Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Ogólnym celem izolacji mikrogleju magnetycznego CD11b jest osiągnięcie wysokiej czystości końcowej wydajności mikrogleju postnatalnej w stosunkowo krótkim czasie do celów wszechstronnych eksperymentów in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak mechanizmy sygnalizacyjne związane z zapaleniem neuronów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z obecnie dostępnymi metodami jest to, że izolacja trwa około 30 minut, bez poświęceń w czystości, wydajności lub żywotności.

Zacznij od przeniesienia świeżo ściętych głów od jedno- lub dwudniowych szczeniąt myszy do kaptura z laminarnym przepływem powietrza. Następnie użyj 4,5-calowych prostych nożyczek do mikropreparowania, aby wykonać małe nacięcie w czaszce i oponach mózgowych, wkładając końcówki w otwór utworzony przez dekapitację i przecinając ogon do rostralu. Po wykonaniu nacięcia obierz jedną z półkul na bok.

Następnie użyj pęsety zakrzywionej lub haczykowatej, aby usunąć cały mózg. Przenieś mózg do 50-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry 0,25% trypsyny EDTA i inkubuj przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj mózg świeżą pożywką wzrostową, dodając i usuwając pożywkę.

Po zakończeniu płukania dodaj dwa mililitry pożywki wzrostowej na mózg i homogenizuj przez rozcieranie mózgu. Gdy tkanka mózgowa nie zmniejszy się, przejdź na pipetę o mniejszym otworze. Pod koniec rozcierania, gdy zawiesina jest klarowna bez widocznych kawałków, przepuść zawiesinę przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów, aby utworzyć pojedynczą hodowlę komórkową.

Następnie odpipetować od ośmiu do dziewięciu mililitrów pożywki wzrostowej do kolb T75, po dwie kolby na mózg, i dodać mililitr homogenatu mózgowego do każdej kolby. Hoduj komórki aż do izolacji szesnastego dnia. Po szesnastu dniach przenieś pożywkę wzrostową z kolby do świeżej 50-mililitrowej probówki.

Dodaj trzy mililitry 0,25% trypsyny EDTA do każdej kolby T75. Następnie potrząsać kolbami przez pięć minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Odwirować pożywkę wzrostową w ilości 0,4 g przez pięć minut.

Po wstrząsaniu przez pięć minut dodać co najmniej cztery mililitry odwirowanej pożywki hodowlanej, aby zatrzymać reakcję EDTA trypsyny, i rozcierać, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały odłączone. Następnie przepuść komórki przez sitko do komórek o średnicy 70 mikromolów, aby utworzyć pojedynczą hodowlę komórkową. Wykonaj liczenie komórek, a następnie wiruj w dół z prędkością 0,4 razy g przez pięć minut.

Następnie weź pięciomililitrową rurkę z polistyrenu, dodaj jeden mililitr zalecanej pożywki i zaznacz menisk. Dodaj zalecaną pożywkę do 2,5 mililitra i zaznacz również tę łąkotkę. Następnie usuń pożywkę i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach zalecanego podłoża.

Przenieś tę mieszaninę do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej, a następnie rozcieńczyć do oznaczenia jednego mililitra. Następnie dodaj 50 mikrolitrów surowicy szczurzej na każdy mililitr zawieszonych komórek i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji należy przygotować koktajl selekcyjny, mieszając 25 mikrolitrów składnika A i 25 mikrolitrów składnika B. Po upływie pięciu minut dodać 50 mikrolitrów koktajlu selekcyjnego do komórek i inkubować przez kolejne pięć minut w temperaturze pokojowej.

Wiruj mikrosfery przez 45 sekund. Następnie dodaj 80 mikrolitrów mikrosfer na jeden mililitr próbki i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj zalecane podłoże do oznaczenia 2,5 mililitra na rurce polistyrenowej.

Umieść probówkę w uchwycie magnetycznym na trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po inkubacji powoli wylej pożywkę do 15-mililitrowej rurki polistyrenowej znajdującej się jeszcze w magnesie. Powtórz separację magnetyczną jeszcze trzy razy, za każdym razem dodając zalecane medium do oznaczenia 2.5 mililitra.

Po ostatniej separacji magnetycznej dodaj trzy mililitry pożywki wzrostowej i policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek. Umieść komórki na płytkach pokrytych poli-D-lizyną do zabiegów. Umieść frakcję ujemną z 15-mililitrowej probówki, która zawiera głównie astrocyty, w kolbach T75.

Po co najmniej sześciu godzinach inkubacji w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, przed powrotem do inkubatora wymienić całą pożywkę wzrostową w kolbach zawierających frakcję ujemną. Zdjęcie przedstawia immunocytochemię izolowanej hodowli mikrogleju badanej pod kątem IBA, markera mikrogleju w kanale zielonym i GFAP, markera astrocytów, w kanale czerwonym. Barwienie Hoechsta ujawnia obecność jąder komórkowych.

Brak komórek GFAP-dodatnich pokazuje, że mikroglej wyizolowany przy użyciu zestawu do pozytywnej selekcji CD11b również ma wysoką czystość. Te immunoklonowane białka z izolowanej hodowli mikrogleju zostały zbadane pod kątem GFAP, który pojawia się jako pasmo około 51 kilodaltonów, i IBA1, które pojawia się jako pasmo około 15 kilodaltonów. Beta-aktyna była używana jako kontrola obciążenia i pojawia się w około 42 kilodaltonach.

Problem ze starym zestawem izolacyjnym polegał na tym, że fluorescencję PE można było zaobserwować w kanale czerwonym, jak widać tutaj. Zmodyfikowana procedura nie wytwarza żadnej autofluorescencji z kulek magnetycznych, jak widać w czerwonym kanale tutaj. Mikroglej wyizolowany za pomocą tej procedury może być wykorzystany do badań sygnalizacyjnych.

Analiza Western blot pokazuje, że Fyn i fosfo-src tyrozyna Y416 mogą być wykryte w mikrogleju wyizolowanym naszą nowo udoskonaloną metodą. Frakcja ujemna z separacji mikrogleju zawiera astrocyty, które można wykorzystać do badań sygnalizacyjnych. Western blot pokazuje, że frakcja ujemna zawiera komórki GFAP-dodatnie.

Analiza Western blot pokazuje, że Fyn i tyrozyna fosfo-src Y416 mogą być wykryte w komórkach GFAP-dodatnich. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak wielokanałowa mikroskopia fluorescencyjna, western blotting i ilościowy PCR, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące ekspresji genów i sygnalizacji białkowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać tę technikę szybkiej izolacji do celów eksperymentów z mikroglejem.