Name: Oznaczanie względnej siły działania przeciwciała monoklonalnego anty-TNF (mAb) przez neutralizację TNF przy użyciu metody bioanalitycznej in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 7 s
Description: Poznaj metodę oznaczania względnej siły działania przeciwciał anty-TNF przy użyciu komórek WEHI 164. Protokół umożliwia porównanie efektywności neutralizacji cytokiny TNF-alfa w badaniach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Radę Nauki i Technologii (CONACYT), Meksyk grant PEI CONACYT 2015 220333, bez udziału w projektowaniu badania.

<ol><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+A+Review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Patho%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: A Review of programmed cell death.</a> Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Darwish, R. S. <a target="_blank" href="https://www.dovepress.com/regulatory-mechanisms-of-apoptosis-in-regularly-dividing-cells-peer-reviewed-article-CHC">Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells.</a> Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).</li>
<li>Tracey, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18155297">Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review.</a> Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).</li>
<li>Körner, H., Sedgwick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+necrosis+factor+and+lymphotoxin%3A+Molecular+aspects+and+role+in+tissue-specific+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity.</a> Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).</li>
<li>Wong, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17916444">TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions.</a> Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).</li>
<li>Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+antagonists%3A+different+kinetics+and%2For+mechanisms+of+action+may+explain+differences+in+the+risk+for+developing+granulomatous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection.</a> Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).</li>
<li>Karvinen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+time-resolved+fluorescence+quenching+assay+%28LANCE%29+for+caspase-3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3.</a> J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).</li>
<li>Ren, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+TRAIL+death+receptors+DR4+and+DR5+by+the+signal+recognition+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle.</a> Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).</li>
<li>Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+CD8%2B+T+cells+to+control+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3(2001).</li>
<li>Ramasubramanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamasubramanyan%2C+N+%22Low+acidic+species+compositions+and+methods+for+producing+and+using+the+same%22">Low acidic species compositions and methods for producing and using the same</a>. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li>
<li>Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WEHI+164+subclone+13+assay+for+TNF%3A+sensitivity%2C+specificity%2C+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability.</a> Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).</li>
<li>Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+formulations+of+recombinant+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor.</a> Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).</li>
<li>Ponnappan, S., Ponnappan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+immune+function%3A+molecular+mechanisms+to+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Antiox+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions.</a> Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).</li>
<li>Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+sensitization+to+TNF-induced+apoptosis+by+acute+glutathione+depletion+in+murine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes.</a> Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).</li>
<li>Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+TNF+cytokine+neutralization+with+a+vNAR+from+Heterodontus+francisci+shark%3A+a+potential+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use.</a> mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).</li>
<li>Männel, D. N., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+induction+of+tumor+necrosis+factor+production+in+human+monocytes+requires+complete+S-form+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide.</a> Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).</li>
<li>Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+inhibitors-state+of+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge.</a> Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Charakterystyka ta pomaga określić a priori biologiczne zachowanie opracowywanej cząsteczki przed przeprowadzeniem kosztownych i czasochłonnych badań klinicznych. Jest również przydatny do zwalniania partii po partii zatwierdzonego produktu leczniczego. Warto wspomnieć, że testy te są przydatne do określenia, czy cząsteczka ma odpowiedni efekt biologiczny w odniesieniu do jej mechanizmu działania. Metoda bioanalityczna przedstawiona w tym samouczku ma kluczowe znaczenie dla porównania różnych cząsteczek anty-TNF...

Siła biologiczna to ilościowa miara aktywności biologicznej oparta na atrybutach badanego produktu, które są powiązane z odpowiednimi właściwościami biologicznymi, podczas gdy ilość (wyrażona w masie) jest fizykochemiczną miarą zawartości białka. Testy siły działania, wraz z innymi metodologiami analitycznymi, są wykonywane w ramach badań zgodności, stabilności i porównywalności produktów. W tym sensie pomiary siły działania są wykorzystywane do wykazania, że partie produktu spełniają krytyczne atrybuty jakości (CQA) lub kryteria akceptacji we wszystkich fazach badań klinicznych i po dopuszczeniu do obrotu.
Apoptoza to zaprogramowana śmierć komórki, naturalnie występująca, gdy komórki są zainfekowane wirusem lub gdy komórki są zestresowane przez czynnik środowiskowy, który zagraża żywotności i funkcji komórki1,2. Między innymi hamowanie apoptozy, czyli neutralizacja biologiczna, jest jednym z zasadniczo znanych mechanizmów terapeutycznych mAb, szczególnie w leczeniu chorób przewlekłych, takich jak choroby zapalne o podłożu immunologicznym. Cząsteczki anty-TNFα wywierają swoje właściwości terapeutyczne poprzez blokowanie interakcji czynnika martwicy nowotworu alfa (TNFα) z receptorami powierzchniowymi komórek p55 i p75<klasa SUP='xref'>3, zapobiegając w ten sposób szlakom sygnałowym, które ostatecznie prowadzą do apoptozy komórkowej. 
TNFα może powodować stany zapalne w niektórych chorobach przewlekłych4. TNFα jest fałszywie wydzielany do środowiska zewnątrzkomórkowego przez makrofagi, które są strażnikami wrodzonego układu odpornościowego i głównymi aktorami tego rodzaju choroby5. Jako powszechna ścieżka, deregulacja TNFα jest związana z patogenezą tych chorób. Bez kontroli i pod ciągłą indukcją i stresem komórkowym, TNFα indukuje śmierć komórek i degenerację tkanek, ostatecznie prowadząc do reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby Leśniowskiego-Crohna i innych profili patologicznych6.
Antagoniści TNF, którzy blokują interakcję między TNF a jego receptorami, są coraz częściej stosowane jako skuteczna terapia zmniejszająca symptomatologię i hamująca postęp tych chorób. Obecnie leki anty-TNFα są szeroko stosowane do kontrolowania ogólnoustrojowego stężenia tej cytokiny, zapobiegając w ten sposób dalszej degeneracji zaangażowanych tkanek. W tym sensie konieczne jest zapewnienie powtarzalnego i solidnego testu biologicznego w celu opisania specyficznej zdolności leku do osiągnięcia efektu biologicznego. 
W tym protokole podkreślone są kluczowe kroki - zidentyfikowane podczas opracowywania testu neutralizacji - dla skutecznego pomiaru siły biologicznej, ze szczególnym naciskiem na umiejętności potrzebne do wykonania metody bioanalitycznej. Ta metoda bioanalityczna dostarcza użytecznych informacji na temat porównywalności między różnymi seriami lub produktami leczniczymi anty-TNFα w porównaniu z klinicznie przebadaną substancją referencyjną.

<table><tbody><tr><td>WEHI 164</td><td>ATCC</td><td>CRL-1751</td><td>Komórki włókniakomięsaka z Mus musculus</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td>Przechowywać podłoże w temperaturze 2 & stopni; C do 8 & stopni; C</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>GIBCO</td><td>11835-030</td><td>Przechowywać podłoże w temperaturze 2 & deg; C do 8 & stopni; C</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>GIBCO</td><td>25200-056</td><td>Przechowywać podłoże w temperaturze -10 &; C do -20 &deg; C</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>GIBCO</td><td>14190-136</td><td>Przechowywać podłoże w temperaturze 2 & st; C do 8 & stopni; C</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko TNF-alfa R</td><td>& D Systems</td><td>210-TA-020</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C do -70 & C</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (USA), hyklon o bardzo niskiej IgG</td><td></td><td>SH3089803</td><td>Przechowywać w temperaturze -10 stopni; C do -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (USA), scharakteryzowana</td><td>Hyklon</td><td>SH3007103</td><td>Przechowywać w temperaturze -10 stopni; C do -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kaspazy-glo 3/7</td><td>Promega</td><td>G8093</td><td>Przechowuj substrat Caspase-Glo. 3/7 i bufor Caspase-Glo. 3/7 w &ndash; 20 &ordm; C chroniony odŚwiatło</td></tr><tr><td>EDTA, sól disodowa, dihydrat, kryształ, A.C.S. Odczynnik</td><td>J.T.Baker</td><td>8993-01</td><td>--</td></tr><tr><td>Próbka mAb Adalimumab</td><td>Probiomed</td><td>NA</td><td>Końcowe stężenia w mikropłytce wynoszą:&nbsp; 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 i 0,004 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Referencyjne i kontrolne mAb Adalimumab</td><td>Abbvie</td><td>NA</td><td>Stężenia końcowe w mikropłytce wynoszą:&nbsp; 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 i 0,004 &mu; Czytnik mikropłytek g / ml</td></tr><tr><td></td><td>Urządzenia molekularne</td><td>89429-536</td> Wielomodowy czytnik mikropłytek <td>SpectraMax M3</td></tr><tr><td>Oprogramowanie&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>--</td><td>Inkubator SoftMax Pro 6.3 GxP</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Revco&nbsp;</td><td>30482</td><td>Revco RNW3000TABB Okap z wymuszonym przepływem CO2</td></tr> z <tr><td>przepływem laminarnym&nbsp;</td><td>Firma Baker&nbsp; &nbsp;</td><td>200256</td><td>Baker SG603A-HE | Wysoka sprawność, klasa II typ A2&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

oznaczanie względnej siły działania przeciwciała monoklonalnego anty-tnf (mab) przez neutralizację tnf przy użyciu metody bioanalitycznej in vitro

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

Ten protokół pokazuje pomiar neutralizacji aktywności apoptotycznej TNFα w mysim modelu komórkowym fibroblastów (WEHI 164) przy użyciu mAb anty-TNFα. Ponadto protokół ten może być wykorzystany do oceny innych cząsteczek anty-TNFα, takich jak białka fuzyjne. Zastosowany tutaj model komórkowy jest wrażliwy na apoptozę, w której pośredniczy TNFα, gdy w warunkach hodowli komórkowej indukowany jest dodatkowy czynnik stresowy (np. deprywacja surowicy). Procedura ta ilustruje, w jaki sposób przeprowadzić ten test analityczny, podkreślając kluczowe operacje związane z przygotowaniem próbki, rozcieńczaniem komórek, indukcją apoptozy i pomiarami spektrofotometrycznymi, które mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia pomyślnych wyników. Protokół ten ujawnia najlepsze warunki wydajności związane z indukcją apoptozy i wydajnym rejestrowaniem sygnału, co prowadzi do niskich wartości niepewności.

Wykres dawka-odpowiedź (z kontrolami) 
<silna klasa="xfig">Rysunek 1 przedstawia odpowiedź luminescencyjną w porównaniu ze stężeniem mAb. Ta sigmoidalna funkcja jest przykładem uwalniania kaspazy 3 i 7 w pożywce do hodowli testowej w wyniku lizy komórek. Śmierć komórki jest zwiększona przez głód surowicy oraz indukcję sygnalizacji TNFα. Dlatego cząsteczka anty-TNFα (mAb) oddziałuje z cytokiną, hamując (poprzez przeszkodę steryczną) jej interakcję z receptore...

Protokół do określania względnej aktywności antyapoptotycznej mAb anty-TNFα przy użyciu mechanizmu neutralizacji z komórkami WEHI 164 jest przedstawiony tutaj. Protokół ten jest przydatny do porównywania siły neutralizacji różnych cząsteczek o tej samej funkcjonalności biologicznej.

Oznaczanie względnej siły działania przeciwciała monoklonalnego anty-TNF (mAb) przez neutralizację TNF przy użyciu metody bioanalitycznej in vitro

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar względnej aktywności cząsteczek anty-TNF-alpha. W tym przykładzie porównujemy dwa monoklonalne przeciwciała anty-TNF-alpha, aby określić wydajność neutralizacji jednego referencyjnego mAb w stosunku do badanego mAb próbki. Niniejszy tutorial przedstawia szczegółowe kroki wyznaczania aktywności neutralizacji TNF-alpha, które nie zostały zawarte w literaturze.Komórki mogą być poddawane stresowi wywołanemu przez różne czynniki środowiskowe, na przykład głodzenie. Każda komórka posiada na swojej powierzchni różne białka nazywane receptorami. Niektóre z nich wykazują swoistość względem cytokiny TNF-alpha.Gdy cząsteczka ta oddziałuje z receptorem i powstaje specyficzny sygnał, sygnalizacja ta w połączeniu z czynnikiem stresu środowiskowego prowadzi do zaprogramowanej śmierci komórki zwanej apoptozą. Jednak w obecności cząsteczki anty-TNF-alpha, która może być przeciwciałem monoklonalnym, cytokina ta może zostać stytrowana przez mAb, przechodząc proces neutralizacji, co pomaga komórkom przetrwać. W związku z tym, przy zastosowaniu standaryzowanej metodologii, można zmierzyć siłę neutralizacji danej cząsteczki.Protokół ten jest obecnie wykonywany w ciągu pięciu dni. Pierwszego dnia należy przygotować roztwory do hodowli komórkowej. Dodatkowo zostaną rozmrożone i podpasażowane komórki WEHI 164.W drugim i trzecim dniu należy zweryfikować stopień konfluencji komórek. Po tym kroku należy odszczepić komórki, policzyć je, dostosować gęstość komórkową, a na koniec ponownie poddać komórki hodowli. Wszystkie te etapy muszą być powtarzane każdego dnia.W czwartym dniu należy oznaczyć stężenie mAb za pomocą absorbancji UV i przygotować rozcieńczenia przeciwciał. Następnie należy przygotować roztwory indukujące apoptozę. Na koniec należy dostosować gęstość komórek WEHI 164 do poziomu pół miliona komórek na mL.Piątego dnia zostanie przygotowany roztwór substratu do wykrywania komórek apoptotycznych, a następnie przeprowadzona analiza spektrofotometryczna. Na koniec omówione zostanie badanie wyników in silico. Wszystkie roztwory zastosowane w tym protokole są przedstawione na tym slajdzie.W pierwszym dniu ten roztwór musi zostać przygotowany przed rozpoczęciem protokołu, z wyjątkiem roztworów do indukcji apoptozy i substratów, które należy zużyć niezwłocznie po rozpuszczeniu. Na początku protokołu należy wyjąć zamrożone komórki z pojemnika z ciekłym azotem. Probówka z zamrożonymi komórkami WEHI musi być przechowywana w lodzie do momentu użycia.Przed rozpoczęciem jakichkolwiek czynności należy oczyścić i zdezynfekować miejsce pracy, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej. Przenieś statyw do izotermy do komory z laminarnym przepływem powietrza i odmierz 9 mL podgrzanego wcześniej pożywki hodowlanej do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Za pomocą 1 mL podgrzanej wcześniej pożywki hodowlanej przemyj komórki WEHI 164, delikatnie pipetując w górę i w dół, aż zamrożone komórki oddzielą się od mikroprobówki.Mieszaj przez odwracanie pięć razy, aż zamrożone komórki całkowicie się rozmrożą. Następnie wirować komórki z prędkością 125 g przez trzy minuty. Odrzucić nadsącz i rozbić osad komórkowy.Do probówki należy dodać pięć mL uprzednio podgrzanego pożywki hodowlanej i mieszać zawiesinę, aż komórki zostaną całkowicie resuspendowane. Przenieść komórki do kolby hodowlanej typu T. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i przy zawartości dwutlenku węgla 5%. Każdego dnia przed odłączeniem komórek należy policzyć komórki w hodowli; obowiązkowe jest zweryfikowanie stanu zdrowia hodowli pod mikroskopem.Badacz musi zweryfikować stan zdrowia, żywotność oraz gęstość komórek przed subkulturowaniem. Weryfikację tę należy przeprowadzić również w przypadku testu biologicznego. W pierwszej kolejności należy potwierdzić brak zanieczyszczeń biologicznych, na przykład bakterii.Po drugie, stan zdrowia komórek można zweryfikować na podstawie stopnia konfluencji. Konfluencja powyżej 90% jest wystarczająca do uzyskania dobrych wyników. Jeśli jednak komórki nie osiągnęły pożądanej gęstości, kolbę należy zwrócić do inkubatora i czekać, aż komórki osiągną wymaganą gęstość i stopień konfluencji.Zużyte pożywkę należy usunąć z kolby T. Przymocowane do ścianek kolby komórki należy przemyć 5 mL roztworu do przemywania komórek. Należy uważać, aby nie usunąć przytwierdzonych komórek.Mieszać ręcznie, aby usunąć pozostałości pożywki i szczątki komórkowe. Krok ten należy powtórzyć dwukrotnie. Odessać pozostałe roztwory płuczące za pomocą podciśnienia i dodać 3 mL roztworu do odrywania komórek.Mieszać i inkubować przez trzy minuty. Po zakończeniu inkubacji dodać do kolby T podgrzaną wcześniej pożywkę hodowlaną w celu dezaktywacji enzymu oraz odzyskania komórek.Przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 mL i odwiruj. Zidentyfikuj osad komórkowy i odlej nadsącz. Usunięcie zużytej pożywki jest kluczowe dla hodowli zdrowych komórek.Rozdziel grudki osadu komórkowego i resuspenduj komórki w 5 mL podgrzanej wcześniej pożywki hodowlanej. Przenieś 50 µL zawiesiny komórkowej do mikroprobówki. Policz komórki, stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego.Policz komórki i określ ich żywotność. Po uzyskaniu liczby żywych komórek, dostosuj 15 mL pożywki hodowlanej do gęstości komórkowej wynoszącej pół miliona komórek na mL, korzystając z poniższego wzoru. Przenieś 15 mL tak przygotowanej zawiesiny komórkowej do kolby T i inkubuj przez noc.Cały proces hodowli należy powtórzyć co najmniej raz więcej, tak aby łącznie przeprowadzić trzy pasaż komórek przed rozpoczęciem testu neutralizacji. W czwartym dniu należy zmierzyć gęstość optyczną substancji referencyjnej, próbki analitycznej oraz próbki kontrolnej za pomocą absorpcji UV przy 280 nanometrach. Dla każdej z próbek należy wykonać wstępne rozcieńczenie do stężenia 2 mg/mL przy użyciu pożywki hodowlanej do testu, przygotowując trzy niezależne powtórzenia.Wykonaj drugie rozcieńczenie każdej próbki mAb do stężenia 2 µg/mL. Rozlej 75 µL pożywki hodowlanej do testu do 60 studzienek znajdujących się w środkowej części polistyrenowej mikropłytki. Dodaj 230 µL substancji referencyjnej do studzienek 2B i 2C.Próbki analityczne w studzienkach 2D i 2E. I na koniec próbka kontrolna w studzienkach 2F i 2G. Próbka kontrolna to cząsteczka o znanej mocy względnej.Następnie należy wykonać rozcieńczenia seryjne w mikropłytce. Przykład przedstawiono na następnych slajdach. Pamiętaj, aby wymieszać roztwory przed ich naniesieniem do dołków.Operacja ta jest kluczowa dla powodzenia niniejszego protokołu. Przed przystąpieniem do pracy należy dostosować zawiesinę komórek do stężenia 500 000 komórek/mL w dozowniku. Należy dodać 50 µL zawiesiny komórek do wewnętrznych 60 dołków płytki testowej, zaczynając od kolumny drugiej do jedenastej.Przed dodaniem cieczy do mikropłytki wymieszaj zawiesinę komórkową. Natychmiast przenieś 50 µL rozcieńczeń przeciwciał mAb na płytkę testową. W przypadku par lanes, dozuj rozcieńczenia, obracając mikropipetą.Rozcieńczenia przeciwciał mAb można rozprowadzić do dołków w następującej kolejności, rozdzielając kontrole do sąsiednich dołków. Rozcieńczyć TNF-alpha w 500 µL ultraczystej wody. Wymieszać za pomocą mieszalnika wierzchołkowego przy 2200 rpm.Przenieś do probówki o pojemności 15 mL, a następnie rozcieńcz do stężenia 40 nanograms per mL w pożywce hodowlanej do testu. Rozdziel 50 microliters roztworu indukującego apoptozę do 60 wewnętrznych studzienek testowych. Rozdziel 50 microliters roztworu indukującego apoptozę do 60 wewnętrznych studzienek testowych.Na koniec inkubować przez 16 godzin. Piątego dnia rozpuścić substrat w tym roztworze buforowym zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszać, odwracając naczynie pięć razy.Dozuj roztwór substratu. Dodaj 50 µL roztworu substratu do każdej studzienki z próbką na płytce analitycznej. Dodaj również substrat do kontroli.Mieszaj płytkę analityczną w wstrząsarce typu vortex z prędkością 400 rpms przez trzy minuty. Wyjmij płytkę analityczną z mieszalnika i inkubuj w temperaturze pokojowej. Włącz czytnik płytek-spektrofotometr.Otwórz oprogramowanie SoftMax Pro lub dowolny równoważny program. Włóż mikropłytkę do spektrofotometru i dostosuj następujące parametry. Aktywuj funkcję luminescencji oraz ustaw typ odczytu na funkcję Endpoint.Dostosuj obszar odczytu (Read Area), wyłączając kolumny 1 i 12. Wybierz typ płytki (Plate Type) jako 96-dołkowa standardowa mikro płytka z przezroczystym dnem. Zmień czas integracji (Integration Time) do 1250 milisekund.Ustaw czas wstrząsania mikropłytki na 10 sekund. Wybierz dołki, w których zostaną umieszczone substancja referencyjna, substancja analityczna oraz próbka kontrolna. Rozpocznij odczyt.Wyniki w tym teście to krzywe odpowiedzi wyrażone w luminescencji w stosunku do skali logarytmicznej stężenia mAb. Punkty przegięcia tych krzywych stanowią stężenia efektywne, EC50 dla każdego mAb. C lub EC50 wyrażono w nanogramach na mL.Wartość ta sama w sobie nie ma jednak znaczenia, jeśli nie zostanie porównana z próbką referencyjną. Z tego powodu aktywność próbki analitycznej wyraża się w procentach i określa jako aktywność względną. Aktywność względna stanowi średnią z trzech niezależnych wyników z mikropłytek, które wynikają odpowiednio z wartości EC50 dla każdej płyty.Porównanie próbek kontrolnych z próbkami referencyjnymi pomaga w określeniu wszelkich odchyleń lub błędów systematycznych w aktualnym teście. Porównanie próbki referencyjnej z próbką analityczną pomaga określić względną aktywność. Tabela ta przedstawia względną aktywność przeciwciał mAb oraz ich przedział ufności na poziomie 95%. Wyświetla ona również względne odchylenie standardowe dla każdej próbki w odniesieniu do aktywności substancji referencyjnej.Względna odchylenie standardowe powyżej 15% uznaje się za nieakceptowalne. Takie scharakteryzowanie pozwala na a priori określenie zachowania biologicznego cząsteczki będącej w fazie opracowania, przed przeprowadzeniem kosztownych i czasochłonnych badań klinicznych. Jest ono również przydatne przy uwalnianiu partii zatwierdzonego produktu.Ustaliliśmy, że testy te są pomocne w określeniu, czy cząsteczka wykazuje odpowiedni efekt biologiczny w odniesieniu do jej mechanizmu działania. Jako część metod biofizycznych, ta metodologia pozwala określić za pomocą środków biologicznych siłę działania i skuteczność jakości oraz właściwości leku, wykazując tym samym pełne znaczenie jego funkcji efektorowych.

determination-relative-potency-an-anti-tnf-monoclonal-antibody-mab

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test ELISA można łatwo przekształcić w analizę Luminex xMAP, a dzięki zaletom multipleksowania można jednocześnie przesiewowo badać kilka przeciwciał w celu zidentyfikowania optymalnej pary przeciwciał, co prowadzi do zwiększenia czułości i zakresu dynamicznego przy jednoczesnym obniżeniu kosztów analizy.

Konwersja testu ELISA typu capture na test Luminex xMAP z wykorzystaniem metody wielipleksowego przesiewania przeciwciał

Ten film demonstruje testy mikroneutralizacji do pomiaru przeciwciał neutralizujących za pomocą komórek nerki Madin-Darby Canine nadekspresji kwasu sjalowego związanego z α2,6 w surowicy ludzkiej. Ten test jest często stosowany w badaniach serologicznych grypy u...

Test mikroneutralizacji do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących w surowicy ludzkiej

Ten film demonstruje technikę oceny skuteczności przeciwciał przeciwko czynnikowi martwicy nowotworu alfa (TNFα), cytokinie zapalnej, za pomocą podejścia bioanalitycznego in vitro. TNFα po wprowadzeniu do zestresowanych komórek wyzwala apoptozę. Jednak wiązanie się z przeciwciałami ogranicza TNFα, zapobiegając apoptozie. Stopień apoptozy określa się ilościowo za pomocą testu bioluminescencji.

Metoda in vitro do określania aktywności antyapoptotycznej przeciwciał przeciwko TNFα

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół elektroforezy strefy kapilarnej do oceny wewnętrznej fizykochemicznej heterogeniczności przeciwciał monoklonalnych jako atrybutu jakości.

Elektroforeza kapilarna Separacja izoform przeciwciał monoklonalnych za pomocą neutralnej kapilary

Ten protokół opisuje porównanie in vitro dwóch kluczowych cech funkcjonalnych rytuksymabu: wiązania celu i indukcji cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC). Metody te wykorzystano do bezpośredniego porównania referencyjnego rytuksymabu z rytuksymabem biopodobnym. Testy te mogą być stosowane podczas opracowywania leków biopodobnych lub jako kontrola jakości w ich produkcji.

In vitro Metody porównywania wiązania celu i indukcji CDC między przeciwciałami terapeutycznymi: zastosowania w analizie biopodobieństwa

Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.

Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy

Tutaj prezentujemy metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach do wykrywania przeciwciał neutralizujących lub innych czynników, które zakłócają pobieranie przez komórkę enzymatycznych terapii zastępczych w ludzkiej matrycy, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub ludzka surowica.

Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

MALT1 reguluje wrodzoną odporność, ale jak to się dzieje, pozostaje niejasne. Użyliśmy selektywnego inhibitora parakaspazy MALT1 MLT-827, aby rozwikłać wkład MALT1 w sygnalizację wrodzoną za receptorami lektynopodobnymi Toll lub typu C, wykazując, że MALT1 reguluje produkcję cytokin szpikowych i za receptorami lektynopodobnymi typu C, selektywnie.

Mieloidowa wrodzona regulacja szlaku sygnalizacyjnego przez aktywność parakaspazy MALT1

Poznaj metodę oznaczania względnej siły działania przeciwciał anty-TNF przy użyciu komórek WEHI 164. Protokół umożliwia porównanie efektywności neutralizacji cytokiny TNF-alfa w badaniach immunologicznych.

Oznaczanie względnej siły działania przeciwciała monoklonalnego anty-TNF (mAb) przez neutralizację TNF przy użyciu metody bioanalitycznej in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie względnej siły działania przeciwciała monoklonalnego anty-TNF (mAb) przez neutralizację TNF przy użyciu metody bioanalitycznej in vitro

Przeglądaj więcej filmów