Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Ogólnym celem niniejszego protokołu generowania ludzkich organoidów mózgu pochodzących z iPSC jest modelowanie wczesnych zaburzeń neurorozwojowych u ludzi. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju ludzkiego mózgu, takie jak rola syntesomów i rzęsek w nowej neurogenezie oraz pierwotnej mikrocefalii. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona solidny i szybki model pozwalający na uzyskanie powtarzalnych wyników z organoidów mózgu pochodzących z iPSC pacjentów.

Procedurę zaprezentuje Elke Gabriel, stażysta podoktorski z mojego laboratorium w Center for Molecular Medicine w Kolonii. Aby rozpocząć procedurę, należy zebrać neurosfery za pomocą mikropipety 200 µL, używając końcówki 2 mm uprzednio przeciętej sterylnymi nożyczkami. Następnie należy umieścić neurosfery w odstępach około 5 mL od siebie na folii parafinowej w szalce 100 mL.

Następnie ostrożnie usuń jak największą ilość pozostałego medium. Po tym dodaj kroplę matrycy EHS na każdą pojedynczą neurosferę. Inkubuj krople matrycy EHS z neurosferami przez 15 minut w temperaturze 37 °C.

Następnie ostrożnie wypłucz neurosfery z folii parafinowej, używając pożywki do neurosfer. Po tym inkubuj neurosfery przez kolejne cztery dni, dodając dwa mililitry świeżej pożywki do neurosfer w drugim dniu. W tej procedurze dodaj 100 mililitrów pożywki do organoidów mózgu do każdej kolby z mieszadłem przez jej boczne ramiona.

Następnie podgrzej medium w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 minut. Upewnij się, że wszystkie neurosfery są od siebie oddzielone. Jeśli dwie lub więcej sfer są połączone poprzez macierz EHS, rozdziel je, przecinając łączącą je macierz skalpelem.

Ustaw program mieszania na 25 RPM. Ostrożnie przenieś neurosfery osadzone w matrycy EHS do kolb z mieszadłem zawierających 100 ml pożywki do organoidów. Następnie rozmieść kolby z mieszadłem na platformie z mieszadłem magnetycznym w inkubatorze na 14 dni w temperaturze 37 °C.

Jest to dzień zero hodowli organoidów. Wymieniaj medium raz w tygodniu, usuwając połowę medium i dodając taką samą ilość świeżego medium. Na tym etapie, w 14. dniu, zbierz organoidy z hodowli w kolbie z mieszadłem (spinner flask), używając wcześniej przyciętej mikropipety o pojemności 1 ml.

Przenieś wszystkie organoidy do szalki 60 mm i przemyj je raz 5 mL ciepłego medium DMEM F12 przez 3 minuty. Następnie przygotuj probówkę 1,5 mL zawierającą 500 µL ciepłego, 4% PFA. Umieść każdy organoid osobno w oddzielnej probówce i utrwalaj przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie za pomocą pętli do szczepienia należy usunąć organoidy. Potem usunąć PFA i przemyć utrwalone organoidy dwukrotnie, po 10 minut za każdym razem, przy użyciu 1 ml PBS. Następnie organoidy należy przechowywać w 1 ml PBS w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 7 dni do dalszego wykorzystania.

Aby zatopić organoidy do kriosekcjonowania, należy usunąć PBS i dodać 1 mililitr 30% roztworu sacharozy do każdej probówki w celu odwodnienia organoidów przed ich zamrożeniem. Po dodaniu roztworu sacharozy organoidy powinny unosić się na powierzchni. Organoidy należy przechowywać przez noc w roztworze sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Do następnego dnia organoidy powinny opaść na dno probówki. Następnie należy wypełnić winylową formę do preparatów 400 mililitrami związku OCT. Za pomocą pętli do szczepień należy umieścić organoid w centrum formy.

Oznacz krawędź formy nazwą próbki. Następnie zamroź formę zawierającą organoid w temperaturze -80 °C do momentu kriosekcjonowania. Następnie pokryj szklane szkiełka do kriosekcji 0,1% PLL i PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie pozostawić preparaty do wyschnięcia na trzy godziny. Przechowywać preparaty w temperaturze 4 °C i ogrzać je do temperatury pokojowej przed użyciem. Następnie wykonać seryjne cięcia kriozamrożonych organoidów o grubości od 20 do 50 µm na szklanych krioslajdach pokrytych PLL.

Pozostawić skrawki do wyschnięcia na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania. Obrazowanie immunofluorescencyjne krioskrawków organoidów wykazujących typową VZ oraz prymitywną płytkę korową. VZ rozciąga się od strony apikalnej do strony bazalnej.

Należy zauważyć, że komórki w obrębie VZ wykazują układ jąder przypominający palisadę, co sugeruje, że są to komórki glejowe radialne. Prawy panel przedstawia barwienie immunofluorescencyjne dla dodatnich NPC zlokalizowanych w VZ oraz neuronów dodatnich dla TUJ1 w prymitywnej płytce korowej. Przedstawiono tutaj dwa przykłady VZ zabarwionych za pomocą PVIM i ARL 13B.

Obszary zaznaczone białymi kwadratami zostały powiększone. Apikalne komórki glejowe radialne dzielące się po stronie apikalnej strefy VZ są dodatnie pod kątem PVIM. Płaszczyzna podziału komórki w anafazie jest pozioma względem linii powierzchni światła, która jest zaznaczona barwieniem ARL 13B.

Po opanowaniu, technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu 23 dni, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby pamiętać o okresowej kontroli jakości oraz sprawdzaniu obecności mikroplasmy w kulturach. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się neurobiologią rozwoju do zgłębiania mechanizmów neurorozwoju w ludzkich organoidach mózgu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak generować ludzkie organoidy mózgu z różnych linii komórkowych iPSC, w tym z linii komórkowych pacjentów z zaburzonymi funkcjami komórkowymi.