Usprawniona izolacja TCR z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak repertuar TCR alfa i beta w określonej populacji antygenu, a także funkcjonalność in vivo ludzkich TCR. Głównymi zaletami tej techniki jest stosunkowo wysoka skuteczność reakcji PCR, a także jej kompatybilność z późniejszym klonowaniem TCR. Protokół ten wykorzystuje dwuetapowy PCR do amplifikacji łańcuchów alfa i beta TCR z pojedynczej komórki bez wcześniejszej wiedzy na temat sekwencji TCR.

Pierwszy PCR jest reakcją multipleksową wykorzystującą pulę starterów specyficznych dla regionu alfa lub beta w połączeniu ze starterem specyficznym dla regionu stałego. Drugi PCR jest reakcją zagnieżdżoną, która rozpoczyna się od sekwencji adaptera wbudowanej na pięciu głównych końcach produktu PCR, a także sekwencji wewnętrznego regionu stałego. Startery te zawierają również unikalne miejsca restrykcyjne w pięciu pierwszych i trzech pierwszych końcach produktu PCR, aby ułatwić późniejsze klonowanie.

Po sklonowaniu do wektora szablonu, zakodowana sekwencja TCR jest chimeryczna, składająca się z ludzkich regionów zmiennych z lustrzanymi regionami stałymi. Chimeryczny konstrukt TCR pozwala na interakcję między TCR a lustrzanym kompleksem sygnalizacyjnym CD3, dzięki czemu ten protokół klonowania TCR jest kompatybilny z późniejszymi badaniami funkcjonalnymi w lustrzanych liniach komórkowych i humanizowanych modelach mysich. Przygotuj się do sortowania pojedynczych komórek, przygotowując odczynniki do odwrotnej transkrypcji w czystym, wolnym od szablonów obszarze.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w metodzie PCR z pojedynczą komórką, będą miały trudności z powodu niskiego poziomu matrycy. Z drugiej strony, czułość zagnieżdżonego PCR multipleksu jest wrażliwa na niskie poziomy zanieczyszczenia matrycy. Dlatego konieczne jest dokładne oczyszczenie obszarów, w których będziesz ustawiać reakcje PCR.

W tej reakcji stosuje się mieszaninę trzech starterów odwróconych specyficznych dla stałego regionu łańcuchów alfa i beta. Przygotować główną mieszaninę z odwrotną transkrypcją, łącząc odczynniki w zbiorniku do pipetowania. Aby uwzględnić błąd pipetowania, przygotuj mieszaninę reakcyjną wystarczającą na dziesięć dodatkowych studzienek.

Użyj wielokanałowego pipetowania sześciu mikrolitrów na dołek do 96-dołkowej płytki PCR. Przykryj talerz luźno uszczelką i trzymaj talerz na lodzie. Przygotuj limfocyty T do sortowania pojedynczych komórek, barwiąc komórki przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórki.

Posortuj limfocyty T na raz komórkę na studzienkę, pozostawiając dwanaście wierszy pustych, które posłużą jako kontrola negatywna. Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i wiruj w temperaturze 1000 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Natychmiast uruchom reakcję odwrotnej transkrypcji.

Jeśli to możliwe, przeprowadź pierwszą reakcję PCR tego samego dnia. Aby przeprowadzić reakcję multipleksową, należy oddzielnie wymieszać główne mieszaniny V alfa i V beta PCR w zbiornikach do pipetowania. Trzymaj płytkę z cDNA na lodzie lub na zimnym bloku.

Przenieś 22,5 mikrolitra reakcji beta TCR do nowej 96-dołkowej płytki PCR. Następnie użyj wielokanałowego, aby przenieść 2,5 mikrolitra cDNA na płytkę PCR. Użyj wielokanałowego pipetowania 22,5 mikrolitra reakcji alfa TCR bezpośrednio do płytki zawierającej pozostałą część cDNA.

Uszczelnij płytki klejem, delikatnie zwiruj i krótko odwiruj. Uruchom pierwszą reakcję PCR. Talerze można przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Następnego dnia przygotuj drugie zagnieżdżone reakcje PCR. Za pomocą wielokanałowego pipetowania wzorca miesza się do reakcji TCR alfa i TCR beta w ilości 22,5 mikrolitra na studzienkę na dwie nowe 96-dołkowe płytki PCR. Dodaj matrycę do reakcji multipleksowej PCR w ilości 2,5 mikrolitra na studzienkę.

Uszczelnij płytki, delikatnie zwiruj i krótko odwiruj. Pozostała pierwsza reakcja PCR powinna być szczelnie zamknięta i przechowywana w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby służyła jako źródło kopii zapasowej. Wykonaj drugą reakcję PCR.

Po zakończeniu drugiej zagnieżdżonej reakcji PCR wylej pięć mikrolitrów reakcji na 1% żel agarozowy. Uwzględnij studzienki kontroli dodatniej i ujemnej. Oczekiwane pasmo powinno mieć rozmiar około 500 par zasad.

Oczyść pozostałą część drugiej reakcji, dwadzieścia mikrolitrów, za pomocą zestawu do oczyszczania PCR w formacie 96 dołków i wykonaj sekwencjonowanie Sangera. Uzyskane sekwencje TCR mogą być analizowane za pomocą dostępnego w Internecie oprogramowania immunogenetycznego. Informacje o sekwencji można wykorzystać do oceny repertuaru i klonalności populacji komórek T.

Sparowane sekwencje TCR alfa i beta mogą być wykorzystane w dalszej analizie funkcjonalnej. Wykonaj kolejne ligacje TCR beta i TCR alfa do wektora szablonu. Matryca TCR beta i TCR alfa są zastępowane łańcuchami amplifikowanymi PCR.

W pierwszej ligacji matryca TCR beta jest zastępowana łańcuchem beta amplifikowanym PCR. Po pomyślnym wprowadzeniu TCR beta zweryfikowanym przez sekwencjonowanie test-digest, zastąp matrycę TCR alfa łańcuchem amplifikowanym alfa PCR. HEK293T komórki są używane do testowania udanego parowania łańcucha TCR i ekspresji powierzchni komórki.

HEK293T komórki są kotransfekowane wektorem TCR oznaczonym przez ametrynowy reporter fluorescencyjny i wektorem kodującym kompleks CD3 oznaczony GFP. Ekspresja powierzchniowa chimerycznego TCR jest weryfikowana za pomocą cytometrii przepływowej poprzez barwienie komórek przeciwciałem anty-mysim CD3. Poziom powierzchniowej ekspresji CD3 w komórkach transfekowanych chimerycznym konstruktem TCR powinien być porównywalny z tymi transfekowanymi za pomocą w pełni lustrzanego wektora matrycy kontrolnej.

Podsumowując, opisaliśmy skuteczny protokół oparty na PCR do identyfikacji i klonowania sparowanych łańcuchów TCR z pojedynczych komórek. Przewidujemy, że będzie to cenne narzędzie do badania odpowiedzi ludzkich limfocytów T w autoimmunizacji, nadzorze nad nowotworami i eliminacji patogenów. Główną zaletą opisywanego tutaj protokołu PCR jest jego kompatybilność z późniejszymi badaniami in vitro i in vivo.