Name: Usprawniona izolacja TCR z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Poznaj usprawnioną metodę izolacji TCR z pojedynczych komórek i generowania wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo. Technika ta umożliwia badanie reprezentacji receptorów T i funkcjonalności odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ oraz Fundację Roberta i Janice McNair.
Dziękujemy Sandrze Pena i Andrene McDonald za rekrutację pacjentów, Samuelowi Blumowi za pomoc techniczną, Dr. George'owi Makedonasowi za dar przeciwciał i kontrolnego DNA używanego do optymalizacji PCR.

1. Zidentyfikuj interesującą populację limfocytów T.
UWAGA: Proliferacja specyficzna dla antygenu w połączeniu z barwnikiem podziału komórkowego (takim jak ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny, CFSE) może być wykorzystana do izolacji limfocytów T na podstawie ich proliferacji w odpowiedzi na stymulację antygenową. Jeśli zaczynasz od PBMCs, 7-dniowa ekspansja in vitro powinna wystarczyć do zidentyfikowania specyficznego dla antygenu CFSE low population12.
<ol>
	<li>Wymieszaj PBMC 1:1 z komórkami zasilającymi dopasowanymi do MHC i oznacz 5 μM barwnikiem podziału komórek CFSE.</li>
	<li>Płytka 2-2,5 x 105 komórek na basenie w 96-dołkowej płytce do hodowli okrągłodennej w 200 μl 10% FCS kompletnej pożywce RPMI. 
	UWAGA: Complete RPMI zawiera 2 mM l-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 μM aminokwasów endogennych MEM, 5 mM HEPES, 5,5 × 10− 5 jednostek 2-merkaptoetanolu, 100 U ml− 1 penicyliny i 100 μg mL− 1 streptomycyny.</li>
	<li>Stymuluj komórki antygenem peptydowym 25 μM.</li>
	<li>W czwartym dniu hodowli ostrożnie usunąć i wymienić 100 μl pożywki. 
	UWAGA: Bardziej optymalnym podejściem do identyfikacji limfocytów T specyficznych dla antygenu jest użycie tetramerów peptyd-HLA13. Barwienie tetramerami pozwala na jednoczesną ocenę swoistości antygenu, a także restrykcji HLA.</li>
</ol>
2. Ustaw sortowanie pojedynczych komórek.
<ol>
	<li>Wykonuj wszystkie zabiegi w kapturze lub wyznaczonym miejscu wolnym od amplifikowanego szablonu. Podajcie odczynniki, aby uniknąć zanieczyszczenia, oczyść wszystkie powierzchnie robocze i, jeśli to możliwe, sprzęt 10% wybielaczem przed konfiguracją PCR. Używaj końcówek filtrujących, odczynników wolnych od RNAzy i DNAzy oraz tworzyw sztucznych na wszystkich etapach PCR i klonowania wektorów. Kluczowe odczynniki można znaleźć w Tabeli Materiałów. 
	UWAGA: Reakcja multiplex PCR jest bardzo wrażliwa, a niski poziom zanieczyszczenia może spowodować amplifikację produktu.</li>
	<li>Wygeneruj główną mieszaninę odwrotnej transkrypcji, łącząc 10-krotny bufor reakcyjny RT, 25-krotny DNTP, enzym 9 U RT, 0,01% inhibitora Triton-X, 0,7 U inhibitora RNAzy i 383 nM każdego startera RT-TCR (wymienionego w Tabeli 1) w sterylnym zbiorniku do pipetowania. Dla każdej płytki 96-dołkowej należy uzupełnić mieszaninę wzorcową wystarczającą do przeprowadzenia 10 dodatkowych reakcji (łącznie 106), aby skompensować utratę cieczy podczas pipetowania. Patrz Tabela 2 dla składników reakcji i ilości na studzienkę.</li>
	<li>Przygotować 96-dołkową płytkę do pobierania PCR do sortowania komórek, pipetując 6 μl głównej mieszanki odwrotnej transkrypcji na studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej. Trzymaj talerz na lodzie lub w zimnym bloku.</li>
	<li>Oznacz komórki przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórki (takim jak CD4 i CD3 lub CD8 i CD3, każdy w ilości 2 μg/ml, w połączeniu z barwnikiem podziału komórkowego lub barwieniem tetramerowym).</li>
	<li>Sortuj limfocyty T po jednej komórce na studzienkę, pomijając dwunasty rząd, który posłuży jako kontrola ujemna. 
	UWAGA: Wydajność sortowania będzie zależeć od precyzyjnego wyrównania płytki zbiorczej w uchwycie płytki, a także od utrzymania komórek i płytek w niskiej temperaturze przed reakcją cDNA. Płytki zbiorcze powinny być przechowywane na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem czasu sortowania, kiedy są zamocowane na płycie chłodzącej. Nie wszystkie sortowniki są wyposażone w uchwyt na talerze z regulacją temperatury; Jednak zdecydowanie zaleca się korzystanie z jednego z nich. Ponieważ sortowanie trwa zwykle około 10 - 15 minut na płytkę, istnieje zwiększony potencjał degradacji RNA, jeśli płytka nie jest utrzymywana w niskiej temperaturze.</li>
	<li>Jako kontrolę pozytywną należy na tym etapie dodać większą liczbę komórek (100 komórek) ręcznie za pomocą pipety do jednego z dołków. Alternatywnie, wcześniej wyizolowane RNA z połączonych komórek można zastosować jako kontrolę pozytywną przy 10 ng na studzienkę. 
	UWAGA: Pipeta oczyszcza kontrolne RNA z precyzją i starannością, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego innych studzienek i wyników fałszywie dodatnich.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną i wirować w temperaturze 1000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Natychmiast transkrybuj RNA do cDNA, inkubując płytkę w temperaturze 25 °C przez 10 minut, 37 °C przez 45 minut i 85 °C przez 10 minut. 
	UWAGA: Aby zapewnić skuteczną reakcję PCR, zaleca się, aby pierwsza reakcja PCR została wykonana tego samego dnia. Alternatywnie, transkrybowane płyty można przechowywać w temperaturze -80°C do 2 miesięcy.</li>
</ol>
3. Wykonaj PCR zagnieżdżony w multipleksie
UWAGA: Przygotuj wszystkie mieszanki wzorcowe w czystym miejscu wolnym od szablonów, aby uniknąć zanieczyszczenia.
<ol>
	<li>Rozpuść każdy starter regionu zmiennego do 100 μM za pomocąH2Owolnych od DNAzy i RNAz. Następnie połącz 20 μl każdego z 44 starterów, aby wygenerować pulę starterów V-alfa. Aby wygenerować pulę starterów V-beta, połącz 20 μl każdego z 40 starterów V-beta oraz 80 μlH2O, wolnych od DNAzy i RNAzy. Sekwencje starterów są wymienione w tabeli 1. Po zebraniu stężenie każdego startera w mieszance wynosi 2,3 μM.</li>
	<li>Rozpuść startery o stałym obszarze do 100 μM roztworu podstawowego za pomocąH2O, wolnego od DNAzy i RNAz. Rozcieńczyć startery o stałym obszarze do 10 μM roztworu roboczego i podwielokrotności do użycia.</li>
	<li>Przygotuj dwa oddzielne miksy główne do amplifikacji TCR-alpha i TCR-beta. Wygeneruj mieszanki główne, łącząc bufor 5X, 80 μM dNTP, 3% DMSO, pulę starterów 2 μM (końcowe stężenie 46 nM dla każdego startera), 200 nM starter odwrotny regionu TCR, polimerazę DNA 1 U oraz H2Owolne od DNAzy i RNAzy (Tabela 2). Dla każdej płytki 96-dołkowej należy uzupełnić mieszaninę wzorcową wystarczającą do przeprowadzenia 10 dodatkowych reakcji (łącznie 106 reakcji), aby skompensować utratę cieczy podczas pipetowania. 
	UWAGA: Obliczenia opierają się na końcowej objętości PCR wynoszącej 25 μl na studzienkę, gdzie 22,5 μl głównej mieszanki PCR łączy się z 2,5 μl matrycy cDNA.</li>
	<li>Płytkę z cDNA należy przechowywać na lodzie lub w zimnym bloku. Za pomocą wielokanałowego pipetowania 22,5 μl reakcji TCR-beta do nowej 96-dołkowej płytki PCR. Następnie użyj wielokanałowego, aby przenieść 2,5 μl cDNA na płytkę PCR.</li>
	<li>Za pomocą wielokanałowego pipetowania 22,5 μl reakcji TCR-alfa bezpośrednio do płytki zawierającej pozostałą część cDNA.</li>
	<li>Uszczelnij płytki klejem, delikatnie zwiruj i wiruj w temperaturze 1000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję multipleksową PCR w następujących cyklach: 5 min w temperaturze 95 °C, a następnie 34 cykle po 20 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 54 °C i 1 min w temperaturze 72 °C, a następnie 7 min w temperaturze 72 °C.</li>
	<li>Przeprowadzić zagnieżdżoną reakcję PCR w końcowej objętości 25 μl, używając 2,5 μl mieszaniny multiplex PCR jako matrycy.
	<ol>
		<li>Rozpuść wewnętrzne i adaptorowe startery do 100 μM za pomocąH2O, wolnych od DNAzy i RNAzy. Wykonać 10 μM podwielokrotności dla zapasu roboczego.</li>
		<li>Przygotuj dwa oddzielne miksy główne do amplifikacji TCR-alpha i TCR-beta. Wymieszaj 5X bufor, 25X DNTP, 3% DMSO, 200 nM starter adaptera do przodu, 200 nM starter zagnieżdżony do tyłu, polimerazę DNA 1 U oraz polimerazę DNA i H2Owolną od nukleaz, aby uzyskać końcową objętość 22,5 μL (Tabela 2). Dla każdej płytki 96-dołkowej należy uzupełnić mieszaninę wzorcową wystarczającą do przeprowadzenia 10 dodatkowych reakcji (w sumie 106), aby skompensować utratę cieczy podczas pipetowania. 
		UWAGA: W drugiej reakcji PCR należy użyć buforu 5X PCR zawierającego barwnik ładujący, aby ułatwić ładowanie żelu agarozowego.</li>
		<li>Za pomocą wielokanałowego pipetowania wzorca miesza się do reakcji TCR-alfa i TCR-beta w ilości 22,5 μl na studzienkę na dwie nowe 96-dołkowe płytki PCR.</li>
		<li>Dodać matrycę do reakcji multipleksowej PCR w ilości 2,5 μl na basenik. 
		UWAGA: Pozostałą pierwszą reakcję PCR należy zapieczętować i przechowywać w temperaturze -20 °C, aby służyła jako źródło dodatkowej matrycy, jeśli zajdzie taka potrzeba (patrz krok 4.3 Uwaga).</li>
		<li>Uszczelnić płytki, delikatnie odwirować i wirować w temperaturze 1000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Uruchomić zagnieżdżoną reakcję PCR w następujących cyklach: 5 min w 95 °C, a następnie 34 cykle po 20 s w 95 °C, 30 s w 56 °C i 1 min w 72 °C, a następnie 7 min w 72 °C.</li>
		<li>Przeprowadzić 5 μl końcowej reakcji na 1% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny (łącznie z studzienkami kontroli ujemnej i dodatniej). 
		UWAGA: Oczekiwane pasmo powinno przebiegać przy wielkości około 500 pz. Przykładowa reakcja jest pokazana w Rysunek 2.</li>
		<li>Oczyścić pozostałą część drugiej reakcji (20 μl) za pomocą zestawu do oczyszczania PCR w formacie 96 dołków, eluować 15 μl 70 °C H2O na basenik i przeprowadzić sekwencjonowanie Sangera. Do sekwencjonowania należy użyć odpowiedniego startera do przodu z adapterem TCR-alpha lub TCR-beta (Tabela 1). 
		UWAGA: Sekwencje można analizować za pomocą dostępnego online oprogramowania immunogenetycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Subklonowanie łańcuchów PCR alfa i beta.
UWAGA: Pula starterów do przodu użytych w pierwszej reakcji i starterów odwrotnych w drugiej reakcji PCR są używane do włączenia miejsc restrykcyjnych. W związku z tym uzyskane produkty PCR o łańcuchu alfa i beta są gotowe do sekwencyjnego subklonowania do matrycowego wektora retrowirusowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
<ol>
	<li>Trawić oczyszczone produkty PCR z reakcji zagnieżdżonej beta z BstbI i MfeI (Tabela 3). 
	UWAGA: Nie przekraczać wkładki 5 μg.</li>
	<li>Równolegle przetraw wektor szablonu za pomocą BstbI i MfeI (Tabela 3). Użyj 1-2 μg wektora szablonu na TCR. Uruchom strawiony wektor na żelu agarozowym i wyizoluj większe pasmo (~7500 pz). Oczyść wektor za pomocą zestawu do oczyszczania DNA w żelu. 
	UWAGA: Podczas trawienia enzymu restrykcyjnego usuwany jest matrycowy mysi region zmienny TCR-beta, co pozwala na dodanie ludzkiego regionu zmiennej TCR-beta.</li>
	<li>Oczyść strawione produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. 
	UWAGA: Sprawdź zdolność oczyszczania DNA kolumn wchodzących w skład zestawu; W razie potrzeby użyj kilku kolumn. Minimalna ilość oczyszczonej wkładki niezbędna do pomyślnej reakcji ligacji wynosi 50 ng przy minimalnym stężeniu 10 ng/μl. Jeśli oczyszczona ilość wkładki nie jest wystarczająca do pomyślnego podwiązania, można powtórzyć drugą reakcję PCR.</li>
	<li>Traktować wektor matrycy enzymem 10 U przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby zapobiec samoligacji, a następnie inaktywować ciepło przez 10 minut w temperaturze 75 °C. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (Tabela 3).</li>
	<li>Ligacyjna wstawka i wektor TCR-beta za pomocą ligazy DNA w całkowitej objętości 20 μl przy 6 molowym nadmiarze wstawki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W sumie reakcja ligacji powinna zawierać około 150 ng DNA (Tabela 3).</li>
	<li>W celu przemian zmieszać 8 μl reakcji ligacji z 80 μl chemicznie kompetentnych komórek E.coli DH5α (tabela materiałów) i inkubować na lodzie przez 30 minut. Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 45 s. Dodać 500 μl bulionu Super Optimal z supresją katabolitu (S.O.C.) i wstrząsać przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieść 250 μl kultury bakteryjnej na płytce agarowej zawierającej ampicylinę Lysogeny Bulion (LB). Inkubować płytkę przez noc (~16 h) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia zbierz kolonie bakterii i wyhoduj je w 3 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę przez noc. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu DNA.</li>
	<li>Potwierdź pomyślne wprowadzenie łańcucha beta za pomocą testu na małą skalę z enzymami restrykcyjnymi BstbI i MfeI. W całkowitej objętości reakcyjnej 12 μl połącz 200-500 μg plazmidowego DNA, 0,25 μl każdego enzymu i 10-krotny bufor enzymatyczny (tabela 3). Przeprowadź reakcję na 1% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny, aby potwierdzić rozmiar wstęgi wkładki (~500 pz).</li>
	<li>Po potwierdzeniu obecności wstawki, należy zsekwencjonować odcinek TCR-beta wektora za pomocą startera odwrotnego IRES (Tabela 1).</li>
	<li>Po potwierdzeniu sekwencji wstawki TCR-beta wykonaj podobny proces insercji regionu zmiennej alfa. Trawić oczyszczone produkty PCR z reakcji zagnieżdżonej alfa i nowo wygenerowaną wstawkę TCR-beta zawierającą wektor, za pomocą SnaBI i SacII. 
	UWAGA: Podczas trawienia enzymu restrykcyjnego usuwany jest matrycowy mysi region zmiennej TCR-alfa, co pozwala na dodanie ludzkiego regionu zmiennej TCR-alfa.</li>
	<li>Insercje ligatowe alfa do wektorów TCR kodujących odpowiedni region zmiennej beta za pomocą ligazy DNA w całkowitej objętości 20 μl przy 6 molowym nadmiarze insertu przez 30 min w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W sumie reakcja ligacji powinna zawierać około 150 ng DNA (Tabela 3).</li>
	<li>W przypadku przemian zmieszać 8 μl reakcji ligacji z 80 μl chemicznie kompetentnych komórek E.coli DH5α (tabela materiałów) i inkubować na lodzie przez 30 minut. Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 45 s. Dodać 500 μl pożywki S.O.C. i wstrząsać przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieść 250 μl kultury bakteryjnej na płytce agarowej zawierającej ampicylinę Lysogeny Bulion (LB). Inkubować płytkę przez noc (~16 h) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia zbierz kolonie bakterii i wyhoduj je w 3 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę przez noc. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu DNA.</li>
	<li>Potwierdź pomyślne wprowadzenie łańcucha alfa za pomocą testu na małą skalę z enzymami restrykcyjnymi SnaBI i SacII. W całkowitej objętości reakcyjnej 12 μl połącz 200-500 μg plazmidowego DNA, 0,25 μl każdego enzymu i 10x bufor enzymatyczny (tabela 3). Przeprowadź reakcję na 1% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny, aby potwierdzić rozmiar wstęgi wkładki (~500 pz).</li>
	<li>Po potwierdzeniu obecności wstawki, zsekwencjonuj przekrój TCR-alfa wektora za pomocą startera MSCV2-forward (Tabela 1).</li>
	<li>Po walidacji sekwencji łańcucha alfa sprawdź pełną wstawkę TCR poprzez sekwencjonowanie za pomocą startera TCR-beta-reverse i IRES-reverse (Tabela 1).</li>
</ol>
5. Sprawdź ekspresję i specyficzność powierzchni komórki TCR.
Uwaga: HEK293T komórki są używane do testowania udanego parowania łańcucha TCR i ekspresji powierzchni komórki (Rysunek 3A)8. Barwienie tetramerem peptydowo-MHC można również przeprowadzić na transfekowanych komórkach HEK293T w celu zbadania zachowania swoistości antygenowej po izolacji genu TCR (<silna klasa = "xfig">Figura 3B).
<ol>
	<li>Umieścić HEK293T komórek na 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych w proporcjach 1 x 105 komórek na studzienkę w 1 ml kompletnej pożywce DMEM zawierającej 5% FCS i hodować przez noc w temperaturze 37 °C. Umieścić na płytkach wystarczającą liczbę komórek, aby mieć wyznaczone oddzielne studzienki dla każdego nowego TCR, szablon kontrolny wektor TCR, tylko wektor CD3, tylko kontrolny wektor TCR, i studnia nietransfekowana. 
	UWAGA: Transfekcja z całkowicie mysim wektorem TCR szablonu (mTCR-pMIA) w połączeniu z wektorem mCD3εγδζ-pMIG, samym wektorem mTCR-pMIA i samym wektorem mCD3εγδζ-pMIG są używane jako kontrole dodatnie i negatywne. 
	UWAGA: Complete DMEM zawiera 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 μM aminokwasów endogennych, 5 mM buforu HEPES, 5,5 x 10-5 jednostek 2-merkaptoetanolu, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Następnego dnia należy przetransfekować komórki 1 μg chimerycznym wektorem h/mTCR-pMIA, 1 μg mysim wektorem CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) i odczynnikiem do transfekcji na bazie liposomów zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Dla każdego TCR dodać 6 μl odczynnika do transfekcji do 100 μl DMEM o temperaturze pokojowej, bez surowicy. Krótko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>W oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml połącz 1 μg wektora TCR-pMIA z 1 μg mysim wektorem CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) lub 1 μg każdego wektora oddzielnie dla kontroli.</li>
	<li>Kroplami dodawać odczynnik do transfekcji/roztwór DMEM do probówek zawierających wektor DNA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Kroplami dodaj odczynnik do transfekcji/roztwór DMEM/DNA do komórek HEK293T. Delikatnie postukaj w płytkę, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Po 24 godzinach wymień pożywkę i trzymaj komórki w hodowli przez dodatkowe 24 godziny.</li>
	<li>Usunąć komórki z płytki przez energiczne pipetowanie i wybarwić komórki przeciwciałem anty-mysim CD3 (2,5 μg/ml) w celu sprawdzenia ekspresji powierzchniowej chimerycznego TCR za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Aby porównać ekspresję CD3 między komórkami, które zostały transfekowane do podobnego poziomu, należy przeprowadzić analizę na komórkach wyrażających podobny wysoki poziom fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych (GFP dla kompleksu CD3 i ametryna dla wektora ekspresyjnego TCR). Optymalnie, analiza powinna być bramkowana na komórkach GFP+Ametrine+ o intensywności fluorescencji 104 do 105 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
	UWAGA: Poziom ekspresji CD3 w komórkach transfekowanych konstruktem chimerycznym powinien być porównywalny z wektorem myszy kontrolnej (oryginalny szablon) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A). Wygenerowane wektory retrowirusowe TCR są kompatybilne z systemami ekspresji in vivo, jak opisano wcześniej4.</li>
</ol>

<ol><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+development+and+the+CD4-CD8+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision.</a> Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).</li>
<li>Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+fate+and+intense+debate%3A+myths%2C+models+and+mechanisms+of+CD4-+versus+CD8-lineage+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice.</a> Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).</li>
<li>Tubo, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+naive+CD4%2B+T+cells+from+a+diverse+repertoire+produce+different+effector+cell+types+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection.</a> Cell. 153 (4), 785-796 (2013).</li>
<li>Sprouse, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+and+expression+of+human+TCRs+in+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice.</a> J Immunol Methods. , (2016).</li>
<li>Lennon, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+islet+accumulation+in+type+1+diabetes+is+a+tightly+regulated%2C+cell-autonomous+event%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event.</a> Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).</li>
<li>Dash, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+analysis+of+TCRalpha+and+TCRbeta+chains+at+the+single-cell+level+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice.</a> J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).</li>
<li>Kobayashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cloning+and+expression+system+yields+and+validates+TCRs+from+blood+lymphocytes+of+patients+with+cancer+within+10+days%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days.</a> Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).</li>
<li>Szymczak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+%27self-cleaving%27+2A+peptide-based+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).</li>
<li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+retrogenic+mice%3A+a+rapid%2C+flexible+alternative+to+T-cell+receptor+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li>
<li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).</li>
<li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+percentage+of+peripheral+T+cells+with+two+different+T+cell+receptor+alpha-chains+and+of+their+potential+role+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity.</a> J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).</li>
<li>Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Bone+Marrow+Progenitor+Cells+to+Generate+T-cell+Receptor+Retrogenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li>
<li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice%3A+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).</li>
<li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+%28TCR%29+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR%2FCD3+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W obecnym protokole opisujemy skuteczną metodę amplifikacji TCR pojedynczej komórki, a następnie subklonowania sparowanych łańcuchów alfa i beta TCR do matrycowego wektora ekspresji retrowirusowej. Chociaż opracowano kilka protokołów PCR z pojedynczymi komórkami, żaden z nich do tej pory nie był kompatybilny z natychmiastowym subklonowaniem do wektora ekspresji. W większości przypadków amplifikowana jest częściowa sekwencja obejmująca wysoce zmienne regiony CDR3, z wystarczającą sekwencją, aby ekstrapolować region zmienn...

Receptor limfocytów T (TCR) decyduje o losie limfocytów T podczas rozwoju, stanu stacjonarnego/homeostazy i stymulacji antygenowej na peryferiach1,2,3. Niedawna ekspansja technologii głębokiego sekwencjonowania ujawniła wcześniej niedocenianą różnorodność TCR w odpowiedziach limfocytów T specyficznych dla antygenu. Różnorodność TCR sugeruje potencjał funkcjonalnie szerokich odpowiedzi limfocytów T. W celu zintegrowania analizy repertuaru sekwencji TCR z testami funkcjonalnymi TCR, podejścia do sekwencjonowania powinny być zaprojektowane tak, aby były kompatybilne z systemami eksperymentalnymi i modelami in vivo wykorzystywanymi do późniejszej analizy funkcjonalnej wybranych TCR. Opracowaliśmy skuteczne podejście do izolacji sekwencji TCR u ludzi i usprawniliśmy subklonowanie do chimerycznego wektora szablonu TCR człowieka / myszy kompatybilnego z ekspresją TCR w myszach humanizowanych przez HLA4. Izolacja odpowiednich łańcuchów alfa i beta heterodimerycznych TCR wymaga amplifikacji PCR obu łańcuchów z pojedynczej komórki. Chociaż opracowano i wykorzystano kilka protokołów klonowania pojedynczych komórek TCR, żaden z nich do tej pory nie był łatwo kompatybilny z wysokoprzepustowym, usprawnionym bezpośrednim klonowaniem nieznanych TCR Vα/Vβ do wektorów retrowirusowych niezbędnych do reekspresji in vivo4,5,6,7. Poprzednie badania wykorzystywały dwa główne podejścia, albo selektywne wzmacnianie ograniczonej części TCR wystarczającej do ekstrapolacji sekwencji, albo amplifikacja całej sekwencji TCR4,5,6,7. Dalsza analiza funkcjonalna sekwencji TCR uzyskanych za pomocą pierwszego podejścia wymaga kosztownego montażu in silico i budowy TCR de novo. Podczas gdy drugie podejście zapewnia pełną sekwencję TCR, ludzki region stały nie jest zgodny z ekspresją in vivo sklonowanych TCR w modelach mysich. Nasze podejście zostało specjalnie zaprojektowane, aby było kompatybilne z analizą funkcjonalną in vivo TCR w modelach mysich. Opracowaliśmy wydajny i usprawniony protokół PCR z pojedynczą komórką, który pozwala na bezpośrednie subklonowanie fragmentów PCR do wektora wyrażenia matrycy.
Nasze podejście wykorzystuje bardzo czułą reakcję PCR zagnieżdżoną w multipleksie, która jest przeprowadzana w dwóch krokach. W pierwszym etapie reakcji multipleksowej do amplifikacji TCR-alfa wykorzystuje się pulę 40 starterów specyficznych dla wszystkich łańcuchów V-beta oraz pulę 44 starterów specyficznych dla wszystkich łańcuchów V-alfa bez wcześniejszej znajomości sekwencji (Tabela 1). Starter do przodu ma sekwencję adaptera, która jest włączona do 5' produktu PCR. Odwrócony starter opiera się na stałym obszarze TCR. Zidentyfikowaliśmy unikalne miejsca restrykcyjne, które są nieobecne w ludzkich zmiennych lub węzłowych regionach TCR, i włączyliśmy je do nowo przeprojektowanych starterów TCRα i TCRβ (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). W drugiej zagnieżdżonej reakcji stosuje się starter specyficzny dla sekwencji adaptora i zagnieżdżony starter odwrotny w stałym obszarze w celu dalszego wzmacniania łańcuchów TCR ze zwiększoną swoistością (Tabela 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Po izolacji pojedynczej komórki, dwie rundy PCR (pierwsza reakcja z pulą zarówno starterów Vα, jak i Vβ, a druga ze starterami adaptorowymi) dają produkt PCR, który można bezpośrednio sklonować do matrycowego wektora retrowirusowego. Ostateczny konstrukt TCR zakoduje, w pojedynczej otwartej ramce odczytu (ORF), ludzkie regiony zmiennych połączone z mysimi stałymi regionami połączonymi "samodzielną" sekwencją białkową, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. Sekwencja P2A była używana w wielu systemach i została gruntownie przetestowana specjalnie pod kątem wyrażenia TCRs8,9,10,11. Chociaż po translacji większość sekwencji P2A pozostaje przyłączona do C-końca łańcucha alfa połączonego elastycznym łącznikiem, podczas gdy sekwencja sygnałowa łańcucha beta ma dodatkową prolinę, modyfikacja ta nie ma szkodliwego wpływu na funkcję TCR. Stały region myszy jest używany w konstrukcji zamiast ludzkiego, aby uniknąć potencjalnych zmienionych interakcji z dalszymi komponentami sygnalizacyjnymi po ponownej ekspresji w komórkach myszy. Pojedynczy ORF spowoduje stechiometryczne oddzielne wyrażenie łańcuchów alfa i beta9,11. Obecny protokół opiera się na odczynnikach i podejściach, które są powszechnie dostępne, i został zaprojektowany tak, aby można go było wykonywać w sposób usprawniony i wydajny. Chociaż specjalnie użyliśmy tej techniki do oznaczania TCR z samoreaktywnych limfocytów T zaangażowanych w cukrzycę autoimmunologiczną, przewidujemy, że protokół ten może mieć szerokie zastosowanie do identyfikacji i oceny funkcjonalnej ludzkich TCR specyficznych dla epitopów autoimmunologicznych, epitopów raka lub odpowiedzi na patogeny i szczepionki.

<table><tbody><tr><td>Międzynarodowa Organizacja Inwestycyjna&nbsp;</td><td>eBionauka&nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>anty-ludzki CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/ml</td></tr><tr><td>anty-ludzkiego CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/ml</td></tr><tr><td>anty-mysi CD3 AF647</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>100322</td><td>2,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor RNAzy biotech grd 2,5KU&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0,7 U</td></tr><tr><td>Zestaw RT cDNA o wysokiej pojemności&nbsp;</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (enzym RT)&nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: Woda wolna od nukleaz 1000mL</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA polimeraza 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 Well Half Skirt PCR Plate</td><td>Phenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Przezroczysta folia samoprzylepna&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>4306311</tr><tr><td>UltraPure Agaroza&nbsp;</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>Nowa Anglia Biolabs&nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (wkładka) 30 U (wektor)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (wkładka) 80 U (wektor)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (wkładka) 80 U (wektor)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (wkładka) 80 U (wektor)</td></tr><tr><td>Fosfataza jelitowa cieląt ()</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Szybka ligaza&nbsp;</td><td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii&nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus miniprzygotowuje systemy oczyszczania DNA&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps systemy oczyszczania DNA&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td>Zestaw do czyszczenia i koncentratora DNA <td>A7640-25</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 Zestaw do czyszczenia i koncentratora DNA-5</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-306A Zestaw do ekstrakcji</td><td></td></tr><tr><td>żelu QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Skuteczność subklonowania Kompetentne komórki DH5a&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>18265017</tr><tr><td>Odczynnik Transit LT-1 1mL (odczynnik do transfekcji)</td><td>Mirus&nbsp;</td><td></td><td></td>MIR2300</tr><tr><td>BD FACS Aria II (sorter)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (cytometr przepływowy)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

usprawniona izolacja tcr z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji tcr u ludzi in vitro i in vivo

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Chociaż opracowano kilka metod sekwencjonowania sparowanych łańcuchów alfa i beta receptora limfocytów T (TCR) z pojedynczych limfocytów T, żadna z nich jak dotąd nie sprzyjała dalszej analizie funkcjonalnej in vivo heterodimerów TCR. Opracowaliśmy ulepszony protokół oparty na dwuetapowym PCR zagnieżdżonym w multipleksie, w wyniku czego powstaje produkt PCR, który obejmuje całe zmienne regiony ludzkich łańcuchów TCR alfa i beta. Identyfikując unikalne miejsca restrykcyjne i włączając je do starterów PCR, sprawiliśmy, że produkt PCR jest kompatybilny z bezpośrednim subklonowaniem do matrycowego wektora retrowirusowego. Powstały w ten sposób konstrukt retrowirusowy koduje chimeryczny ludzko-mysi TCR z mysią domeną wewnątrzkomórkową, która jest funkcjonalna w komórkach myszy lub w modelach mysich in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, opisany tutaj protokół łączy identyfikację łańcucha TCR alfa i beta w parze pojedynczych komórek z usprawnionym generowaniem wektorów retrowirusowych, które można łatwo przystosować do ekspresji TCR in vitro i in vivo. Film i towarzyszący mu materiał mają na celu przedstawienie bardzo szczegółowego opisu PCR jednokomórkowego, tak aby można było postępować zgodnie z krytycznymi krokami i uniknąć potencjalnych pułapek. Dodatkowo udostępniamy szczegółowy opis kroków klonowania niezbędnych do wygenerowania wektora wyrażenia. Po opanowaniu, cała procedura, od sortowania pojedynczych komórek do ekspresji TCR, może być wykonana w krótkim okresie dwóch tygodni.

Skuteczność reakcji PCR zagnieżdżonej w multipleksie jest sprawdzana w kroku 3.2.7 (Rysunek 2) poprzez wyczerpanie 5μL drugiej reakcji na żelu agarozowym. Średnio oczekuje się, że wydajność amplifikacji TCR-beta wyniesie około 80%, podczas gdy wydajność reakcji TCR-alfa jest zwykle niższa i wynosi około 50%4. Tylko sparowane łańcuchy TCR-alfa i TCR-beta mogą być używane do ekspresji TCR; jednak wszystkie produkty PCR można sekwencjonow...

Obecny protokół łączy sekwencjonowanie łańcucha alfa i beta TCR w parach pojedynczych komórek z usprawnionym generowaniem wektorów retrowirusowych kompatybilnych z ekspresją TCR in vitro i in vivo.

Usprawniona izolacja TCR z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak repertuar TCR alfa i beta w określonej populacji antygenu, a także funkcjonalność in vivo ludzkich TCR. Głównymi zaletami tej techniki jest stosunkowo wysoka skuteczność reakcji PCR, a także jej kompatybilność z późniejszym klonowaniem TCR. Protokół ten wykorzystuje dwuetapowy PCR do amplifikacji łańcuchów alfa i beta TCR z pojedynczej komórki bez wcześniejszej wiedzy na temat sekwencji TCR.Pierwszy PCR jest reakcją multipleksową wykorzystującą pulę starterów specyficznych dla regionu alfa lub beta w połączeniu ze starterem specyficznym dla regionu stałego. Drugi PCR jest reakcją zagnieżdżoną, która rozpoczyna się od sekwencji adaptera wbudowanej na pięciu głównych końcach produktu PCR, a także sekwencji wewnętrznego regionu stałego. Startery te zawierają również unikalne miejsca restrykcyjne w pięciu pierwszych i trzech pierwszych końcach produktu PCR, aby ułatwić późniejsze klonowanie.Po sklonowaniu do wektora szablonu, zakodowana sekwencja TCR jest chimeryczna, składająca się z ludzkich regionów zmiennych z lustrzanymi regionami stałymi. Chimeryczny konstrukt TCR pozwala na interakcję między TCR a lustrzanym kompleksem sygnalizacyjnym CD3, dzięki czemu ten protokół klonowania TCR jest kompatybilny z późniejszymi badaniami funkcjonalnymi w lustrzanych liniach komórkowych i humanizowanych modelach mysich. Przygotuj się do sortowania pojedynczych komórek, przygotowując odczynniki do odwrotnej transkrypcji w czystym, wolnym od szablonów obszarze.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w metodzie PCR z pojedynczą komórką, będą miały trudności z powodu niskiego poziomu matrycy. Z drugiej strony, czułość zagnieżdżonego PCR multipleksu jest wrażliwa na niskie poziomy zanieczyszczenia matrycy. Dlatego konieczne jest dokładne oczyszczenie obszarów, w których będziesz ustawiać reakcje PCR.W tej reakcji stosuje się mieszaninę trzech starterów odwróconych specyficznych dla stałego regionu łańcuchów alfa i beta. Przygotować główną mieszaninę z odwrotną transkrypcją, łącząc odczynniki w zbiorniku do pipetowania. Aby uwzględnić błąd pipetowania, przygotuj mieszaninę reakcyjną wystarczającą na dziesięć dodatkowych studzienek.Użyj wielokanałowego pipetowania sześciu mikrolitrów na dołek do 96-dołkowej płytki PCR. Przykryj talerz luźno uszczelką i trzymaj talerz na lodzie. Przygotuj limfocyty T do sortowania pojedynczych komórek, barwiąc komórki przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórki.Posortuj limfocyty T na raz komórkę na studzienkę, pozostawiając dwanaście wierszy pustych, które posłużą jako kontrola negatywna. Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i wiruj w temperaturze 1000 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Natychmiast uruchom reakcję odwrotnej transkrypcji.Jeśli to możliwe, przeprowadź pierwszą reakcję PCR tego samego dnia. Aby przeprowadzić reakcję multipleksową, należy oddzielnie wymieszać główne mieszaniny V alfa i V beta PCR w zbiornikach do pipetowania. Trzymaj płytkę z cDNA na lodzie lub na zimnym bloku.Przenieś 22,5 mikrolitra reakcji beta TCR do nowej 96-dołkowej płytki PCR. Następnie użyj wielokanałowego, aby przenieść 2,5 mikrolitra cDNA na płytkę PCR. Użyj wielokanałowego pipetowania 22,5 mikrolitra reakcji alfa TCR bezpośrednio do płytki zawierającej pozostałą część cDNA.Uszczelnij płytki klejem, delikatnie zwiruj i krótko odwiruj. Uruchom pierwszą reakcję PCR. Talerze można przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Następnego dnia przygotuj drugie zagnieżdżone reakcje PCR. Za pomocą wielokanałowego pipetowania wzorca miesza się do reakcji TCR alfa i TCR beta w ilości 22,5 mikrolitra na studzienkę na dwie nowe 96-dołkowe płytki PCR. Dodaj matrycę do reakcji multipleksowej PCR w ilości 2,5 mikrolitra na studzienkę.Uszczelnij płytki, delikatnie zwiruj i krótko odwiruj. Pozostała pierwsza reakcja PCR powinna być szczelnie zamknięta i przechowywana w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby służyła jako źródło kopii zapasowej. Wykonaj drugą reakcję PCR.Po zakończeniu drugiej zagnieżdżonej reakcji PCR wylej pięć mikrolitrów reakcji na 1% żel agarozowy. Uwzględnij studzienki kontroli dodatniej i ujemnej. Oczekiwane pasmo powinno mieć rozmiar około 500 par zasad.Oczyść pozostałą część drugiej reakcji, dwadzieścia mikrolitrów, za pomocą zestawu do oczyszczania PCR w formacie 96 dołków i wykonaj sekwencjonowanie Sangera. Uzyskane sekwencje TCR mogą być analizowane za pomocą dostępnego w Internecie oprogramowania immunogenetycznego. Informacje o sekwencji można wykorzystać do oceny repertuaru i klonalności populacji komórek T.Sparowane sekwencje TCR alfa i beta mogą być wykorzystane w dalszej analizie funkcjonalnej. Wykonaj kolejne ligacje TCR beta i TCR alfa do wektora szablonu. Matryca TCR beta i TCR alfa są zastępowane łańcuchami amplifikowanymi PCR.W pierwszej ligacji matryca TCR beta jest zastępowana łańcuchem beta amplifikowanym PCR. Po pomyślnym wprowadzeniu TCR beta zweryfikowanym przez sekwencjonowanie test-digest, zastąp matrycę TCR alfa łańcuchem amplifikowanym alfa PCR. HEK293T komórki są używane do testowania udanego parowania łańcucha TCR i ekspresji powierzchni komórki.HEK293T komórki są kotransfekowane wektorem TCR oznaczonym przez ametrynowy reporter fluorescencyjny i wektorem kodującym kompleks CD3 oznaczony GFP. Ekspresja powierzchniowa chimerycznego TCR jest weryfikowana za pomocą cytometrii przepływowej poprzez barwienie komórek przeciwciałem anty-mysim CD3. Poziom powierzchniowej ekspresji CD3 w komórkach transfekowanych chimerycznym konstruktem TCR powinien być porównywalny z tymi transfekowanymi za pomocą w pełni lustrzanego wektora matrycy kontrolnej.Podsumowując, opisaliśmy skuteczny protokół oparty na PCR do identyfikacji i klonowania sparowanych łańcuchów TCR z pojedynczych komórek. Przewidujemy, że będzie to cenne narzędzie do badania odpowiedzi ludzkich limfocytów T w autoimmunizacji, nadzorze nad nowotworami i eliminacji patogenów. Główną zaletą opisywanego tutaj protokołu PCR jest jego kompatybilność z późniejszymi badaniami in vitro i in vivo.

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykazujemy tutaj, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) może być wykorzystane jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanych specyficznościach receptorów limfocytów T (TCR). Myszy transjądrowe te wykazują ekspresję odpowiadającego TCR z ich locus endogennego pod kontrolą promotora endogennego.

Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Manipulowanie czasową ekspresją genów w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) można osiągnąć za pomocą indukowalnych systemów genetycznych. Jednak wytwarzanie tych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Protokół ten zapewnia szybką ekspresję transgenu w różnicujących się komórkach pochodzących z ES, a następnie analizę dalszego różnicowania układu krwiotwórczego.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Przedstawiamy szybki i elastyczny protokół dla systemu ekspresji in vivo opartego na pojedynczym receptorze limfocytów T (TCR).  Wektory retrowirusowe są wykorzystywane do transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu zbadania rozwoju i funkcji pojedynczych komórek T in vivo jako alternatywy dla myszy transgenicznych TCR.

Transdukcja retrowirusowa komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia myszy retrogenicznych receptora komórek T

Tutaj opisujemy nowatorską metodę generowania specyficznych dla antygenu receptorów limfocytów T (TCR) poprzez parowanie TCRα lub TCRβ istniejącego TCR, posiadającego swoistość antygenową będącą przedmiotem zainteresowania, z komplementarnym półłańcuchem repertuaru obwodowych receptorów limfocytów T. Generowane de novo TCR zachowują swoistość antygenową z różnym powinowactwem.

Generowanie receptorów ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu de novo poprzez transdukcję retrowirusową centralnego hemiłańcucha

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Przedstawiamy protokół retrowirusowej transdukcji przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T od transgenicznych myszy Cas9, zapewniając efektywną alternatywę dla edycji genów w badaniu różnicowania Th17.

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Przedstawiamy ulepszone protokoły transdukcji retrowirusowej receptorów transportowych i konkurencyjnego naprowadzania w celu zbadania lokalizacji limfocytów specyficznych dla narządów i mikrośrodowisk za pośrednictwem receptorów. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów transportu komórek odpornościowych i ma potencjalne zastosowania w przyszłych badaniach podstawowych i terapeutycznych.

Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Ten protokół opisuje kluczowe kroki uprawy pierwotnych komórek T, w tym ich izolację, aktywację, ekspansję oraz przejściową transfekcję przez elektroporację mRNA. Dodatkowo proponowany jest przepływ pracy i panel przeciwciał do analizy cytometrycznej fenotypu, markerów aktywacji, żywotności oraz ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR).

Izolacja, hodowla i przejściowa transfekcja pierwotnych ludzkich komórek T w celu wygenerowania komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)

Poznaj usprawnioną metodę izolacji TCR z pojedynczych komórek i generowania wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo. Technika ta umożliwia badanie reprezentacji receptorów T i funkcjonalności odpowiedzi immunologicznej.

Usprawniona izolacja TCR z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Usprawniona izolacja TCR z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo

Przeglądaj więcej filmów