Name: Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj szybką izolację magnetyczną CD11b mikrogleju z mózgu myszy po porodzie. Ta metoda zapewnia wysoką czystość i wydajność w około 30 minut, umożliwiając wszechstronne badania biologii mikrogleju in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health (NIH): NS088206 i ES026892. Podziękowania należą się również W. Eugene'owi i Lindzie Lloyd za Katedrę Ufundowaną przez AGK oraz Dziekanat za Profesorstwo Dziekanów AK.

Wykorzystanie zwierząt i procedury protokolarne zostały zatwierdzone i nadzorowane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Iowa (Ames, IA, USA)
1. Uprawa mieszanych kultur glejowych
<ol>
	<li>Szybko odetnij głowę 1-2 jednodniowym szczeniętom za pomocą 5,5-calowych nożyczek operacyjnych i natychmiast umieść głowy w probówce o pojemności 50 ml na lodzie. Zauważmy, że ta dekapitacja jest sposobem eutanazji.</li>
	<li>W kapturze z laminarnym przepływem powietrza wykonaj małe nacięcie w czaszce i oponach mózgowych za pomocą 4.5-calowych prostych nożyczek do mikropreparowania. Rozpocznij cięcie od końca ogonowego do końca rostralnego (nosa). Dostań się pod skórę, korzystając z otworu utworzonego przez dekapitację.
	<ol>
		<li>Po nacięciu oderwij jedną z półkul na bok. Następnie użyj pęsety zakrzywionej lub haczykowatej, aby usunąć cały mózg.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz mózg (mózgi) w nowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 0,25% kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctan (EDTA) na 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Użyj 2 ml trypsyny-EDTA na mózg.</li>
	<li>Umyj mózg (mózgi) świeżymi pożywkami wzrostowymi (10% FBS, DMEM/F12, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 1% pirogronianu sodu i 1% aminokwasów endogennych), dodając i usuwając pożywkę. Powtórz to 4 razy.</li>
	<li>Dla każdego mózgu umieść na płytce dwie kolby T-75 zawierające pożywkę wzrostową. Dlatego dodaj do probówki 2 ml pożywki wzrostowej na mózg. Zatem będzie to odpowiednik 1 ml homogenizowanego mózgu z 8-9 ml pożywki wzrostowej na kolbę T-75.</li>
	<li>Homogenizuj poprzez rozcieranie mózgu (mózgów) pipetami o różnych rozmiarach apertury, w kolejności od największego do najmniejszego. Kiedy widać, że tkanka mózgowa nie zmniejsza się, przejdź do następnej pipety. Pod koniec rozcierania zawiesina powinna być przezroczysta, bez widocznych fragmentów.
	<ol>
		<li>Użyj kolejno pipety o pojemności 25 ml, pipety o pojemności 5 ml, a następnie pipety o pojemności 10 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepuść każdą jednorodną zawiesinę mózgu przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm, aby przekształcić ją w pojedynczą hodowlę komórkową.</li>
	<li>Dla każdego homogenizowanego mózgu należy umieścić na płytce dwie kolby T-75 zawierające pożywkę wzrostową, jak opisano w kroku 1.5 (1 ml homogenizowanego mózgu z 8-9 ml pożywki wzrostowej na kolbę T-75).</li>
	<li>Zmień pożywkę wzrostową po 6 dniach i rosnąć do izolacji 16 dnia.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek mikrogleju
<ol>
	<li>Po 16 dniach wyjąć pożywkę wzrostową z kolby i umieścić ją w świeżej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA do każdej kolby T-75. Potrząsać kolbami przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.
	<ol>
		<li>Odwirować usuniętą pożywkę wzrostową o masie 0,4 x g przez 5 minut i użyć do zatrzymania reakcji trypsyna-EDTA w następnym etapie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wytrząsaniu przez 5 minut, dodać co najmniej 4 ml pożywki wzrostowej (świeżej lub użytej pożywki z 2.1.1), aby zatrzymać reakcję trypsyna-EDTA.</li>
	<li>Wykonaj trituration, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały odłączone.</li>
	<li>Po roztarciu przepuść komórki przez sitko o wielkości 70 μm, aby przekształcić je w pojedynczą hodowlę komórkową, wykonaj zliczanie komórek, a następnie wiruj komórki w temperaturze 0,4 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Na każde 100 x 106 komórek (około 15 x kolby T-75) użyj 1 ml zalecanej pożywki (2% FBS, DPBS (bez chlorku wapnia i magnezu), 1 mM EDTA) do ponownego zawieszenia osadu komórkowego. 
	UWAGA: Wszystkie poniższe kroki są dostosowane do separacji 1 ml.</li>
	<li>Weź probówkę z polistyrenu o pojemności 5 ml, dodaj 1 ml zalecanej pożywki i zaznacz menisk. Dodaj zalecane podłoże o pojemności do 2,5 ml i również to oznacz. Wyrzuć zalecane podłoże i przenieś ponownie zawieszone komórki do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Dodać 50 μl surowicy szczurzej na każdy 1 ml zawieszonych komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj koktajl selekcyjny, mieszając 25 μl składnika A i 25 μl składnika B. Te komponenty są zastrzeżone.</li>
	<li>Dodaj 50 μl koktajlu selekcyjnego do komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: W przypadku czystszych kultur powtórz krok 2.9 (zalecany, ale nie obowiązkowy).</li>
	<li>Wiruj mikrosfery przez 45 s. Dodaj 80 μl mikrosfer na 1 ml próbki. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Doprowadzić objętość do 2,5 ml w probówce polistyrenowej, dodając zalecane podłoże.</li>
	<li>Umieść rurkę w magnesie na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Dostosuj inkubację, aby zwiększyć czystość. Powoli wylej zalecane podłoże do probówki o pojemności 15 ml z magnesem nadal w probówce z polistyrenu.</li>
	<li>Powtórz krok 2.12 jeszcze trzy razy. W celu zwiększenia czystości można przeprowadzić dodatkowe inkubacje magnetyczne.</li>
	<li>Dodaj 3 ml pożywki wzrostowej i policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.</li>
	<li>Komórki płytkowe odpowiednio w płytkach pokrytych poli-D-lizyną (PDL) do zabiegów. Traktować komórki 48 godzin po wysianiu płytek pokrytych inPDL. Dzięki temu komórki mogą zregenerować się po stresie związanym z separacją. 
	UWAGA: Sprawdź czystość kultury za pomocą immunocytochemii, jak opisano wcześniej15.</li>
	<li>Frakcję ujemną (zebraną w probówce o pojemności 15 ml), która zawiera głównie astrocyty, należy umieścić w kolbach T-75 w pożywce wzrostowej.</li>
	<li>Po co najmniej 6 godzinach inkubacji w inkubatorze o temperaturze 37 °C należy zmienić pożywkę i pozwolić jej wyrosnąć O/N. Następnego dnia należy podzielić astrocyty na potrzeby zabiegów.</li>
</ol>

<ol><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age%3A+from+origin+to+neuropsychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).</li>
<li>Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derive+from+progenitors%2C+originating+from+the+yolk+sac%2C+and+which+proliferate+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain.</a> Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).</li>
<li>Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).</li>
<li>Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+new+roles+for+the+synaptic+stripper%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia: new roles for the synaptic stripper.</a> Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).</li>
<li>Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+is+genetically+implicated+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 302, 89-102 (2015).</li>
<li>Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+p38alpha+MAPK+is+critical+for+LPS-induced+neuron+degeneration%2C+through+a+mechanism+involving+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha.</a> Mol Neurodegener. 6, 84(2011).</li>
<li>Panicker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fyn+Kinase+Regulates+Microglial+Neuroinflammatory+Responses+in+Cell+Culture+and+Animal+Models+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease.</a> J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).</li>
<li>Moehle, M. S., West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+and+M2+immune+activation+in+Parkinson%27s+Disease%3A+Foe+and+ally%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally?</a> Neuroscience. 302, 59-73 (2015).</li>
<li>Saijo, K., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+origin+and+phenotypes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial cell origin and phenotypes in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Floden, A. M., Combs, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+repetitively+isolated+from+in+vitro+mixed+glial+cultures+retain+their+initial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype.</a> J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).</li>
<li>Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+isolation+of+murine+microglia+by+mild+trypsinization%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization.</a> Glia. 44 (3), 183-189 (2003).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+CNS+myeloid+cells+and+their+roles+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration.</a> Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).</li>
<li>Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+cell+sorting%3A+a+fast+and+effective+method+of+concurrent+isolation+of+high+purity+viable+astrocytes+and+microglia+from+neonatal+mouse+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).</li>
<li>Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+receptor+signaling+in+the+brain+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenosine receptor signaling in the brain immune system.</a> Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).</li>
<li>Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+thrombin+receptor+modulates+inflammation+and+astrogliosis+to+improve+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury.</a> Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).</li>
<li>Ay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+epigenetic+regulation%2C+and+functional+characterization+of+Prkd1+gene+promoter+in+dopaminergic+cell+culture+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+Cdelta+upregulation+in+microglia+drives+neuroinflammatory+responses+and+dopaminergic+neurodegeneration+in+experimental+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Starsze metody izolacji mikrogleju mają ograniczone poziomy odzysku, które nie są odpowiednie dla różnych analiz białek metodą Western blot i analiz RNA metodą qRT-PCR. Zróżnicowane przyleganie i łagodne metody trypsynizacji to dwa powszechne podejścia o niskiej wydajności mikrogleju 13,14,15. Podejście oparte na kolumnach CD11b również ma niski odzysk, ale osiąga większą czystość niż zróżnicowane przyleganie i łagodna trypsyna ...

Microglej to niezależne od Myb makrofagi pochodzenia mezodermalnego, które odróżniają się od progenitorów erytromieloidalnych c-kit+/CD45- w wyspach krwi woreczka żółtkowego1,2. Gdy mikroglej embrionalny skolonizuje ośrodkowy układ nerwowy (OUN), przechodzi z formy ameboidalnej do rozgałęzionej 3. Te dorosłe mikroglej są klasyfikowane jako inwigilowane, ponieważ ich dynamiczne rozgałęzienia badają zdrowy miąższ mózgu pod kątem potencjalnych zniewag4. Chociaż mikroglej przyczynia się tylko do około 10% populacji komórek OUN, ich zdolność do układania się między sobą zapewnia maksymalne skanowanie miąższu 4,5. Wzorce molekularne związane z niebezpieczeństwem (DAMP), takie jak α-synukleina6,7 i amyloid-β8, lub wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), takie jak lipopolisacharyd (LPS)9, klasycznie aktywują mikroglej w celu promowania odpowiedzi zapalnej charakteryzującej się powrotem do ameboidalnego stanu aktywnego i wytwarzaniem tlenku azotu, czynnika martwicy nowotworu-α (TNFα), interleukina 1β (IL-1β), IL-6, IL-12 i ligand motywu chemokiny C-C 29,10,11. W stanach neurozapalnych, takich jak choroba Parkinsona, w których nagromadziła się patogenna α-synukleina, cykl neurodegeneracyjny powstaje w wyniku śmierci neuronów dopaminergicznych, które uwalniają więcej zagregowanej α-synukleiny, co dodatkowo sprzyja klasycznej aktywacji mikrogleju7. Podobnie jak makrofagi obwodowe, mikroglej może również mieć zdolność do alternatywnej aktywacji w obecności cytokin przeciwzapalnych IL-4 i IL-10, co daje im potencjał do wspomagania naprawy neuronów i łagodzenia stanu zapalnego2,11. Oprócz ich ról immunologicznych w OUN, mikroglej został opisany jako ważny regulator obwodów neuronalnych poprzez przycinanie synaps podczas rozwoju. Na przykład myszy Cx3cr1-KO mają mniej gęsty mikroglej i zmniejszone przycinanie synaptyczne, co prowadzi do nadmiaru kolców dendrytycznych, niedojrzałych synaps i wzorców elektrofizjologicznych słabo rozwiniętej klasy CNS12. Zrozumienie tych fizjologicznych zawiłości i różnorodnych funkcjonalnych ról mikrogleju w homeostazie OUN ma kluczowe znaczenie dla poszukiwania terapii ukierunkowanych na zaburzenia neurodegeneracyjne.
W dziedzinie neuroimmunologii, eksperymenty in vitro są wysoce pożądane ze względu na większą wykonalność badań mechanistycznych, niższe koszty utrzymania oraz mniejszą czaso- i pracochłonność. Co więcej, zdolność do izolowania populacji komórek ma kluczowe znaczenie dla określenia funkcjonalności tych komórek docelowych w określonych warunkach. Istnieje wiele metod izolacji mikrogleju, ale są one ograniczone przez ich zdolność do uzyskiwania stosunkowo dużej liczby i czystości do szerokich eksperymentów13,14,15. Na przykład klaster różnicowania 11b (CD11b) jest wspólnym markerem powierzchniowym monocytów, makrofagów i mikrogleju16. Wykorzystując CD11b, metoda separacji magnetycznej została po raz pierwszy opisana jako podejście oparte na kolumnach, które dało ~99,5% czystości i ~1,6 x 106 mikrogleju na mózg noworodka<klasa sup="xref">17. Nasze laboratorium niedawno opracowało metodę separacji magnetycznej CD11b bez kolumny15, którą przeprowadziliśmy w probówce polistyrenowej, oznaczając CD11b przeciwciałem monoklonalnym sprzężonym z fikoerytryną (PE). Bispecyficzne przeciwciało drugorzędowe przeciwko kompleksom PE i dekstranu z PE. Po związaniu wprowadzane są cząstki magnetyczne pokryte dekstranem, które wiążą się z końcem dekstranowym kompleksu przeciwciał. Na koniec rurkę polistyrenową umieszcza się w magnesie w celu izolacji mikrogleju. Podejście to podwoiło wydajność do ~3,2 x 106 mikrogleju na mózg noworodka, ale kosztem zmniejszenia czystości do ~97%.
Tutaj demonstrujemy szybki i wyrafinowany protokół separacji magnetycznej CD11b bez kolumn (Rysunek 1). Ta ulepszona metoda pozostaje tak samo wykonalna, jak nasza oryginalna metoda bez kolumny, ponieważ cena zestawu do separacji magnetycznej CD11b jest taka sama. Czas ukończenia skraca się o połowę, co może mieć kluczowe znaczenie dla maksymalizacji przeżywalności i wydajności komórek. Warto zauważyć, że czystość osiągnięta dzięki tej zoptymalizowanej metodzie wynosi ~>99%, co stanowi wyraźną poprawę w stosunku do czystości osiągniętej przy użyciu oryginalnej metody bez kolumn opracowanej przez nasze laboratorium15. Co najważniejsze, CD11b-PE nie jest wykorzystywany, co eliminuje potrzebę inkubacji z dala od światła i umożliwia wykorzystanie kanału czerwonego do mikroskopii fluorescencyjnej. Wreszcie, podobnie jak w oryginalnej metodzie CD11b, za pomocą tej ulepszonej metody uzyskuje się frakcję astrocytową o wysokiej wydajności i czystości. Astrocyty są najliczniejszymi komórkami glejowymi w OUN, co prowadzi do wniosku, że ich funkcje homeostatyczne są niezbędne w odniesieniu do patofizjologii18. Te komórki glejowe odgrywają rolę w różnych funkcjach fizjologicznych, takich jak tworzenie bariery krew-mózg, dostarczanie składników odżywczych, utrzymywanie homeostazy neuroprzekaźników, tworzenie blizn glejowych w odpowiedzi na uraz, neuroprotekcja, uczenie się i pamięć oraz zapalenie nerwów, co ilustruje ich potencjał badawczy w biologii gleju19. Morfologię i funkcjonalność mikrogleju i astrocytów ustalono za pomocą mikroskopii konfokalnej, Western blot, ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), testu azotynów Griessa i testu cytokin Luminex multiplex. Udoskonalenie zapewnione przez ten protokół daje większą pewność co do czystości mikrogleju lub astrocytów, szersze zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej z dostępnością kanału czerwonego oraz oszczędność czasu, co jest ważne dla eksperymentów in vitro.

<table><tbody><tr><td>Zestaw separacyjny EasySep CD11b II</td><td>StemCell Technologies</td><td>18970</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>13H469</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (DPBS)</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna cd11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Mikroglej jest główną reakcją na uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego; jednak wiele pozostaje niewiadomych na temat ich roli w regulacji zapalenia nerwów. Mikroglej to komórki mezodermalne, które działają podobnie do makrofagów w badaniu stresu zapalnego. Klasyczna (typ M1) i alternatywna (typ M2) aktywacja makrofagów została również rozszerzona na mikroglej w celu lepszego zrozumienia podstawowej interakcji tych fenotypów w stanach neurozapalnych, takich jak choroba Parkinsona, Alzheimera i Huntingtona. Eksperymenty in vitro z wykorzystaniem pierwotnego mikrogleju oferują szybkie i wiarygodne wyniki, które można rozszerzyć na środowisko in vivo. Chociaż jest to wyraźna przewaga nad eksperymentami in vivo, wyizolowanie mikrogleju przy jednoczesnym osiągnięciu odpowiednich plonów o optymalnej czystości było wyzwaniem. Powszechnie stosowane obecnie metody mają albo niski odzysk, albo niską czystość, albo jedno i drugie. W niniejszym artykule demonstrujemy udoskonalenie metody separacji magnetycznej CD11b bez kolumn, która zapewnia wysoki odzysk komórek i zwiększoną czystość w o połowę krótszym czasie. Proponujemy tę zoptymalizowaną metodę jako wysoce użyteczny model pierwotnej izolacji mikrogleju w celu badania zapalenia nerwów i neurodegeneracji.

Mikrogleja wyizolowana przy użyciu zestawu CD11b Positive Selection kit II charakteryzuje się wysoką czystością
Pierwotne mikrogleje mysie wyizolowano zgodnie z wyżej wspomnianym protokołem i wysiano na szkiełka podstawowe pokryte poli-D-lizyną w celu sprawdzenia czystości izolacji. W każdej studzience wysiano dziesięć tysięcy komórek, a następnie przeprowadzono analizę immunocytochemiczną, wykorzystując cząsteczkę adaptorową wiążą...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Ogólnym celem magnetycznej izolacji mikrogleju CD11b jest uzyskanie wysokiej czystości końcowej wydajności postnatalnego mikrogleju w stosunkowo krótkim czasie na potrzeby wszechstronnych eksperymentów in vitro. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak mechanizmy sygnalizacyjne istotne dla zapalenia układu nerwowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z obecnie dostępnymi metodami jest to, że izolacja trwa około 30 minut, bez utraty czystości, wydajności lub żywotności komórek.Należy rozpocząć od przeniesienia świeżo odciętych głów jednodniowych lub dwudniowych myszy do komory z laminarnym przepływem powietrza. Następnie, używając prostych nożyczek mikrochirurgicznych o długości 4,5 cala, należy wykonać małe nacięcie czaszki i opon mózgowych, wprowadzając końcówki nożyczek w otwór powstały po odcięciu głowy i tnąc w kierunku od strony ogonowej do rostralnej. Po wykonaniu nacięcia jedną z półkul należy odsunąć na bok.Następnie za pomocą zakrzywionej lub haczykowatej pęsety usuń cały mózg. Przenieś mózg do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 2 ml 0,25% trypsyny z EDTA i inkubuj przez 15 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Przemyj mózg świeżą pożywką wzrostową, dodając i usuwając pożywkę.Po zakończeniu płukania należy dodać dwa mililitry pożywki wzrostowej na jeden mózg, a następnie homogenizować tkankę poprzez triturację mózgu. Gdy tkanka mózgowa przestanie ulegać rozdrobnieniu, należy przejść do użycia pipety o mniejszej średnicy otworu. Po zakończeniu trituracji, gdy zawiesina stanie się klarowna i pozbawiona widocznych grudek, należy przefiltrować ją przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm w celu uzyskania hodowli pojedynczych komórek.Następnie pipetujemy od ośmiu do dziewięciu mililitrów pożywki hodowlanej do kolb T75, po dwie kolby na jeden mózg, i dodajemy jeden mililitr homogenizatu mózgu do każdej kolby. Hodujemy komórki aż do momentu izolacji w szesnastym dniu. Po szesnastu dniach przenosimy pożywkę z kolby do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Do każdej kolby T75 dodaj trzy mililitry 0,25% trypsyny EDTA. Następnie wstrząsaj kolby przez pięć minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Odwiruj pożywkę hodowlaną z prędkością 0,4 ×g przez pięć minut.Po pięciu minutach wstrząsania dodaj minimum 4 mL odwirowanej pożywki hodowlanej, aby zatrzymać reakcję trypsyny z EDTA, a następnie poddaj zawiesinę tryturacji, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały odlepione. Następnie przefiltruj komórki przez sito komórkowe o oczkach 70 µm, aby uzyskać kulturę pojedynczych komórek. Wykonaj przeliczenie komórek, a następnie odwiruj je z prędkością 0,4 ×g przez pięć minut.Następnie należy wziąć probówkę polistyrenową o pojemności pięciu mililitrów, dodać jeden mililitr zalecanego medium i zaznaczyć poziom menisku. Dodać zalecane medium do objętości 2,5 mililitra i również zaznaczyć ten menisk. Następnie usunąć medium i resuspender osad w 500 µL zalecanego medium.Przenieś tę mieszaninę do polistyrenowej probówki o pojemności pięciu mililitrów, a następnie dopełnij do poziomu jednego mililitra. Następnie dodaj 50 µL surowicy szczura na każdy 1 mL zawiesiny komórek i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji przygotuj koktajl selekcyjny, mieszając 25 µL składnika A i 25 µL składnika B. Po upływie pięciu minut dodaj 50 µL koktajlu selekcyjnego do komórek i inkubuj przez kolejne pięć minut w temperaturze pokojowej.Mieszaj mikrosfery na wortexie przez 45 sekund. Następnie dodaj 80 µL mikrosfer na jeden mililitr próbki i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj zalecane medium do poziomu 2,5 ml w probówce polistyrenowej.Umieść probówkę w uchwycie magnetycznym na trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po inkubacji powoli przelej medium do probówki polistyrenowej o pojemności 15 ml, wciąż znajdującej się w magnesie. Powtórz separację magnetyczną jeszcze trzy razy, za każdym razem dodając zalecane medium do poziomu 2,5 ml.Po ostatniej separacji magnetycznej dodać trzy mililitry pożywki wzrostowej i policzyć liczbę komórek za pomocą licznika komórek. Komórki wysiać na płytki pokryte poli-D-lizyną w celu przeprowadzenia zabiegów. Frakcję negatywną z probówki o objętości 15 ml, zawierającą głównie astrocyty, wysiać do kolb T75.Po co najmniej sześciu godzinach inkubacji w inkubatorze w temperaturze 37°C, należy wymienić całe pożywkę wzrostową w kolbach zawierających frakcję negatywną przed ponownym umieszczeniem ich w inkubatorze. Na tym obrazie przedstawiono immunocytochemię wyizolowanej kultury mikrogleju z użyciem przeciwciał przeciwko IBA, markerowi mikrogleju (kanał zielony), oraz GFAP, markerowi astrocytów (kanał czerwony). Barwienie Hoechstem ujawnia obecność jąder komórkowych.Brak komórek wykazujących pozytywną reakcję na GFAP dowodzi, że mikroglej wyizolowany przy użyciu zestawu do selekcji pozytywnej CD11b również charakteryzuje się wysoką czystością. Białka z hodowli wyizolowanego mikrogleju poddano analizie immunoblottingowej w celu wykrycia białka GFAP, które pojawia się jako prążek o masie około 51 kilodaltonów, oraz białka IBA1, które pojawia się jako prążek o masie około 15 kilodaltonów. Jako kontrola ładunku wykorzystano beta-aktynę, która pojawia się przy około 42 kilodaltonach.Problemem w przypadku starego zestawu do izolacji było to, że w kanale czerwonym można było zaobserwować fluorescencję PE, co widać tutaj. Zmodyfikowana procedura nie powoduje autofluorescencji kulek magnetycznych, co widać tutaj w kanale czerwonym. Mikroglej wyizolowany przy użyciu tej procedury może być wykorzystany do badań nad sygnalizacją.Analiza Western blot wykazuje, że białka Fyn oraz fosfo-src tyrozyna Y416 mogą być wykrywane w mikrogleju wyizolowanym za pomocą naszej nowo udoskonalonej metody. Frakcja negatywna z separacji mikrogleju zawiera astrocyty, które mogą być wykorzystane do badań nad sygnalizacją. Analiza Western blot wykazuje, że frakcja negatywna zawiera komórki GFAP-dodatnie.Analiza Western blot wykazuje, że białka Fyn oraz fosfo-src tyrozyna Y416 mogą zostać wykryte w komórkach GFAP-dodatnich. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak wielokanałowa mikroskopia fluorescencyjna, Western blotting oraz ilościowy PCR, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące ekspresji genów i sygnalizacji białkowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania tej szybkiej techniki izolacji do celów eksperymentów na mikrogleju.

rapid-refined-cd11b-magnetic-isolation-primary-microglia-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie opisujemy protokół izolacji komórek CD11b, w tym mikrogleju, z mózgów młodych myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie. Tkanki mózgowe są homogenizowane w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, które są inkubowane z mikrokulkami pokrytymi przeciwciałem anty-CD11b, a następnie rozdzielane na podstawie kolumny magnetycznej w celu oczyszczenia populacji komórek CD11b +.

Izolacja magnetyczna mikrogleju z mózgów młodych myszy

Ten film demonstruje protokół ekstrakcji komórek mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgach myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek. Protokół obejmuje preparację uszkodzonej tkanki mózgowej zawierającej komórki mikrogleju, potraktowanie tkanki określonymi enzymami w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki oraz wykorzystanie kulek magnetycznych specyficznych dla receptora mikrogleju do wyizolowania komórek mikrogleju.

Izolowanie mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgu myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Film demonstrował metodę izolowania i hodowli komórek z mózgu noworodka myszy. Polegało to na enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji mózgu, a następnie hodowli w pożywkach wzrostowych pozbawionych neuronalnego czynnika wzrostu w celu uzyskania mieszanej populacji glejowej.

Uzyskiwanie mieszanej hodowli komórek glejowych z mózgu noworodka myszy

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Wysiłki zmierzające do szczegółowego zrozumienia funkcji mikrogleju zostały utrudnione przez brak modeli hodowli mikrogleju, które podsumowują właściwości dojrzałego mikrogleju in vivo. Protokół ten opisuje podejście oparte na izolacji i hodowli, mające na celu utrzymanie solidnego przetrwania wysoce rozgałęzionego dojrzałego mikrogleju szczurów w warunkach o zdefiniowanej pożywce.

Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

Poznaj szybką izolację magnetyczną CD11b mikrogleju z mózgu myszy po porodzie. Ta metoda zapewnia wysoką czystość i wydajność w około 30 minut, umożliwiając wszechstronne badania biologii mikrogleju in vitro.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Przeglądaj więcej filmów