Name: Sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Poznaj sekwencyjną ekstrakcję soli do analizy wiązania białek z chromatyną. Ta szybka i ekonomiczna metoda pozwala ocenić wpływ manipulacji genetycznych, chemicznych i środowiskowych na interakcje epigenetycznych regulatorów z chromatyną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez V scholar award (V2014-004) i V scholar plus award (D2016-030) od V Foundation for Cancer Research, a także American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS IRG Grant 58-006-53) dla Purdue University Center for Cancer Research. E. G. P. był wspierany przez Borch Graduate Endowment Award dla Wydziału Chemii Medycznej i Farmakologii Molekularnej Uniwersytetu Purdue.

1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotuj 100 ml roztworu hipotonicznego Bufor A: 0,3 M sacharozy, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA i 0,5% NP-40. Przechowywać w temperaturze 4 ºC. 
	UWAGA: Niektóre linie komórkowe, takie jak HEK293T, wymagają mniej rygorystycznych warunków lizy. Jeśli jądra łatwo ulegają lizie, użyj zmodyfikowanego buforu A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,05 mM EDTA, 0,1% NP-40 i 10% glicerolu.</li>
	<li>Przygotować 250 ml roztworu podstawowego 2x mRIPA: 100 mM Tris pH 8,0, 2% NP-40 i 0,5% deoksycholanu sodu.</li>
	<li>Przygotować 100 ml roztworu podstawowego 5 M NaCl.</li>
	<li>Używając roztworów 2x mRIPA i 5 M NaCl, przygotuj 50 ml 1x roztworu mRIPA dla każdego z sześciu stężeń soli: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM i 500 mM NaCl. Przed rozpoczęciem eksperymentu ostudź wszystkie roztwory na lodzie.</li>
	<li>Hoduj linie komórkowe w pożądanych warunkach. 
	UWAGA: Podczas określania skutków strącenia białka, SSE dla linii eliminacji należy porównać z komórkami typu dzikiego. Te SSE muszą być wykonywane równolegle. Przykłady stosowania chemicznych inhibitorów lub bodźców znajdują się w sekcjach 3 - 5.</li>
</ol>
2. Podstawowa sekwencyjna ekstrakcja soli
<ol>
	<li>Zbierz 8 milionów komórek w każdym stanie i umyj dwukrotnie 5 ml lodowatego PBS. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby mieć równą liczbę komórek, aby mieć równoważne stężenia białka. Dokładna liczba komórek może wymagać optymalizacji dla poszczególnych linii komórkowych lub określonych białek. Ważne jest, aby nie było ich zbyt wiele, ponieważ wzrost stężeń białek uniemożliwi obserwację krzywej elucji, która jest zależna od wiązania równowagi. Jednak przy zbyt małej liczbie komórek może nie być wystarczającej ilości białka do wykrycia krzywej, a osad chromatyny jest trudniejszy do wyizolowania i może zostać utracony między frakcjami.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml inhibitorów proteazy Buffer A +, przenieść do 1,5 ml mikroprobówek wirówkowych i obracać od góry do dołu w temperaturze 4 ºC przez 10 minut.</li>
	<li>Izolować jądra przez odwirowywanie przy 6000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C . 
	UWAGA: Po tym kroku otoczka jądrowa powinna być nadal nienaruszona. Jeśli otoczka jądrowa jest nienaruszona, pastylka ponownie całkowicie się zawiesi; Jednak gdy otoczka zostanie poddana lizie i chromatyna zostanie uwolniona, osad nie zostanie ponownie zawieszony. Jeżeli otoczka jądrowa nie jest nienaruszona po inkubacji buforu A, należy użyć zmodyfikowanego buforu A.</li>
	<li>Dodać 200 μl inhibitorów proteazy mRIPA 0 mM NaCl + do każdej osady jądra przed ponownym zawiesieniem osadu. Homogenizować każdą próbkę, pipetując 15 razy za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Osad powinien łatwo ponownie zawiesić się, jednak jądra ulegną lizie podczas pipetowania, a próbka stanie się gęsta, lepka i trudna do pipetowania.
	<ol>
		<li>Aby wciągnąć osad do końcówki, należy postukać końcem końcówki pipety o dno probówki wirówki. Osad nie rozpuści się w pełni po uwolnieniu DNA z jąder, ale pipetowanie go rozbije.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy wszystkie próbki zostaną zhomogenizowane, inkubować wszystkie próbki na lodzie przez 3 min. 
	UWAGA: Może być konieczne zoptymalizowanie czasu inkubacji w zależności od interesującego białka.</li>
	<li>Wyizolować osad chromatyny, wirując próbki przez 3 minuty w temperaturze 6500 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Będzie to frakcja 0 mM. Ten roztwór mRIPA o stężeniu 0 mM może działać jako etap płukania w celu lizy jąder i usunięcia wszelkich luźnych białek niezwiązanych z chromatyną.</li>
	<li>Dodaj 200 μl inhibitorów proteazy mRIPA 100 mM NaCl + do każdej osadki chromatyny przed ponownym zawiesiniem osadu. Rozdrobnij osad chromatyny, pipetując osad w górę iw dół 15 razy. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby być konsekwentnym w kwestii liczby pipetowania granulek.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 3 minuty. Ten etap inkubacji pozwala wszystkim próbkom osiągnąć stan równowagi, co jest szczególnie ważne, gdy istnieje wiele próbek.</li>
	<li>Wirować przy 6500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do czystej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Powtórzyć 2,6 - 2,10 dla pozostałych stężeń soli. 
	UWAGA: Po 400 mM NaCl, mRIPA granulka powinna być przezroczysta i lepka i nie pozostanie na dnie tuby. Osad można umieścić w pokrywie probówki wirówkowej, podczas gdy supernatant jest odizolowany.</li>
	<li>Dodaj 70 μl 4x barwnika ładującego białko do każdej frakcji i załaduj 30 μl każdej frakcji do żelu akrylamidowego SDS do analizy western blot. 
	UWAGA: Aby określić profil wiązania białka, ważne jest, aby załadować równoważne objętości lizatu, a nie ładować równe stężenia białka.</li>
	<li>Wykonaj standardowy western blot, przenosząc go na błonę i użyj przeciwciał pierwszorzędowych dla białek będących przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Aby określić ilościowo białko eluowane z chromatyny, należy inkubować blot w przeciwciałach drugorzędowych IRDye we fluorescencji w podczerwieni i zobrazować go za pomocą imagera. Chociaż można zastosować inne metody wywoływania, zalecamy obrazowanie fluorescencyjne lub w podczerwieni, ponieważ ma ono bardziej ilościowy charakter.</li>
	<li>Użyj ImageJ lub podobnego oprogramowania, aby obliczyć intensywność białka eluowanego przy każdym stężeniu soli. Tworząc wykres intensywności pasma w stosunku do stężenia soli, można określić wzór elucji interesującego Cię białka.</li>
</ol>
3. Sekwencyjne wydobycie soli w obecności inhibitora "czytnika"
<ol>
	<li>Zbierz dwa zestawy komórek (4 miliony) i wyizoluj jądra, jak w standardowym SSE.</li>
	<li>Ponownie zawiesić oba zestawy w 200 μl mRIPA 0 mM NaCl i inkubować przez 3 minuty. Pozwoli to na usunięcie wszelkich wolnych białek z jąder.</li>
	<li>Dodać 200 μl mRIPA 0 mM NaCl do każdej granulki. Dodać inhibitor (2 μl z 1 mM (+)JQ1) do jednej próbki, a DMSO do zestawu kontrolnego.</li>
	<li>Mieszać granulki przez pipetowanie 15 razy i inkubować na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Wirować przy 6500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do czystej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Powtórz 3,3 - 4 dla wszystkich stężeń soli i wykonaj standardowy western blot.</li>
</ol>
4. Sekwencyjna ekstrakcja soli w obecności inhibitora "writer"
<ol>
	<li>Traktuj komórki inhibitorem (10 μM SAHA) lub DMSO przez 3 godziny.</li>
	<li>Zbierz 4 miliony komórek do każdego zabiegu.</li>
	<li>Wykonaj standardowe SSE dla próbek z inhibitorem dodanym do wszystkich.</li>
</ol>
5. Sekwencyjna ekstrakcja soli po uszkodzeniu DNA
<ol>
	<li>Traktuj komórki doksorubicyną 1 μM przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zmień pożywkę na komórkach i pozwól im się zregenerować przez 3 godziny.</li>
	<li>Zbierz 8 milionów komórek i wykonaj podstawowe SSE.</li>
</ol>
6. Niesekwencyjna ekstrakcja soli
<ol>
	<li>Zbierz 12 milionów komórek i umyj je za pomocą PBS.</li>
	<li>Podziel komórki tak, aby w mikroprobówce wirówkowej znajdowały się 2 miliony komórek.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 500 μl buforu A i inkubować przez 10 minut.</li>
	<li>Wyizolować jądra przez odwirowanie przy 6000 x g.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulki w 200 μl każdego z mRIPA + NaCl.</li>
	<li>Homogenizować każdą próbkę, pipetując 15 razy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 3 minuty.</li>
	<li>Wyizolować chromatynę przez odwirowanie przy 6500 x g i przenieść supernatant do czystych probówek. Dodaj 70 μl barwnika ładującego i przeprowadź 30 μl na żelu SDS do analizy western blot.</li>
</ol>

<ol><li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rese%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho+switch+triggers+brd4+chromatin+binding+and+activator+recruitment+for+gene-specific+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting.</a> Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).</li>
<li>Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+bromodomains+of+Polybromo-1+contribute+to+chromatin+association+and+tumor+suppression+in+clear+cell+renal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma.</a> J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+group+complexes--many+combinations%2C+many+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+cell+biol%22%5BJournal%5D)">Polycomb group complexes--many combinations, many functions.</a> Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).</li>
<li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+BET+bromodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of BET bromodomains.</a> Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).</li>
<li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+recognition+and+large-scale+structural+analysis+of+the+human+bromodomain+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family.</a> Cell. 149 (1), 214-231 (2012).</li>
<li>Sanchez, R., Zhou, M. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+human+bromodomains+in+chromatin+biology+and+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opin+drug+disc+dev%22%5BJournal%5D)">The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription.</a> Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).</li>
<li>Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin%2C+DNA+torsion%2C+and+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).</li>
<li>Kakarougkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+PBAF+in+Transcriptional+Repression+and+Repair+at+DNA+Breaks+in+Actively+Transcribed+Regions+of+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin.</a> Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).</li>
<li>Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1%2FC2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li>
<li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Charakterystyka interakcji białek i chromatyny poprzez ekstrakcję solą jest powszechną metodą stosowaną od dziesięcioleci14,15; Jednak wcześniej nie był systematycznie optymalizowany, aby ujawnić jego pełną użyteczność. Pokazujemy, w jaki sposób ta sekwencyjna metoda zapewnia szybki i niedrogi sposób rozróżniania zmian w wiązaniu chromatyny, gdy zmienia się białko lub środowisko. SSE jest wysoce elastyczny i optymalizowalny, a co ważne, jest technicznie prosty i ...

Regulacja DNA w komórkach eukariotycznych to skomplikowany i wyrafinowany system, który jest ściśle kontrolowany przez szereg białek, które koordynują reakcje na bodźce wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe. DNA jest owijane wokół oktamerów histonowych, tworząc nukleosomy, które mogą być luźno rozmieszczone wzdłuż DNA lub zagęszczone w ciasne cewki1. Ten strukturalny układ DNA i histonów jest znany jako chromatyna, która jest regulowana przez sieć białek, które odczytują, zapisują i usuwają modyfikacje potranslacyjne (PTM) na histonach2. Niektóre histonowe PTM, takie jak acetylacja, zmieniają ładunek aminokwasu, na którym są osadzone, zmieniając interakcje między histonami a DNA2. Histonowe PTM służą również do rekrutacji regulatorów transkrypcji, remodelerów chromatyny, maszynerii naprawy uszkodzeń DNA i maszynerii replikacji DNA do określonych regionów genomu3.
Większość metod badania oddziaływań chromatyny albo bada interakcje na małą skalę, albo obejmuje analizy całego genomu na dużą skalę. Badania wiązania in vitro często wykorzystują indywidualne rekombinowane domeny z peptydami histonowymi lub DNA w testach takich jak testy przesunięcia ruchliwości elektroforezy (EMSA), izotermiczna kalorymetria miareczkowa, polaryzacja fluorescencji i ściąganie peptydów. Ponieważ testy te zazwyczaj koncentrują się na pojedynczej domenie białkowej, ułatwiają zrozumienie małego elementu układanki, ale nie pozwalają nam zrozumieć kooperatywnego charakteru białek wielodomenowych, nie mówiąc już o ich roli w kompleksach wielobiałkowych. Kolejną warstwę zawiłości dodaje niejednorodny skład większości kompleksów modyfikujących chromatynę u ssaków. Ta niejednorodność białek, w połączeniu z dynamiczną naturą krajobrazu chromatyny, sprawia, że trudno jest odtworzyć interakcje wiązania in vivo białek chromatyny z chromatyną in vitro.
Metody in vivo poczyniły znaczne postępy; jednak często są drogie, czasochłonne i technicznie wymagające. Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje sekwencjonowanie (ChIP-seq) jest bardzo przydatna do określania lokalizacji białek i modyfikacji histonów w całym genomie, jednak wymaga znacznej optymalizacji4. Białka są często sieciowane z chromatyną w celu zachowania interakcji; Może to jednak powodować sztuczne interakcje i maskowanie epitopów5. Ponadto immunoprecypitacje (IP) wymagają wysoce specyficznych przeciwciał oraz szeroko zakrojonej optymalizacji ścinania DNA i warunków IP za pomocą ChIP-qPCR przy użyciu znanego miejsca wiązania, które często nie jest dostępne a priori. Po optymalizacji warunków ChIP przetwarzanie próbek jest kosztowne i wymaga od kilku tygodni do miesięcy w celu sekwencjonowania i analizy. Chociaż metoda ta jest nieoceniona w identyfikacji lokalizacji białek związanych z chromatyną w całym genomie, koszt i zaangażowanie czasowe sprawiają, że stosowanie tej metody do generowania hipotez na temat tego, jak małe zmiany mogą wpływać na globalne właściwości wiązania, jest zaporowe.
W tym artykule opisujemy, jak można wykorzystać test sekwencyjnej ekstrakcji soli (SSE) do zbadania globalnych profili wiązania białek związanych z chromatyną i rozróżnienia, jak zmiany w białku, kompleksie lub globalnym profilu PTM mogą zmieniać interakcje. Chociaż ekstrakcja soli jest powszechnie i szeroko stosowaną techniką, pokazujemy, że ta sekwencyjna metoda jest wysoce powtarzalna i wszechstronna. SSE pozwala nam scharakteryzować, w jaki sposób pojedyncza podjednostka kompleksu lub nawet pojedyncza domena przyczynia się do ogólnego powinowactwa kompleksu do chromatyny masowej. SSE można również wykorzystać do określenia, czy na wiązanie białka mają wpływ zmiany w krajobrazie chromatyny, dostarczając interesujących hipotez dotyczących celowania w znaczniki histonowe, które można potwierdzić za pomocą ChIP-seq i innych badań całego genomu.
Pierwotnie zaadaptowaliśmy tę metodę od Wu et al., aby zbadać funkcję Polybromo1 (PBRM1) w wiązaniu remodelera chromatyny PBAF6,7. Korzystając z tej techniki, określiliśmy rolę PBRM1 w wiązaniu chromatyny w kompleksie przebudowy chromatyny PBAF, a następnie określiliśmy względny wkład sześciu indywidualnych bromodomen w tę funkcję7.
Tutaj opisujemy, jak zoptymalizować tę metodę, aby badać wiązanie chromatyny w różnych typach komórek, aby ocenić względne powinowactwo wiązania podobnych kompleksów modyfikujących chromatynę, aby zbadać przemieszczenie białka z chromatyny przez chemiczny inhibitor i określić efekty wiązania chromatyny po zmianach w krajobrazie chromatyny.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu, kryształ 2,5 kg (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza, kryształ 500 g AR&uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>8360-04</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu, granulowany 500 g (cz.�g.) (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Baza trizma(R), podstawowy wzorzec i bufor, >=99,9% (miareczkowanie), krystaliczny</td><td>kwas Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (etylenodinitrylo) tetraoctowy, sól disodowa, dihydrat 125 g ar (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>4931-02</td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082</td><td>Amresco</td><td>E109-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Bufor Roztwór (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu, 6-hydrat, kryształ 500 g cz.d.a.; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>GLICEROL, 1L</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>SÓL SODOWA KWASU DEOKSYCHOLOWEGO, 100g</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Eppendorf Research plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-690-032</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 R mikrowirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Wtórna mysz IgG połączona z HRP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Wtórna królicza IgG sprzężona z HRP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało BMI-1</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBRM1</td><td>Przeciwciało Bethyl</td><td>A301-591A</td><td></td></tr><tr><td>ARID1a</td> Santa <td>Cruz</td><td>sc-32761</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało BRD4</td><td>Bethyl</td><td>A301-9852a</td><td></td></tr><tr><td>(+) JQ1</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>11187</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10009929</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>AK Scientific</td><td>25316-40-9</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Macron</td><td>4948-02</td><td></td></tr><tr><td>Mini komórka trans-blot</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini zbiornik żelowy</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100g</td><td>Stosowany jako 5% roztwór w PBS-T jako roztwór blokujący dla Western blot</td></tr><tr><td>Bufor do biegania Bolt MOPS SDS (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek Bolt LDS (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Wstępnie barwiona drabinka białkowa, 10 do 250 kDa</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>metylowy Alkohol, bezwodny</td><td>Macron</td><td>3041-10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna kEDTA, 1X</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>AZYDEK SODU, 250g UN1687</td><td>Amresco</td><td>0639-250G</td><td></td></tr><tr><td>DODECYLOSIARCZAN SODU (SDS)500g UN1325</td><td>Amresco</td><td>0227-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna, do elektroforezy, >=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898-1kg</td><td></td></tr><tr><td>BigTop Probówki do mikrowirówek, polipropylen</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Prefabrykowane żele 4-12%</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125BOX</td><td></td></tr><tr><td>Hemisulfan leupeptyny, 5 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>22035-0,005</td><td>Stosowany do roztworu inhibitora proteazy.</td></tr><tr><td>APROTININ, 10 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>20550-0.01</td><td>Stosowany do roztworu inhibitora proteazy.</td></tr><tr><td>PEPSTATYNA A, 5 MG</td><td>RPI Research Products</td><td>30100-0,005</td><td>Stosowany jako roztwór inhibitora proteazy.</td></tr><tr><td>OVCA429 komórki</td><td>Dar od Karen Cowden Dahl. Ph.D.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>Ogniwa ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nośniki McCoy's 5A</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM), Proszek</td><td>Corning Mediatech</td><td>50-011-PC</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (100X) aminokwas endogenny</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FB-11: Surowica bydlęca płodu, USA Źródło</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>VWR Power Źródło:</td><td>VWR</td><td>13-690-032</td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Wyjaśnienie właściwości wiążących białek ukierunkowanych na chromatynę może być bardzo trudne ze względu na złożoną naturę chromatyny i heterogeniczną naturę większości kompleksów modyfikujących chromatynę u ssaków. Aby pokonać te przeszkody, dostosowaliśmy test sekwencyjnej ekstrakcji soli (SSE) do oceny względnego powinowactwa do wiązania kompleksów związanych z chromatyną. Ten łatwy i prosty test może być wykorzystany przez osoby niebędące ekspertami do oceny względnej różnicy w powinowactwie wiązania dwóch powiązanych kompleksów, zmian powinowactwa kompleksu, gdy podjednostka zostaje utracona lub pojedyncza domena jest dezaktywowana, oraz zmiany powinowactwa wiązania po zmianach w krajobrazie chromatyny. Poprzez sekwencyjne ponowne zawieszanie chromatyny luzem w rosnących ilościach soli, jesteśmy w stanie profilować elucję określonego białka z chromatyny. Korzystając z tych profili, jesteśmy w stanie określić, w jaki sposób zmiany w kompleksie modyfikującym chromatynę lub zmiany w środowisku chromatyny wpływają na interakcje wiążące. Łącząc SSE z innymi testami in vitro i in vivo, możemy określić rolę poszczególnych domen i białek w funkcjonalności kompleksu w różnych środowiskach chromatyny.

W niniejszej pracy przedstawiamy zalety i zastosowania powszechnie stosowanej metody sekwencyjnej ekstrakcji solnej (SSE), którą dostosowaliśmy na podstawie literatury6. W Rysunku 1 porównujemy powtarzalność SSE z ekstrakcją białek w sposób niesekwencyjny, analizując wzorce elucji białek ARID1a i PBRM1. Przystępnie obserwujemy, że ARID1a, podjednostka kompleksu BAF, eluje głównie przy 200 mM NaCl, natomiast PBRM1, wyłączna podjednostka...

Sekwencyjna ekstrakcja soli białek związanych z chromatyną jest użytecznym narzędziem do określania właściwości wiązania dużych kompleksów białkowych. Metoda ta może być stosowana do oceny roli poszczególnych podjednostek lub domen w ogólnym powinowactwie kompleksu białkowego do chromatyny masowej.

Sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Ogólnym celem procedury sekwencyjnej ekstrakcji solnej jest charakterystyka profili wiązania białek do chromatyny całkowitej oraz ocena, w jaki sposób wiązanie to ulega zmianie podczas manipulacji białkiem lub jego środowiskiem. Metoda ta pozwala zmierzyć względne powinowactwo regulatorów epigenetycznych do chromatyny i może być wykorzystana do oceny, jak interakcje te zmieniają się pod wpływem manipulacji genetycznych, chemicznych i środowiskowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona szybki i niedrogi sposób oceny profili wiązania białek wiążących się z chromatyną.Osoby nowo zajmujące się dziedziną chromatyny często mają trudności z immunoprecypitacją chromatyny, czyli ChIP. Sekwencyjna ekstrakcja solna to stara technika, której mogą użyć nawet niedoświadczeni naukowcy, aby odpowiedzieć na wiele tych samych pytań. Aby rozpocząć procedurę, należy zebrać 8 000 000 komórek z każdej badanej linii komórkowej.Każdą próbkę komórek przemyć dwukrotnie pięcioma mililitrami lodowatego PBS. Ponownie zawiesić każdą próbkę w jednym mililitrze buforu hipotonicznego z inhibitorami proteaz. Przenieść zawiesiny komórkowe do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra.Mieszać zawiesiny przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie wirować zawiesinę przez pięć minut w tej samej temperaturze przy 6 000 G. Odrzucić nadsącz. Wyposażyć mikropipetę w końcówkę o pojemności 1 mL.Do osadu dodać 200 µL bezzolowego zmodyfikowanego buforu RIPA z inhibitorami proteaz. Stukać końcówką pipety o dno probówki do mikrocentryfugi, aby pobrać osad do końcówki. Pipetować osad w górę i w dół 15 razy.Wraz z rozpadem pelletu próbka powinna stać się gęsta i lepka. W ten sposób należy zhomogenizować każdą próbkę, a następnie inkubować je na lodzie przez trzy minuty. Następnie próbki należy odwirować przy 6500 G w temperaturze 4 °C przez trzy minuty.Przenieś nadsączówki do czystych probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Do każdego osadu dodaj 200 mililitrów zmodyfikowanego buforu RIPA z 100 milimolarnym chlorkiem sodu oraz inhibitorami proteaz. Resuspenduj osad, pipetując go w górę i w dół 15 razy.Jeśli osad początkowo trudno jest zassać do końcówki pipety, należy lekko uderzyć końcówką o dno probówki. Powtórz tę czynność dla każdej próbki, a następnie inkubuj próbki na lodzie przez trzy minuty. Odwiruj próbki z prędkością 6500 G w temperaturze 4 °C przez trzy minuty.Przenieś nadsączniki do nowych probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Kontynuuj ekstrakcję próbek w zmodyfikowanych roztworach buforu RIPA z rosnącymi stężeniami chlorku sodu. Gdy osad przestanie pozostawać na dnie probówki, przed zlaniem nadsącznika umieść osad w zakrętce probówki wirówki.Po seryjnej ekstrakcji solnej, do każdej z pięciu frakcji nadsączu dla każdej próbki należy dodać 70 mililitrów czterokrotnego barwnika do ładowania białek. Na żel akrylamidowy SDS należy nanieść 30 mikrolitrów każdej frakcji. Następnie należy wykonać standardowy western blot poprzez przeniesienie białek na membranę i ich barwienie odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi.Inkubuj blot w przeciwciałach wtórnych znakowanych barwnikiem podczerwonym, a następnie wykonaj obrazowanie blota. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby obliczyć intensywność prążka dla każdego stężenia soli. Wykreśl zależność intensywności prążka od stężenia soli, aby określić profil elucji analizowanego białka.Sekwencyjna ekstrakcja solna białek ARID1a i Polybromo 1 wykazała spójną elucję przy stężeniach soli odpowiednio 200 i 300 millimolar. Niesekwencyjna ekstrakcja solna tych samych białek dała mniej spójne wyniki. Czas inkubacji musi zostać zoptymalizowany dla każdego badanego białka.W związku z tym zastosowano SSE w celu zbadania profili elucji po różnych czasach inkubacji. Aktywator transkrypcyjny, Polybromo 1, wykazał podobne profile elucji przy inkubacji przez 3 minuty oraz 10 minut. Represor transkrypcyjny, Polycomb Repressive Complex 1, reprezentowany przez BMI1, wymagał więcej niż 3 minut w celu uwolnienia z chromatyny.Interakcje białko-białko badano poprzez analizę zmian w profilach elucji. W obecności inhibitora białko BRD4 eluowało przy niższych stężeniach soli niż bez inhibitora. Różnice we wzorcach histonowych zaobserwowano po potraktowaniu komórek inhibitorem deacetylazy histonowej, co zmieniło krajobraz chromatyny.Zmiany w wiązaniu białek w warunkach stresu genomicznego komórek znalazły odzwierciedlenie również w profilach elucji. W tym przypadku zwiększenie stężenia soli niezbędnego do elucji sugerowało, że Polybromo 1 wiąże się silniej z chromatyną po uszkodzeniu DNA doksorubicyną. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje od dwóch do trzech godzin.Podczas wykonywania tej procedury należy dążyć do maksymalnej spójności w traktowaniu każdej próbki. Procedurę tę można zastosować w początkowych etapach badania mającego na celu wyjaśnienie mechanizmu i regulacji białka wiążącego chromatynę. Pozwala to zaoszczędzić czas i środki finansowe, unikając niepotrzebnych badań w całym genomie.

sequential-salt-extractions-for-analysis-bulk-chromatin-binding

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Identyfikacja bezpośrednich celów cząsteczek ukierunkowanych na genom pozostaje głównym wyzwaniem. Aby zrozumieć, w jaki sposób cząsteczki wiążące DNA angażują się w genom, opracowaliśmy metodę, która opiera się na sieciowaniu małych cząsteczek w celu wyizolowania chromatyny (COSMIC).

Mapowanie całego genomu interakcji lek-DNA w komórkach za pomocą COSMIC (sieciowanie małych cząsteczek w celu izolacji chromatyny)

MyoD to miogenny czynnik transkrypcyjny o dużej zdolności do indukowania miogennego transdyferencjacji wielu w pełni zróżnicowanych linii komórkowych niezwiązanych z mięśniami. Mechanizmy epigenetyczne zaangażowane w tę transdyferencjację są w dużej mierze nieznane. Tutaj opisujemy metodę oczyszczania z podwójnym powinowactwem, a następnie spektrometrię mas, aby wyczerpująco scharakteryzować partnerów MyoD.

Identyfikacja interaktomii MyoD za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa sprzężonego ze spektrometrią mas

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający osiągnąć rozdzielczość oddziaływań białko-DNA w pobliżu par zasad. Uzyskuje się to poprzez traktowanie egzonukleazą fragmentów DNA selektywnie wzbogaconych przez immunoprecypitację chromatyny (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości.

Metoda ChIP-exo: identyfikacja interakcji białko-DNA z precyzją bliską par zasad

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Ten protokół przedstawia metodę izolacji chromatyny specyficzną dla locus, opartą na rekombinacji specyficznej dla miejsca, w celu oczyszczenia interesującego miejsca pojedynczej kopii genu w jego natywnym kontekście chromatyny z pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae.

Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Poznaj sekwencyjną ekstrakcję soli do analizy wiązania białek z chromatyną. Ta szybka i ekonomiczna metoda pozwala ocenić wpływ manipulacji genetycznych, chemicznych i środowiskowych na interakcje epigenetycznych regulatorów z chromatyną.

Sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę

Przeglądaj więcej filmów