopowych guzów jelita grubego u myszy poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych do kątnicy. Metoda ta umożliwia izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) i zapewnia powtarzalny model do badania przerzutowego raka jelita grubego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Neurobiologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Krążące komórki nowotworowe (CTCs) odgrywają kluczową rolę w przerzutowaniu raka.
- Stworzenie wiarygodnego modelu do badania CTCs jest niezbędne w badaniach nad nowotworami.
- Technika ta ma na celu stworzenie jednorodnych guzów w celu uzyskania lepszych wyników eksperymentalnych.
- Wykorzystanie myszy z niedoborem odporności umożliwia badanie ludzkich komórek nowotworowych.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnego modelu raka jelita grubego u myszy.
- Ułatwienie badania krążących komórek nowotworowych oraz ich biologii.
- Poprawa zrozumienia progresji i przerzutowania nowotworu.
Zastosowane Metody
- Wstrzykiwanie komórek nowotworowych w ścianę kątnicy myszy.
- Stosowanie kleszczy atraumatycznych do ostrożnej manipulacji kątnicą.
- Wykorzystanie mikropompy wtryskowej do precyzyjnego podawania komórek nowotworowych.
- Monitorowanie rozwoju nowotworu oraz izolacja CTC po wstrzyknięciu.
Główne wyniki
- Skuteczne wytworzenie ortotopowych guzów jelita grubego u myszy.
- Izolacja krążących komórek nowotworowych z wytworzonych guzów.
- Wykazanie powtarzalności modelu nowotworowego.
- Potencjał do wiarygodnego przewidywania stadium guza oraz zachowania CTC.
Wnioski
- Technika mikrochirurgiczna stanowi cenne narzędzie w badaniach nad rakiem jelita grubego.
- Model ten może przyczynić się do lepszego zrozumienia biologii CTC.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę w opracowywaniu nowych terapii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ustanowienie powtarzalnych ortotopowych modeli nowotworowych jest kluczowe dla zmniejszenia ryzyka podczas walidacji celów terapeutycznych i zwiększenia pewności prognostycznej w rozwoju leków na raka jelita grubego. Ta technika mikrochirurgiczna umożliwia wiarygodną izolację krążących komórek nowotworowych (CTCs), wspierając badania mechanistyczne nad przerzutami i odpowiedzią terapeutyczną. Model ten wypełnia istotną lukę translacyjną, zapewniając istotny dla przebiegu choroby system do oceny biologii nowotworu i skuteczności terapeutycznej in vivo.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez jednolite tworzenie nowotworów i spójne uwalnianie CTC.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowany system funkcjonalnej walidacji celów z wykorzystaniem guzów pierwotnych, linii komórkowych 2D lub organoidów 3D.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez korelację wzrostu guza z potencjałem przerzutowym i wykrywaniem CTC.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Gotowość do analizy: Pozwala na generowanie modeli z nowotworami odpowiednimi do późniejszych etapów izolacji i analizy CTC.
- Powtarzalność: Zapewnia jednorodne guzy i spójną wydajność pozyskiwania CTC, co umożliwia wiarygodne warunki screeningu związków.
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie walidowanych systemów biologicznych do wysokoprzepustowych analiz opartych na CTC.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje progresję raka jelita grubego u ludzi, w tym przerzuty do wątroby i płuc, w organizmie gospodarza z upośledzoną odpornością.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając izolację CTC do badań nad biomarkerami i farmakodynamiką.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Wspiera kryteria go/no-go w oparciu o obciążenie przerzutami oraz dynamikę CTC obserwowaną in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, w szczególności w programach skoncentrowanych na przerzutach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czynników napędzających przerzuty oraz modulacji szlaków poprzez spójne przyjmowanie się guza i generowanie CTC.
- Screening: Umożliwia standaryzację testów dzięki niezawodnej izolacji CTC, wspierając ilościowe odczyty do oceny związków.
- Analityka: Dostarcza wskaźniki wydajności i czystości CTC, które pomagają porównać warunki terapeutyczne i mechanizmy działania.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, umożliwiając podłużne monitorowanie CTC jako biomarkera farmakodynamicznego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę ortotopową, którą można dostosować do różnych celów w raku jelita grubego oraz różnych modalności terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w modelach przerzutowania i redukuje niejednoznaczność mechanizmów w biologii CTC.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne modele nowotworowe z mierzalną liczbą CTC.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie obciążenia nowotworem z dynamiką CTC, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o hamowanie przerzutów oraz eliminację CTC.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikrochirurgii w zakresie wstrzykiwań ortotopowych i obchodzenia się z tkankami.
- Zależne od pomp do mikroiniekcji, manipulatorów i mikroskopów chirurgicznych w celu zapewnienia precyzyjnego podania.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów przygotowania komórek nowotworowych z kultur 2D, 3D lub źródeł pierwotnych.
- Wymaga infrastruktury do izolacji CTC, w tym wirowania w gradiencie gęstości i selekcji opartej na przeciwciałach.
- Ograniczone przez zależność od gospodarzy z niedoborem odporności, co może wpływać na badania nad terapiami powiązanymi z odpowiedzią immunologiczną.
