Name: Dojrzewanie kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych w bioprzewodach za pomocą stymulacji elektrycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj metodę dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych w bioprzewodach przy użyciu stymulacji elektrycznej. Ta technika umożliwia uzyskanie dojrzałych tkanek sercowych do badań nad lekami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez dotację z Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0006265), granty operacyjne z Canadian Institutes of Health Research (137352 i 143066) oraz grant Fundacji J.P. Bickell (1013821) dla SSN.

1. Mistrzowski projekt i produkcja
UWAGA: Użyj miękkiej litografii do produkcji urządzeń. Wykonaj dwuwarstwowy wzorzec SU-8 do formowania polidimetylosiloksanu (PDMS).
<ol>
	<li>Zaprojektuj urządzenie za pomocą oprogramowania do projektowania i kreślenia (rysunek 1A, po lewej). Narysuj każdą warstwę wzorca osobno. Wydrukuj projekt urządzenia na dwóch maskach fotograficznych w rozdzielczości 20 000 dpi, odpowiadających dwóm warstwom klasy master<sup="xref">15. Ustaw wzór urządzenia jako przezroczysty, a otaczający obszar jako ciemny; maski posłużą jako szablon do optycznego przeniesienia wzoru urządzenia na SU-8 za pomocą litografii (zgodnie z opisem innych15).</li>
	<li>Dozuj około 4 ml SU-8 50 na środek 4-calowej płytki krzemowej. Pokryj SU-8 50 równomiernie na płytce za pomocą powlekarki wirowej, wirując z prędkością 2,000 obrotów na minutę (RPM) przez 30 s. Piecz wafelek na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C przez 10 minut. Wystaw wafel na działanie światła ultrafioletowego (UV) o temperaturze 200 mJ/cm2.</li>
	<li>Wlej około 4 ml SU-8 2050 na środek wafla i wiruj z prędkością 2 500 obr./min przez 30 s. Piecz na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C przez 15 minut. Schłodzić do temperatury pokojowej (RT).</li>
	<li>Powtórz krok 1.3 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Przykryj powlekaną płytkę fotomaską z pierwszej warstwy przezroczystości. Wystaw wafel na działanie światła UV o temperaturze 270 mJ/cm2, aby wykonać pierwszą warstwę. Piec na płycie grzewczej o temperaturze 95 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Wykonaj drugą warstwę SU-8 2050, powtarzając krok 1.3 dwukrotnie.</li>
	<li>Dopasuj maskę drugiej warstwy do elementów na pierwszej warstwie za pomocą wyrównywacza maski. Następnie wystaw na działanie światła UV o temperaturze 240 mJ/cm2. Piec w temperaturze 95 °C przez 15 min. 
	UWAGA: Czas ekspozycji zależy od wymaganej całkowitej dawki promieniowania UV i intensywności strumienia światła UV zmierzonej w dniu poprzedzającym użycie.</li>
	<li>Rozwinąć wafel, zanurzając go w octanie eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA) i wytrząsając z prędkością 200 obr./min przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Umieść wzorzec na szalce Petriego i ostrożnie wylej mieszaninę PDMS (baza do środka sieciującego w stosunku wagowym 10:1) na środek wafla. Zakryj wszystkie funkcje i unikaj pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Podgrzewać w piekarniku w temperaturze 70 °C przez 2 godziny. Za pomocą ostrego ostrza przeciąć krawędź szablonu biodrutu PDMS (Rysunek 1A, po prawej). Oderwij PDMS od wzorca. Przytnij urządzenie za pomocą ostrza. Umieścić szablon biodrutu PDMS w woreczku sterylizacyjnym i autoklawie parowym w temperaturze 121 °C przez 20 minut.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) umieść matrycę biodrutu PDMS na szalce Petriego. Użyj pęsety, aby przytrzymać i zamontować kawałek sterylnego nici chirurgicznego (6-0) w środku kanału mikrostudzienki PDMS, umieszczając ją w rowkach na obu końcach kanału (ryc. 1B-I).</li>
</ol>
2. Stworzenie Komory Stymulacji Elektrycznej
<ol>
	<li>Wykonaj parę prostokątnych kawałków poliwęglanu (długość x szerokość x grubość: 2 cm x 0,85 cm x 0,35 cm) i użyj ich jako ramy komory stymulacji elektrycznej (rysunek 2).</li>
	<li>Wywierć dwa otwory o szerokości 3 mm w odległości 2 cm od siebie wzdłuż linii środkowej każdego elementu ramy z poliwęglanu.</li>
	<li>Wytnij dwa kawałki prętów węglowych o długości 1,5 cm. Wywierć otwór o szerokości 1 mm przez pręt węglowy około 3 mm od końca. Przeciągnij drut platynowy przez otwór pręta węglowego i dokręć drut, owijając go wokół pręta węglowego. Przymocuj klips do drugiego końca platynowego drutu, aby później połączyć go ze stymulatorem elektrycznym.</li>
	<li>Włóż pręty węglowe do elementów ramy z poliwęglanu. Umieść zmontowaną ramę z prętami węglowymi w studzience z sześciodołkową płytą.</li>
	<li>Wlej 2 ml PDMS do studzienki. Zanurz spód ram z poliwęglanu w PDMS, utrzymując powierzchnię PDMS na poziomie blisko, ale nie sięgając do dna prętów węglowych. Podgrzewać w piekarniku w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Wyjąć komorę stymulacji elektrycznej z płytki sześciodołkowej i umieścić ją w woreczku sterylizacyjnym do sterylizacji parowej w temperaturze 121 °C na 20 minut.</li>
</ol>
3. Dysocjacja enzymatyczna hPSC-CM
<ol>
	<li>Skłonić hPSC do różnicowania się w kardiomiocyty za pomocą ustalonego protokołu4. 
	UWAGA: Krótko mówiąc, generuj kardiomiocyty za pomocą ustalonych protokołów ciała embrionalnego (EB) w pożywce stem pro poprzez sekwencyjną suplementację białkiem morfogenetycznym kości 4, podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów, aktywiną A, czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego i homologiem Dickkopfa 14. Użyj EB od 20 do 34 dnia różnicowania do produkcji biodrutów.</li>
	<li>Zebrać EB z dolnej płytki mocującej za pomocą końcówki do pipety P1,000 i przenieść do stożkowej probówki. Osad przez odwirowanie przez 5 minut przy 125 x g i RT. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą wstępnie podgrzanej kolagenazy typu I o temperaturze 37 °C zawierającej 1% dezoksyrybonukleazy I (DNAse I). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w celu roztrawienia.</li>
	<li>Dodać 5 ml wstępnie podgrzanego podłoża do płukania o temperaturze 37 °C i wirować przez 5 minut przy 125 x g i RT. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 2 ml roztworu trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki zatrzymującej zawierającej 3% (v/v) DNazy I.</li>
	<li>Umieścić igłę o masie 20 g (0,9 mm) w strzykawce o pojemności 5 ml i przepuścić przez nią zawiesinę EB 3-5 razy.</li>
	<li>Dodać 7 ml pożywki płuczącej i wirować przy 280 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulat w zmodyfikowanym podłożu Dulbecco firmy Iscove (IMDM) i przechowywać na lodzie. Określ numer komórki za pomocą hemocytometru. Weź 0,5 x 106 komórek i osad przez odwirowanie przy 280 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić wszystkie składniki żelu na lodzie przed zmieszaniem ich w sterylnej probówce. Wymieszaj następujące składniki żelu kolagenowego (stężenie końcowe): 2,1 mg / ml kolagenu typu I z ogona szczura, 24,9 mM glukozy, 23,8 mM NaHCO3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES i 10% macierzy zewnątrzkomórkowej w 1x pożywce M199. Na końcu dodaj kolagen i macierz zewnątrzkomórkową. Mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Zawieś 0,5 x 106 komórek z 3,5 μl żelu kolagenowego i dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Za pomocą końcówki pipety P10 dodaj 4 μl zawiesiny komórek do kanału o długości 0,5 cm (Rysunek 1B-II). W razie potrzeby wyreguluj położenie szwu za pomocą sterylnych kleszczy.</li>
	<li>Przykryj dno szalki Petriego sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), uważając, aby nie dotknąć żelu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Zastąp PBS 12 ml pożywki hodowlanej (np. stem pro lub pożywki zalecanej przez producenta komórki), wystarczającej do pokrycia komórek (ryc. 1B-III). Hodowla w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 1 tydzień. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.</li>
</ol>
4. Stymulacja elektryczna w uprawie biodrutów
<ol>
	<li>W BSC dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki sześciodołkowej płytki, w której będzie mieściła się komora stymulatora elektrycznego. Użyj sterylnej pęsety, aby delikatnie umieścić autoklawowane urządzenie do stymulacji elektrycznej w studzience. Wyrzuć PBS ze studni.</li>
	<li>Przykryj pręty węglowe 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Użyj sterylnej pęsety, aby zamontować biodruty w komorze stymulacji elektrycznej i ustawić je prostopadle do prętów węglowych (rysunek 2).</li>
	<li>Umieść pokrywkę na wierzchu płytki sześciodołkowej, ale pozostaw wystarczającą ilość platynowych przewodów wychodzących na zewnątrz płytki, aby połączyć się ze stymulatorem elektrycznym. Umieścić sześciodołkową płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i podłączyć przewód platynowy do stymulatora elektrycznego.</li>
	<li>Stymulować bioprzewody za pomocą stymulatora elektrycznego o następującym ustawieniu: dwufazowy powtarzający się impuls, czas trwania impulsu 1 ms, 3 V/cm i 1 impuls na sekundę (PPS). Podnoś PPS co 24 godziny do następujących wartości: 1,83, 2,66, 3,49, 4,82, 5,15 i 6. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.</li>
	<li>Obserwuj kurczliwość kardiomiocytów w odpowiedzi na stymulację elektryczną pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu. 
	UWAGA: Po tygodniu stymulacji biodruty stają się dojrzałe (patrz sekcja z wynikami).</li>
</ol>

<ol><li>Sun, X., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+hydrogel-based+strategies+for+application+in+cardiac+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration.</a> Biomed Mater. 10 (3), 034005(2015).</li>
<li>Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+strategies+of+engineered+tissues+and+their+application+in+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration.</a> Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).</li>
<li>Hastings, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+and+cell+delivery+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug and cell delivery for cardiac regeneration.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiovascular+progenitor+cells+develop+from+a+KDR%2B+embryonic-stem-cell-derived+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population.</a> Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Snir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+ultrastructural+and+proliferative+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).</li>
<li>Dolnikov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+intracellular+Ca2%2B+handling+and+the+role+of+sarcoplasmic+reticulum+in+the+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction.</a> Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).</li>
<li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adolescence%3A+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+a+differentiated+cardiac+muscle+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct.</a> Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).</li>
<li>Radisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assembly+of+engineered+myocardium+by+electrical+stimulation+of+cardiac+myocytes+cultured+on+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).</li>
<li>Schaaf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+engineered+heart+tissue+as+a+versatile+tool+in+basic+research+and+preclinical+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology.</a> PLoS One. 6 (10), e26397(2011).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+engineered+human+myocardium+with+mechanical+loading+and+vascular+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture.</a> Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).</li>
<li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biowire%3A+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li>
<li>Lake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/protocolexchange/protocols/4049">Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li>
<li>Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+applications+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Cardiac applications for human pluripotent stem cells.</a> Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).</li>
<li>Radisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+correlate+with+cell+density+and+cell+viability+in+engineered+cardiac+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue.</a> Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Niniejszy manuskrypt opisuje konfigurację i wdrożenie platformy inżynieryjnej, biowire, w celu poprawy dojrzewania hPSC-CM. Urządzenie może być wykonane w standardowych zakładach mikrofabrykacji, a biodruty mogą być wytwarzane przy użyciu popularnych technik hodowli komórkowych i stymulatora elektrycznego.
O ile nam wiadomo, nie ma zgłoszonej metody podobnej do biodrutów. Strategia ta pokazuje, że poprawa właściwości dojrzewania była zależna od schematu stymulacji elektrycznej, o czym świadczy...

Terapia oparta na komórkach jest jedną z najbardziej obiecujących i zbadanych strategii naprawy/regeneracji serca. Zostało to wsparte przez inżynierię tkanek serca i wspólne dostarczanie biomateriałów1,2. Większość dostępnych źródeł komórek została przebadana na modelach zwierzęcych pod kątem ich potencjalnie korzystnego wpływu na uszkodzone, chore lub starzejące się serca3. W szczególności podjęto znaczne wysiłki w celu wykorzystania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) pochodzących z kardiomiocytów (hPSC-CM), potencjalnie nieograniczonego źródła komórek autologicznych w inżynierii tkankowej serca. hPSC-CM mogą być tworzone przy użyciu kilku ustalonych protokołów4,5,6. Jednak uzyskane komórki wykazują fenotypy podobne do płodowych, z szeregiem niedojrzałych cech w porównaniu z dorosłymi kardiomiocytami komorowymi7,8. Może to stanowić przeszkodę w zastosowaniu hPSC-CM jako modeli dorosłej tkanki serca w badaniach nad odkrywaniem leków oraz w opracowywaniu modeli chorób serca u dorosłych9.
Aby przezwyciężyć to ograniczenie niedojrzałości fenotypowej, aktywnie badano nowe podejścia wspomagające dojrzewanie kardiomiocytów. Wczesne badania wykazały skuteczne właściwości pro-dojrzewające w kardiomiocytach noworodków szczurów poprzez cykliczne mechaniczne10 lub stymulację elektryczną11. Wykazano również, że zagęszczanie żelu i cykliczna stymulacja mechaniczna poprawiają niektóre aspekty dojrzewania hPSC-CM 12,13, przy minimalnym poprawie właściwości elektrofizjologicznych i obchodzenia się z wapniem. W związku z tym opracowano system platformy o nazwie "drut biologiczny" (biowire), dostarczając zarówno wskazówek strukturalnych, jak i stymulacji pola elektrycznego w celu przyspieszenia dojrzewania hPSC-CMs14. System ten wykorzystuje mikroprefabrykowaną platformę do tworzenia wyrównanej tkanki serca, która jest podatna na stymulację polem elektrycznym. Można to wykorzystać do poprawy dojrzałości strukturalnej i elektrofizjologicznej hPSC-CM. Tutaj opisujemy szczegóły wytwarzania takich biodrutów.

<table><tbody><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A-4544</td><td>hPSC-CM pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>kompozyt AutoCAD Autodesk</td><td>, Inc</td><td></td><td>Oprogramowanie do projektowania urządzenia</td></tr><tr><td>Pręty węglowe, & Oslash; 3 mm</td><td></td><td></td><td>Komponent komory stymulatora elektrycznego</td></tr><tr><td>Kolagen, typ 1, ogon szczura</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>Żel kolagenowy: 2,1 mg/ml kolagenu typu I z ogona szczura w 24,9 mM glukozy, 23,8 mM NaHCO3, 14,3 mM NaOH, 10 mM HEPES, w 1x pożywce M199 z 10% Matrigelem o obniżonym współczynniku wzrostu.</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>0,2% kolagenazy typu I (w/v) i 20% FBS (v/v) w PBS z Ca2+ i Mg2+. Sterylizować za pomocą 0,22 &mu; m przefiltrować i zrobić 12 ml porcji. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I (DNaza I)</td><td>EMD Milipor</td><td>260913-25MU</td><td>Przygotować 1 mg/ml roztworu podstawowego DNazy I w wodzie. Przefiltrować sterylnie i przechowywać 0,5 ml podwielokrotności w temperaturze &minus; 20 &stopni; C</td></tr><tr><td>Wiertła i wiertła (&Oslash; 1 mm i 2 mm)</td><td>Dremel</td><td></td><td>Wiercenie otworów w ramach z poliwęglanu</td></tr><tr><td>Stymulator elektryczny</td><td>Trawa</td><td>s88x</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>WISENT Inc.</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Składnik żelu kolagenowego</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>MilliQ</td><td></td><td>18.2 M&Omega; &środkowa kropka; cm przy 25 & stopniach; C, ultraczysty, do wytwarzania wszystkich rozwiązań</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Składnik żelu kolagenowego</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Torrey Pines</td><td>HS40</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Ilbecco's Medium (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Nakładka do maski</td><td>EVG&nbsp;</td><td>EVG 620</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, obniżony współczynnik wzrostu&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Składnik żelu kolagenowego</td></tr><tr><td>Medium 199 (M199)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11825015</td><td>Składnik żelu kolagenowego</td></tr><tr><td>Monotioglicerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M-6145</td><td>hPSC-CM pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (P/S)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z Ca2+ i Mg2+&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Plate (6-dołkowy)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Plate (6-dołkowy), niskie mocowanie</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Druty platynowe, 0,2 mm</td><td></td><td></td><td>Element komory stymulatora elektrycznego</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dow</td><td>Corning Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Eter monometylowy glikolu propylenowego octan (PGMEA)</td><td>Łania i Ingalls Inc.</td><td></td><td>Aby opracować woreczek na wafel</td></tr><tr><td>, otwierane</td><td>konwertery</td><td>92308</td><td>Do sterylizacji parowej</td></tr><tr><td>Wafel krzemowy, 4-calowy</td><td>UniversityWafer Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Składnik żelu kolagenowego</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Składnik żelu kolagenowego</td></tr><tr><td>Powlekarka sprin</td><td>Specjalistyczne systemy powlekania</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana StemPro-34</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10639011</td><td>Pożywka hodowlana hPSC-CM. Aby przygotować 50 ml, dodaj 1,3 ml suplementu, 500 &mu; L 100 i razy; L-glutamina, 250 &mu; L 30 mg/ml transferyny, 500 &mu; l 5 mg/ml kwasu askorbinowego, 150 &mu; L z 26 &mu; l /2 ml monotioglicerolu (MTG) i 500 &mu; L (1%) penicylina/streptomycyna.</td></tr><tr><td>Medium do</td><td></td><td></td><td>mycia: FBS (1:1)</td></tr><tr><td>SU-8 50&nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>fotorezyst, komponent główny</td></tr><tr><td>SU-8 2050&nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>fotorezyst, składnik główny</td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Roche</td><td>10-652-202</td><td>hPSC-CM pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA, 0,25%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>pożywka hodowlana hPSC-CM</td></tr><tr><td>Podłoże</td><td></td><td></td> myjące <td>IMDM zawierające 1% penicyliny/streptomycyny</td></tr></tbody></table>

dojrzewanie kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych w bioprzewodach za pomocą stymulacji elektrycznej

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Kardiomiocyty pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) były obiecującym źródłem komórek i zachęciły do zbadania ich potencjalnych zastosowań w badaniach kardiologicznych, w tym w odkrywaniu leków, modelowaniu chorób, inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Jednak komórki wytwarzane przez istniejące protokoły wykazują zakres niedojrzałości w porównaniu z natywnymi dorosłymi kardiomiocytami komorowymi. Podjęto wiele wysiłków w celu osiągnięcia dojrzałości hPSC-CM, przy czym do tej pory osiągnięto jedynie umiarkowane dojrzewanie. W związku z tym opracowano system inżynieryjny o nazwie biowire, który dostarcza zarówno fizycznych, jak i elektrycznych wskazówek, które prowadzą hPSC-CM do bardziej dojrzałego stanu in vitro. System wykorzystuje mikroprefabrykowaną platformę do wstrzykiwania hPSC-CM w żelu kolagenowym typu I wzdłuż sztywnego szwu szablonowego w celu złożenia w wyrównaną tkankę serca (biowire), która jest poddawana stymulacji polem elektrycznym z coraz większą częstotliwością. W porównaniu z niestymulowanymi kontrolami, stymulowane kardiomiocyty bioprzewodowe wykazują zwiększony stopień dojrzałości strukturalnej i elektrofizjologicznej. Takie zmiany są zależne od szybkości stymulacji. Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje projektowanie i tworzenie biodrutów.

Uzasadnieniem zastosowania szwu w bioprzewodach (biowires) jest pełnienie roli matrycy dla formowania konstrukcji 3D, które ustawiają się wzdłuż jednej osi i naśladują kształt włókien sercowych. Wykazano, że po siedmiu dniach hodowli w bioprzewodzie komórki przebudowały żel wokół szwu (Rysunek 3A). Komórki zgromadziły się wzdłuż osi szwu, tworząc ukierunkowaną tkankę serca (Rysunek 3). Po 7 dniach prekultywacji bioprzewody poddano 7-dniowej stymulacji pol...

Platforma biowire serca to metoda in vitro używana do dojrzewania ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hPSC-CM) poprzez połączenie trójwymiarowej hodowli komórek ze stymulacją elektryczną. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono szczegółową konfigurację platformy biowire serca.

Dojrzewanie kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych w bioprzewodach za pomocą stymulacji elektrycznej

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie kontrolowanych metod trójwymywowej hodowli komórek w stymulacji elektrycznej w celu promowania dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z ludzkich embrionalnych oraz indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkanki serca, w tym w kwestii tego, jak różne parametry stymulacji elektrycznej lub czas trwania stymulacji wpływają na funkcję komórek serca i stopień ich dojrzałości. Wynikiem końcowym są inżynieryjne ludzkie tkanki serca o zwiększonym stopniu dojrzałości.Zastosowania tej techniki obejmują diagnostykę, w tym badanie bezpieczeństwa i skuteczności nowych leków, ponieważ kardiomiocyty o dojrzałych charakterystykach, takich jak przewodzenie elektryczne, najprawdopodobniej będą stanowić dokładniejsze modele ludzkich komórek serca w badaniach przesiewowych leków. Połączyć monomer PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1 i dokładnie wymieszać. Pozostawić na pięć minut w celu odgazowania.Następnie napełnić szalkę Petriego zawierającą matrycę dla bioprzewodu mieszanką PDMS. Należy starać się zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza. Następn

maturation-human-stem-cell-derived-cardiomyocytes-biowires-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj demonstrujemy nieinwazyjną metodę oceny kurczliwości kardiologicznych urządzeń medycznych przy użyciu monowarstw 2D indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM), platerowanych na elastycznym podłożu, w połączeniu z mikroskopią opartą na wideo. Narzędzie to będzie przydatne do oceny in vitro właściwości skurczowych urządzeń do elektrofizjologii serca.

Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj metodę dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych w bioprzewodach przy użyciu stymulacji elektrycznej. Ta technika umożliwia uzyskanie dojrzałych tkanek sercowych do badań nad lekami.

Dojrzewanie kardiomiocytów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych w bioprzewodach za pomocą stymulacji elektrycznej

Przeglądaj więcej filmów