Sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę
2 października 2017
Sekwencyjna ekstrakcja soli białek związanych z chromatyną jest użytecznym narzędziem do określania właściwości wiązania dużych kompleksów białkowych. Metoda ta może być stosowana do oceny roli poszczególnych podjednostek lub domen w ogólnym powinowactwie kompleksu białkowego do chromatyny masowej.
Ogólnym celem procedury sekwencyjnej ekstrakcji soli jest scharakteryzowanie profili wiązania białek z chromatyną masową oraz oszacowanie, w jaki sposób wiązanie jest zmieniane, gdy manipuluje się białkiem lub jego środowiskiem. Metoda ta mierzy względne powinowactwo regulatorów epigenetycznych do chromatyny i może być wykorzystana do oceny, jak te interakcje zmieniają się po manipulacji genetycznej, chemicznej i środowiskowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to szybki i niedrogi sposób oceny profili wiązania białek wiążących chromatynę.
Osoby, które są nowe w dziedzinie chromatyny, często zmagają się z immunoprecypitacją chromatyny lub ChIP. Sekwencyjna ekstrakcja soli to stara technika, której nawet niedoświadczeni naukowcy mogą użyć, aby odpowiedzieć na wiele z tych samych pytań. Aby rozpocząć procedurę, zbierz 8 000 000 komórek z każdej interesującej nas linii komórkowej.
Umyj każdą próbkę komórek pięcioma mililitrami lodowatego PBS dwukrotnie. Zawiesić każdą próbkę i jeden mililitr hipotonicznego buforu z inhibitorami proteazy. Przenieś zawiesiny komórek do 1,5 mililitrowych probówek wirówek do mikrowirówek.
Obracać zawiesiny, od góry do dołu, przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odwirowywać zawiesinę przez pięć minut w tej samej temperaturze przy 6 000 G. Odrzucić supernatant. Wyposaż mikropipetę w końcówkę o pojemności jednego mililitra.
Dodaj do osadu 200 mikrolitrów bezsolnego modyfikowanego buforu ripa z inhibitorami proteazy. Postukaj końcówką pipety o dno probówki mikrowirówki, aby wciągnąć osad do końcówki. Odpipetować granulkę w górę i w dół 15 razy.
Próbka powinna stać się gęsta i lepka, gdy osad się rozpadnie. W ten sposób homogenizować każdą próbkę i inkubować próbki na lodzie przez trzy minuty. Następnie odwirować próbki w temperaturze 6500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty.
Przenieść supernatanty do czystych 1,5 mililitrowych probówek wirówek do mikrowirówek. Do każdej osadki dodać 200 mililitrów zmodyfikowanego buforu ripa ze 100 milimolowym chlorkiem sodu i inhibitorami proteazy. Odpipetować granulkę w górę i w dół 15 razy.
Jeśli początkowo trudno jest wprowadzić osad do końcówki pipety, postukaj w końcówkę na dnie probówki. Powtórzyć ten proces dla każdej próbki i inkubować próbki na lodzie przez trzy minuty. Odwirować próbki w temperaturze 6500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty.
Przenieść supernatanty do nowych 1,5 mililitrowych probówek do mikrowirówek. Kontynuować ekstrakcję próbek do zmodyfikowanych roztworów buforowych ripa o rosnącym stężeniu chlorku sodu. Gdy osad nie pozostaje już na dnie probówki, umieść go w nasadce probówki wirówkowej przed dekantacją supernatantu.
Po seryjnej ekstrakcji solą, dla każdej próbki, dodaj 70 mililitrów czterokrotnego barwnika obciążającego białko do każdej z pięciu frakcji sklarowanych nad osadem. Załaduj 30 mikrolitrów każdej frakcji na żel akrylamidowy SDS. Wykonaj standardowy western blot, przenosząc białka do błony i barwiąc odpowiednimi pierwszorzędowymi przeciwciałami.
Inkubować blot w przeciwciałach drugorzędowych znakowanych barwnikiem w podczerwieni i obrazować blot. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby obliczyć intensywność pasma każdego stężenia soli. Wykreślić intensywność pasma w stosunku do stężenia soli, aby określić wzór elucji białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Sekwencyjna ekstrakcja soli białek ARID1a i Polybromo 1 wykazała stałą elucję o stężeniach soli odpowiednio 200 i 300 milimolowych. Niesekwencyjna ekstrakcja solą tych samych białek wykazała mniej spójne wyniki. Czas inkubacji musi być zoptymalizowany dla każdego badanego białka.
W związku z tym SSE wykorzystano do zbadania profili elucji po różnych długościach inkubacji. Aktywator transkrypcji, Polybromo 1, wykazywał podobne profile elucji podczas inkubacji przez trzy minuty i 10 minut. Represor transkrypcyjny, Polycomb Repressive Complex 1, wskazywany przez BMI1, potrzebował więcej niż trzech minut, aby zostać uwolnionym z chromatyny.
Interakcje białko-białko badano poprzez badanie zmian w profilach elucji. W obecności inhibitora, bromodomena zawierająca białko cztery wykazywała niższe stężenia soli niż bez inhibitora. Różnice w wzorcach histonów zaobserwowano, gdy komórki potraktowano inhibitorem deacetylazy histonowej, zmieniającym krajobraz chromatyny.
Zmiany w wiązaniu białek, gdy komórki doświadczyły stresu genomowego, znalazły również odzwierciedlenie w profilach elucji. W tym przypadku wzrost stężenia soli potrzebnego do elucji sugerował, że Polybromo 1 wiąże się ściślej z chromatyną po uszkodzeniu DNA przez doksorubicynę. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, pamiętaj, aby być jak najbardziej konsekwentnym w traktowaniu każdej próbki. Procedura ta może być stosowana w początkowych etapach badania w celu wyjaśnienia mechanizmu i regulacji białka wiążącego chromatynę. Oszczędza to czas i pieniądze na niepotrzebnych badaniach całego genomu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Procedura sekwencyjnej ekstrakcji solnej została opracowana w celu charakterystyki profili wiązania białek z chromatyną całkowitą oraz oceny, w jaki sposób wiązania te ulegają zmianom pod wpływem różnych manipulacji. Metoda ta jest szczególnie użyteczna przy ocenie powinowactwa regulatorów epigenetycznych do chromatyny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia chromatyny
- Interakcje białkowe
- Epigenetyka
Wstęp
- Sekwencyjna ekstrakcja solna to technika służąca do badania białek wiążących się z chromatyną.
- Stanowi ona szybką i kosztowo efektywną alternatywę dla immunoprecypitacji chromatyny (ChIP).
- Metoda ta jest dostępna nawet dla niewykwalifikowanych naukowców.
- Pozwala ona na ocenę, w jaki sposób oddziaływania białek zmieniają się pod wpływem czynników genetycznych, chemicznych i środowiskowych.
Cel badania
- Charakterystyka profili wiązania białek wiążących się z chromatyną.
- Ocena wpływu różnych manipulacji na wiązanie białek.
- Zapewnienie prostego rozwiązania dla badaczy zajmujących się chromatyną.
Zastosowane metody
- Pozyskanie 8 000 000 komórek z każdej badanej linii komórkowej.
- Sekwencyjna ekstrakcja solna w celu wyizolowania białek związanych z chromatyną.
- Ocena powinowactwa wiązania białek do chromatyny.
- Ocena zmian w profilach wiązania w różnych warunkach.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczną charakterystykę profili wiązania białek.
- Wykazuje ona, w jaki sposób czynniki środowiskowe mogą zmieniać powinowactwa wiązania.
- Wyniki wskazują na użyteczność tej techniki zarówno dla doświadczonych, jak i początkujących badaczy.
- Zapewnia wgląd w interakcje regulatorów epigenetycznych z chromatyną.
Wnioski
- Sekwencyjna ekstrakcja solna jest cennym narzędziem do badania oddziaływań chromatyny.
- Metoda ta jest wydajna i dostępna dla różnorodnych zastosowań badawczych.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie dynamiki wiązania białek w biologii chromatyny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Sekwencyjna ekstrakcja solna (SSE) zapewnia szybką i kostoelektrawną metodę oceny powinowactwa białek wiążących chromatynę, umożliwiając wczesną walidację celów w procesie odkrywania leków ukierunkowanym na epigenetykę. Poprzez ilościowe określenie, w jaki sposób perturbacje genetyczne, chemiczne lub środowiskowe zmieniają oddziaływania białko-chromatyna, SSE wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kompleksów modyfikujących chromatynę przed przejściem do czasochłonnych i kosztownych analiz. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w identyfikacji związków wiodących, odróżniając efekty bezpośredniego wiązania od pośrednich odpowiedzi komórkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pomiar względnych zmian powinowactwa wiązania w przypadku utraty podjednostek kompleksu lub dezaktywacji domen, co pozwala wyjaśnić funkcjonalny wkład poszczególnych białek w wiązanie z chromatyną.
- Wartość naukowa: Analiza profili elucji przy rosnących stężeniach soli w celu odróżnienia specyficznego wiązania z chromatyną od niespecyficznych oddziaływań, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia osobom bez specjalistycznej wiedzy z zakresu ChIP generowanie ilościowych danych o wiązaniu, co przyspiesza weryfikację hipotez na wczesnym etapie badań.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie powtarzalnych profili elucji, które służą jako ilościowe odczyty do przesiewania wpływu związków na zmiany w krajobrazie chromatyny.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje standardową infrastrukturę do western blotu oraz analizy obrazu, co ułatwia standaryzację testu pomiędzy laboratoriami i redukuje zmienność techniczną.
- Wartość operacyjna: Wymaga jedynie podstawowego sprzętu do wirowania i elektroforezy, co obniża bariery we wdrażaniu metody w kaskadach przesiewowych dla modulatorów epigenetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy zmiany w środowisku chromatyny (np. poprzez inhibitory HDAC) ze zmianami w wiązaniu białek, co wspiera mechanistyczne badania zorientowane na biomarkery w systemach istotnych dla procesów chorobowych.
- Wartość naukowa: Ocenia przesunięcia w wiązaniu w warunkach stresu genomicznego (np. uszkodzeń DNA indukowanych doksorubicyną), dostarczając danych do modeli prognostycznych dotyczących angażowania celu w warunkach patofizjologicznych.
- Wartość operacyjna: Uzupełnia testy komórkowe i biochemiczne, zapewniając ortogonalną walidację ciągłości oddziaływań chromatyny od etapu odkrycia do fazy przedklinicznej.
Integracja potoków i procesów roboczych
SSE wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu po optymalizację kandydata, stanowiąc pomost mechanistyczny między biochemicznymi badaniami wiązania a komórkowymi odczytami fenotypowymi w programach epigenetycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez kwantyfikację wpływu złożonych zmian na wiązanie chromatyny, co umożliwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego w przypadku celów epigenetycznych.
- Przesiewanie: Dostarcza profili elucji zależnych od stężenia soli jako danych ilościowych do porównywania indukowanych przez związki zmian stanu chromatyny w ramach kampanii przesiewowych.
- Analityka: Generuje dane o intensywności prążków wykreślone w funkcji stężenia soli, dostarczając obliczalnych przesunięć powinowactwa wiązania, które stanowią podstawę do analizy relacji struktura-aktywność.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany wiązania in vitro z modyfikacjami krajobrazu chromatyny komórkowej, wspierając dopasowanie biomarkerów translacyjnych w połączeniu z odczytami funkcjonalnymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi standaryzowaną, niskokosztową możliwość zastosowania w przypadku wielu celów chromatynowych, promując ponowne wykorzystanie platformy w procesach odkrywania leków epigenetycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez odróżnienie bezpośredniego wiązania z chromatyną od pośrednich efektów komórkowych za pomocą kontrolowanego eluowania solą.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne, ilościowe profile wiązania z wykorzystaniem powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego, co poprawia standaryzację międzyzespołową.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza zależność od niskoprzepustowych metod ChIP podczas wstępnych ocen wiązania, poprawiając efektywność kapitałową w początkowych projektach z zakresu epigenetyki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów kompleksów modyfikujących chromatynę z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościową odporność wiązania na zaburzenia środowiskowe.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu biochemii chromatyny oraz ilościowej analizy western blot w celu zapewnienia dokładnej interpretacji profilu elucji.
- Metoda zależy od dostępu do wirówek chłodzących, probówek do mikrowirówki oraz standardowej aparatury do elektroforezy SDS-PAGE i western blot.
- Konieczne jest zastosowanie standaryzowanych protokołów zbierania i lizy komórek, aby zminimalizować zmienność między próbkami i zapewnić porównywalne wyniki ekstrakcji soli.
- Wymagana jest optymalizacja czasów inkubacji dla każdego białka docelowego, ponieważ kinetyka uwalniania wiązań różni się w zależności od kompleksów modyfikujących chromatynę.
- Metoda ogranicza się do porównań powinowactwa względnego; wyznaczenie bezwzględnych stałych wiązania wymaga walidacji za pomocą ortogonalnych metod biofizycznych.
