Dojrzewanie kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych w bioprzewodach za pomocą stymulacji elektrycznej

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie kontrolowanych trójwymiarowych metod hodowli komórek w stymulacji elektrycznej w celu promowania dojrzewania ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkanek serca, w tym na to, jak różne parametry stymulacji elektrycznej lub czas trwania wpływają na funkcję komórek serca i stan dojrzewania. Efektem końcowym są zmodyfikowane ludzkie tkanki serca o zwiększonej dojrzałości.

Implikacje tej techniki rozciągają się na zastosowania diagnostyczne, takie jak testowanie bezpieczeństwa i skuteczności nowych leków, ponieważ kardiomiocyty o dojrzałych cechach, takich jak postęp elektryczny, najprawdopodobniej posłużą jako dokładniejsze modele ludzkich komórek serca w badaniach przesiewowych leków. Połącz monomer PDMS i utwardzacz w proporcji 10:1 i dobrze wymieszaj. Pozwól mu zastygnąć na pięć minut, aby odgazować.

Następnie załadować szalkę Petriego zawierającą wzorzec do matrycy biodrutu mieszaniną PDMS. Staraj się zminimalizować tworzenie się pęcherzyków powietrza. Następnie utwardź PDMS w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie odzyskaj zestaloną formę, najpierw używając ostrego ostrza wokół krawędzi, a następnie odrywając ją. Następnie przytnij nadmiar PDMS i zbierz wszystkie szablony w woreczku do sterylizacji. Para automatycznie naklawa szablony w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut.

A następnie załaduj każdą matrycę na sterylną szalkę Petriego pod wentylacją szafy bezpieczeństwa biologicznego. Teraz dla każdego szablonu użyj pęsety, aby zamontować kawałek sterylnego jedwabnego szwu 6.0 w rowku obejmującym cały kanał. Szablony są wtedy gotowe do wysiewu komórek.

Szew posłuży jako szablon do tworzenia konstruktów 3D, które wyrównują się wzdłuż osi szwu, naśladując kształt włókien serca. Dla każdej komory wykonaj parę prostokątnych kawałków poliwęglanu, które posłużą jako rama komory stymulacji elektrycznej. Wzdłuż linii środkowej każdego elementu wywierć dwa otwory o szerokości trzech milimetrów w odległości dwóch centymetrów od siebie.

Do każdej komory przygotuj dwa pręty węglowe o długości 1,5 centymetra. Około 3 milimetry od końca każdego pręta wywierć otwór o szerokości jednego milimetra. Następnie nawlecz każdy otwór drutem platynowym i owiń jeden koniec drutu wokół pręta.

Następnie do każdej komory włóż dwa pręty między dwa kawałki poliwęglanu, tworząc ramę. Następnie wlej około dwóch mililitrów PDMS do studzienki z sześciodołkową płytką i umieść ramkę w studzience z PDMS, zanurzając dno ramek. Utwardź PDMS w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby PDMS zabezpieczył ramę.

Następnie wyjmij gotową komorę z płytki z dołączonym PDMS. Aby przetestować działanie zmontowanej komory, podłącz platynowe przewody do akumulatora i użyj woltomierza, aby sprawdzić, czy prąd przepływa przez pręty. Teraz przenieś komory funkcjonalne do woreczka sterylizacyjnego i użyj 20 minut sterylizacji parowej w temperaturze 121 stopni Celsjusza, aby przygotować je do hodowli komórkowej.

Aby przygotować żel, należy wstępnie schłodzić wszystkie składniki żelu na lodzie przed zmieszaniem ich w sterylnej probówce. Upewnij się, że kolagen i macierz pozakomórkowa są dodawane na końcu, a następnie mieszają składniki za pomocą pipetowania. Komórki mają bowiem kardiomiocyty zróżnicowane z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Zbierz komórki i dla każdej rośliny przygotowania biodrutu przygotuj 3,5 mikrolitra żelu kolagenowego zawierającego pół miliona komórek. Teraz użyj końcówki pipety P10, aby załadować około czterech mililitrów zawiesiny do szablonu kanału o długości 0,5 centymetra w każdym naczyniu. W razie potrzeby dostosuj pozycję szwu za pomocą sterylnych kleszczy, aby był w pełni rozciągnięty.

Po wysianiu komórek należy zawsze ponownie zawiesić mieszaninę komórek żelowych przed pobraniem autoklawu, aby uzyskać spójne wyniki. Po załadowaniu kanałów przykryj dno naczynia sterylnym PBS, uważając, aby nie dotknąć żelu. Zapewni to, że biodruty nie ulegną odwodnieniu podczas polimeryzacji.

Po inkubacji biodrutów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, zastąp PBS wystarczającą ilością pożywki hodowlanej, aby pokryć komórki. Zwykle wystarcza 12 mililitrów. Następnie hoduj naczynie przez tydzień, wymieniając pożywkę co drugi dzień.

W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj dwa mililitry PBS do każdej studzienki sześciodołkowej płytki, która będzie mieścić komorę stymulatora elektrycznego. Następnie za pomocą sterylnej pęsety delikatnie umieść urządzenia autoklawu w studzienkach. Po ustawieniu się na miejscu wyrzuć PBS i zastąp go pięcioma mililitrami ciepłego podłoża, które powinno całkowicie pokryć pręty węglowe.

Przed hodowlą komórek przez 24 godziny obserwuj kurczliwość kardiomiocytów w odpowiedzi na stymulację elektryczną, aby upewnić się, że komórki wychwytują bodziec elektryczny i reagują skurczami. Następnie umieść bioprzewody w komorze stymulatora elektrycznego i ustaw kanały prostopadle do prętów węglowych. Wyciągnij platynowe druty z dala od płyty, a następnie zakryj płyty.

Podłącz przewody do stymulatora elektrycznego. Ustaw stymulator tak, aby dostarczał dwufazowe impulsy jednomilisekundowe o częstotliwości jednego herca i przy trzech woltach na centymetr. Następnie przenieś preparaty ze stymulatora elektrycznego do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zwiększaj szybkość stymulacji stopniowo co 24 godziny od jednego herca w dniu zero do sześciu herców w szóstym dniu. Podczas tego tygodnia hodowli zmieniaj podłoże co drugi dzień. I codziennie obserwuj kurczliwość kardiomiocytów.

Po siedmiu dniach hodowli wstępnej w komórkach biowire ponownie uformowano żel wokół szwu. Komórki zebrały się wzdłuż osi szwu, tworząc wyrównaną tkankę serca. Komórki wykazywały ekspresję białek kurczliwych serca wykazywały sarkomeryczne prążki w aparacie skurczowym, a ich miofibryle były ustawione wzdłuż osi szwu.

Komórki w biodrucie wykazywały niższe tempo proliferacji niż komórki w ciałach embrionalnych. Gospodarka wapniowa uległa znacznej poprawie w kardiomiocytach hodowanych w biowires. Leczenie kofeiną wywołało nagłe uwolnienie wapnia z siateczki sakroplazmatycznej.

Takie stany nieustalone stwierdzono tylko w stymulowanych komórkach. Stwierdzono również istotnie wyższą częstotliwość stymulacji w zależności od amplitudy uwalniania wapnia. Ponadto kardiomiocyty hodowane w biodrutach wykazały poprawę gęstości hERG i prądu prostownika wewnętrznego w porównaniu z hodowlą w ciałach embrionalnych, które zostały dodatkowo wzmocnione przez stymulację elektryczną.

Poprawa prądu prostownika wewnętrznego była zgodna ze zwiększoną ekspresją dżinsu kanału prostownika prostowniczego potasu, KCN J2. Automatyzm: zdolność do spontanicznego bicia była znacznie wyższa w kardiomiocytach pochodzących z ciała embrionalnego w porównaniu z kontrolowanymi biodrutami. Kontrola wykazała automatyzm porównywalny z przygotowaniem biodrutu poddanego schematowi sześciu herców. Po opanowaniu konfiguracji biodrutów można wykonać w pół dnia.

Konfiguracja elektrostymulacji zajmie kilka godzin, a ostateczne wyniki można osiągnąć w ciągu dwóch tygodni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że kardiomiocyty zróżnicowane z różnych linii komórkowych lub różnych protokołów mogą nieznacznie różnić się dojrzałością i czystością. Dlatego może być konieczna optymalizacja parametrów eksperymentalnych, takich jak szybkość stymulacji komórek.

Po tej procedurze można zoptymalizować inne warunki, w tym zmienność składu komórkowego i wykorzystanie zmutowanych kardiomiocytów, aby odpowiedzieć na szereg dodatkowych pytań.