Rekombinowane α-β- i γ-synukleiny stymulują aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w testach bezkomórkowych

Rekombinowane synukleiny alfa, beta i gamma stymulują aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w testach bezkomórkowych. Cześć, nazywam się Sovanarak Lek. Jestem studentem medycyny w Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L.Foster School of Medicine.

W tym filmie zademonstruję dwukierunkowy test metryczny fosfatazy białkowej z użyciem rekombinowanych białek synukleinowych. Przygotowanie i radiantów. Przygotowanie buforu fosforanowego p-nitrofenolu.

Aby przygotować 50 milicali buforu pNPP, rozpuść zasadę Trizma w 25 mililitrach ultraczystej wody dejonizowanej w zlewce. Dodaj czystą mieszadło i umieść na mieszadle magnetycznym. Gdy Trizma się rozpuści, dodać chlorek wapnia, ciągle mieszając.

Dostosuj pH do 7,0. Przenieść roztwór do cylindra z podziałką. Doprowadź końcową całkowitą objętość do 50 milicali za pomocą ultraczystej wody dejonizowanej.

Przygotowanie zielonego roztworu malachitu. Zielony roztwór malachitu wymaga trzech roztworów, części A, B i C. Roztwór A to czteromolowy kwas solny. Roztwór jest połączeniem molibdenianu amonu i roztworu A. Roztwór C to 0,045% soli zielonego szczawianu malachitu.

Aby przygotować roztwór D, wymieszaj jedną część B z trzema częściami C, w stosunku jeden do trzech. Mieszaj godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec przefiltruj roztwór D przez membranę o średnicy 22 mikremów i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Chronić przed światłem. Przygotowanie aktywatora. Aktywator to jednoprocentowe rozwiązanie Tween 20.

Pippette 10 mikrolitrów Tween 20 w 990 mikrolitrach ultraczystej wody dejonizowanej. Wiruj, aż animacja 20 całkowicie się rozpuści. Przygotowanie zieleni malachitowej plus roztwór roboczy Tween 20.

Dodać aktywator do roztworu D w proporcji 1 do 100. Przygotowanie fosfopeptydu treoniny. Aby przygotować roztwór podstawowy o wartości dwóch mM pT, dodaj 550 mikrolitrów ultraczystej wody dejonizowanej do jednego miligrama pT.

Wirować, aż fosfopeptyd całkowicie się rozpuści. Umieść na lodzie do natychmiastowego użycia. Przechowywać dodatkowe porcje pT w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Preparat synukleiny. Zawiesić ponownie jeden miligram synukleiny w ultraczystej wodzie dejonizowanej mil o końcowym stężeniu jednego miligrama na promil. Delikatnie wiruj, aby się rozpuścił.

Zużyć natychmiast i przechowywać niewykorzystane podwielokrotności w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przygotowanie wzorców fosforanowych. Wzorce fosforanowe krok pierwszy.

Aby przygotować 1 mM roztwór podstawowy fosforanu, rozpuść fosforan potasu w ultraczystej wodzie dejonizowanej w zlewce z mieszadłem. Przenieś do cylindra podziałki i doprowadź końcową objętość do 100 mils. Jest to rozwiązanie o mocy 10 mM.

Przefiltruj cały roztwór przez filtr 22 mikros za pomocą dużej strzykawki. Rozcieńczyć to do 1 do 100, aby uzyskać 1 mM roztwór fosforanu, który ma być stosowany do wzorców testowych. Wzorce fosforanowe krok drugi.

Dodaj odpowiednią ilość fosforanu i ultraczystej wody dejonizowanej do probówek o wielkości 1,5 mililitra zgodnie z tabelą. W ten sposób uzyska się probówki zawierające 150, 300, 600, 1, 200 i 2 400 pmol fosforanu. I przechowuj podwielokrotności w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Test aktywności PP2A. Przygotować test PP2A w probówkach o średnicy 1,5 mililitra na lodzie. Dodaj 43 mikrolitry buforu pNPP.

Dodać jeden mikrolitr ludzkiego rekombinowanego PP2Ac. Dodaj synukleinę i inkubuj PP2A plus synukleinę przez 30 minut na nutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj 16 mikrolitrów 2mM pT.

Inkubować 10 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Na 96-dołkowej płytce z płaskim dnem dodaj 25 mikrolitrów każdego wzorca fosforanowego po dwóch od niskiego do wysokiego. Odpipetować 24 mikrolitry każdego testu PP2A w dwóch egzemplarzach na tę samą 96-dołkową płytkę z wzorcami.

Odmierzyć pipetą 75 mikrolitrów roztworu D zawierającego Tween 20 do każdej próbki i wzorca. Po dodaniu MGT zobaczysz zmianę koloru w studzienkach, gdy obecne są wolne fosforany. Analiza fotometryczna.

Analizuj na spektrofotometrze ustawionym na 630 nanometrów. Reprezentatywne wyniki. Tutaj mamy reprezentatywny test PP2A i wykres przedstawiający krzywą standardową.

Po lewej stronie znajdują się wzorce fosforanowe. Im więcej fosforanów zawierają studnie, tym ciemniejszy odcień zieleni. Po prawej stronie mamy PP2A, który był inkubowany z synukleinami alfa, beta lub gamma w różnych stężeniach molowych.

Wyższe stężenia były bardziej skuteczne w stymulowaniu aktywności podjednostki katalitycznej PP2A. Tutaj widzimy graficzne przedstawienie aktywności PP2A w odpowiedzi na różne stężenia alfa synukleiny, beta synukleiny i synukleiny gamma. Alfa synukleina, beta synukleina i gamma synukleina były istotnymi stymulatorami aktywności PP2A w stężeniu od jednego do dwóch mikromolowców.

Tylko alfa synukleina i beta synukleina były istotnymi stymulatorami aktywności PP2A przy stężeniu 0,5 mikromolowym. Rycina trzecia przedstawia interakcję PP2Ac z endogennymi synukleinami w mózgu myszy. W A rekombinowane synukleiny alfa, beta i gamma są pokazane jako kontrole pozytywne.

W B koimmunoprecypitację przeprowadzono przy użyciu przeciwciała swoistego dla PP2Ac 1D6, które obniżyło PP2Ac, a także obniżyło znaczną ilość interaktywującej alfa synukleiny, ale prawie nie beta-synukleiny. Żadna synukleina gamma nie spadła z PP2Ac w koimmunoprecypitacji. Te dane dotyczące koimmunoprecypitacji sugerują, że alfa synukleina jest endogennym modulatorem PP2Ac in vivo.

Chcemy podziękować wszystkim, którzy pomogli nam w realizacji tego filmu. Podsumowując, jest to Ruth Perez. Sonavarak Lek.

Javier Vargas Życzę wielu sukcesów. Do widzenia i powodzenia.