Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Przygotowanie i krojenie przy użyciu wibratomu. Do stabilizacji mózgu podczas procedury krojenia potrzebne są trzy bloki agarowe. Aby uniknąć kontaminacji, należy użyć zestawu narzędzi wysterylizowanych w autoklawie.

Usunąć agar. Próbkę należy osuszyć na papierze filtracyjnym przed przyklejeniem jej do metalowej płytki za pomocą medycznego kleju cyjanoakrylowego. Za pomocą szpatułki wyjąć mózg i ostrożnie umieścić go w szalce Petriego wypełnionej medium przygotowawczym.

Następnie krótko osusz mózg na papierze filtracyjnym. Pokryj metalową płytkę medycznym klejem cyjanoakrylowym. Użyj pęsety i szpatułki, aby umieścić mózg na uchwycie do preparatów.

Użyj wcześniej przygotowanych dwóch kawałków agaru, aby zapewnić stabilność mechaniczną z obu stron. W tym momencie mózg należy umieścić obok bloku agaru i ustabilizować dwoma kolejnymi blokami, aby zapobiec uszkodzeniom podczas krojenia. Umieść metalową płytkę w wibrotomie i pokryj tkankę zimnym medium przygotowawczym.

Następnie, za pomocą wibratomu, przeprowadź horyzontalne rozcięcie tkanki na plastry o grubości 350 micrometers w OHSC. Przenieś plastry do szalki Petriego, wykorzystując tył złamanej pipety Pasteura do ich zebrania. Przechowuj plastry mózgu w zimnym medium preparacyjnym.

Przeanalizuj skrawki optycznie przy użyciu mikroskopu binokularnego. Wyodrębnij obszar hipokampa i wejdź do kory wewnętrznej, używając skalpela z okrągłym ostrzem rozmiaru 15. Ważne jest, aby pobrać tylko te skrawki o nienaruszonej cytoarchitekturze, wyizolowane z części środkowej hipokampa, pomiędzy hipokampem grzbietowym a brzusznym.

OHSC niskiej jakości należy natychmiast odrzucić. Przenieść dwa lub trzy uzyskane plastry do wkładu do hodowli komórkowej o rozmiarze porów 0,4 µm. Odessać medium przygotowawcze z górnej części wkładu do hodowli komórkowej za pomocą pipety Pasteura.

Umieść insert w sześciodołkowej płytce hodowlanej zawierającej 1 ml pożywki hodowlanej w każdym dołku. Inkubuj płytki w temperaturze 35°C w pełnej wilgotności z 5% CO2 i wymieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co drugi dzień. Po sześciu dniach hodowli w przypadku tkanki szczura lub po 14 dniach w przypadku tkanki mysiej reakcje zapalne związane z samą procedurą krojenia powinny ustąpić.

Można teraz przystąpić do przeprowadzania eksperymentów. Reprezentatywne wyniki badań nad neuroprotekcją. Część A obrazu przedstawia nieuszkodzone OHSC utrzymywane w pożywce hodowlanej przez dziewięć dni in vitro bez żadnego traktowania, które służą jako plastry kontrolne.

Jak potwierdzono za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej, w grupie kontrolnej OHSC stwierdzono dobrą preserwację neuronów. Komórki mikrogleju wykazujące pozytywną reakcję z izolektyną B4 były zlokalizowane głównie w warstwach molekularnej i splotowej i wykazywały fenotyp rozgałęziony. W warstwie ziarnistej zakrętu zębatego stwierdzono obecność jedynie niewielkiej liczby komórek mikrogleju pozytywnych z izolektyną B4 oraz praktycznie brak jąder pozytywnych z jodkiem propidyny.

Kolejny zestaw OHSC, przedstawiony na części B rysunku, utrzymywano w pożywce hodowlanej przez sześć dni, następnie poddano im uszkodzeniu przy użyciu 50 µM NMDA przez cztery godziny, a następnie ponownie utrzymywano w pożywce hodowlanej przez kolejne trzy dni. Po uszkodzeniu NMDA w miejscu urazu neuronów, we wszystkich warstwach zakrętu zębatego, nastąpiła masowa akumulacja aktywowanych mikroglialnych komórek wykazujących pozytywną reakcję z izolektyną B4.

Analiza ilościowa wykazała, że w warstwie ziarnistej zakrętu zębatego liczba mikroglialnych komórek wykazujących pozytywną reakcję z izolektyną B4 była wyższa w uszkodzonych OHSC w porównaniu z warunkami kontrolnymi. Analogicznie, liczba degenerujących neuronów wykazujących pozytywną reakcję z jodkiem propidium była silnie zwiększona w warstwie ziarnistej skrawków uszkodzonych NMDA. Przykładowe wyniki badań nad inwazją nowotworową.

Wszystkie obrazy przedstawiają wyniki inwazji guza SS przy użyciu OHSC, obrazowane za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Kolor czerwony oznacza cytoarchitekturę OHSC, a zielony komórki nowotworowe. Obraz A przedstawia typowy wzorzec inwazji dla komórek glejaka U138, którym pozwolono na inwazję przez cztery dni.

Można zaobserwować wyraźne, sferyczne, odrębne guzy, a struktura OHSC wydaje się być nienaruszona z wyraźnie widocznym zakrętem zębatym i Cornu Ammonis. Obraz B pokazuje inny wzorzec inwazji, wygenerowany przez komórki glejaka LN229 po czterech dniach. W tym przypadku pojedyncze guzy nie mogą być wyraźnie rozróżnione ze względu na powstałą sieć, która pokrywa większość OHSC, mimo że cytoarchitektura pozostaje nienaruszona z niedeformowanym zakrętem zębatym i Cornu Ammonis.

Można ponadto wywnioskować, że komórki LN229 są bardziej inwazyjne niż komórki U138. Zdjęcia C i D przedstawiają ten sam wynik inwazji nowotworu dla komórek LN229 po czterech dniach inwazji. Po lewej stronie można zaobserwować, że masa nowotworowa pokrywa niemal całe pole widzenia.

Obraz D przedstawia odpowiadające mu barwienie jodkiem propidium. Na tym preparacie cytoarchitektura nie jest już zachowana, ponieważ Cornu Ammonis nie jest już widoczne, a zakręt zębaty jest również zniekształcony. Możliwą przyczyną takiego wyniku mógł być OHSC, który nie był w pełni nienaruszony na początku eksperymentu, zbyt duża liczba zastosowanych komórek nowotworowych lub zbyt długi czas inwazji, co doprowadziło do zaobserwowanego zaniku struktury.

W związku z tym tego typu wyniki inwazji należy odrzucić. Organotypowe hodowle skrawków hipokampa stanowią bardzo dobry model in vitro odzwierciedlający fizjologię mózgu z zachowanymi połączeniami neuronalnymi. Z jednego modelu można uzyskać kilka hodowli skrawków, co pozwala na testowanie wielu warunków w tkance pochodzącej od jednego zwierzęcia, a uzyskane wyniki są wysoce powtarzalne.

Ze względu na wysoki stopień dostępności, organotypowe hodowle przekrojów hipokampa doskonale nadają się do wielu rodzajów eksperymentów. Obejmuje to badania elektrofizjologiczne i neurogenezy, a także doświadczenia nad neuroprotekcją, inwazją nowotworową oraz oddziaływaniami komórek nowotworowych z anatomicznie zdrową tkanką mózgową.