Name: Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Poznaj mikrochirurgiczną technikę izolacji krążących komórek nowotworowych w ortotopowym modelu raka jelita grubego u myszy. Ta metoda umożliwia badanie biologii CTC i metastazy nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą (WE 3548/4-1) oraz Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Przedstawione tutaj eksperymenty na zwierzętach zostały niezależnie ocenione i zatwierdzone przez instytucjonalny i rządowy Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Federacji Stowarzyszeń Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (FELASA). Podjęto wszelkie możliwe środki, aby zminimalizować cierpienie, w tym znieczulenie i analgezję lub, jeśli to konieczne, przedwczesną eutanazję.
1. Przygotowanie komórek i organoidów
UWAGA: Użyj objętości 20 μL ze 100 000 komórek do każdego wstrzyknięcia. Użyj macierzy membrany podstawnej (BMM), aby zapobiec wyciekom i zapewnić standaryzowaną iniekcję. Aby zapewnić powtarzalne wyniki, należy przeprowadzać testy uwierzytelniania linii komórkowych (np. za pomocą profilowania STR) w regularnych odstępach czasu.
<ol>
	<li>Przygotowanie pierwotnych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek 
	UWAGA: Zawsze pracuj w sterylnych warunkach. Konieczne jest natychmiastowe przeniesienie świeżo wyciętej tkanki z sali operacyjnej do laboratorium na lodzie w celu zapewnienia wysokiej żywotności komórek. 
	Dobre samopoczucie pacjenta i optymalne leczenie muszą być zawsze na pierwszym miejscu. Dlatego próbki tkanek do badań muszą być pozyskiwane w sposób, który nie przeszkadza w późniejszym badaniu patologicznym i ocenie stopnia zaawansowania wyciętego guza. W większości przypadków uzasadnione jest zatem zlecenie pobrania próbek do badań przez przeszkolonego patologa, aby zapewnić brak ingerencji w diagnozę patologiczną.
	<ol>
		<li>Natychmiast po sterylnym usunięciu z wyciętej próbki (najlepiej ~1 cm3) umieść próbkę tkanki w probówce o pojemności 50 ml wstępnie wypełnionej 20-30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przechowywać probówkę na lodzie i natychmiast przenieść do laboratorium.</li>
		<li>Umieść tkankę na szalce Petriego i umyj ją dwukrotnie dużą ilością PBS, aby usunąć pozostałą krew.</li>
		<li>Pokrój tkankę na małe kawałki (~ 2-4 mm) za pomocą skalpela (np. z ostrzem #20 lub #36).</li>
		<li>Użyj dysocjatora zgodnie z instrukcjami producenta w celu dalszej dysocjacji tkanki nowotworowej do zawiesiny jednokomórkowej. Alternatywnie, użyj innych protokołów enzymatycznego trawienia guza.</li>
		<li>Policz komórki otrzymanej zawiesiny jednokomórkowej (np. w liczniku redlic lub hemocytometrze).</li>
		<li>Odwirować (5 minut przy 1 500 x g) i dwukrotnie przepłukać zawiesinę komórek PBS.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w BMM w stężeniu 5 x 106 komórek/ml i przechowywać je na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie linii komórkowych do iniekcji
	<ol>
		<li>Hoduj wszystkie linie komórkowe raka jelita grubego w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5% CO2 ) i przygotuj je w dniu operacji.</li>
		<li>Pobrać komórki zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych, policzyć komórki (np. w liczniku redlic lub hemocytometrze) i obliczyć wymaganą ilość dla wszystkich wstrzyknięć w zależności od liczby zwierząt, które mają zostać wstrzyknięte.</li>
		<li>Przygotować 3-5 razy więcej niż faktycznie potrzebna objętość, aby uwzględnić straty w pipetowaniu i martwą objętość strzykawki do wstrzykiwań.</li>
		<li>Odwirować (5 minut przy 1 500 g) i dwukrotnie przemyć zawiesinę komórkową PBS.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w BMM w stężeniu 5 x 106 komórek/ml i przechowywać je na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat organoidowy 
	UWAGA: Wszystkie hodowle organoidów 3D są hodowane w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5% CO2 ). Szczegółowe protokoły hodowli organoidów zostały opublikowane wcześniej. 18,19,20 Podobnie jak w przypadku konwencjonalnych linii komórkowych, zalecamy objętość 20 μL BMM przy 100 000 komórek na wstrzyknięcie. Organoidy przygotowuje się w dniu zabiegu w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przygotuj następującą pożywkę (zwaną dalej DMEM/F12+++): Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutaminy (200 mM) + 1% penicyliny/Streptomycyny.</li>
		<li>Napełnij wstępnie probówki o pojemności 15 ml 1 ml DMEM/F12+++.</li>
		<li>Ostrożnie odessać organoidy z powierzchni płytki hodowlanej i przenieść zawartość 3 do 5 studzienek do jednej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Ostrożnie rozbij organoidy na mniejsze kawałki, pipetując je w górę i w dół za pomocą przedłużonej szklanej pipety.</li>
		<li>Dodać 5 ml DMEM/F12+++ do probówki, a następnie odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 600 μl enzymatycznego buforu dysocjacyjnego i przenieść zawiesinę do jednego dołka na płytce 6-dołkowej.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-5 minut, a następnie ostrożnie pipetować zawiesinę w górę i w dół w celu rozpuszczenia organoidów. 
		UWAGA: Sprawdź trawienie pod mikroskopem; Jest kompletny, gdy wszystkie skupiska komórek zostały zdysocjowane na pojedyncze komórki.</li>
		<li>Po pomyślnym trawieniu dodaj 1,4 ml DMEM/F12+++, aby zatrzymać trawienie. Następnie przenieś wszystkie studzienki strawionych organoidów do probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Policz komórki i oblicz wymaganą ilość dla wszystkich wstrzyknięć.</li>
		<li>Przygotować 3 - 5 razy większą objętość niż faktycznie potrzebna objętość, aby uwzględnić straty w pipetowaniu i martwą objętość strzykawki iniekcyjnej</li>
		<li>Odwirować (5 minut przy 1 500 x g) i dwukrotnie przepłukać zawiesinę komórek PBS.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w BMM do stężenia 5 x 106 komórek/ml i utrzymywać je na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ortotopowy model myszy
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierząt biorców do zabiegu chirurgicznego 
	UWAGA: Użyj 6-8 tygodniowego NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma, NSG) myszy jako biorcy. 21 NSG to jedne z najbardziej zagrożonych immunologicznie myszy, pozbawione dojrzałych komórek B, T i NK oraz wielu innych wad immunologicznych. 21 Niezawodnie rozwijają guzy, nawet jeśli wstrzykuje się im niską liczbę komórek i są bardzo podatne na odległe przerzuty. Myszy NSG są doskonałymi hodowcami i mogą być trzymane w konwencjonalnych jednostkach wolnych od specyficznych patogenów (SPF).
	<ol>
		<li>Przed pierwszym nacięciem należy wstrzyknąć podskórnie 0,05 mg/kg buprenorfiny.</li>
		<li>Stosować sewofluran w stężeniu 3-3,5% obj. do znieczulenia ogólnego. Utrata odruchu szczypania palca u nogi wskazuje na wystarczające znieczulenie.</li>
		<li>Zakryj oczy znieczulonych myszy maścią okulistyczną, aby uniknąć wysuszenia rogówki.</li>
		<li>Unieruchamiaj myszy w pozycji leżącej na małym stole.</li>
		<li>Ogol brzuch golarką elektryczną (alternatywnie można użyć kremu do depilacji) i zdezynfekuj go co najmniej 3-krotną ilością klorheksydyny/jodu i 70% alkoholu.</li>
		<li>Przykryj pole operacyjne sterylnymi serwetami. 
		UWAGA: Stosowanie antybiotyków okołooperacyjnych jest opcjonalne i podlega wytycznym instytucjonalnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laparotomia w linii środkowej i odsłonięcie jelita ślepego
	<ol>
		<li>Użyj nożyczek (alternatywnie można użyć skalpeli), aby wykonać małe nacięcie w linii środkowej (3 - 5 mm) skóry w dolnej części brzucha. Podnieś muskulaturę ściany brzucha kleszczami i ostrożnie naciąć ją nożyczkami, otwierając w ten sposób jamę brzuszną.</li>
		<li>Zidentyfikuj i ostrożnie zewnętrz jelito ślepe za pomocą atraumatycznych kleszczy. Umieść ślepy woreczek końcowy jelita ślepego na brzuchu, kierując się w stronę czaszki.</li>
		<li>Po utwardzeniu utrzymuj jelito ślepe wilgotne za pomocą ciepłych wacików z soli fizjologicznej przez cały czas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja ortotopowa, zamknięcie jamy brzusznej i rekonwalescencja pooperacyjna
	<ol>
		<li>Do wstrzykiwań dociernych należy użyć standardowej strzykawki o pojemności 1 ml z kaniulą 30 G. Zamontuj tę strzykawkę na pompie do mikroiniekcji, która z kolei jest zamontowana na mikromanipulatorze.</li>
		<li>Ostrożnie chwyć czubek jelita ślepego atraumatycznymi kleszczami i delikatnie go wygładzij, głaszcząc go w dół drugim zestawem kleszczy zwilżonych ciepłą solą fizjologiczną.</li>
		<li>Umieść kaniulę bezpośrednio nad jelitem ślepym.</li>
		<li>Wykonaj następujące czynności pod kontrolą wzrokową za pomocą dwuokularowego mikroskopu chirurgicznego.</li>
		<li>Ostrożnie chwyć jelito ślepe dwoma atraumatycznymi kleszczami na obu końcach zewnętrznej części jelita ślepego, lekko je rozciągnij, a następnie powoli przeciągnij nad kaniulą, która jest umieszczona równolegle i bezpośrednio powyżej. Bardzo ważne jest, aby nie dokonywać perforacji całej ściany jelita (a więc wstrzykiwania komórek do światła), a także nie dokonywać perforacji błony surowiczej poza początkowy punkt penetracji, ponieważ doprowadziłoby to do przecieku i rozsiewu otrzewnej.
		<ol>
			<li>Przesuń jelito w kierunku kaniuli, a nie kaniulę w kierunku jelita. Przytrzymaj i rozciągnij jelito między dwoma kleszczami. Ręce chirurga muszą spoczywać na powierzchni, aby zmniejszyć drżenie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wstrzyknąć komórki między błoną surowiczą (widzianą jako bardzo cienka, półprzezroczysta wyściółka nad śródściennymi naczyniami krwionośnymi) a mięśniami. Dlatego kaniula musi być wizualnie umieszczona nad naczyniami krwionośnymi i pod cienką półprzezroczystą błoną.</li>
		<li>Użyj przełącznika nożnego, aby rozpocząć wstrzykiwanie w celu zmniejszenia drżenia, gdy kaniula znajduje się w ścianie jelita.</li>
		<li>Gdy kaniula znajdzie się na swoim miejscu, rozpocznij wstrzykiwanie. Stosować czas trwania 20 s, co daje ustawienie 1 μl/s na jednostce sterującej pompy. 
		UWAGA: Wstrzyknięcie do uszkodzonego naczynia krwionośnego lub w jego pobliżu prowadzi do bezpośredniego rozsiewu wewnątrznaczyniowego i przerzutów odległych, dlatego należy go unikać.</li>
		<li>Po zakończeniu iniekcji należy ostrożnie wyjąć kaniulę, pociągając ją do tyłu.</li>
		<li>Umieść suchy wacik pod jelitem ślepym, a następnie dokładnie spłucz jelito ślepe wodą destylowaną, aby zlizować wyciekające komórki i tym samym zapobiec sztucznemu rozprzestrzenianiu się otrzewnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknięcie brzucha i rekonwalescencja pooperacyjna
	<ol>
		<li>Po spłukaniu delikatnie cofnij jelito ślepe do jamy brzusznej.</li>
		<li>Zamknij ścianę brzucha za pomocą 6-0 szybko wchłaniających się szwów biegowych.</li>
		<li>Zamknij skórę klipsami chirurgicznymi do ran.</li>
		<li>Umieść mysz na mapie ogrzewania ustawionej na 38 °C, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.</li>
		<li>Uważnie obserwuj stan pooperacyjny myszy przez następne 48 godzin. W przypadku wystąpienia dolegliwości należy podawać 0,05 mg/kg buprenorfiny co 12 godzin.</li>
		<li>Monitoruj myszy co najmniej raz dziennie pod kątem oznak niepokoju spowodowanego wzrostem guza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pełnej
UWAGA: Pobieranie krwi przez przezskórne nakłucie serca u znieczulonych myszy, a następnie eutanazja. Idealnie byłoby, gdyby 1000 μl krwi zostało pobrane do strzykawki wypełnionej 100 μl antykoagulantu (kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) lub heparyna). Użyj przeciwciała anty-ludzkiego-EpCAM (cząsteczka adhezyjna komórek nabłonka), aby zidentyfikować CTC. Działa to bardzo dobrze, jeśli w modelu mysim wykorzystuje się ludzkie linie komórkowe nabłonka. W przypadku innych urządzeń mogą być wymagane inne przeciwciała.
<ol>
	<li>Wzbogacenie CTC:
	<ol>
		<li>Napełnij wstępnie probówki o pojemności 15 ml pożywką o gradiencie gęstości o pojemności 5 ml i ostrożnie przenieś krew do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować (30 minut przy 300 x g bez hamulca) i ostrożnie usunąć górny supernatant.</li>
		<li>Resztę przelać do nowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować (15 min, 300 x g z hamulcem).</li>
		<li>Odzyskać interfazę zawierającą komórki jednojądrzaste (odrzucić resztę) i dwukrotnie przemyć komórki PBS.</li>
		<li>Zawiesić osad w 200 μl PBS/1% EDTA i dodać 4 μl przeciwciała EpCAM. Inkubuj 20 minut na lodzie w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesiewanie i kompletacja
	<ol>
		<li>Przygotować następujący bufor (zwany dalej buforem do zbierania): PBS + 10% płodowa surowica cielęca (FCS) + 1% penicylina/streptomycyna (1%) + 0,8% EDTA.</li>
		<li>Za pomocą pisaka PAP narysuj okrąg o średnicy ~1 cm na sterylnej szalce Petriego o średnicy 6 cm (zapobiega rozpraszaniu się płynu w naczyniu) i odpipetuj 700 μl buforu do tego koła.</li>
		<li>Dodaj 50 μl zawiesiny komórek do 700 μl buforu do pobierania w okręgu. Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem. Podziel próbkę na różne naczynia, jeśli jest zbyt gęsta.</li>
		<li>Poczekaj, aż komórki się uspokoją (~5 min).</li>
		<li>Przesiewać kroplę zawiesiny komórkowej dla komórek barwionych (= EpCAM-dodatnich) komórek.</li>
		<li>Po znalezieniu komórki należy ją pobrać za pomocą mikromanipulatora i umieścić w buforze o pojemności 50 μl, w zależności od zamierzonej dalszej analizy (np. buforu do ekstrakcji RNA lub pożywki hodowlanej).</li>
		<li>W zależności od zamierzonych dalszych analiz, wyizolować komórki i/lub pożywkę EpCAM-ujemne jako kontrole ujemne.</li>
		<li>Kontynuuj dalsze analizy (np. hodowla komórkowa, PCR).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26742998">Cancer statistics, 2016.</a> CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).</li>
<li>Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15639298">Colorectal cancer.</a> Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).</li>
<li>Schölch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.smartscitech.com/index.php/CCM/article/view/323">Circulating tumor cells of colorectal cancer.</a> Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).</li>
<li>Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+significance+of+circulating+and+disseminated+tumour+cells+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer.</a> Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).</li>
<li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+minimal+residual+disease+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer.</a> World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).</li>
<li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+and+outcome+in+non-metastatic+colorectal+cancer%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study.</a> Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).</li>
<li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+differences+of+circulating+tumor+cells+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer.</a> Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).</li>
<li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+Spread+Emerging+From+Liver+Metastases+of+Colorectal+Cancer%3A+Does+the+Seed+Leave+the+Soil+Again%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again?</a> Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).</li>
<li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analysis+shows+that+detection+of+circulating+tumor+cells+indicates+poor+prognosis+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).</li>
<li>Steinert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Escape+and+Survival+Mechanisms+in+Circulating+Tumor+Cells+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer.</a> Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mighty+mouse%3A+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li>
<li>Roper, J., Hung, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priceless+GEMMs%3A+genetically+engineered+mouse+models+for+colorectal+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development.</a> Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).</li>
<li>Schölch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+combined+with+TLR7%2F8+activation+induces+strong+immune+responses+against+gastrointestinal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors.</a> Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).</li>
<li>Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+activation+and+ionizing+radiation+induce+strong+immune+responses+against+multiple+tumor+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities.</a> Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).</li>
<li>Schölch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+exhibit+stem+cell+characteristics+in+an+orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).</li>
<li>Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/open-access/mouse-models-of-colorectal-cancerderived-circulating-tumor-cells-2161-0444-1000389.pdf">Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells.</a> Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).</li>
<li>van Noort, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Drug+Candidates+for+the+Treatment+of+Metastatic+Colorectal+Cancer+through+Global+Inverse+Gene-Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling.</a> Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID%2Fgamma%28c%29%28null%29+mouse%3A+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li>
<li>Simon, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+phenotypic+and+genomic+analysis+of+C57BL%2F6J+and+C57BL%2F6N+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains.</a> Genome Biol. 14 (7), R82(2013).</li>
<li>Kalish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C57BL%2F6N+Mice+Are+More+Resistant+to+Ehrlich+Ascites+Tumors+Than+C57BL%2F6J+Mice%3A+The+Role+of+Macrophage+Nitric+Oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Monit+Basic+Res%22%5BJournal%5D)">C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide.</a> Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J Vis Exp. (10), e484(2007).</li>
<li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+PI3K%2FMEK+inhibition+promotes+tumor+apoptosis+and+regression+in+PIK3CA+wild-type%2C+KRAS+mutant+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer.</a> Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).</li>
<li>Coffee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+BRAF+and+PI3K%2FmTOR+blockade+is+required+for+effective+treatment+of+BRAF%28V600E%29+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer.</a> Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).</li>
<li>Belmont, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+dual+blockade+of+the+kinases+PI3K+and+mTOR+in+KRAS-mutant+colorectal+cancer+models+results+in+combined+sensitivity+to+inhibition+of+the+receptor+tyrosine+kinase+EGFR%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR.</a> Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).</li>
<li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li>
<li>Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inducible%2C+Large-Intestine-Specific+Transgenic+Mouse+Model+for+Colitis+and+Colitis-Induced+Colon+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research.</a> Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).</li>
<li>Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomimo ich przedklinicznie udowodnionej aktywności w podskórnych modelach mysich, zdecydowana większość nowych związków zawodzi w badaniach klinicznych i nigdy nie trafia do kliniki. 11 Ten oczywisty brak podskórnych modeli myszy do dokładnej symulacji biologii i wzorców wzrostu nowotworów doprowadził do opracowania ortotopowych modeli myszy opartych na wstrzyknięciu komórek nowotworowych bezpośrednio do pierwotnego narządu.
Ortotopowe modele myszy są w stanie symulować...

Rak jelita grubego (CRC) jest jedną z najczęstszych przyczyn zgonów z powodu raka w krajach zachodnich. 1 Podczas gdy pierwotny guz często może być wycięty, wystąpienie odległych przerzutów dramatycznie pogarsza rokowanie i często prowadzi do śmierci. 2,3 Biologicznym korelatem przerzutów są krążące komórki nowotworowe (CTC), które odłączają się od guza, przeżywają krążenie, przyczepiają się do nabłonka w narządzie docelowym, atakują narząd i ostatecznie wyrastają z nowych zmian. 4 Chociaż wiadomo, że CTC mają znaczenie prognostyczne 5,6,7,8,9, ich biologia jest tylko częściowo zrozumiała, co wynika z ich ekstremalnej rzadkości w CRC. 10
Modele myszy są potężnym narzędziem do badania różnych aspektów biologii raka. Klasyczne, podskórne modele guzów są wytwarzane przez podskórne wstrzyknięcie komórek nowotworowych do myszy biorców, które mogą być immunokompetentne (jeśli stosuje się syngeniczne mysie komórki nowotworowe) lub z niedoborem odporności. Podskórne modele guzów są niedrogie i szybko dostarczają danych; Ich wzrost guza w punkcie końcowym można łatwo i nieinwazyjnie zmierzyć. Jednak 88% nowych związków, które wykazały działanie przeciwnowotworowe w takich modelach, zawodzi w badaniach klinicznych. 11 Jest to częściowo spowodowane różnicami międzygatunkowymi między ludźmi a myszami; Jednak duża część tego niepowodzenia wynika z niskiej wartości predykcyjnej podskórnych modeli myszy.
Ortotopowe modele myszy, w których komórki nowotworowe są wstrzykiwane do narządu pochodzenia i w ten sposób rosną w swoim pierwotnym mikrośrodowisku, są coraz częściej wykorzystywane w badaniach nad rakiem. 11,12,13,14 Modele ortotopowe nie tylko symulują lokalne warunki wzrostu guza; w wyniku anatomicznie prawidłowego miejsca wzrostu guza, ortotopowe modele myszy umożliwiają również realistyczną symulację przerzutów i dlatego są wykorzystywane do badania biologii CTC8,15,16 lub ich odpowiedzi na różne metody leczenia w CRC. 13,17
Główną wadą ortotopowych modeli myszy jest ich techniczna złożoność. W zależności od narządu, do którego mają zostać wstrzyknięte komórki, krzywa uczenia się, zanim eksperymentator będzie w stanie wywołać powtarzalne nowotwory, jest dość długa. Dotyczy to zwłaszcza modeli raka jelita grubego, ponieważ komórki nowotworowe muszą zostać wstrzyknięte do ściany jelita, co często prowadzi do perforacji, wycieku komórek nowotworowych lub utraty komórek nowotworowych w dole śluzowym. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie metody przygotowania komórek z pierwotnych próbek tkanek, linii komórkowych 2D oraz hodowli organoidów 3D i ich wstrzykiwania do jelita ślepego myszy. Opisana tutaj technika prowadzi do wysoce jednorodnych guzów i, w zależności od biologii guza linii komórkowej użytej do iniekcji, powtarzalnego tworzenia odległych przerzutów i CTC u myszy biorców. 15

<table><tbody><tr><td>Pożywki i komponenty do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15630056</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Suplement Glutamax-I (200 mM)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>35050038</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Penicylina/ Streptomycyna (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>DMEM/ F12 +++ podłoże</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>61965026</td><td>podstawowa pożywka linii komórkowych 2D (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>podstawowa pożywka linii komórkowych 2D (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>Bufor dysocjacji enzymatycznej TrypLE Express</td> Life <td>Technologies GmbH</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matryca błony podstawnej (BMM, bez czerwieni fenolowej)</td><td>CORNING B.V. Life Sciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%, czerwień fenolowa)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-/48-dołkowe z pokrywką</td><td>CORNING</td><td>3516/3548</td><td></td></tr><tr><td>kolba do hodowli komórkowych 75 cm&sup2;, 250 ml</td><td>VWR International GmbH</td><td>734-2066</td><td></td></tr><tr><td>kolba do hodowli komórkowych 150 cm&sup2;, 600 ml</td><td>Corning B.V. Nauki Przyrodnicze</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf 1,5 ml / 2 mL</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72.706.400/ 72.695.400</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 mL, 50 mL</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Szkiełka liczące (do maszyny liczącej TC20)</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura (szkło, 150 mm)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>11546963/ FB50251</td><td>cienko ciągnięte za pomocą palnika Bunsena</td></tr><tr><td>GentleMACS Dysocjator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>do przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej</td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td> do delikatnego <td>przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej</td></tr><tr><td>Rurki MACS C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>do przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej</td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji guza ludzkiego</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>do przygotowania</td></tr> <tr><td>pierwotnej tkanki nowotworowejSokół 70 i mikro; m Sitko komórkowe</td><td>Corning BV Life Sciences</td><td>352350</td><td>do przygotowania pierwotnej tkanki nowotworowej</td></tr> <tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Sprzęt chirurgiczny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>AbbVie Germany GmbH & Co. KG</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Tlen</td><td>medyczny Air Liquide Medical</td><td></td> GmbH-Buprenorphine <td></td></tr><tr><td></td><td>Temgesic-Bepanthen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- maść okulistyczna</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna 0,9% (E154)</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Braun</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml (bez martwej objętości) - Injekt-F SOLO</td> Igła iniekcyjna <td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>30G</td> Waciki celulozowe <td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lohmann & Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki Micro-Adson</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki - ToughCut</td><td>FST - Narzędzia do nauki o lasce</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do igieł Olsen-Hegar</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw AutoClip</td><td>FST - Narzędzia do nauki o nauce</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (chirurgiczny szew)</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>Stołowy aparat do znieczulenia badawczego z płukanką O2 i waporyzatorem Sevoflurane</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicro Pump z kontrolerem Micro4 World</td><td>Precision Instruments</td><td>UMP3-4</td><td>sprzęt do wysoce kontrolowanego iniekcjonizmu ortotopowego</td></tr><tr><td>Przełącznik nożny do kontrolera SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments</td><td>15867</td><td>sprzęt do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej</td></tr><tr><td>Trójosiowy ręczny mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M325</td><td>sprzęt do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej</td></tr><tr><td>Magnetyczny stojak do mikromanipulatora</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sprzęt M10</td><td>do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej</td></tr><tr><td>Stalowa podstawa do stojaka magnetycznego M10</td><td>World Precision Instruments</td><td>5479</td><td>sprzęt do wysoce kontrolowanej iniekcji ortotopowej</td></tr><tr><td>Płyta grzejna 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - Golarka do włosów</td><td>AESCULAP -</td> Braun-lornetkowy <td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop chirurgiczny</td><td>Parkland</td><td>Scientific VS-2Z</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Izolacja CTC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td></td></tr><tr><td>Gradient gęstości średni &ndash; Ficoll</td><td>StemCell - Lymphoprep</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-ludzkie przeciwciało CD326 (EpCAM) klon 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324210</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-mysie CD326 (EpCAM) klon przeciwciała G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118210</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego, &oslash; 60 x 15 mm, 21 cm&sup2;, Vent</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop do hodowli komórek</td><td>Mikromanipulator Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferman 4r</td> Pompa aspiracyjna <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTram Air</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>podłączona do mikromanipulatora</td></tr><tr><td>Uniwersalny ściągacz mikroelektrod Dmz</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td>wymagany do produkcji mikrokapilar do aspiracji pojedynczych komórek</td></tr><tr><td>Kapilary szklane z pryzmatem</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Długopis PAP</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td>bufor do zbierania</td></tr><tr><td>Surowicy cielęcej płodu (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>bufor do pobierania</td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>bufor do pobierania</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td>bufor do kompletacji</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Immunohistochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony klon przeciwciała anty-ludzkiego CD326 (EpCAM) 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324201</td><td>immunohistochemia EpCAM (por. rys. 2C)</td></tr><tr><td>HRP królik anty-mysie IgG</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td>EpCAM immunohistochemia (cf, ryc. 2C)</td></tr></tbody></table>

izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Pomimo zalet łatwej aplikacji i opłacalności, podskórne modele myszy mają poważne ograniczenia i nie symulują dokładnie biologii guza i rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wprowadzono ortotopowe modele myszy; Jednak takie modele są wymagające technicznie, zwłaszcza w pustych narządach, takich jak jelito grube. Aby wytworzyć jednolite guzy, które niezawodnie rosną i dają przerzuty, kluczowe znaczenie mają standaryzowane techniki przygotowania i wstrzykiwania komórek nowotworowych. 
Opracowaliśmy ortotopowy mysi model raka jelita grubego (CRC), który rozwija bardzo jednolite guzy i może być używany do badań biologicznych nowotworów, jak również do prób terapeutycznych. Komórki nowotworowe z guzów pierwotnych, dwuwymiarowych (2D) linii komórkowych lub trójwymiarowych (3D) organoidów są wstrzykiwane do jelita ślepego i, w zależności od potencjału przerzutowego wstrzykniętych komórek nowotworowych, tworzą guzy o wysokim przerzutach. Ponadto CTC można znaleźć regularnie. Opisujemy tutaj technikę przygotowania komórek nowotworowych zarówno z linii komórkowych 2D, jak i organoidów 3D, a także pierwotnej tkanki nowotworowej, techniki chirurgiczne i iniekcyjne, a także izolację CTC od myszy z guzem i przedstawiamy wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów.

Skuteczne i powtarzalne generowanie guzów jelita grubego w tym modelu zależy w krytyczny sposób od precyzyjnego wstrzyknięcia komórek, bez ich rozlania lub wycieku. Jeśli zostanie to osiągnięte, model ten jest niezwykle niezawodny i bardzo rzadko prowadzi do sztucznego rozsiewu otrzewnowego. Kinetyka wzrostu guzów, jak i wzorce ich rozsiewu, zależą od biologii zastosowanych organoidów i komórek.15 Podczas gdy komórki HCT116 niezawodnie przerzutują do wątroby w tym ...

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Ogólnym celem tej techniki mikrochirurgicznej jest wstrzyknięcie komórek nowotworu jelita grubego w ścianę kątnicy w celu wywołania powtarzalnych i przerzutowych nowotworów jelita grubego u myszy. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii krążących komórek nowotworowych; jej głównymi zaletami są wysoce powtarzalne i jednorodne guzy, co umożliwia wiarygodne przewidywanie stadium choroby oraz liczby krążących komórek nowotworowych. Należy rozpocząć od ostrożnego wyewagowania kątnicy u myszy z niedoborem odporności w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, używając do tego pęsety atraumatycznej.Umieszczenie ślepego końca kątnicy na brzuchu w taki sposób, aby woreczek był skierowany kranialnie. Do wstrzyknięcia dokątniczego należy zamocować standardową strzykawkę o pojemności 1 ml, wyposażoną w kaniulę o rozmiarze 30 G, i napełnić ją komórkami nowotworowymi, a następnie umieścić w mikropompce wstrzykującej zamontowanej na mikromanipulatorze. Następnie należy użyć pęsety atraumatycznej, aby ostrożnie uchwycić czubek kątnicy, a drugą pęsetą, zwilżoną ciepłą solą fizjologiczną, delikatnie wygładzić kątnicę ruchami skierowanymi w dół.Następnie przenieś zwierzę pod binokularowy mikroskop chirurgiczny i, ustawiając kaniulę bezpośrednio równolegle i powyżej kątnicy, użyj dwóch pęset atraumatycznych, aby ostrożnie rozciągnąć tkankę na obu końcach wyewaginowanego odcinka kątnicy. Powoli nasuń kątnicę na kaniulę, uważając, aby nie przebić całego pasa ściany ani błony surowiczej poza początkowym punktem penetracji, i umieść kaniulę nad naczyniami krwionośnymi oraz pod cienką, półprzezroczystą błoną wewnątrz pasa ściany. Po umieszczeniu kaniuli użyj przełącznika nożnego, aby wstrzyknąć 20 µl komórek w czasie 20 sekund.Pomiędzy cienką, półprzezroczystą błoną surowiczą, powyżej naczyń krwionośnych ściennych a warstwą mięśniową. Po wstrzyknięciu wszystkich komórek ostrożnie usuń kaniulę i umieść suchy tampon pod kąkraką. Aby zapobiec sztucznemu rozsiewowi otrzewnowemu, poddaj lizie wszelkie wycieknięte komórki, dokładnie płucząc miejsce wodą destylowaną, a następnie delikatnie wprowadź kąkraką z powrotem do jamy brzusznej.Zamknij ścianę brzusną za pomocą szybko wchłanialnych szwów ciągłych, a skórę za pomocą chirurgicznych klipsów do ran. Następnie umieść mysz na macie grzewczej ustawionej na 38 °C z monitorowaniem aż do pełnego wybudzenia. Aby wyizolować krążące komórki nowotworowe, w odpowiednim punkcie końcowym eksperymentu napełnij stożkowe probówki o pojemności 15 ml pięcioma mililitrami medium do gradientu gęstości na probówkę i ostrożnie przenieś próbki krwi pełnej pobrane od zwierząt z nowotworem na warstwy gradientu gęstości.Oddziel komórki poprzez wirowanie, a następnie ostrożnie pobierz frakcję przejściową (interface) zawierającą mononuklearną frakcję komórek. Przenieś komórki mononuklearne pipetą do nowej probówki o pojemności 15 ml w celu ponownego wirowania. Następnie przemyj osad w probówce za pomocą PBS.Po drugim przemyciu ponownie zawiesić osady w 200 µL PBS z dodatkiem EDTA i dodać cztery µL przeciwciała anty-AMP cAMP do każdej próbki, inkubując przez 20 minut w lodzie i w ciemności. Następnie, używając hydrofobowego pisaka do tworzenia barier, narysować okrąg o średnicy około 1 cm w jednej sterylnej szalce Petriego o średnicy 6 cm dla każdej próbki, a następnie dodać 700 µL buforu do pobierania do każdego okręgu, a po nim 50 µL zawiesiny komórkowej. Za pomocą mikroskopu sprawdzić gęstość komórek i pozwolić próbkom osiąść przez około pięć minut.Następnie należy przeskanować kroplę komórek pod kątem pozytywności amp camp i za pomocą mikromanipulatora przenieść interesujące komórki do 15 µL odpowiedniego buforu przeznaczonego do planowanej dalszej analizy. Zastosowanie komórek jelita grubego w tym modelu niezawodnie prowadzi do uzyskania większej liczby myszy w ciągu 35 dni od wstrzyknięcia komórek nowotworowych, przy czym guzy pierwotne osiągają rozmiar około 10 mm, a przerzuty do wątroby i płuc oraz krążące komórki nowotworowe są niemal zawsze obecne. Ponadto krążące komórki nowotworowe można łatwo wyizolować do dalszych analiz.Po opanowaniu i przy prawidłowym wykonaniu technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu 10 minut, co ułatwia tworzenie jednorodnych i przerzutowych guzów, które mogą być wykorzystywane zarówno w badaniach terapeutycznych, jak i molekularnych. Ograniczenia modelu obejmują zależność od lizatów komórkowych, które mają swoje własne limity, a także immunodeficyt myszy; oba te problemy można rozwiązać poprzez zastosowanie zmutowanych komórek raka jelita grubego. Ze względu na swoją prostotę, model ten może stanowić wartościowe uzupełnienie obecnie dostępnych modeli raka jelita grubego.

isolation-circulating-tumor-cells-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Do ustanowienia tego modelu można wykorzystać dwie techniki: wstrzyknięcie zawiesiny komórek nowotworowych w ścianę kątnicy lub przeszczepienie fragmentu guza podskórnego na kątnicę. Model ten jest przydatny do badania naturalnej progresji raka jelita grubego oraz testowania nowych środków terapeutycznych przeciwko rakowi jelita grubego.

Ortotopowy model raka jelita grubego u myszy

Ten film opisuje protokół tworzenia mysiego modelu spontanicznych przerzutów ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem jelita grubego lub PDX. Te modele ksenoprzeszczepów częściowo naśladują cechy ludzkich nowotworów i rozumieją krytyczne aspekty nowotworów złośliwych u ludzi, w tym inwazję i przerzuty.

Mysie modele spontanicznych przerzutów: platforma do badania potencjału przerzutowego komórek raka jelita grubego wstrzykiwanych ortotopowo

Ten film opisuje protokół generowania przerzutów przez organoidy CRC pochodzące z PDX, znakowane lentiwirusem GFP, do śledziony myszy z niedoborem odporności. Mikroprzerzuty nowotworowe kolonizujące inne narządy można wykryć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu oceny ekspresji GFP.

Ustalanie eksperymentalnego modelu mysiego przerzutów: wszczepianie komórek organoidowych CRC z ekspresją GFP w modelu PDX w celu wykrycia mikroprzerzutów

Film opisuje technikę iniekcji śródśladowej komórek rakowych w celu opracowania ortotopowego modelu myszy z wysoce jednorodnymi guzami. W związku z tym ortotopowy model myszy umożliwia realistyczną symulację przerzutów, stanowiąc cenne narzędzie do badania zmian fenotypu podczas wzrostu i rozprzestrzeniania się guza.

Wstrzyknięcie śródśladowych komórek nowotworowych: technika dostarczania komórek rakowych w celu ustalenia ortotopowego modelu myszy raka jelita grubego

Ten film opisuje szczegółowy protokół izolowania krążących komórek nowotworowych z próbki krwi pełnej z mysiego modelu guza jelita grubego poddanego eutanazji. Te wyizolowane CTC mogą być hodowane i wykorzystywane do zamierzonej dalszej analizy.

Izolacja CTC z próbki krwi pełnej: metoda uzyskiwania CTC z mysiego modelu raka jelita grubego

Wykazano, że Wykazano, że krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają ważną rolę w przerzutach nowotworowych. W tym miejscu opisano metodę izolacji i namnażania CTC z krwi pełnej syngenicznego modelu guza myszy z przerzutami raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Izolacja i rozmnażanie krążących komórek nowotworowych z mysiego modelu raka

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Hodowla CTC pozwala na głębszą funkcjonalną charakterystykę raka, poprzez badanie specyficznej ekspresji markerów oraz ocenę oporności na leki i zdolności do kolonizacji wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla CTC może być obiecującym narzędziem klinicznym dla medycyny spersonalizowanej w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.

Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Wstrzyknięcie organoidów raka jelita grubego (CRC) do żyły wrotnej powoduje przerzuty do wątroby bogate w zręb. Ten mysi model przerzutów do wątroby CRC stanowi użyteczne narzędzie do badania interakcji guz-zręb i opracowywania nowych terapii ukierunkowanych na zręb, takich jak terapie genowe za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem.

Wstrzyknięcie do żyły wrotnej organoidów raka jelita grubego w celu zbadania zrębu z przerzutami do wątroby

Ten protokół opisuje ortotopową implantację komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta w ścianie jelita ślepego myszy z niedoborem odporności. Model podsumowuje zaawansowany rak jelita grubego, chorobę z przerzutami i pozwala na ocenę nowych leków terapeutycznych w klinicznie istotnym scenariuszu przerzutów do płuc i wątroby.

Ortotopowa implantacja komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta u myszy podsumowuje zaawansowanego raka jelita grubego

Poznaj mikrochirurgiczną technikę izolacji krążących komórek nowotworowych w ortotopowym modelu raka jelita grubego u myszy. Ta metoda umożliwia badanie biologii CTC i metastazy nowotworowej.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Przeglądaj więcej filmów