Name: Rekombinowane α-β- i γ-synukleiny stymulują aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w testach bezkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w obecności rekombinowanych synuklein α, β i γ przy użyciu testu kolorymetrycznego. Protokół pozwala badać interakcje białkowe w mózgu myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy doceniają wysiłki poprzednich członków laboratorium, Kendry Mackett, Sandry Slusher i Jie Chen, którzy pracowali nad optymalizacją metody. Autorzy dziękują również National Institutes of Health, Fundacji Michaela J. Foxa, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso Scholarly Activity Research Project (SARP), Fundacji Lizanell and Colbert Coldwell, Multiple System Atrophy Coalition, Hoy Family Research i Anna Mae Doyle Gift Funds za wsparcie finansowe tych badań.

1. Przygotowanie i odczynników
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu fosforanu p-nitrofenylu (pNPP)
	<ol>
		<li>Przygotować 50 ml buforu pNPP w następujący sposób.</li>
		<li>Odważyć 0,30285 g zasady Tris (patrz tabela materiałów) i rozpuścić w 25 ml ultraczystej wody dejonizowanej.
		<ol>
			<li>Dodać 41,6 μl ze 120 mM CaCl2. Dostosuj do pH 7,0 za pomocą 1 M HCl i doprowadź końcową objętość roztworu do 50 ml za pomocą ultraczystej wody dejonizowanej.</li>
			<li>Upewnij się, że końcowe stężenie wynosi 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7,0.</li>
			<li>Przechowywać bufor pNPP w temperaturze 4 oC.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku roztworów zieleni malachitowej przygotuj następujące elementy.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór A, dodając 32,8 ml stężonego HCl do 67,2 ml ultraczystej wody dejonizowanej, aby utworzyć 4 M roztwór HCl. 
		UWAGA: Roztwór malachitu przygotowuje się w dygestorium przy użyciu jednorazowych rękawiczek, maski na twarz i okularów ochronnych.</li>
		<li>Przygotować roztwór B, odważając 4,2 g molibdenianu amonu i dodając go do 95,8 ml roztworu A.</li>
		<li>Przygotuj roztwór C, ważąc 0,045 g soli malachitowej zielonego szczawianu i dodając ultraczystą wodę dejonizowaną, aby uzyskać końcową całkowitą objętość do 100 ml.</li>
		<li>Przygotować roztwór D, mieszając roztwory B i C w stosunku 1:3 (v/v), mieszać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przefiltruj roztwór D przez jednostkę filtrującą z membraną nitrocelulozową o wielkości porów 0,22 μm za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Przygotowany roztwór malachitu przechowywać w temperaturze 4 oC z dala od światła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie aktywatora
	<ol>
		<li>Aby przygotować 1% roztwór tween 20, odpipetuj 10 μl tween 20 do 990 μl ultraczystej wody dejonizowanej (v/v), a następnie wiruj, aż tween 20 całkowicie się rozpuści.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu roboczego zieleni malachitowej Tween 20 (MGT).
	<ol>
		<li>Zmieszać aktywator (etap 1.3) z roztworem zieleni malachitowej (roztwór D, etap 1.2.5) w stosunku 1:100 (np. 1 μl aktywatora na 99 μl roztworu zieleni malachitowej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie substratu fosfopeptydu treoniny (KRpTIRR) (pT).
	<ol>
		<li>Aby przygotować bulion o wielkości 2 mM, umieść fiolkę z fosfopeptydem o pojemności 1 mg na lodzie, dodaj 550 μl ultraczystej wody dejonizowanej i delikatnie przemieszaj, aby się rozpuścił.
		<ol>
			<li>Wykonaj ~10 porcji i przechowuj pT w temperaturze -20oC.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie synukleiny
	<ol>
		<li>Przygotuj synukleiny w dygestoriach za pomocą jednorazowych rękawiczek, maski na twarz i okularów ochronnych.</li>
		<li>Zawiesić 1 mg rekombinowanej synukleiny w 1 ml ultraczystej wody dejonizowanej do końcowego stężenia 1 mg/ml.</li>
		<li>Delikatnie zmieszaj do rozpuszczenia i umieść na lodzie.</li>
		<li>Przygotować 50 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 oC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wzorców fosforanowych
	<ol>
		<li>Przygotować 0,1 mM roztwór podstawowy fosforanu w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Odważyć 0,1361 g KH2PO4 i umieścić w zlewce z 80 ml ultraczystej wody dejonizowanej. Dodaj mieszadło i wymieszaj do rozpuszczenia. Przenieś cały roztwór do cylindra miarowego i doprowadź końcową całkowitą objętość do 100 ml ultraczystą wodą dejonizowaną.</li>
			<li>Przefiltrować cały roztwór przez jednostkę filtrującą z membraną nitrocelulozową o wielkości porów 0,22 μm za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml; końcowe stężenie wynosi 10 mM.</li>
			<li>Rozcieńczyć roztwór (10 mM) w stosunku 1:100; końcowe stężenie wyniesie 0,1 mM fosforanu (PO4), który zostanie użyty do wzorców testowych.</li>
			<li>Przechowywać podstawowy roztwór fosforanu w temperaturze 4 oC.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Patrz Tabela 1 w celu ograniczenia rozcieńczeń stosowanych do sporządzania wzorców PO4 o końcowej całkowitej objętości 1250 μL każdy. Dodaj odpowiednią ilość fosforanów i ultraczystej wody dejonizowanej do probówek o pojemności 1,5 ml zgodnie z tabelą 1.
		<ol>
			<li>Przygotowane wzorce PO4 należy przechowywać w temperaturze -20 oC.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="7">Standardy fosforanowe </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,1 mM roztwór PO4 (ml)</td>
			<td>0</td>
			<td>75</td> Rozdział
			<td>150</td> szt.
			<td>300</td> szt.
			<td>600</td> szt.
			<td>1 200</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraczysta woda dejonizowana (ml)</td>
			<td>1 250</td> szt.
			<td>1 175</td> osób
			<td>1 100</td> szt.
			<td>950</td> szt.
			<td>650</td> szt.
			<td>50</td> Rozdział
		</tr>
		<tr>
			<td>Stężenie końcowe PO4 [pmol]</td>
			<td>0</td>
			<td>150</td> szt.
			<td>300</td> szt.
			<td>600</td> szt.
			<td>1 200</td> szt.
			<td>2 400</td> szt.
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wzorce fosforanów.
2. Test PP2A w odpowiedzi na rekombinowane synukleiny
UWAGA: Całkowita końcowa objętość dla każdej reakcji wyniesie 60 μL, więc eksperymentator musi odpowiednio dostosować początkową objętość bufora pNPP, aby dostosować się do objętości synuklein używanych dla każdej próbki. W większości przypadków objętość bufora pNPP będzie wynosić od 40 do 44 μL.
<ol>
	<li>Przygotować każdą reakcję PP2Ac w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Do probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 39 μl buforu pNPP i umieść na lodzie.</li>
		<li>Dodać 1 μl (105 ng/μL lub 0,0007 U/μL) ludzkiego rekombinowanego PP2Ac (rPP2Ac).</li>
		<li>Dodać 4 μl synukleiny 0, 1,5, 7,5, 15 lub 30 μM do rPP2Ac w buforze pNPP dla końcowych stężeń 0, 0,1, 0,5, 1,0 i 2,0 μM i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut na jednostce obrotowej; końcowa objętość wyniesie 60 μl.</li>
		<li>Po 30 minutach przenieść próbki do lodu i dodać 16 μl 2 mM pT substratu.</li>
		<li>Każdą mieszaninę do oznaczania PP2A inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C w łaźni wodnej z przerywanym wstrząsaniem.</li>
		<li>Do 96-dołkowej płytki z płaskim dnem dodać 25 μl każdego wzorca PO4 (0, 150, 300, 600, 1,200 i 2,400 pmol) w zduplikowanych studzienkach od niskiego do wysokiego.</li>
		<li>Następnie dodać 25 μl każdej próbki doświadczalnej (test PP2A ± synukleiny), przygotowanej w krokach 2.1.1 do 2.1.6, w celu zduplikowania studzienek na tej samej 96-dołkowej płytce.</li>
		<li>Następnie dodać 75 μl roztworu roboczego MGT do każdej studzienki zawierającej wzorce i próbki.</li>
		<li>Pozostaw talerz w temperaturze pokojowej na 10 minut.</li>
		<li>Obserwuj zmianę koloru w próbkach mających mierzalne różnice w poziomach fosforanów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza fotometryczna
<ol>
	<li>Przeanalizować 96-dołkową płytkę zawierającą wzorce i próbki za pomocą spektrofotometrycznego czytnika płytek o długości fali ustawionej na 630 nm29.</li>
	<li>Wykreślić wytworzoną krzywą absorbancji (próbki odczytane przy 630 nm) i zauważyć, że pozostaje ona liniowa do stężenia PO4 4 pmol.</li>
</ol>

<ol><li>Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+alpha-%2C+beta-+and+gamma-synucleins+in+the+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS.</a> Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).</li>
<li>Iwai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+precursor+protein+of+non-A+beta+component+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+is+a+presynaptic+protein+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system.</a> Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).</li>
<li>Irizarry, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+precursor+protein+of+the+non-A+beta+component+of+senile+plaques+%28NACP%29+in+the+human+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).</li>
<li>Shibayama-Imazu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+distribution+and+developmental+change+of+neuron+specific+14+kDa+protein+%28phosphoneuroprotein+14%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14).</a> Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).</li>
<li>Nakajo, S., Shioda, S., Nakai, Y., Nakaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphoneuroprotein+14+%28PNP+14%29+and+its+mRNA+expression+in+rat+brain+determined+by+immunocytochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphoneuroprotein 14 (PNP 14) and its mRNA expression in rat brain determined by immunocytochemistry and in situ hybridization.</a> Brain Res Mol Brain Res. 27 (1), 81-86 (1994).</li>
<li>Buchman, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persyn%2C+a+member+of+the+synuclein+family%2C+has+a+distinct+pattern+of+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system.</a> J Neurosci. 18 (22), 9335-9341 (1998).</li>
<li>George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+protein+regulated+during+the+critical+period+for+song+learning+in+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch.</a> Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).</li>
<li>Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+localization+of+synelfin+%28synuclein%2C+NACP%29+to+presynaptic+terminals+in+cultured+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons.</a> Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).</li>
<li>Greten-Harrison, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphabetagamma-Synuclein+triple+knockout+mice+reveal+age-dependent+neuronal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).</li>
<li>Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+alpha+synuclein+to+neuronal+survival+and+function+-+Implications+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease.</a> J Neurochem. , (2016).</li>
<li>Perez, R. G., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Could+a+loss+of+alpha-synuclein+function+put+dopaminergic+neurons+at+risk%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk?</a> J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).</li>
<li>Lou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+129+phosphorylation+reduces+the+ability+of+alpha-synuclein+to+regulate+tyrosine+hydroxylase+and+protein+phosphatase+2A+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 285 (23), 17648-17661 (2010).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Synucleins+in+the+Mammalian+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22JARO%22%5BJournal%5D)">Localization of Synucleins in the Mammalian Cochlea.</a> JARO. 9 (4), 452-463 (2008).</li>
<li>Guardia-Laguarta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+Is+Localized+to+Mitochondria-Associated+ER+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes.</a> J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).</li>
<li>Shibayama-Imazu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+PNP+14+%28beta-synuclein%29+in+neuroendocrine+tissues%3A+localization+in+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Distribution of PNP 14 (beta-synuclein) in neuroendocrine tissues: localization in Sertoli cells.</a> Mol Reprod Dev. 50 (2), 163-169 (1998).</li>
<li>Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).</li>
<li>Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Lewy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">100 years of Lewy pathology.</a> Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Alerte, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+aggregation+alters+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+and+immunoreactivity%3A+lessons+from+viral+transduction+of+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice.</a> Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).</li>
<li>Peng, X., Tehranian, R., Dietrich, P., Stefanis, L., Perez, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+activation+of+protein+phosphatase+2A+reduces+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+dopaminergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3523-3530 (2005).</li>
<li>Perez, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha-synuclein+in+the+regulation+of+dopamine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis.</a> J Neurosci. 22 (8), 3090-3099 (2002).</li>
<li>Porras, J. L., Perez, R. G. Ch. III. <a target="_blank" href="http://www.academia.edu/28970880/POTENTIAL_CONTRIBUTION_OF_%CE%91LPHA-SYNUCLEIN_DYSREGULATION_TO_PARKINSONS_DISEASE_PATHOLOGY">Nova Publishers - Alpha-Synuclein</a>. Kanowitz, H. C., Polizzi, M. , NOVA Science Publishers. 51-70 (2014).</li>
<li>Tehranian, R., Montoya, S. E., Van Laar, A. D., Hastings, T. G., Perez, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+inhibits+aromatic+amino+acid+decarboxylase+activity+in+dopaminergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylase activity in dopaminergic cells.</a> J Neurochem. 99 (4), 1188-1196 (2006).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy-like+aggregation+of+alpha-synuclein+reduces+protein+phosphatase+2A+activity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo.</a> Neuroscience. 207, 288-297 (2012).</li>
<li>Geng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+binds+the+K%28ATP%29+channel+at+insulin-secretory+granules+and+inhibits+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein binds the K(ATP) channel at insulin-secretory granules and inhibits insulin secretion.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 300 (2), E276-E286 (2011).</li>
<li>Farrell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motor+parkinsonian+pathology+in+aging+A53T+alpha-synuclein+mice+is+associated+with+progressive+synucleinopathy+and+altered+enzymatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Non-motor parkinsonian pathology in aging A53T alpha-synuclein mice is associated with progressive synucleinopathy and altered enzymatic function.</a> J Neurochem. 128 (4), 536-546 (2014).</li>
<li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A%3A+a+highly+regulated+family+of+serine%2Fthreonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochem J. 353 (Pt 3), 417-439 (2001).</li>
<li>Wlodarchak, N., Xing, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP2A+as+a+master+regulator+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PP2A as a master regulator of the cell cycle.</a> Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 51 (3), 162-184 (2016).</li>
<li>George, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synucleins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The synucleins.</a> Genome Biol. 3 (1), (2002).</li>
<li>Fathi, A. R., Krautheim, A., Lucke, S., Becker, K., Juergen Steinfelder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonradioactive+technique+to+measure+protein+phosphatase+2A-like+activity+and+its+inhibition+by+drugs+in+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nonradioactive technique to measure protein phosphatase 2A-like activity and its inhibition by drugs in cell extracts.</a> Anal Biochem. 310 (2), 208-214 (2002).</li>
<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antiaggregation+gene+therapy+strategy+for+Lewy+body+disease+utilizing+beta-synuclein+lentivirus+in+a+transgenic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">An antiaggregation gene therapy strategy for Lewy body disease utilizing beta-synuclein lentivirus in a transgenic model.</a> Gene Ther. 11 (23), 1713-1723 (2004).</li>
<li>Hashimoto, M., Rockenstein, E., Mante, M., Mallory, M., Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Synuclein+inhibits+alpha-synuclein+aggregation%3A+a+possible+role+as+an+anti-parkinsonian+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an anti-parkinsonian factor.</a> Neuron. 32 (2), 213-223 (2001).</li>
<li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine%2Fthreonine+protein+phosphatase+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 18, (2010).</li>
<li>Anwar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+alterations+to+the+nigrostriatal+system+in+mice+lacking+all+three+members+of+the+synuclein+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family.</a> J Neurosci. 31 (20), 7264-7274 (2011).</li>
<li>Vargas-Medrano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+FTY720-based+compounds+stimulate+neurotrophin+expression+and+phosphatase+activity+in+dopaminergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel FTY720-based compounds stimulate neurotrophin expression and phosphatase activity in dopaminergic cells.</a> ACS Med Chem Lett. 5 (7), 782-786 (2014).</li>
<li>Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwingle%2C+M+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).</li>
</ol>

W latach 1999 – 2011 dr Perez był członkiem wydziału na Wydziale Neurologii Uniwersytetu w Pittsburghu School of Medicine.

Ten test zieleni malachitowej z pT został użyty do pomiaru aktywności PP2Ac, ponieważ jest łatwiejszy do wykonania niż klasyczna metoda, która wykorzystuje 32substraty znakowane P. Kolejną zaletą tego testu w porównaniu z testami promieniotwórczymi jest to, że izotopy promieniotwórcze stwarzają pewne ryzyko i mogą być kosztowne, zwłaszcza 32cząsteczki znakowane P, które mają krótki okres półtrwania, co ogranicza liczbę testów, które można wykonać przed wygaśnięciem odczynników. Użycie zieleni malachitowej zamiast radioaktywności eliminuje również konieczność utylizacji odpadów 32P. Testy zieleni malachitowej są również dość czułe przy pomiarze aktywności fosfataz serynowo-treoninowych w porównaniu z innym testem kolorymetrycznym, który wykorzystuje substrat p-nitrofenylofosforan (pNPP), który jest nieselektywny, ponieważ może być defosforylowany przez szeroką liczbę enzymów32.
Komercyjne zestawy zieleni malachitowej do pomiaru aktywności PP2A są dostępne od jakiegoś czasu i były wcześniej używane w laboratorium. Jednak podczas wykonywania wielu testów zieleni malachitowej takie zestawy stały się zbyt drogie. Ponadto komercyjne zestawy do aktywności PP2A są stabilne tylko przez jeden rok, a odczynniki są dostępne w postaci sproszkowanej i przy odpowiednim przechowywaniu, zapewniają łatwo dostępne składniki testowe, które są strukturalnie stabilne przez długi czas.
Przed badaniem bSyn i gSyn, aSyn stosowano jako kontrolę pozytywną w celu stymulacji aktywności PP2Ac i określenia ilości PP2Ac wymaganej do testów, a także w celu potwierdzenia, że uzyskane dane pozostają na skali z krzywą wzorcową (150 - 2400 pmol PO4). Warto zauważyć, że jeśli aSyn zbyt silnie stymuluje PP2Ac, mimo że reakcja jest zazwyczaj liniowa, dane wyjdą poza skalę i substancje chemiczne w roztworze MGT wytrącą się, co uniemożliwi dokładne zmierzenie ilości uwolnionego wolnego PO4 za pomocą czytnika płytek.
Biorąc pod uwagę, że aSyn przyczynia się do aktywności PP2Ac in vivo i in vitro 12,19,21,23,25 oraz że wszystkie synukleiny mają znaczną homologię, postawiono hipotezę, że wszyscy członkowie rodziny synukleiny mogą być w stanie stymulować PP2Ac w testach bezkomórkowych. Korzystając z opisanego tutaj testu kolorymetrycznego, stwierdzono, że rzeczywiście wszystkie trzy rekombinowane synukleiny (aSyn, bSyn, gSyn) stymulują aktywność PP2Ac, co zwiększa prawdopodobieństwo, że wszystkie trzy synukleiny mogą pełnić podobne funkcje w układzie nerwowym. Jednak mózg z chorobą Parkinsona lub demencją z przypadkami ciał Lewy'ego ma mniejszą aktywność PP2Ac w tkankach zawierających wysoce zagregowany aSyn23. Tkanki myszy zawierające patologię podobną do ciał Lewy'ego również wykazują zmniejszoną aktywność PP2Ac25. To, a także nowe dane na rysunku 3, jak również wcześniejsze dane z myszy z nokautem aSyn12, zdecydowanie sugerują, że ani bSyn, ani gSyn nie mogą zazwyczaj zrekompensować utraty rozpuszczalnego aSyn w mózgu, lub alternatywnie, że te homologi synukleiny mogą nie wiązać się z PP2Ac tak silnie jak aSyn, jak pokazano (Figura 3). Atlas mózgu Allena pokazuje kolokalizację wszystkich trzech mRNA synukleiny w wielu obszarach mózgu i chociaż myszy z potrójnym nokautem synukleiny zostały wygenerowane 9,33, aktywność PP2Ac nie została oceniona w tym modelu. Co ciekawe, aSyn, który jest fosforylowany na Ser129 przez kinazę podobną do Polo 2, jest mniej zdolny do aktywacji PP2Ac12, ale dowody pokazane tutaj dla bSyn sugerują, że fosforylacja bSyn prawdopodobnie nie wpłynie na aktywność PP2Ac, ponieważ bardzo mało bSyn zaszło z PP2Ac w mózgu myszy (Figura 3). Podsumowując, dane sugerują, że endogenne modulatory aktywności PP2Ac, takie jak aSyn, prawdopodobnie przyczyniają się do dobrego samopoczucia i choroby.
Przedstawiony tutaj protokół jest prostą, ale potężną techniką określania zdolności PP2Ac do defosforylacji substratu fosfopeptydowego w odpowiedzi na różne zabiegi. Na przykład ta sama metodologia może być wykorzystana do testowania innych aktywatorów PP2Ac, takich jak ceramidy, a także potencjalnych nowych środków terapeutycznych34, lub do oceny wpływu inhibitorów PP2Ac in vitro. Ważne jest również, aby podkreślić, że podobne testy mogą mierzyć aktywność PP2Ac, który został wyizolowany przez immunoprecypitację 1D6 z ekstraktów komórkowych lub tkanek ciała, jak wcześniej opisali autorzy 12,19,25. Przyszłe zastosowania testu zieleni malachitowej wykraczają poza pomiar aktywności PP2Ac, ponieważ za pomocą takiego testu można również określić aktywność ATP.
Należy pamiętać, że krzywa wzorcowa musi być generowana za każdym razem dla każdego niezależnego testu PP2Ac. Obowiązkowe jest upewnienie się, że wszystkie używane odczynniki są wolne od fosforanów, ponieważ wolne fosforany sztucznie zwiększają sygnał tła i dają błędne wyniki. W dniu badania konieczne jest przygotowanie wystarczającej ilości świeżego roztworu MGT dla wszystkich próbek, które mają być oznaczone. Ponadto MGT jest dobry tylko w dniu, w którym jest wytwarzany i ma tendencję do wytrącania się po kilku godzinach. PP2Ac zakupiony od dostawcy musi być podzielony na porcje i przechowywany w stanie zamrożonym wkrótce po otrzymaniu, aby zapobiec cyklom zamrażania i rozmrażania, które zmniejszają jego aktywność. Ponieważ inne fosfatazy mogą defosforylować substrat pT (np. PP1 i PP535), podczas analizy ekstraktów komórkowych lub tkankowych, w których PP2Ac nie został wyizolowany przez immunoprecypitację, próbki muszą zostać przepuszczone przez kolumny w celu usunięcia wolnych fosforanów, a w celu potwierdzenia swoistości fosfatazy należy zastosować specyficzne inhibitory fosfatazy, jak opisano wcześniej18.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55361/recombinant-synucleins-stimulate-protein-phosphatase-2a-catalytic">Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays</a>
One of the authors&#39; names was corrected from:
Brian Marcus
to:
Brian S. Marcus

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55361/recombinant-synucleins-stimulate-protein-phosphatase-2a-catalytic">Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays</a>

Erratum: Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

Badania definiujące rozkład synuklein w mózgu i rdzeniu kręgowym pokazują, że wszystkie trzy synukleiny są wzbogacone w tkankach nerwowych, chociaż odnotowano różne wzorce lokalizacji1. Na przykład aSyn występuje najliczniej w miejscach presynaptycznych w korze mózgowej i zwojach podstawy2,3, bSyn ma bardziej równomierny rozkład w mózgu i rdzeniu kręgowym4,5, a gSyn jest bardziej obfity w rdzeniu kręgowym i zwojach obwodowych6. Chociaż może wystąpić pewna embrionalna ekspresja wszystkich synuklein, trzy homologi stają się bardziej obfite w okresie noworodkowym4,5,6,7,8. Co ciekawe, dane z myszy z potrójnym nokautem synukleiny wskazują, że utrata wszystkich trzech synuklein powoduje dysfunkcję neuronów w wieku 9, wspierając ważne funkcje synukleiny w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)10,11. Nie wiadomo jeszcze, czy myszy z potrójnym nokautem synukleiny wykazują zmiany w dystrybucji lub aktywności PP2Ac. Dane z pojedynczych myszy z nokautem synukleiny ujawniają, że utrata samego aSyn jest w stanie znacznie zmniejszyć aktywność PP2Ac w brain12. Oprócz OUN wszystkie synukleiny lokalizują się w innych tkankach w całym ciele13,14,15.
Ze względu na swoje dobrze znane genetyczne powiązania z neurodegeneracją16,17, aSyn jest jednym z najlepiej zbadanych z trzech synuklein. Laboratorium Perez od dawna pracuje nad zdefiniowaniem normalnych czynności funkcjonalnych aSyn, szczególnie w klasie CNS<sup="xref">11,12,18,19,20,21,22,23, a ostatnio w tkankach obwodowych24, 25. Wśród nich było odkrycie, że aSyn odgrywa kluczową rolę regulacyjną w stymulowaniu aktywności PP2Ac19. Aktywność PP2A w znacznym stopniu przyczynia się do prawidłowego funkcjonowania mózgu, w tym do regulacji produkcji dopaminy26. Holoenzym PP2A składa się z trzech niezależnych podjednostek, katalitycznej podjednostki C, PP2Ac, podjednostki rusztowania A i jednej z kilku różnych podjednostek regulatorowych / ukierunkowanych B, które pomagają zlokalizować PP2A w określonych mikrodomenach subkomórkowych, zapewniając w ten sposób funkcjonalną różnorodność PP2A27. Dowody wskazują, że interakcje aSyn z PP2Ac znacząco przyczyniają się do jego aktywności fosfatazy in vitro i in vivo12,19,21,23,25. Kiedy aSyn gromadzi się w agregatach białkowych, tak jak ma to miejsce, gdy ciała Lewy'ego tworzą się w neuronach choroby Parkinsona i demencji z ciałami Lewy'ego (DLB), tkanki z zagregowanym aSyn mają zmniejszoną aktywność PP2Ac23,25, gdy poziomy rozpuszczalnego aSyn maleją. Biorąc pod uwagę, że wszystkie trzy synukleiny mają znaczącą homologię28 (aSyn dzieli 66% tożsamości z bSyn i 56% z gSyn) i że aSyn przyczynia się do aktywacji PP2Ac, postawiono hipotezę, że wszyscy członkowie rodziny białek synukleiny mogą być w stanie zwiększyć aktywność PP2Ac, przynajmniej in vitro. Aby to ocenić, aktywność PP2Ac mierzono w odpowiedzi na rekombinowany aSyn, bSyn i gSyn za pomocą prostego testu kolorymetrycznego, wzorowanego na metodzie Fathi i wsp.29. Ta metoda i nowe odkrycia są szczegółowo opisane w tym artykule.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T15003</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (chlorek wapnia)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Skoncentrowany HCl&nbsp; &nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>9535-33</td><td></td></tr><tr><td>Molibdenian amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1343</td><td></td></tr><tr><td>Sól zielonego szczawianu malachitu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6880</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Fosfopeptyd treoniny (KRpTIRR)</td><td>Peptyd Nowej Anglii LLC</td><td>BP12-011</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 ( fosforan potasu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka podjednostka PP2A C</td><td>Cayman Chemical&nbsp;</td><td></td><td></td>10011237</tr><tr><td>Rekombinowany ludzki &alfa;-synukleina</td><td>rPeptyd</td><td>S-1001-2</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki &beta;-synukleina</td><td>rPeptyd</td><td>S-1003-2</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki &gamma;-synukleina</td><td>rPeptyd</td><td>S-1007-2</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac 1D6</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td>05-421</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-92217</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało aSyn C-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało bSyn EP1537Y</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-79903</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało gSyn E-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10698</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 ml</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment/Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiskan Czytnik płytek Spectrum</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>51118650 pH-metr&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>13-636-AB15P</td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinowane α-β- i γ-synukleiny stymulują aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2a w testach bezkomórkowych

Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

α-synukleina (aSyn), β-synukleina (bSyn) i γ-synukleina (gSyn) są członkami konserwatywnej rodziny białek opiekuńczo-podobnych, które są wysoce eksprymowane w tkankach neuronalnych kręgowców. Spośród trzech synuklein tylko aSyn jest silnie związany z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona, demencja z ciałami Lewy'ego i zanik wieloukładowy. Badając normalną funkcję aSyn, dane wskazują, że aSyn stymuluje aktywność podjednostki katalitycznej enzymu defosforylującego o obfitej ekspresji, PP2Ac in vitro i in vivo. Wcześniejsze dane pokazują, że agregacja aSyn w ludzkim mózgu zmniejsza aktywność PP2Ac w regionach z patologią ciał Lewy'ego, w których rozpuszczalny aSyn stał się nierozpuszczalny. Ponieważ jednak wszystkie trzy synukleiny mają znaczną homologię w sekwencjach aminokwasów, eksperymenty zaprojektowano w celu sprawdzenia, czy wszystkie mogą modulować aktywność PP2Ac. Stosując rekombinowane synukleiny i rekombinowane białko PP2Ac, aktywność oceniano za pomocą testu kolorymetrycznego zieleni malachitowej. Dane ujawniły, że wszystkie trzy rekombinowane synukleiny stymulowały aktywność PP2Ac w testach bezkomórkowych, zwiększając prawdopodobieństwo, że zachowana homologia między synukleinami może obdarzyć wszystkie trzy homologi zdolnością wiązania się i aktywacji PP2Ac. Dane dotyczące koimmunoprecypitacji sugerują jednak, że modulacja PP2Ac prawdopodobnie zachodzi poprzez endogenne interakcje między aSyn i PP2Ac in vivo.

Funkcję i aktywność białek mogą zmieniać modyfikacje potranslacyjne, takie jak fosforylacja. Wiele białek może zostać ufosforylowanych przez kinazę lub defosforylowanych przez fosfatazę. W przypadku fosfatazy białkowej 2A (PP2A), ta wielopodjednostkowa fosfataza ułatwia defosforylację reszt seryny i treoniny w szerokim spektrum fosfoprotein. Nieprawidłowa aktywność PP2A może prowadzić do dysregulacji funkcji białek, co występuje w wielu chorobach, w tym w chorobie Parkinsona, w której aSyn może ulec hiperfosforylacji, oraz w chorobie Alzheimera, w której białko tau może ulec hiperfosforylacji. Stanowiło to uzasadnienie dla optymalizacji wewnętrznej procedury służącej do szybkiej oceny aktywności PP2Ac oraz określenia, czy nieprawidłowa aktywność PP2Ac może prowadzić do dysfunkcji komórkowych.
Z wykorzystaniem tego bezkomórkowego testu kolorymetrycznego zmierzono aktywność PP2Ac poprzez ilościowe określenie ilości wolnego PO4 odszczepionego z substratu pT (Rysunek 1A) i porównano ją z znanymi pikomolowymi ilościami PO4 na krzywej wzorcowej (Rysunek 1B). Aktywność PP2Ac mierzono również w odpowiedzi na stężenia 0,0, 0,1, 0,5, 1,0 oraz 2,0 µM synuklein (Rysunek 1A) w porównaniu do bazowej aktywności PP2Ac w przypadku braku dodanej synukleiny (przy dużej strzałce na Rysunku 1A).
<img alt="Mikropłytka ELISA i wykres przedstawiający poziomy fosforylacji synukleiny oraz analizę danych absorbancji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Aktywacja PP2A przez rekombinowane synukleiny, mierzona w stosunku do znanych poziomów fosforanów w standardach. W (A) aSyn, bSyn i gSyn oceniano w zakresie stężeń białka od 0 - 2 µM, aby porównać je ze standardami 0 - 2400 pmol PO4 . (B) Wygenerowano krzywą wzorcową dla testu PP2Ac z użyciem zieleni malachitowej, aby zapewnić znane ilości fosforanów, w odniesieniu do których można obliczyć wartości uzyskane w warunkach eksperymentalnych. W każdym przypadku wraz ze wzrostem aktywności PP2Ac zwiększa się ilość wolnego PO4 odszczepionego od substratu pT, co powoduje powstanie ciemniejszego zielonego koloru. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wyniki pokazują, że dodanie synuklein do PP2Ac w początkowym etapie inkubacji może zwiększyć ilość zmierzonego wolnego PO4 , co świadczy o zwiększonej aktywności PP2Ac. Analiza statystyczna po wielu powtórzeniach wykazuje, że wszystkie trzy rekombinowane synukleiny (aSyn, bSyn, gSyn) istotnie zwiększają aktywność PP2Ac (Rycina 2). Wyniki te sugerują, że zmiany w ilości rozpuszczalnych komórkowych synuklein mogą zmieniać aktywność PP2Ac, a tym samym wpływać na homeostazę komórkową. Nie wiadomo jednak, czy wszystkie trzy synukleiny przyczyniają się do aktywacji PP2Ac in vivo, choć dane na Rycynie 3 sugerują, że aSyn prawdopodobnie wpływa na aktywność PP2Ac in vivo.
<img alt="Wykres słupkowy aktywności PP2A; stężenie synukleiny; analiza statystyczna; wyniki interakcji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Aktywność PP2Ac jest stymulowana przez wszystkie trzy synukleiny. Przedstawiono graficzną reprezentację aktywacji PP2Ac w odpowiedzi na różne stężenia rekombinowanej aSyn, bSyn lub gSyn. Wszystkie trzy rekombinowane synukleiny stymulowały aktywność PP2Ac. W większości eksperymentów aSyn wydawała się być nieco silniejsza, choć wyniki analiz ANOVA przeprowadzonych przy użyciu oprogramowania statystycznego były w ogólnym rozrachunku bardzo zbliżone. Dane przedstawiają średnią ± SEM z 4-9 niezależnych eksperymentów. ns, brak istotności; * p &lt;0.05; ** p &lt;0.01; **** p &lt;0.0001. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby ocenić, która z synuklein może oddziaływać z PP2Ac w mózgu, przeprowadzono testy koimmunoprecypitacji (Co-IP) z wykorzystaniem mózgu myszy typu dzikiego oraz przeciwciała specyficznego dla PP2Ac, 1D6. Następnie białka rozdzielono za pomocą SDS-PAGE, a na membranach wykonano detekcję PP2Ac, aSyn, bSyn i gSyn przy użyciu ustalonych metod19. Kontrole z rekombinowanymi synukleinami potwierdzają specyficzność przeciwciał przeciwko aSyn, bSyn i gSyn (Rysunek 3A). Dane z Co-IP wykazują, że główną synukleiną powiązaną z PP2Ac w mózgu była aSyn, ponieważ w Co-IP wytrąciło się znacznie mniej bSyn (Rysunek 3B), a gSyn nie wytrąciła się w ogóle (dane nie pokazano). Sugeruje to odrębną rolę endogennej aSyn w regulacji PP2Ac w mózgu. Podnosi to również możliwość, że modulacja PP2Ac za pomocą terapii opartych na bSyn mogłaby potencjalnie przywrócić aktywność PP2A u osób z synukleinopatią, ponieważ wiadomo, że bSyn nie jest amyloidogenna, a jak pokazano tutaj, może stymulować PP2Ac30,31.
<img alt="Analiza Western blot wykazująca próbki białek (raSyn, rbSyn, rgSyn) w badaniu interakcji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Interakcja PP2Ac z endogennymi synukleinami w mózgu myszy. (A) Rekombinowane aSyn, bSyn i gSyn przebadano za pomocą przeciwciał specyficznych dla synukleiny, zgodnie z poniższym opisem. (B) Wykorzystując homogenat mózgu myszy, przeprowadzono Co-IP z użyciem przeciwciała 1D6, a następnie próbki przeanalizowano metodą immunoblottingu. Dane przedstawiono dla PP2Ac, aSyn i bSyn, ale nie dla gSyn, która nie uległa Ko-IP z PP2Ac. Próbki startowe pokazują względne poziomy PP2Ac (ścieżka 1), aSyn (ścieżka 4) i bSyn (ścieżka 7) w homogenatach początkowych. Próbki końcowe pokazują pozostałe poziomy PP2Ac (ścieżka 2), aSyn (ścieżka 5) i bSyn (ścieżka 8) w homogenatach po przeprowadzeniu Co-IP PP2Ac z użyciem 1D6. Znaczące poziomy PP2Ac zostały immunoprecypitowane za pomocą przeciwciała 1D6 (ścieżka 3), które spowodowało również wytrącenie znacznych ilości aSyn (ścieżka 6, przy strzałce), ale bardzo niewielkiej ilości bSyn (ścieżka 9, silnie przeeksponowana w celu pokazania słabego sygnału bSyn, przy strzałce). *Gwiazdki i nawiasy oznaczają sygnały nieswoiste na blotach. Szczegóły dotyczące użytych przeciwciał znajdują się w Tabeli Materiałów. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ta publikacja przedstawia protokół pokazujący, jak mierzyć aktywność rekombinowanej podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A (PP2Ac) w odpowiedzi na rekombinowane białka α-synukleiny, β-synukleiny lub γ-synukleiny za pomocą prostego testu kolorymetrycznego. Pokazujemy wyniki dotyczące swoistości α-synukleiny wobec PP2Ac w mózgu myszy.

Rekombinowane α-β- i γ-synukleiny stymulują aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w testach bezkomórkowych

&#945;-Synuclein (aSyn), &#946;-Synuclein (bSyn), and &#947;-Synuclein (gSyn) are members of a conserved family of chaperone-like proteins that are highly ...

Rekombinowane synukleiny alfa, beta i gamma stymulują aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w testach bezkomórkowych. Witam, nazywam się Sovanarak Lek. Jestem studentem medycyny w Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L. Foster School of Medicine.W tym filmie zaprezentuję kolorymetryczny test aktywności fosfatazy białkowej z wykorzystaniem rekombinowanych białek synukleiny. Przygotowanie buforów i odczynników. Przygotowanie buforu z fosforanem p-nitrofenolu.Aby przygotować 50 ml buforu pNPP, rozpuścić Trizma base w 25 ml ultraczystej wody dejonizowanej w zlewce. Dodać czysty mieszadło magnetyczne i umieścić na mieszadle magnetycznym. Po rozpuszczeniu Trizma, przy ciągłym mieszaniu, dodać chlorek wapnia.Dostosować pH do wartości 7.0. Przenieść roztwór do cylindra miarowego. Uzupełnić końcową objętość całkowitą do 50 mils wodą dejonizowaną ultrazczystą.Przygotowanie roztworu zieleni malachitowej. Roztwór zieleni malachitowej wymaga trzech komponentów: części A, B i C. Roztwór A to czteromolowy kwas solny. Roztwór B to połączenie molibdanu amonu oraz roztworu A. Roztwór C to 0,045% szczawian zieleni malachitowej.Aby przygotować roztwór D, wymieszać jedną część B z trzema częściami C w stosunku 1:3. Mieszać przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec przefiltrować roztwór D przez membranę 22 µm i przechowywać w temperaturze 4 °C.Chronić przed światłem. Przygotowanie aktywatora. Aktywator jest roztworem Tween 20 o stężeniu 1%.Odmierz pipetą 10 µL Tween 20 do 990 µL ultraczystej wody dejonizowanej. Mieszaj w wortexie do całkowitego rozpuszczenia Tween 20. Przygotowanie roztworu roboczego zieleni malachitowej z Tween 20.Dodać aktywator do roztworu D w stosunku 1:100. Przygotowanie fosfopeptydu treoniny. Aby przygotować roztwór stokowy pT o stężeniu 2 mM, dodać 550 µL ultrapure deionized water do 1 mg pT.Mieszać w vortexie do całkowitego rozpuszczenia fosfopeptydu. Umieścić na lodzie w celu natychmiastowego użycia. Nadmiarowe alikwoty pT przechowywać w temperaturze -20 °C.Przygotowanie synukleiny. Zawiesić jeden miligram synukleiny w mil ultrapurej wody dejonizowanej do uzyskania stężenia końcowego jeden miligram na mil. Delikatnie wymieszać w vortexie do rozpuszczenia.Należy użyć natychmiast, a niewykorzystane aliquoty przechowywać w temperaturze -80 °C. Przygotowywanie standardów fosforanowych. Krok pierwszy przygotowania standardów fosforanowych.Aby przygotować 1 mM roztwór zapasowy fosforanu, rozpuścić fosforan potasu w ultreczystej wodzie dejonizowanej w zlewce z mieszadłem magnetycznym. Przenieść roztwór do cylindra miarowego i uzupełnić objętość końcową do 100 mils. Jest to roztwór 10 mM.Przefiltruj cały roztwór przez filtr 22 µm, używając dużej strzykawki. Rozcieńcz go w stosunku 1:100, aby przygotować 1 mM roztwór fosforanów, który będzie służył jako wzorce do analizy. Krok drugi przygotowania wzorców fosforanów.Do probówek 1,5 ml należy dodać odpowiednią ilość fosforanu oraz ultraczystej wody dejonizowanej zgodnie z tabelą. Pozwoli to na przygotowanie probówek zawierających 150, 300, 600, 1 200 i 2 400 pmol fosforanu. Alikwoty należy przechowywać w temperaturze -20 °C.Test aktywności PP2A. Przygotować test PP2A w probówkach 1,5 ml na lodzie. Dodać 43 µL buforu pNPP.Dodaj 1 µL ludzkiej rekombinowanej PP2Ac. Dodaj synukleinę i inkubuj PP2A wraz z synukleiną przez 30 minut na mieszalniku typu Nutator w temperaturze 4 °C. Następnie dodaj 16 µL 2mM pT.Inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C w kąpieli wodnej. Na płytkę 96-dołkową z płaskim dnem nanieść po 25 µL każdego standardu fosforanowego w dwóch powtórzeniach, od najniższego do najwyższego stężenia. Pipetować po 24 µL każdego testu PP2A w dwóch powtórzeniach na tę samą płytkę 96-dołkową ze standardami.Do każdej próbki i wzorca pipetuj 75 µL roztworu D zawierającego Tween 20. Po dodaniu MGT w dołkach, w których obecne są wolne fosforany, nastąpi zmiana barwy. Analiza fotometryczna.Analizę należy przeprowadzić za pomocą spektrofotometru ustawionego na 630 nanometrów. Wyniki reprezentatywne. Przedstawiono tutaj reprezentatywny test PP2A oraz wykres obrazujący krzywą wzorcową.Po lewej stronie znajdują się standardy fosforanowe. Im więcej fosforanu znajduje się w dołkach, tym ciemniejszy jest odcień zieleni. Po prawej stronie mamy PP2A inkubowaną z alfa, beta lub gamma synukleinami w różnych stężeniach molowych.Wyższe stężenia były skuteczniejsze w stymulowaniu aktywności podjednostki katalitycznej PP2A. Tutaj widzimy reprezentację graficzną aktywności PP2A w odpowiedzi na zmienne stężenia alfa-synukleiny, beta-synukleiny i gamma-synukleiny. Alfa-synukleina, beta-synukleina i gamma-synukleina były istotnymi stymulatorami aktywności PP2A przy stężeniu od 1 do 2 µM.Jedynie alfa-synukleina i beta-synukleina były istotnymi stymulatorami aktywności PP2A przy stężeniu 0,5 micromolar. Rysunek trzy przedstawia oddziaływanie PP2Ac z endogennymi synukleinami w mózgu myszy. W części A rekombinowane alfa-, beta- i gamma-synukleiny służą jako kontrole dodatnie.W części B przeprowadzono koimmunoprecypitację z użyciem przeciwciała 1D6 specyficznego dla PP2Ac, które wyizolowało PP2Ac oraz znaczną ilość oddziałującej alfa-synukleiny, lecz prawie żadnej beta-synukleiny. W koimmunoprecypitacji z PP2Ac nie wyizolowano gamma-synukleiny. Dane z tej koimmunoprecypitacji sugerują, że alfa-synukleina jest endogennym modulatorem PP2Ac in vivo.Chcielibyśmy podziękować wszystkim, którzy pomogli nam w przygotowaniu tego filmu. Podsumowując, są to Ruth Perez i Sonavarak Lek.Javier Vargas. Życzę wielkich sukcesów. Do widzenia i powodzenia.

recombinant-synucleins-stimulate-protein-phosphatase-2a-catalytic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji...

Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi białkami, które kodują zarówno domeny GTPazy, jak i kinazy, i które są fosforylowane w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół znakowania LRRK1 i LRRK2 w komórkach za pomocą ortofosforanu 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób na pomiar ich ogólnego poziomu fosforylacji komórkowej.

Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

Tutaj prezentujemy protokół izolacji coraz bardziej nierozpuszczalnej/zagregowanej alfa-synukleiny (α-syn) z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Dzięki zastosowaniu o zwiększonej mocy detergentu i technikom ultrawirowania z dużą prędkością, można badać zmienne właściwości agregacji α-syn w tkankach chorych i niechorych.

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Mutacje w genie bogatej w leucynę kinazy powtórzeniowej 2 (LRRK2) powodują dziedziczną chorobę Parkinsona. Opracowaliśmy łatwą i solidną metodę oceny kontrolowanej przez LRRK2 fosforylacji Rab10 w ludzkich neutrofilach krwi obwodowej. Może to pomóc w identyfikacji osób ze zwiększoną aktywnością szlaku kinazy LRRK2.

Izolacja neutrofili ludzkiej krwi obwodowej w celu zbadania szlaku kinazy LRRK2 związanego z chorobą Parkinsona poprzez ocenę fosforylacji Rab10

Ten protokół ma na celu efektywne ilościowe określanie aktywności systemu ubikwityna-proteasom (UPS) w różnych przedziałach komórkowych mózgu gryzoni. Użytkownicy mogą badać działanie UPS we frakcjach jądrowych, cytoplazmatycznych i synaptycznych u tego samego zwierzęcia, co skraca czas i liczbę zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia tych złożonych analiz.

Kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Leishmania Translational Extract (LTE) to eukariotyczny system ekspresji białek bez komórek, pochodzący od jednokomórkowego pasożyta, Leishmania tarentolae. Ten zoptymalizowany protokół sprawia, że produkcja LTE jest prosta i opłacalna. Nadaje się do różnych zastosowań skoncentrowanych na wielorównoległej ekspresji i badaniu złożonych białek eukariotycznych i ich interakcji.

Produkcja i optymalizacja LTE, bezkomórkowego systemu ekspresji białek pochodzących z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Poznaj metodę pomiaru aktywności podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w obecności rekombinowanych synuklein α, β i γ przy użyciu testu kolorymetrycznego. Protokół pozwala badać interakcje białkowe w mózgu myszy.

Rekombinowane α-β- i γ-synukleiny stymulują aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w testach bezkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal

Rekombinowane α-β- i γ-synukleiny stymulują aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w testach bezkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów