Sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę
October 2nd, 2017
Sekwencyjna ekstrakcja soli białek związanych z chromatyną jest użytecznym narzędziem do określania właściwości wiązania dużych kompleksów białkowych. Metoda ta może być stosowana do oceny roli poszczególnych podjednostek lub domen w ogólnym powinowactwie kompleksu białkowego do chromatyny masowej.
Ogólnym celem procedury sekwencyjnej ekstrakcji soli jest scharakteryzowanie profili wiązania białek z chromatyną masową oraz oszacowanie, w jaki sposób wiązanie jest zmieniane, gdy manipuluje się białkiem lub jego środowiskiem. Metoda ta mierzy względne powinowactwo regulatorów epigenetycznych do chromatyny i może być wykorzystana do oceny, jak te interakcje zmieniają się po manipulacji genetycznej, chemicznej i środowiskowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to szybki i niedrogi sposób oceny profili wiązania białek wiążących chromatynę.
Osoby, które są nowe w dziedzinie chromatyny, często zmagają się z immunoprecypitacją chromatyny lub ChIP. Sekwencyjna ekstrakcja soli to stara technika, której nawet niedoświadczeni naukowcy mogą użyć, aby odpowiedzieć na wiele z tych samych pytań. Aby rozpocząć procedurę, zbierz 8 000 000 komórek z każdej interesującej nas linii komórkowej.
Umyj każdą próbkę komórek pięcioma mililitrami lodowatego PBS dwukrotnie. Zawiesić każdą próbkę i jeden mililitr hipotonicznego buforu z inhibitorami proteazy. Przenieś zawiesiny komórek do 1,5 mililitrowych probówek wirówek do mikrowirówek.
Obracać zawiesiny, od góry do dołu, przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odwirowywać zawiesinę przez pięć minut w tej samej temperaturze przy 6 000 G. Odrzucić supernatant. Wyposaż mikropipetę w końcówkę o pojemności jednego mililitra.
Dodaj do osadu 200 mikrolitrów bezsolnego modyfikowanego buforu ripa z inhibitorami proteazy. Postukaj końcówką pipety o dno probówki mikrowirówki, aby wciągnąć osad do końcówki. Odpipetować granulkę w górę i w dół 15 razy.
Próbka powinna stać się gęsta i lepka, gdy osad się rozpadnie. W ten sposób homogenizować każdą próbkę i inkubować próbki na lodzie przez trzy minuty. Następnie odwirować próbki w temperaturze 6500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty.
Przenieść supernatanty do czystych 1,5 mililitrowych probówek wirówek do mikrowirówek. Do każdej osadki dodać 200 mililitrów zmodyfikowanego buforu ripa ze 100 milimolowym chlorkiem sodu i inhibitorami proteazy. Odpipetować granulkę w górę i w dół 15 razy.
Jeśli początkowo trudno jest wprowadzić osad do końcówki pipety, postukaj w końcówkę na dnie probówki. Powtórzyć ten proces dla każdej próbki i inkubować próbki na lodzie przez trzy minuty. Odwirować próbki w temperaturze 6500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty.
Przenieść supernatanty do nowych 1,5 mililitrowych probówek do mikrowirówek. Kontynuować ekstrakcję próbek do zmodyfikowanych roztworów buforowych ripa o rosnącym stężeniu chlorku sodu. Gdy osad nie pozostaje już na dnie probówki, umieść go w nasadce probówki wirówkowej przed dekantacją supernatantu.
Po seryjnej ekstrakcji solą, dla każdej próbki, dodaj 70 mililitrów czterokrotnego barwnika obciążającego białko do każdej z pięciu frakcji sklarowanych nad osadem. Załaduj 30 mikrolitrów każdej frakcji na żel akrylamidowy SDS. Wykonaj standardowy western blot, przenosząc białka do błony i barwiąc odpowiednimi pierwszorzędowymi przeciwciałami.
Inkubować blot w przeciwciałach drugorzędowych znakowanych barwnikiem w podczerwieni i obrazować blot. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby obliczyć intensywność pasma każdego stężenia soli. Wykreślić intensywność pasma w stosunku do stężenia soli, aby określić wzór elucji białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Sekwencyjna ekstrakcja soli białek ARID1a i Polybromo 1 wykazała stałą elucję o stężeniach soli odpowiednio 200 i 300 milimolowych. Niesekwencyjna ekstrakcja solą tych samych białek wykazała mniej spójne wyniki. Czas inkubacji musi być zoptymalizowany dla każdego badanego białka.
W związku z tym SSE wykorzystano do zbadania profili elucji po różnych długościach inkubacji. Aktywator transkrypcji, Polybromo 1, wykazywał podobne profile elucji podczas inkubacji przez trzy minuty i 10 minut. Represor transkrypcyjny, Polycomb Repressive Complex 1, wskazywany przez BMI1, potrzebował więcej niż trzech minut, aby zostać uwolnionym z chromatyny.
Interakcje białko-białko badano poprzez badanie zmian w profilach elucji. W obecności inhibitora, bromodomena zawierająca białko cztery wykazywała niższe stężenia soli niż bez inhibitora. Różnice w wzorcach histonów zaobserwowano, gdy komórki potraktowano inhibitorem deacetylazy histonowej, zmieniającym krajobraz chromatyny.
Zmiany w wiązaniu białek, gdy komórki doświadczyły stresu genomowego, znalazły również odzwierciedlenie w profilach elucji. W tym przypadku wzrost stężenia soli potrzebnego do elucji sugerował, że Polybromo 1 wiąże się ściślej z chromatyną po uszkodzeniu DNA przez doksorubicynę. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, pamiętaj, aby być jak najbardziej konsekwentnym w traktowaniu każdej próbki. Procedura ta może być stosowana w początkowych etapach badania w celu wyjaśnienia mechanizmu i regulacji białka wiążącego chromatynę. Oszczędza to czas i pieniądze na niepotrzebnych badaniach całego genomu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Procedura Sekwencyjnej Ekstrakcji Soli jest zaprojektowana do charakteryzacji profili wiązania białek do masy chromatyny i oceny, w jaki sposób te wiązania są modyfikowane przez różne manipulacje. Ta metoda jest szczególnie przydatna do oceny affinności regulatorów epigenetycznych do chromatyny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia chromatyny
- Interakcje białkowe
- Epigenetyka
Tło
- Sekwencyjna Ekstrakcja Soli to technika do badania białek wiązanych z chromatyną.
- Oferuje szybką i niedrogą alternatywę dla immunoprecypitacji chromatyny (ChIP).
- Ta metoda jest dostępna nawet dla niedoświadczonych naukowców.
- Pozwalla na ocenę, w jaki sposób interakcje białkowe zmieniają się w zależności od czynników genetycznych, chemicznych i środowiskowych.
Cel badania
- Charakteryzowanie profili wiązania białek wiązanych z chromatyną.
- Ocenienie wpływu różnych manipulacji na wiązanie białek.
- Dostarczenie prostego metodu dla naukowców z dziedziny chromatyny.
Stosowane metody
- Zbiór 8 000 000 komórek z każdej linii komórkowej.
- Sekwencyjna ekstrakcja soli w celu izolowaniu białek związanych z chromatyną.
- Ocena affinności wiązania białek do chromatyny.
- Ocena zmian w profilach wiązania w różnych warunkach.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie charakteryzuje profile wiązania białek.
- Wykazuje, jak affinności wiązania mogą być modyfikowane przez czynniki środowiskowe.
- Wyniki wskazują na przydatność tej techniki zarówno dla doświadczonych, jak i początkujących naukowców.
- Dostarcza wglądu w interakcje regulatorów epigenetycznych z chromatyną.
Wnioski
- Sekwencyjna Ekstrakcja Soli jest cennym narzędziem do badania interakcji z chromatyną.
- Metoda jest efektywna i dostępna dla różnych zastosowań badawczych.
- Zwiększa zrozumienie dynamiki wiązania białek w biologii chromatyny.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Sequential Salt Extraction (SSE) provides a rapid, cost-effective method to evaluate chromatin-binding protein affinity, enabling early-stage target validation in epigenetics-focused drug discovery. By quantifying how genetic, chemical, or environmental perturbations alter protein-chromatin interactions, SSE supports mechanistic de-risking of chromatin-modifying complexes before committing to resource-intensive assays. This approach improves predictive confidence in lead identification by distinguishing direct binding effects from indirect cellular responses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures relative binding affinity changes when complex subunits are lost or domains inactivated, clarifying functional contributions of individual proteins to chromatin engagement.
- Scientific Value: Profiles elution patterns under increasing salt concentrations to differentiate specific chromatin binding from nonspecific associations, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Enables non-experts to generate quantitative binding data without specialized ChIP expertise, accelerating early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible elution profiles that serve as quantitative readouts for screening compound effects on chromatin landscape alterations.
- Operational Value: Uses standard western blot infrastructure and image analysis, facilitating assay standardization across laboratories and reducing technical variability.
- Operational Value: Requires only basic centrifugation and electrophoresis equipment, lowering barriers to adoption in screening cascades for epigenetic modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links alterations in chromatin environment (e.g., via HDAC inhibitors) to changes in protein binding, supporting biomarker-aligned mechanistic studies in disease-relevant systems.
- Scientific Value: Evaluates binding shifts under genomic stress (e.g., doxorubicin-induced DNA damage), informing predictive models of target engagement under pathophysiological conditions.
- Operational Value: Complements cellular and biochemical assays by providing orthogonal validation of chromatin interaction continuity from discovery to preclinical stages.
Pipeline & Workflow Integration
SSE fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, offering a mechanistic bridge between biochemical binding assays and cellular phenotypic readouts in epigenetics programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how complex alterations affect chromatin binding, enabling pathway clarification and biological de-risking of epigenetic targets.
- Screening: Delivers salt-dependent elution profiles as quantitative outputs for comparing compound-induced chromatin state changes across screening campaigns.
- Analytics: Generates band intensity data plotted against salt concentration, providing calculable binding affinity shifts that inform structure-activity relationship discussions.
- Translational Research: Connects in vitro binding changes to cellular chromatin landscape modifications, supporting translational biomarker alignment when coupled with functional readouts.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, low-cost capability applicable across multiple chromatin targets, promoting platform reuse in epigenetic drug discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by distinguishing direct chromatin binding from indirect cellular effects through controlled salt elution.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative binding profiles using widely available laboratory equipment, enhancing cross-team standardization.
- Strategic Value: Reduces reliance on low-throughput ChIP for initial binding assessments, improving capital efficiency in early epigenetics projects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chromatin-modifying complex targets based on quantitative binding resilience to environmental perturbations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biochemistry and western blot quantification to ensure accurate elution profile interpretation.
- Depends on access to refrigerated centrifuges, microcentrifuge tubes, and standard SDS-PAGE/western blot instrumentation.
- Necessitates standardized cell harvesting and lysis protocols to minimize variability between samples and ensure comparable salt extraction results.
- Involves optimization of incubation times for each target protein, as binding release kinetics vary across chromatin-modifying complexes.
- Limited to relative affinity comparisons; absolute binding constants require orthogonal biophysical methods for validation.
