Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej
September 7th, 2017
Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wizualizacja tworzenia się naczyń krwionośnych in vivo w trójwymiarowych rusztowaniach w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Mierzone są kluczowe pytania w dziedzinie wytwarzania kości, takie jak to, jak neutralizować i oszukiwać tworzenie naczyń krwionośnych in vivo w trójwymiarowych rusztowaniach w czasie rzeczywistym. Jedną z zalet tej techniki jest to, że umożliwia ona jednoczesną neutralizację CERES, metryk zewnątrzkomórkowych i otaczających sieci molekularnych in vivo.
Na początek przygotuj jednorodny roztwór zawierający 20 gramów PLGA i 20 mililitrów 1,4 dioksanu. Następnie dodaj dwa gramy sproszkowanego nHAP do roztworu. Za pomocą mieszadła magnetycznego energicznie mieszaj zawiesinę z prędkością 1500 obr./min w temperaturze pokojowej przez 16 godzin, aby uzyskać jednolitą pastę, która będzie używana do drukowania porowatych rusztowań PLGA NHAP.
Po wydrukowaniu liofiluj rusztowania przez 48 godzin, aby całkowicie usunąć rozpuszczalnik. A następnie sterylizuj je w 75-procentowym etanolu przez godzinę. Następnie należy je jeszcze raz zlifalyzować, aby uzyskać neutralny, antyseptyczny materiał.
Następnie dodaj cztery punkty pięć razy 10 do jednej piątej cząstek lentiwirusa do każdego rusztowania i pozwól cząstkom wchłonąć się w nawilżonym inkubatorze, utrzymując temperaturę 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Teraz, gdy cząsteczka lentiwirusa zostanie wchłonięta na rusztowaniach, umyj rusztowania dwukrotnie dwoma mililitrami PBS, aby usunąć wszelkie niezwiązane pozostałości. Zamrozić umyte rusztowania w ciekłym azocie.
A po ponownym lifalyzowaniu przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszych badań. Przenieś rusztowania 3D wcześniej pokryte czterema punktami pięć razy dziesięć do piątych cząstek lentiwirusowych przenoszących zielone białko fluorescencyjne w dwupunktowych glilitrowych fiolkach kriogenicznych wypełnionych jednym mililitrem kompletnego DMEM i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przez pięć dni. Co dwanaście godzin inkubacji należy pobrać jeden mililitr próbek pożywki zawierającej cząstki lentiwirusowe uwolnione z rusztowań i zastąpić je jednym mililitrem świeżej pożywki.
Aby przeprowadzić HEK293T komórek, najpierw usuń pożywkę z komórek HEK293T hodowanych na 12-dołkowej płytce i dwukrotnie przemyj komórki PBS. Następnie dodaj jeden mililitr wcześniej zebranej pożywki do umytych komórek HEK293T i inkubuj płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze. Po 48 godzinach inkubacji zmierz liczbę komórek HEK293T dodatnich dla GFB za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia liczby bioaktywnych cząstek lentiwirusa.
Na początek losowo podziel sześć czarnych myszy C57 na trzy grupy leczenia: kontrolną, PH i PHp po 14 zwierząt każda. Ogol skórę na głowie znieczulonej myszy i zdezynfekuj powierzchnię nalewką jodową, a następnie 75-procentowym roztworem alkoholu. Umieść głowę myszy w instrumencie stereotaktycznym i zmierz skórę skalpelem, a następnie za pomocą nożyczek wykonaj jednocentymetrowe cięcie liniowe.
Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika zeskrob okostną z kości czaszki, aby odsłonić jej powierzchnię. Następnie, po lewej stronie czaszki, utwórz za pomocą wiertła trepanacyjnego defekt o średnicy krytycznej o średnicy czterech milimetrów. Przeszczep rusztowanie w bok ubytku kostnego.
Użyj kleszczyków okulistycznych, aby delikatnie pokryć pole operacyjne okostną. Następnie zamknij ranę, zakładając trzy szwy na każdy centymetr nacięcia. Na koniec podaj przeciwbólową buprenorfinę, aby opanować ból pooperacyjny i trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała do momentu przebudzenia.
Gdy mysz odzyska przytomność, zapewnij jej pożywienie i wodę oraz monitoruj jej codzienną aktywność do końca eksperymentu. Po zmontowaniu systemu mikroskopii wielofotonowej do obrazowania TPEF i SHG, dostrój femtosekundowy laser szafirowy tytanowy do 860 nanometrów. Aby uwidocznić nowo powstałe naczynia krwionośne, wstrzyknij myszu dożylnie 200 mikrolitrów 10 miligramów na mililitr roztworu dekstranu w soli fizjologicznej, a następnie, za pomocą instrumentu stereotaktycznego, unieruchomij znieczulone zwierzę na płycie grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza.
Wstrzyknij myszu 200 mikrolitrów soli fizjologicznej dootrzewnowo, aby zapobiec odwodnieniu. Na koniec podaj zwierzęciu trzyprocentową mieszaninę izofluranu w 100 procentach tlenu, aby utrzymać wystarczające znieczulenie i analgezję podczas obrazowania. Aby rozpocząć obrazowanie, zeskanuj parę luster galvo, aby utworzyć obszar próbkowania o wymiarach 512 na 512 mikrometrów.
Następnie, używając soczewki obiektywowej NA z jednym punktem O, skoncentruj wiązkę wzbudzenia na próbce i zbierz wstecznie rozproszony sygnał TPEF HSG. Ustaw pole widzenia tak, aby obejmowało normalny obszar kości i krawędź ubytku w grupie kontrolnej, ale tylko wszczepione rusztowanie podczas obrazowania zwierzęcia z grupy PH lub PHp. Następnie zeskanuj pięć różnych miejsc wady.
Pobieraj stosy obrazów co 12 sekund przez dwugodzinny okres obrazowania. Prezentowana jest fotografia rusztowania przygotowanego techniką druku 3d wraz z obrazem z mikrotomografii komputerowej obrazującym ogólną porowatość przygotowanego materiału. Mikroporowata struktura rusztowania jest pokazana na obrazie SEM uzyskanym w powiększeniu 5000 razy.
Jak wykazano, komórki HEK293T potraktowane pożywką zawierającą cząstki lentiwirusowe uwolnione z rusztowań skutecznie wyrażały białko zielonej fluorescencji. Jak oszacowano za pomocą cytometrii przepływowej, całkowita liczba uwolnionych cząstek osiągnęła około 40 procent. Najsilniejszy efekt uwalniania zaobserwowano w ciągu pierwszych 24 godzin badania i stopniowo zmniejszał się w czasie, potwierdzając, że cząsteczki lentiwirusa pokryte na rusztowaniach zachowują swoją aktywność biologiczną do 96 godzin.
Analiza in vivo naczyń krwionośnych utworzonych w obrębie ubytku kości łydkowej wykazała, że nowe naczynia krwionośne, choć niewykrywalne w grupie kontrolnej myszy, były wyraźnie widoczne zarówno w grupie PH, jak i PHp osiem tygodni po przeszczepie rusztowania. Dodatkowo, podczas gdy zarówno w grupie PH, jak i PHp wykryto wiele miejsc odkładania się kolagenu, tylko w grupie PHp można było zaobserwować rosnącą liczbę mniejszych naczyń wyrastających na rusztowania, a ogólna powierzchnia naczyń krwionośnych była znacząco inna. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o unieruchomieniu głowy myszy, aby utrzymać ją nieruchomo podczas skanowania, aby uniknąć artefaktów. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie fotoakustyczne, w celu uzyskania dodatkowych danych, takich jak obrazy tkanek głębokich. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regeneracją kości do badania angiogenezy w przeszczepach.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować tworzenie się plazmy in vivo na rusztowaniach 3D w czasie rzeczywistym i mikroskopię mikrofotonową.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia protokół wizualizowania formowania się naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem mikroskopi multifotonowej w 3D rusztowań. Badania koncentrują się na angiogenesie w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniu w modelu mysiego krytycznego defektu kości czaszkowej, ujawniając wyższą liczbę nowych naczyń krwionośnych w grupie leczonej w porównaniu do kontroli.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Angiogenesa
Tło
- Formowanie się naczyń krwionośnych jest kluczowe dla inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej.
- Rozumienie angiogenesy może poprawić strategie regeneracji kości.
- Mikroskopia multifotonowa umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki naczyń.
- Genetycznie zmodyfikowane rusztowania mogą wpływać na odpowiedzi angiogenne.
Cel badania
- Wizualizacja formowania się naczyń krwionośnych in vivo w 3D rusztowaniu.
- Ocena wpływu genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniu na angiogenesę.
- Wykorzystanie mikroskopi multifotonowej do wizualizowania rozwoju naczyń w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Przygotowanie jednorodnego roztworu PLGA i nHAP.
- Wykorzystanie miksera magnetycznego do stworzenia jednorodnej pasty do drukowania rusztowaniu.
- Zastosowanie mikroskopi multifotonowej do wizualizowania w czasie rzeczywistym.
- Porównanie formowania się naczyń krwionośnych między grupą leczoną i kontrolną.
Główne wyniki
- W grupie leczonej obserwowano zwiększone formowanie się naczyń krwionośnych.
- Wizualizacja w czasie rzeczywistym dostarczyła informacji na temat procesów angiogennych.
- Protokół skutecznie wykazał skuteczność rusztowaniu.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia wazkularyzacji w inżynierii tkankowej.
Wnioski
- Badanie skutecznie wizualizowało angiogenesę in vivo z wykorzystaniem zaawansowanych technik obrazowania.
- Genetycznie zmodyfikowane rusztowania wykazały zwiększone formowanie się naczyń krwionośnych.
- To podejście może być zastosowane do dalszych badań w zakresie regeneracji kości i inżynierii tkankowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Real-time visualization of angiogenesis within 3D biomaterial scaffolds addresses a critical bottleneck in bone tissue engineering by enabling direct assessment of vascular integration and scaffold performance. Multiphoton microscopy provides high-resolution, minimally invasive imaging to support predictive confidence in scaffold-driven bone regeneration. This capability informs early-stage portfolio decisions and de-risks translational advancement of engineered constructs for critical defect repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of angiogenic response to genetic scaffold modifications in vivo.
- Supports biological de-risking by visualizing vascular integration at the tissue–scaffold interface.
- Facilitates predictive confidence in scaffold design for regenerative applications.
Screening & Assay Development
- Provides a validated 3D in vivo system for quantifying blood vessel formation in response to scaffold modifications.
- Enables reproducible, quantitative imaging outputs for comparative assessment of scaffold candidates.
- Supports standardization of angiogenesis assays for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold performance with disease-relevant vascularization endpoints in preclinical bone defect models.
- Enables continuity from discovery-stage scaffold optimization to preclinical validation of regenerative efficacy.
- Supports risk-adjusted advancement of scaffold technologies based on real-time vascularization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This multiphoton microscopy-based workflow bridges early discovery, scaffold optimization, and preclinical validation for bone regeneration programs.
- Discovery Biology: Visualizes and quantifies in vivo angiogenesis to clarify scaffold–host interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for candidate scaffold evaluation.
- Analytics: Provides volumetric and temporal data on blood vessel formation for comparative analysis.
- Translational Research: Connects scaffold design to preclinical vascularization and bone regeneration outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse tissue engineering and regenerative medicine programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in scaffold-driven angiogenesis and bone repair.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging and quantification of vascularization in 3D scaffolds.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for scaffold advancement based on real-time biological integration.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of scaffold technologies for critical defect repair.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiphoton microscopy and in vivo imaging protocols.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and animal surgical facilities.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification parameters.
- Adaptation may be needed for different scaffold materials or defect models.
- Imaging artifacts can arise from animal movement, requiring careful immobilization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Scaffold Preparation
7:00
Results: 3D Scaffolds Promote Angiogenesis in Bone Defects
8:33
Conclusion
3:51
Crtitical Bone Defect Model and Scaffold Transplantation
5:21
In Vivo Imaging of Angiogenesis within the Bone Defect
2:30
Lentivirus Particle Release and Transduction Capacity
