Rekombinowane α-β- i γ-synukleiny stymulują aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w testach bezkomórkowych

Rekombinowane synukleiny alfa, beta i gamma stymulują aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w testach bezkomórkowych. Witam, nazywam się Sovanarak Lek. Jestem studentem medycyny w Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L. Foster School of Medicine.

W tym filmie zaprezentuję kolorymetryczny test aktywności fosfatazy białkowej z wykorzystaniem rekombinowanych białek synukleiny. Przygotowanie buforów i odczynników. Przygotowanie buforu z fosforanem p-nitrofenolu.

Aby przygotować 50 ml buforu pNPP, rozpuścić Trizma base w 25 ml ultraczystej wody dejonizowanej w zlewce. Dodać czysty mieszadło magnetyczne i umieścić na mieszadle magnetycznym. Po rozpuszczeniu Trizma, przy ciągłym mieszaniu, dodać chlorek wapnia.

Dostosować pH do wartości 7.0. Przenieść roztwór do cylindra miarowego. Uzupełnić końcową objętość całkowitą do 50 mils wodą dejonizowaną ultrazczystą.

Przygotowanie roztworu zieleni malachitowej. Roztwór zieleni malachitowej wymaga trzech komponentów: części A, B i C. Roztwór A to czteromolowy kwas solny. Roztwór B to połączenie molibdanu amonu oraz roztworu A. Roztwór C to 0,045% szczawian zieleni malachitowej.

Aby przygotować roztwór D, wymieszać jedną część B z trzema częściami C w stosunku 1:3. Mieszać przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec przefiltrować roztwór D przez membranę 22 µm i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Chronić przed światłem. Przygotowanie aktywatora. Aktywator jest roztworem Tween 20 o stężeniu 1%.

Odmierz pipetą 10 µL Tween 20 do 990 µL ultraczystej wody dejonizowanej. Mieszaj w wortexie do całkowitego rozpuszczenia Tween 20. Przygotowanie roztworu roboczego zieleni malachitowej z Tween 20.

Dodać aktywator do roztworu D w stosunku 1:100. Przygotowanie fosfopeptydu treoniny. Aby przygotować roztwór stokowy pT o stężeniu 2 mM, dodać 550 µL ultrapure deionized water do 1 mg pT.

Mieszać w vortexie do całkowitego rozpuszczenia fosfopeptydu. Umieścić na lodzie w celu natychmiastowego użycia. Nadmiarowe alikwoty pT przechowywać w temperaturze -20 °C.

Przygotowanie synukleiny. Zawiesić jeden miligram synukleiny w mil ultrapurej wody dejonizowanej do uzyskania stężenia końcowego jeden miligram na mil. Delikatnie wymieszać w vortexie do rozpuszczenia.

Należy użyć natychmiast, a niewykorzystane aliquoty przechowywać w temperaturze -80 °C. Przygotowywanie standardów fosforanowych. Krok pierwszy przygotowania standardów fosforanowych.

Aby przygotować 1 mM roztwór zapasowy fosforanu, rozpuścić fosforan potasu w ultreczystej wodzie dejonizowanej w zlewce z mieszadłem magnetycznym. Przenieść roztwór do cylindra miarowego i uzupełnić objętość końcową do 100 mils. Jest to roztwór 10 mM.

Przefiltruj cały roztwór przez filtr 22 µm, używając dużej strzykawki. Rozcieńcz go w stosunku 1:100, aby przygotować 1 mM roztwór fosforanów, który będzie służył jako wzorce do analizy. Krok drugi przygotowania wzorców fosforanów.

Do probówek 1,5 ml należy dodać odpowiednią ilość fosforanu oraz ultraczystej wody dejonizowanej zgodnie z tabelą. Pozwoli to na przygotowanie probówek zawierających 150, 300, 600, 1 200 i 2 400 pmol fosforanu. Alikwoty należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

Test aktywności PP2A. Przygotować test PP2A w probówkach 1,5 ml na lodzie. Dodać 43 µL buforu pNPP.

Dodaj 1 µL ludzkiej rekombinowanej PP2Ac. Dodaj synukleinę i inkubuj PP2A wraz z synukleiną przez 30 minut na mieszalniku typu Nutator w temperaturze 4 °C. Następnie dodaj 16 µL 2mM pT.

Inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C w kąpieli wodnej. Na płytkę 96-dołkową z płaskim dnem nanieść po 25 µL każdego standardu fosforanowego w dwóch powtórzeniach, od najniższego do najwyższego stężenia. Pipetować po 24 µL każdego testu PP2A w dwóch powtórzeniach na tę samą płytkę 96-dołkową ze standardami.

Do każdej próbki i wzorca pipetuj 75 µL roztworu D zawierającego Tween 20. Po dodaniu MGT w dołkach, w których obecne są wolne fosforany, nastąpi zmiana barwy. Analiza fotometryczna.

Analizę należy przeprowadzić za pomocą spektrofotometru ustawionego na 630 nanometrów. Wyniki reprezentatywne. Przedstawiono tutaj reprezentatywny test PP2A oraz wykres obrazujący krzywą wzorcową.

Po lewej stronie znajdują się standardy fosforanowe. Im więcej fosforanu znajduje się w dołkach, tym ciemniejszy jest odcień zieleni. Po prawej stronie mamy PP2A inkubowaną z alfa, beta lub gamma synukleinami w różnych stężeniach molowych.

Wyższe stężenia były skuteczniejsze w stymulowaniu aktywności podjednostki katalitycznej PP2A. Tutaj widzimy reprezentację graficzną aktywności PP2A w odpowiedzi na zmienne stężenia alfa-synukleiny, beta-synukleiny i gamma-synukleiny. Alfa-synukleina, beta-synukleina i gamma-synukleina były istotnymi stymulatorami aktywności PP2A przy stężeniu od 1 do 2 µM.

Jedynie alfa-synukleina i beta-synukleina były istotnymi stymulatorami aktywności PP2A przy stężeniu 0,5 micromolar. Rysunek trzy przedstawia oddziaływanie PP2Ac z endogennymi synukleinami w mózgu myszy. W części A rekombinowane alfa-, beta- i gamma-synukleiny służą jako kontrole dodatnie.

W części B przeprowadzono koimmunoprecypitację z użyciem przeciwciała 1D6 specyficznego dla PP2Ac, które wyizolowało PP2Ac oraz znaczną ilość oddziałującej alfa-synukleiny, lecz prawie żadnej beta-synukleiny. W koimmunoprecypitacji z PP2Ac nie wyizolowano gamma-synukleiny. Dane z tej koimmunoprecypitacji sugerują, że alfa-synukleina jest endogennym modulatorem PP2Ac in vivo.

Chcielibyśmy podziękować wszystkim, którzy pomogli nam w przygotowaniu tego filmu. Podsumowując, są to Ruth Perez i Sonavarak Lek.

Javier Vargas. Życzę wielkich sukcesów. Do widzenia i powodzenia.