Name: Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metodę przygotowania organotypowych kultur hipokampa przy użyciu wibrotomu do badań neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej jakości preparatów tkankowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Christine Auste za jej wsparcie przy nagrywaniu wideo oraz Chalidowi Ghadbanowi za doskonałą pomoc techniczną. Urszulę Grabiec wspierał Roux Programm FKZ 29/18.

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Polityką Etyki i Polityką Wykorzystania Zwierząt w Badaniach Neurologicznych, zatwierdzonymi przez Dyrektywę Rady Wspólnot Europejskich 2010/63/UE Parlamentu Europejskiego i Rady Unii Europejskiej w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.
1. Przygotowanie instrumentów i pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Do przygotowania OHSC należy użyć następującego zestawu narzędzi: dwóch małych nożyczek, dwóch zakrzywionych pęset, jednej pęsety z cienką końcówką, trzech ostrzy (dwa o rozmiarze 11, jedno o rozmiarze 15), trzy uchwyty na skalpele, okrągłe bibuły filtracyjne (średnica: 35 mm), agar, jedna żyletka, jedna niemodyfikowana pipeta Pasteura i jedna zmodyfikowana pipeta Pasteura bez końcówki. Wysterylizuj wszystkie materiały w autoklawie przed użyciem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Odważyć 5 g agaru i rozpuścić go w 100 ml wody destylowanej. Sterylizować roztwór przez 20 minut w temperaturze 121,7 °C i 210,8 kPa w autoklawie. Rozprowadzić 3 ml płynnego roztworu agaru na 60-milimetrowych szalkach Petriego za pomocą sterylnej szklanej pipety, pozostawić do zestalenia przez 5 godzin, przykryć folią parafinową z tworzywa sztucznego, aby uniknąć zanieczyszczenia i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia. Bloki agaru są potrzebne do ustabilizowania mózgów podczas procedury krojenia.</li>
	<li>media
	<ol>
		<li>Przygotować 200 ml pożywki (pH 7,35) składającej się ze 198 ml minimalnej pożywki egzogennej (MEM) i 2 ml roztworu L-glutaminy (stężenie końcowe 2 mM). Przygotować roztwór w dniu przygotowania pożywki i przechowywać go w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj 100 ml pożywki hodowlanej składającej się z 49 ml MEM, 25 ml zrównoważonych roztworów soli Hanksa (HBSS), 25 ml (v/v) normalnej surowicy końskiej (NHS), 1 ml roztworu L-glutaminy (końcowe stężenie 2 mM), 100 μg insuliny, 120 mg glukozy, 10 mg streptomycyny, 10 000 U penicyliny i 800 μg witaminy C, jak opisano wcześniej. Ogrzać pożywkę (37 °C), dostosować wartość pH do pH 7,4 i sterylnie przefiltrować (wielkość porów 0,2 μm). Powtarzaj procedurę (rozgrzewka, regulacja pH itp.) co drugi dzień przed zmianą podłoża. Pożywkę należy stosować maksymalnie przez tydzień, jeśli jest przechowywana w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij jedną 35-milimetrową szalkę Petriego pożywką do przechowywania mózgu. Umieść dwie puste szalki Petriego do zebrania tkanki na opakowaniu chłodzącym w obszarze roboczym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i krojenie za pomocą wibratomu
<ol>
	<li>Użyj mózgów 7-9 dniowych szczurów lub 4-5 dniowych myszy do przygotowania OHSC zgodnie z Stoppini i wsp. 4 Po ścięciu głowy zwierząt, usuń skórę z czaszki nożyczkami.</li>
	<li>Wprowadź ostrze cienkich nożyczek do otworu wielkiego i otwórz czaszkę, przecinając wzdłuż osi ogonowej (tylnej) rostralnej (przedniej). Wykonaj dwa cięcia prostopadłe do pierwszego, tak aby nożyczki były skierowane odpowiednio w stronę lewego i prawego ucha ("nacięcie w kształcie litery T").</li>
	<li>Ostrożnie otwórz czaszkę cienkimi kleszczami, uważając, aby nie uszkodzić mózgu. Użyj skalpela (rozmiar ostrza 11), aby przeciąć najbardziej rostralną część bieguna czołowego i móżdżku.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki wyjmij mózg i ostrożnie umieść go na szalce Petriego wypełnionej pożywką do przygotowywania (<silna klasa="xfig">Ryc. 2). Umieść mózg na uchwycie próbki i przymocuj go za pomocą medycznego kleju cyjanoakrylowego. Użyj kawałków agaru, aby zapewnić stabilizację mechaniczną.</li>
	<li>Wyciąć tkankę poziomo w OHSC o grubości 350 μm za pomocą wibratomu ślizgowego.</li>
	<li>Oceń plastry optycznie za pomocą mikroskopu dwuokularowego. Natychmiast wyrzuć OHSC o niskiej jakości. Ważne jest, aby pobierać tylko te wycinki z nienaruszoną cytoarchitekturą wyizolowane ze środkowej części hipokampa (patrz ryc. 3 i 4) między hipokampem grzbietowym a brzusznym.</li>
	<li>Oddziel obszar hipokampa i korę śródwęchową za pomocą skalpela (okrągłe ostrze o rozmiarze 15; <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Szlak perforacyjny i kora śródwęchowa muszą być zachowane.</li>
	<li>Z każdego mózgu uzyskuje się od sześciu do ośmiu OHSC. Przenieść 2-3 plastry do jednej wkładki do hodowli komórkowej (wielkość porów 0,4 μm) i umieścić ją w jednym dołku 6-dołkowego naczynia hodowlanego zawierającego 1 ml pożywki hodowlanej na studzienkę.</li>
	<li>Inkubować 6-dołkowe szalki w temperaturze 35 °C w całkowicie nawilżonej atmosferze z 5% (v/v) CO2 i zmieniać pożywkę do hodowli komórkowych co drugi dzień. 
	UWAGA: Eksperymenty należy przeprowadzać w 6-dniowym okresie in vitro (div). Reakcje zapalne związane z procedurą krojenia ustępują do 6 dnia. Na tym etapie komórki mikrogleju ponownie wykazują rozgałęzioną morfologię, a połączenia synaptyczne dojrzały.</li>
</ol>
3. Ocena jakości tkanek
<ol>
	<li>Fiksacja, etykietowanie i wizualizacja degenerujących się neuronów w OHSC
	<ol>
		<li>Po przeprowadzeniu eksperymentów inkubować OHSC z 5 μg/ml jodku propydyny (PI) przez 2 godziny przed utrwaleniem, w celu wybarwienia jąder degenerujących się neuronów. 
		UWAGA: PI jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy, zawsze należy nosić środki ochrony osobistej (PPE), takie jak rękawice.</li>
		<li>Przemyć OHSC 0,1 M buforem fosforanowym (pH 7,4) i utrwalić je 4% (v/v) roztworem paraformaldehydu (PFA) przez 24 godziny 
		UWAGA: PFA jest substancją toksyczną i podejrzewaną o działanie rakotwórcze. Pracuj pod wyciągiem i noś środki ochrony osobistej.</li>
		<li>Umyj OHSC we wkładkach za pomocą 1 ml PBS i użyj szczotki rigger, aby oddzielić plastry od membrany.</li>
		<li>Oznacz OHSC barwnikiem IB4 w 24-dołkowej płytce (<klasa silna = "xfig">Rysunek 5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie eksperymentów inwazji nowotworów przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych pojedynczych komórek
	<ol>
		<li>Na 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu oznaczyć komórki nowotworowe za pomocą barwnika fluorescencyjnego Karboksyfluoresceiny dioctan sukcynimidylu estru (CFDA SE).</li>
		<li>Odłącz i policz komórki nowotworowe za pomocą komory Neubauera.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce, tak aby 10 μl zawiesiny zawierało pożądaną liczbę komórek (zwykle 50 000 lub 100 000 komórek).</li>
		<li>Nałożyć 10 μl zawiesiny komórkowej na kulturę plastrową i pozostawić komórkom na inwazję przez 3 dni.</li>
		<li>Pod koniec eksperymentu utrwal kultury warstwowe za pomocą 4% (v/v) PFA przez 24 godziny i oznacz kokultury za pomocą PI przez kolejne 24 godziny, aby uwidocznić cytoarchitekturę. 
		UWAGA: PFA jest substancją toksyczną i podejrzewaną o działanie rakotwórcze. Pracuj pod wyciągiem i noś środki ochrony osobistej.</li>
		<li>Zamontuj kokultury na szkiełku nakrywkowym w celu dalszej analizy przy użyciu podłoża montażowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ocena eksperymentów OHSC
Analizuj OHSC za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM). Do wykrywania neuronów znakowanych PI, degeneracji lub cytoarchitektury znakowanej PI stosuje się światło monochromatyczne o długości fali λ = 543 nm i filtr pasma emisyjnego dla długości fal λ = 585-615 nm. W przypadku komórek nowotworowych znakowanych CFDA lub mikrogleju IB4 należy użyć długości fali wzbudzenia λ = 488 nm. W przypadku obu typów eksperymentalnych należy nagrać stos z warstwami optycznymi o grubości 2 μm i użyć go do oceny.

<ol><li>Gähwiler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).</li>
<li>Bahr, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Hippocampal+Slices%3A+A+Model+System+for+Investigating+Synaptic+Mechanisms+and+Pathologic+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes.</a> J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).</li>
<li>Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+microglia+in+brain+slices+and+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging microglia in brain slices and slice cultures.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+mature+hippocampus+slices+for+4+days+in+a+newly+developed+medium%3A+preservation+of+transmitter+release+and+leucine+incorporation+into+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein.</a> Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).</li>
<li>Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+hippocampal+slices+as+in+vitro+models+for+neurodegeneration+Studies+on+cell+viability+and+apoptotic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes.</a> Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Monolayer+Cultures+of+Nervous+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+%28P25-30%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li>
<li>Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23159795">Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).</li>
<li>Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).</li>
<li>Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+induce+primary+and+secondary+traumatic+damage+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+rRes+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).</li>
<li>Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).</li>
<li>Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+studies+of+brain+damage%2C+neuroprotection+and+neurorepair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets+CNS+Neurol+Disord%22%5BJournal%5D)">Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair.</a> Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).</li>
<li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).</li>
<li>Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , BioValley Karger. Basel, Switzerland. (2005).</li>
<li>Berger, T., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+morphological+characteristics+of+oligodendrocytes+in+the+rat+hippocampus+in+situ+and+in+vitro%3A+An+immunocytochemical+study+with+the+monoclonal+Rip+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody.</a> J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).</li>
<li>Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+oligodendrocyte+dynamics+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture.</a> Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+and+neuroprotective+effects+of+the+glutamate+transporter+inhibitor+DL-threo-beta-benzyloxyaspartate+%28DL-TBOA%29+during+physiological+and+ischemia-like+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions.</a> Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).</li>
<li>Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+layer-specific+astrocytic+glutamine+synthetase+immunoreactivity+in+slice+cultures+of+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus.</a> Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18 (4), 319-331 (1996).</li>
<li>Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+factors+protect+neuronal+integrity+and+reduce+microglial+activation+in+an+in+vitro+model+of+N-methyl-D-aspartate-induced+excitotoxic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).</li>
<li>Bahr, B. A., Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+maintenance+of+glutamate+receptors+and+other+synaptic+components+in+long-term+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices.</a> Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).</li>
<li>Holopainen, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+A+model+system+to+study+basic+cellular+and+molecular+mechanisms+of+neuronal+cell+death%2C+neuroprotection%2C+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity.</a> Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).</li>
<li>Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+measuring+organotypic+tissue+slice+culture+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness.</a> J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).</li>
<li>Grabiec, U., Koch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocannabinoid+N-arachidonoyldopamine+%28NADA%29+exerts+neuroprotective+effects+after+excitotoxic+neuronal+damage+via+cannabinoid+receptor+1+%28CB+1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1).</a> Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).</li>
<li>Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tools+for+optimizing+central+nervous+system+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies.</a> Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).</li>
<li>Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+neuronal+damage+in+excitotoxically+lesioned+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures.</a> Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).</li>
<li>He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+extrasynaptic+plasticity+in+glutamatergic+circuits+involving+dentate+granule+cells+following+chronic+N-methyl-D-aspartate+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition.</a> J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).</li>
<li>Kann, O., Taubenberger, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/51802845_Muscarinic_receptor_activation_determines_the_effects_of_store-operated_Ca2-entry_on_excitability_and_energy_metabolism_in_pyramidal_neurons">Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons.</a> Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).</li>
<li>Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neurogenesis+in+organotypic+cultures+of+rat+hippocampus+after+transient+subfield-selective+excitotoxic+insult+induced+by+domoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid.</a> Neuroscience. 208, 97-108 (2012).</li>
<li>Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15207849">Neurogenesis in hippocampal slice cultures.</a> Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).</li>
<li>Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+Cell+Death+in+Slice+Cultures+From+Rat+Hippocampus+Is+Prevented+By+Glutamate+Receptor+Antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists.</a> Neuroscience. 63 (2), (1994).</li>
<li>Koch, M., Kreutz, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20135626">The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels.</a> Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).</li>
<li>Pukrop, T., Dehghani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).</li>
<li>Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bisphosphonate+clodronate+depletes+microglial+cells+in+excitotoxically+injured+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).</li>
<li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).</li>
<li>Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+primary+glioma-+and+cell+line-derived+spheroids+implanted+into+corticostriatal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures.</a> Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).</li>
<li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+tumor+spheroid+invasion+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> J Vis Exp. (99), e52686(2015).</li>
<li>Hagemann, C., Fuchs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+MACC1+on+human+malignant+glioma+progression+and+patients+%27+unfavorable+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis.</a> Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).</li>
<li>Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Biomechanical+Properties+and+Cannabinoids+on+Tumor+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion.</a> Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie OHSC. Model ten pozwala na badanie wewnętrznych możliwości i reakcji tkanki mózgowej po zastosowaniu bodźców fizjologicznych i patologicznych. Oprócz analiz parametrów elektrofizjologicznych, OHSC może być zmieniany chorobowo i można określić wpływ uszkodzenia na wszystkie typy komórek. Możliwe jest leczenie różnymi substancjami i szczegółowy opis procesów zmiany chorobowej lub gojenia przy braku makrofagów i limfocytów.
Najważniejszymi etapami udanego ...

OHSC to dobrze scharakteryzowany model in vitro do badania zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych właściwości neuronów, astrocytów i mikrogleju1. Łatwo jest kontrolować środowisko zewnątrzkomórkowe i monitorować zmiany komórkowe i morfologiczne po różnych bodźcach. Organizacja neuronów hipokampa i ich połączeń jest dobrze zachowana po przygotowaniu2,3. Spośród kilku zalet, OHSC umożliwia monitorowanie uszkodzenia mózgu i inwazji guza bez chirurgii na zwierzętach. Sześć do ośmiu OHSC można uzyskać z jednego mózgu gryzonia. W związku z tym OHSC przyczynia się do znacznego zmniejszenia liczby zwierząt i umożliwia testowanie wielu stężeń leków, manipulacji genetycznych lub różnych modeli zmian u tego samego zwierzęcia. W testach opartych na warstwach warunki eksperymentalne mogą być precyzyjnie kontrolowane. Dodatkowo, zależny od czasu rozwój stanów patologicznych, takich jak uszkodzenia wtórne, można łatwo monitorować za pomocą obrazowania poklatkowego.
W podanym protokole, pierwotnie ustalonym przez Stoppini et al.4, opisano etapy przygotowania i podkreślono ważne punkty orientacyjne dla wyboru odpowiednich przekrojów. Zalecamy przygotowanie szczurów w 7-9 dniu po urodzeniu lub 4-5 myszy w dniu poporodowym. W tych okresach OHSC wykazują dużą odporność na urazy mechaniczne i wysoki potencjał reorganizacji obwodów neuronalnych. Natomiast preparaty z zarodków lub dorosłych szczurów szybko zmieniają swoją strukturę i tracą swoją organotypową morfologię podczas hodowli, a zatem są mniej odpowiednie do badania długoterminowych procesów w badaniach podstawowych5,6,7,8,9,10,11. Innym krytycznym punktem dla wskaźnika przeżywalności OHSC jest grubość samego wycinka, ponieważ dyfuzja, a tym samym dopływ składników odżywczych są ograniczone12,13,14.

<table><tbody><tr><td>6-dołkowy</td><td>Falcon</td><td>35-3046</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fluka</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Systec</td><td>DX-45</td><td></td></tr><tr><td>CFDA</td><td>&nbsp; Thermo Fisher</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM) LSM700</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eagle&acute; s Minimalny niezbędny nośnik&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>32360-034</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina znakowana Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1101</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Merk</td><td>1083371000</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Hank&acute; s Zrównoważony roztwór soli (z Ca2+ i Mg2+)</td><td>Invitrogen</td><td>24020-133</td><td></td></tr><tr><td>Hank&acute; s Zbilansowany roztwór soli (bez Ca2+&nbsp; i Mg2+)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Insulina Sigma Aldrich</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A5960</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>LN229</td><td>Linie komórkowe-Service</td><td>300363</td><td></td></tr><tr><td>Medyczny klej cyjanoakrylowy (klej Histoacryl)</td><td>B.Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli milikomórkowych</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>NMDA Kwas N-metylo-D-asparaginowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Seum</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (wszystkie rozmiary)</td><td>Greiner</td><td>627160/664160/628160</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Roth</td><td>0335.1</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>jod Propidium (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81845-25MG</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>U138</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>Wibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT 1200</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

W organtypowych kulturach warstwowych hipokampa (OHSC), morfologiczne i funkcjonalne cechy zarówno neuronów, jak i komórek glejowych są dobrze zachowane. Model ten nadaje się do rozwiązywania różnych pytań badawczych, które obejmują badania nad neuroprotekcją, eksperymentami elektrofizjologicznymi na neuronach, sieciach neuronalnych lub inwazji guza. Architektura hipokampa i aktywność neuronalna w obwodach wielosynaptycznych są dobrze zachowane w OHSC, mimo że sama procedura krojenia początkowo powoduje uszkodzenia i prowadzi do powstania blizny glejowej. Powstawanie blizn prawdopodobnie zmienia właściwości mechaniczne i dyfuzyjne zachowanie małych cząsteczek itp. Plastry umożliwiają monitorowanie procesów zależnych od czasu po urazie mózgu bez konieczności przeprowadzania operacji na zwierzętach oraz badania interakcji między różnymi typami komórek pochodzących z mózgu, a mianowicie astrocytami, mikroglejem i neuronami zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Ambiwalentnym aspektem tego modelu jest brak przepływu krwi i komórek odpornościowych. Podczas progresji uszkodzenia neuronów ważną rolę odgrywają migrujące komórki odpornościowe z krwi. Ponieważ brakuje tych komórek w plasterkach, wewnętrzne procesy w kulturze można obserwować bez ingerencji zewnętrznej. Ponadto w OHSC skład środowiska zewnętrznego jest precyzyjnie kontrolowany. Kolejną zaletą tej metody jest mniejsza liczba uśmiercanych zwierząt w porównaniu ze standardowymi preparatami. Od jednego zwierzęcia można uzyskać kilka OHSC, co umożliwia jednoczesne badania z wieloma terapiami na jednym zwierzęciu. Z tych powodów OHSC doskonale nadaje się do analizy efektów nowych terapii ochronnych po uszkodzeniu tkanek lub podczas inwazji guza. 
Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę przygotowania OHSC, która pozwala na generowanie wysoce powtarzalnych, dobrze zachowanych wycinków, które mogą być wykorzystane do różnych badań eksperymentalnych, takich jak badania nad neuroprotekcją lub inwazją nowotworów.

Badania neuroprotekcyjne: W celu określenia stopnia uszkodzenia neuronów policzono liczbę jąder dodatnich względem PI oraz mikrogleju dodatniego względem IB4 w każdym trzecim przekroju optycznym warstwy ziarnistej (GCL) zakrętu zębatego (DG). W eksperymentach dotyczących inwazji nowotworu do obliczenia powierzchni zajmowanej przez komórki nowotworowe, jako miary inwazji oraz do wizualizacji różnych wzorców inwazji, wykorzystano projekcję z maksymalną intensywno...

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Przygotowanie i krojenie przy użyciu wibratomu. Do stabilizacji mózgu podczas procedury krojenia potrzebne są trzy bloki agarowe. Aby uniknąć kontaminacji, należy użyć zestawu narzędzi wysterylizowanych w autoklawie.Usunąć agar. Próbkę należy osuszyć na papierze filtracyjnym przed przyklejeniem jej do metalowej płytki za pomocą medycznego kleju cyjanoakrylowego. Za pomocą szpatułki wyjąć mózg i ostrożnie umieścić go w szalce Petriego wypełnionej medium przygotowawczym.Następnie krótko osusz mózg na papierze filtracyjnym. Pokryj metalową płytkę medycznym klejem cyjanoakrylowym. Użyj pęsety i szpatułki, aby umieścić mózg na uchwycie do preparatów.Użyj wcześniej przygotowanych dwóch kawałków agaru, aby zapewnić stabilność mechaniczną z obu stron. W tym momencie mózg należy umieścić obok bloku agaru i ustabilizować dwoma kolejnymi blokami, aby zapobiec uszkodzeniom podczas krojenia. Umieść metalową płytkę w wibrotomie i pokryj tkankę zimnym medium przygotowawczym.Następnie, za pomocą wibratomu, przeprowadź horyzontalne rozcięcie tkanki na plastry o grubości 350 micrometers w OHSC. Przenieś plastry do szalki Petriego, wykorzystując tył złamanej pipety Pasteura do ich zebrania. Przechowuj plastry mózgu w zimnym medium preparacyjnym.Przeanalizuj skrawki optycznie przy użyciu mikroskopu binokularnego. Wyodrębnij obszar hipokampa i wejdź do kory wewnętrznej, używając skalpela z okrągłym ostrzem rozmiaru 15. Ważne jest, aby pobrać tylko te skrawki o nienaruszonej cytoarchitekturze, wyizolowane z części środkowej hipokampa, pomiędzy hipokampem grzbietowym a brzusznym.OHSC niskiej jakości należy natychmiast odrzucić. Przenieść dwa lub trzy uzyskane plastry do wkładu do hodowli komórkowej o rozmiarze porów 0,4 µm. Odessać medium przygotowawcze z górnej części wkładu do hodowli komórkowej za pomocą pipety Pasteura.Umieść insert w sześciodołkowej płytce hodowlanej zawierającej 1 ml pożywki hodowlanej w każdym dołku. Inkubuj płytki w temperaturze 35°C w pełnej wilgotności z 5% CO2 i wymieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co drugi dzień. Po sześciu dniach hodowli w przypadku tkanki szczura lub po 14 dniach w przypadku tkanki mysiej reakcje zapalne związane z samą procedurą krojenia powinny ustąpić.Można teraz przystąpić do przeprowadzania eksperymentów. Reprezentatywne wyniki badań nad neuroprotekcją. Część A obrazu przedstawia nieuszkodzone OHSC utrzymywane w pożywce hodowlanej przez dziewięć dni in vitro bez żadnego traktowania, które służą jako plastry kontrolne.Jak potwierdzono za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej, w grupie kontrolnej OHSC stwierdzono dobrą preserwację neuronów. Komórki mikrogleju wykazujące pozytywną reakcję z izolektyną B4 były zlokalizowane głównie w warstwach molekularnej i splotowej i wykazywały fenotyp rozgałęziony. W warstwie ziarnistej zakrętu zębatego stwierdzono obecność jedynie niewielkiej liczby komórek mikrogleju pozytywnych z izolektyną B4 oraz praktycznie brak jąder pozytywnych z jodkiem propidyny.Kolejny zestaw OHSC, przedstawiony na części B rysunku, utrzymywano w pożywce hodowlanej przez sześć dni, następnie poddano im uszkodzeniu przy użyciu 50 µM NMDA przez cztery godziny, a następnie ponownie utrzymywano w pożywce hodowlanej przez kolejne trzy dni. Po uszkodzeniu NMDA w miejscu urazu neuronów, we wszystkich warstwach zakrętu zębatego, nastąpiła masowa akumulacja aktywowanych mikroglialnych komórek wykazujących pozytywną reakcję z izolektyną B4.Analiza ilościowa wykazała, że w warstwie ziarnistej zakrętu zębatego liczba mikroglialnych komórek wykazujących pozytywną reakcję z izolektyną B4 była wyższa w uszkodzonych OHSC w porównaniu z warunkami kontrolnymi. Analogicznie, liczba degenerujących neuronów wykazujących pozytywną reakcję z jodkiem propidium była silnie zwiększona w warstwie ziarnistej skrawków uszkodzonych NMDA. Przykładowe wyniki badań nad inwazją nowotworową.Wszystkie obrazy przedstawiają wyniki inwazji guza SS przy użyciu OHSC, obrazowane za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Kolor czerwony oznacza cytoarchitekturę OHSC, a zielony komórki nowotworowe. Obraz A przedstawia typowy wzorzec inwazji dla komórek glejaka U138, którym pozwolono na inwazję przez cztery dni.Można zaobserwować wyraźne, sferyczne, odrębne guzy, a struktura OHSC wydaje się być nienaruszona z wyraźnie widocznym zakrętem zębatym i Cornu Ammonis. Obraz B pokazuje inny wzorzec inwazji, wygenerowany przez komórki glejaka LN229 po czterech dniach. W tym przypadku pojedyncze guzy nie mogą być wyraźnie rozróżnione ze względu na powstałą sieć, która pokrywa większość OHSC, mimo że cytoarchitektura pozostaje nienaruszona z niedeformowanym zakrętem zębatym i Cornu Ammonis.Można ponadto wywnioskować, że komórki LN229 są bardziej inwazyjne niż komórki U138. Zdjęcia C i D przedstawiają ten sam wynik inwazji nowotworu dla komórek LN229 po czterech dniach inwazji. Po lewej stronie można zaobserwować, że masa nowotworowa pokrywa niemal całe pole widzenia.Obraz D przedstawia odpowiadające mu barwienie jodkiem propidium. Na tym preparacie cytoarchitektura nie jest już zachowana, ponieważ Cornu Ammonis nie jest już widoczne, a zakręt zębaty jest również zniekształcony. Możliwą przyczyną takiego wyniku mógł być OHSC, który nie był w pełni nienaruszony na początku eksperymentu, zbyt duża liczba zastosowanych komórek nowotworowych lub zbyt długi czas inwazji, co doprowadziło do zaobserwowanego zaniku struktury.W związku z tym tego typu wyniki inwazji należy odrzucić. Organotypowe hodowle skrawków hipokampa stanowią bardzo dobry model in vitro odzwierciedlający fizjologię mózgu z zachowanymi połączeniami neuronalnymi. Z jednego modelu można uzyskać kilka hodowli skrawków, co pozwala na testowanie wielu warunków w tkance pochodzącej od jednego zwierzęcia, a uzyskane wyniki są wysoce powtarzalne.Ze względu na wysoki stopień dostępności, organotypowe hodowle przekrojów hipokampa doskonale nadają się do wielu rodzajów eksperymentów. Obejmuje to badania elektrofizjologiczne i neurogenezy, a także doświadczenia nad neuroprotekcją, inwazją nowotworową oraz oddziaływaniami komórek nowotworowych z anatomicznie zdrową tkanką mózgową.

organotypic-hippocampal-slice-cultures-as-model-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Organoptypowy model hodowli plastrów hipokampa jest modelem in vitro stosowanym do badania uszkodzeń neuronalnych w różnych paradygmatach. W niniejszym artykule opisujemy metody przygotowania hodowli plastrów oraz ilościowego oznaczania uszkodzeń neuronalnych.

Model organotypowej hodowli skrawków hipokampa do badania uszkodzeń neuronów

Opisujemy metodę przygotowania organotypowych skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Skrawki mózgu umieszcza się na porowatych membranach, pozwalając na utworzenie interfejsu z pożywką hodowlaną. Metoda ta pozwala zachować ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni hodowli.

Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Ten film pokazuje rozwój systemu kokultury 3D. Wycinki mózgu myszy umieszcza się na błonie, a znakowane fluorescencyjnie ludzkie komórki guza mózgu mogą na niej rosnąć. Gdy system jest gotowy, jest barwiony do obrazowania.

Ustalenie guza mózgu w organotypowym modelu kokultury warstw

Wideo pokazuje tworzenie i utrzymywanie organtypowych kultur warstwowych z tkanki glejaka. Wyizolowaną tkankę osadza się w matrycy agarozowej, a cienkie skrawki uzyskuje się za pomocą wibratomu. Sekcje te są następnie umieszczane na przepuszczalnych wkładkach membranowych w mikropłytce i hodowane w pożywce do hodowli warstwowej w celu długotrwałej konserwacji.

Generowanie i utrzymywanie kultur plastrów z ludzkiej tkanki glejaka wielopostaciowego

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Przedstawiono protokół dla organotypowych kultur entorhino-hipokampowych, który pozwala na odtworzenie wielu aspektów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu. Badając zmiany układu nerwowo-naczyniowego oprócz zmian w neuronach, protokół ten jest wszechstronnym narzędziem do badania zmian plastycznych w tkance nerwowej po urazie.

Analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Wiele typów ludzkich guzów mózgu jest zlokalizowanych w określonych regionach mózgu i są trudne do wyhodowania w kulturze. Protokół ten odnosi się do roli mikrośrodowiska guza i bada nowe terapie lekowe poprzez analizę fluorescencyjnych pierwotnych komórek guza mózgu rosnących w organotypowym wycinku mózgu myszy.

System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Przy stopniowym i kontrolowanym pozbawianiu surowicy, plastry te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczki i mogą być uważane za model epileptogenezy ex vivo. System ten stanowi doskonałe narzędzie do monitorowania dynamiki spontanicznej aktywności, a także do oceny progresji cech neurozapalnych w całym przebiegu epileptogenezy.

Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

Wprowadzamy protokół do pomiaru w czasie rzeczywistym reakcji komórek przerzutowych raka piersi do mózgu na leki i promieniowanie w organotypowym modelu wycinka mózgu. Metody te zapewniają test ilościowy w celu zbadania efektów terapeutycznych różnych metod leczenia przerzutów raka piersi do mózgu w sposób ex vivo w obrębie interfejsu mikrośrodowiska mózgu.

Model wycinka mózgu ex vivo do badania i celowania we wzrost guza z przerzutami do mózgu raka piersi

Poznaj metodę przygotowania organotypowych kultur hipokampa przy użyciu wibrotomu do badań neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej jakości preparatów tkankowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów