Name: Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj wizualizację angiogenezy in vivo za pomocą mikroskopii wielofotonowej w rusztowaniach 3D-PLGA/nHAp. Ta metoda pozwala obserwować tworzenie naczyń krwionośnych w czasie rzeczywistym u myszy z defektem kości calowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Shenzhen Peacock Program, Chiny (nr 110811003586331), Shenzhen Basic Research Program (No. JCYJ20150401150223631, Nie. JCYJ20150401145529020 i nie. JCYJ20160331190714896), Specjalny Program Badań Publicznych i Budowania Potencjału w Guangdong (nr 2015A020212030), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 81501893), Narodowy Główny Chiński Program Badań Podstawowych (2013CB945503) oraz Program Innowacji SIAT dla Doskonałych Młodych Naukowców (Y5G010).

Opieka nad zwierzętami była zgodna z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych prowincji Guangdong. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone pod nadzorem i zgodą Komisji Etyki ds. Badań nad Zwierzętami, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences.
1. Produkcja lentiwirusów (LV)
<ol>
	<li>Sklonuj cDNA pdgf-b do lentiwirusowego wektora ekspresyjnego (pLenti6/5-eGFP lub LV-eGFP) w niestandardowym miejscu wielokrotnego klonowania za promotorem wirusa cytomegalii, używając miejsc restrykcyjnych Spe I i Sal I, aby skonstruować plazmid pLenti6/5-PDGFB-eGFP (LV-pdgfb)25.</li>
	<li>Wytwarzanie cząstek lentiwirusa (LV-pdgfb) z komórek HEK-293FT poprzez kotransfekcję z plazmidami pakującymi wirusa (pLP1, pLP2 i pVSV-G) przy użyciu standardowej metody fosforanu wapnia z chlorochiną (stężenie końcowe: 25 μM)25.</li>
	<li>Po 48 godzinach transfekcji zebrać i przefiltrować 500 ml supernatantu zawierającego wirusa za pomocą filtra (0,45 μm). Następnie należy zagęścić cząsteczki wirusa przez ultrawirowanie w temperaturze 89 000 x g przez 2 godziny. Zawiesić ponownie w 200 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), podwielokrotności, i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Aby określić miano lentiwirusa, należy inkubować HEK293T komórek z seryjnie rozcieńczanym roztworem lentiwirusa przez 24 godziny i obliczyć miano lentiwirusa, jak opisano wcześniej25.</li>
</ol>
2. Produkcja drukowanych w 3D rusztowań PLGA/nHAp i immobilizacji LV
<ol>
	<li>Rozpuścić 20 g materiału PLGA (poliD,L-laktyd-ko-glikolid) w 20 ml 1,4-dioksanu, aby uzyskać jednorodny roztwór. Dodać 2 g nanosized HAp (nano-hydroksyapatyd) w proszku (nHAp) do roztworu; stosunek PLGA: nHAp powinien wynosić 10:1 (w/w).</li>
	<li>Wymieszany roztwór mieszać energicznie (prędkość mieszania: 1 500 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 16 godzin za pomocą mieszadła magnetycznego, aby uzyskać jednolitą pastę. Wytwórz go w porowatych rusztowaniach PLGA/nHAp za pomocą niskotemperaturowej drukarki 3D ze skomputeryzowaną dyszą, która osadza pastę warstwa po warstwie, od dołu do góry, zgodnie z wcześniej zaprojektowanym modelem26; Rozmiary porów rusztowań wahają się od 200 do 400 μm.</li>
	<li>Suszenie próżniowe liofilizacji rusztowań przez 48 godzin, aby jak najdokładniej usunąć rozpuszczalnik. Namocz rusztowania w 75% roztworze etanolu na 1 godzinę w celu sterylizacji i liofilizuj, aby uzyskać neutralne, aseptyczne rusztowania. 
	UWAGA: Głównymi parametrami liofilizacji próżniowej są temperatura skraplania (°C) i stopień próżni (Pa). W próżni o stopniu 45 Pa rusztowania PLGA/nHAp liofilizowano próżniowo w temperaturze -78 °C przez 48 godzin w celu dokładnego usunięcia rozpuszczalnika.</li>
	<li>Dodać 10 μl cząstek LV (4,5 x 105) do każdego rusztowania PLGA/nHAp (4 mm x 4 mm x 2 mm) i inkubować rusztowania przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze, aby umożliwić adsorpcję.</li>
	<li>Po unieruchomieniu należy dwukrotnie przepłukać rusztowania PBS w celu usunięcia niezwiązanych cząstek LV. Rusztowania pokryte cząstkami LV należy zamrozić w ciekłym azocie, ponownie liofilizować i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
3. Kinetyka in vitro uwalniania cząstek LV z rusztowań i test aktywności transdukcji LV
<ol>
	<li>Inkubować rusztowania 3D (4 mm x 4 mm x 2 mm) przenoszące białko LV-zielonej fluorescencji (LV-eGFP, 4,5 x 105 cząstek LV) w 1 ml kompletnego DMEM w 2,0 ml fiolkach kriogenicznych w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 5 dni.</li>
	<li>Pobieraj 1 ml próbki co 12 godzin od 12 godzin do 120 godzin po inkubacji i zamień pożywkę. W każdym punkcie czasowym dodać 1 ml świeżej pożywki zamiast 1 ml pożywki inkubacyjnej.</li>
	<li>Użyj zebranych pożywek do transdukcji HEK293T komórek przez koinkubację przez 48 godzin. Zmierz liczbę bioaktywnych cząstek LV, określając liczbę komórek HEK293T GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej27.
	<ol>
		<li>Przed transdukcją HEK293T komórek należy usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przepłukać HEK293T komórki PBS. Dodać zebrane podłoża zawierające lentiwirusa uwolnionego z rusztowań do studzienki (1 ml/basenik) i hodować z HEK293T komórkami przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ocena in vitro migracji MSC (BMSC) pochodzących ze szpiku kostnego
<ol>
	<li>Przed testem migracji przygotuj BMSC wyrażające białko fluorescencyjne pomidora (BMSCS-T) i białko PDGF-BB (BMSC-P)28.</li>
	<li>Przeprowadzić test migracji BMSC z komorą Boydena przy użyciu 24-dołkowej płytki i filtrów poliwęglanowych o wielkości porów 8 μm.
	<ol>
		<li>Umieścić 0,5 ml BMSC (5 x 104) transfekowanych LV wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego pomidora (BMSCS-T) w górnych komorach. Umieścić 0,5 ml BMSC (2 x 105) transfekowanych białkiem PDGF-BB (BMSC-P) z ekspresją LV w dolnych komorach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz sześć grup do tego eksperymentu i dodaj 500 μl do dolnej komory każdej studzienki. 
	A. Ślepa kontrola, tylko pożywka bez surowicy 
	B. Kontrola FBS, pożywka uzupełniona 10% FBS 
	C. Kontrola PDGF-BB, 4 ng/mL PDGF-BB w podłożu bez surowicy 
	D. Grupa zasysająca PDGF-BB, przeciwciało poliklonalne PDGF-BB (4 ng/ml) i anty-PDGF-BB (4 ng/ml) w pożywce wolnej od surowicy 
	E. Grupa BMSC, 2 x 105 BMSC w podłożu bez surowicy 
	F. Grupa BMSCs-P, 2 x 105 BMSCs-P w pożywce wolnej od surowicy.</li>
	<li>Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze. Następnie usuń migrowane komórki po stronie dolnej komory i zbierz je w celu ilościowego określenia liczby BMSC-T za pomocą cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Usunąć migrowane komórki po stronie dolnej komory za pomocą skrobaka do komórek i ponownie zawiesić migrowane komórki za pomocą 2 ml PBS. Określ ilościowo liczbę migrowanych BMSC-T za pomocą cytometrii przepływowej29.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Opracowanie modelu krytycznego uszkodzenia kości łykciowej u myszy i przeszczep rusztowania
UWAGA: Samce myszy BALB/c (w wieku 7 tygodni) zostały zakupione w Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Guangdong, Chiny).
<ol>
	<li>Zapisz łącznie 42 samce myszy do eksperymentu z ubytkiem kości kalwarycznej. Losowo podziel myszy na trzy grupy, po czternaście w każdej grupie, które otrzymują następujące leczenie: Grupa A, bez implantów; Grupa B, wszczepione rusztowania PH (PLGA/nHAp); oraz wszczepione rusztowania PHp grupy C (PLGA/nHAp/LV-pdgfb).</li>
	<li>Znieczulić zwierzęta dootrzewnowym podaniem pentobarbitalu sodu (50 mg/kg). Usuń sierść pastą do depilacji i oczyść skórę głowy 75% roztworem alkoholu przed wykonaniem pierwszego nacięcia. Zamocuj głowę każdej myszy za pomocą instrumentu stereotaktycznego, aby utrzymać ją nieruchomo podczas operacji.</li>
	<li>Wykonaj wstępne nacięcie skalpelem, a następnie powiększ je nożyczkami, aby utworzyć 1-centymetrowe liniowe nacięcie skóry. Zeskrob okostną z kości czaszki, aby odsłonić powierzchnię kości czaszki za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.</li>
	<li>Użyj zadzioru trepanacyjnego, aby utworzyć defekt o średnicy krytycznej 4 mm po lewej stronie kalwarii30. Przeszczep rusztowanie w miejsce ubytku kostnego. 
	UWAGA: Krytyczne defekty wielkości (CSD) były pierwotnie definiowane jako "najmniejsza rana śródkostna w określonej kości i gatunku zwierzęcia, która nie zagoi się samoistnie w ciągu życia zwierzęcia". W tym eksperymencie wada o średnicy 4 mm jest ubytkiem kości o krytycznym rozmiarze, zgodnie z poprzednim badaniem31,32.</li>
	<li>Użyj kleszczyków okulistycznych, aby delikatnie przesunąć okostną do tyłu, aby pokryć pole operacyjne. Zszyj naciętą skórę trzema szwami na cm.</li>
	<li>Wykonaj opiekę pooperacyjną. Podawać przeciwbólową buprenorfinę (0,1 mg/kg) w celu złagodzenia bólu. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej, aż zwierzę się obudzi. Następnie należy nakarmić zwierzęta pokarmem i wodą oraz rejestrować ich aktywność każdego dnia aż do końca testu. Uwaga: Analgezja może być podana przed zabiegiem w zależności od wytycznych lokalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami. </li>
</ol>
6. Obrazowanie in vivo angiogenezy w obrębie ubytku kostnego z MPM
UWAGA: Sprzężony z FITC 250 kD dekstran (10 mg/mL) w soli fizjologicznej został dożylnie wstrzyknięty myszom w celu uzyskania obrazów nowych naczyń krwionośnych o wysokim SNR (stosunek sygnału do szumu) zgodnie z poprzednim badaniem33. Należy pamiętać, że jest to procedura przetrwania. 
<ol>
	<li>Zmontuj system mikroskopii wielofotonowej (MPM) do obrazowania dwufotonowej fluorescencji wzbudzonej (TPEF) i sygnału generacji drugiej harmonicznej (SHG).</li>
	<li>Znieczulić zwierzęta dootrzewnowym wstrzyknięciem pentobarbitalu sodu (50 mg/kg) i unieruchomić zwierzęta na płycie grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie 37 °C przez cały czas trwania doświadczeń. Użyj 3,0% izofluranu w 100% tlenie, aby utrzymać zadowalające znieczulenie i analgezję podczas procesu obrazowania. Dootrzewnowo wstrzyknąć sól fizjologiczną (200 μl/zwierzę), aby zapobiec odwodnieniu przed obrazowaniem.</li>
	<li>Dostosuj femtosekundowy laser Ti-Sapphire do długości fali 860 nm. Utwórz obszar próbkowania o wymiarach 512 x 512 μm, skanując parę luster galvo i używając soczewki obiektywowej NA1.0 zanurzonej w wodzie, aby skupić wiązkę wzbudzenia w próbce i zebrać wstecznie rozproszony sygnał TPEF/SHG. 
	UWAGA: Obrazowanie zostało przeprowadzone na domowym systemie obrazowania pod mikroskopem wielofotonowym (MPM). Podczas obrazowania femtosekundowy laser Ti-Sapphire został dostrojony do 860 nm jako optymalnej długości fali wzbudzenia. Wiązka laserowa została zeskanowana rastrowo na próbce za pomocą pary luster galwanometrycznych. Po przejściu przez zwierciadło dichroiczne o długości fali 685 nm, wiązka została skupiona na próbce przez obiektyw 20X NA1.0. Indukowane sygnały TPEF i SHG zostały zebrane przez ten sam cel. Sygnały zostały oddzielone od lasera wzbudzającego przez wspomniane wyżej zwierciadło dichroiczne i oczyszczone przez filtr krótkoprzepustowy 680 nm. Sygnały TPEF i SHG zostały zebrane przez wiązkę światłowodów i przewodzone do spektrografu. Detektor na spektrografie był liniowym układem lamp fotopowielaczy (PMT). Połączenie spektrografu i liniowych PMT dało możliwość rejestrowania sygnału w 16 kolejnych pasmach spektralnych, od 400 nm do 600 nm, w odstępach 12,5 nm. W związku z tym sygnały TPEF i SHG zostały wykryte w tym samym czasie i rozdzielone w domenach spektralnych. Ponadto do obrazowania 3D zastosowano silnik osiowy do kontrolowania głębokości obrazowania. Obszar każdego obrazu został ustawiony na 512 x 512 μm, a przedział głębokości został ustawiony na 2 μm (grupa kontrolna, 5 μm). Warto zauważyć, że 5 miejsc na każdym defektu zostało zobrazowanych w celu zebrania statystycznie istotnych danych, a wybrane miejsca obrazowania zostały rozmieszczone równomiernie i losowo wzdłuż defektu.</li>
	<li>Przeskanuj 5 miejsc na każdej wadze, aby zebrać statystycznie istotne dane do pomiaru formowania się naczynia.
	<ol>
		<li>Używaj miejsc skanowania równomiernie i losowo rozmieszczonych wzdłuż defektu. W przypadku grupy kontrolnej pole widzenia (FOV) powinno obejmować zarówno pierwotny obszar kości, jak i krawędź ubytku, ale w przypadku grup PH i PHp należy mieć pole widzenia na wszczepionym rusztowaniu.</li>
		<li>Wykonaj 1-centymetrowe liniowe nacięcie skóry za pomocą skalpela i zszyj otwartą skórę do mocowania, aby odsłonić miejsce przeszczepu. Za pomocą strzykawki umieść kroplę wody między soczewką zanurzającą a przeszczepami, aby utworzyć szklankę wodną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestruj stosy obrazów co 12 s przez 2 godziny obrazowania. Wyświetlaj i analizuj dane wolumetryczne za pomocą niestandardowego programu MATLAB i określaj ilościowo obszary naczyń krwionośnych za pomocą oprogramowania ImageJ34,35.</li>
</ol>
7. Analiza ekspresji genów pdgf-b i genów związanych z angiogenezą metodą RT-qPCR
UWAGA: PCR został przeprowadzony zgodnie ze zwykłymi krokami: 95 °C przez 30 s, 40 cykli po 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s. Krzywe topnienia po PCR potwierdziły specyficzność amplifikacji pojedynczego celu, a zmiana fałdowania interesującego genu w stosunku do β-aktyny została określona. Reakcja dla każdej próbki została przetestowana trzykrotnie.
<ol>
	<li>Zbierz wszczepione rusztowania i tkanki od myszy eksperymentalnych po 2, 4 i 8 tygodniach od operacji36; próbki grupy kontrolnej (n = 4), pobrane w tych samych punktach czasowych, powinny pochodzić z sąsiedniej tkanki kostnej. 
	UWAGA: W każdym punkcie czasowym (2, 4 i 8 tygodni) myszy były poddawane eutanazji za pomocą wdychania CO2 . Rozwarstwić kalwarię, a następnie usunąć i zebrać wszczepione rusztowania z kalwarii.</li>
	<li>Użyj komercyjnego odczynnika, aby wyekstrahować całkowite RNA z każdej próbki zgodnie z protokołem producenta. Użyj zestawu do odwrotnej transkrypcji, aby dokonać odwrotnej transkrypcji RNA na cDNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Przeprowadzić ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu SYBR Green Detection System; startery są wymienione w Tabeli 1.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="8">Elementarz(5'–3')</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Gen</td>
			<td colspan="2" rowspan="1">Naprzód</td>
			<td colspan="4" rowspan="1">Odwrócony</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFB powiedział:</td>
			<td colspan="3">CATCCGCTCCTTTGATGATCTT</td>
			<td colspan="4">GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vWF (Sieć wirwirowa)</td>
			<td colspan="3">CTCTTTGGGGACGACTTCATC</td>
			<td colspan="4">TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR2</td> powiedział:
			<td colspan="3">GAAATGACACTGGAGCCTACA AG</td>
			<td colspan="4">TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-aktyna</td>
			<td colspan="3">GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGG</td>
			<td colspan="4">GCAGTACATAATTTACACAGAAG CAAT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Zestawy Pimera.
8. Analiza mikrotomografii komputerowej regeneracji kości
<ol>
	<li>Eutanazja myszy za pomocą inhalacji CO2 po 8 tygodniach od operacji. W dobrze wentylowanym środowisku delikatnie umieść każdą mysz w czystej klatce dla myszy i wpompuj gaz CO2 do klatki, aby znieczulić myszy przed eutanazją.</li>
	<li>Wypreparuj czaszkę w celu zobrazowania mikrotomografią piersiową obszaru ubytku kostnego. W eksperymentach należy stosować następujące parametry skanowania: rozdzielczość 9 μm, filtr Al 0,5 mm, napięcie 50 kV i prąd 142 μA.</li>
	<li>Zrekonstruuj wszystkie dane obrazowe za pomocą komercyjnego oprogramowania dostarczonego przez firmę. Skalibruj skany za pomocą funkcji kalibracji oprogramowania CTAn. 
	UWAGA: Umieść jednostkę Hounsfielda (HU) pod myszami podczas każdego skanowania.</li>
</ol>

<ol><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPNMB+enhances+bone+regeneration+by+promoting+angiogenesis+and+osteogenesis%3A+potential+role+for+tissue+engineering+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone.</a> J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).</li>
<li>Schroeder, J. E., Mosheiff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+approaches+for+bone+repair%3A+concepts+and+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence.</a> Injury. 42 (6), 609-613 (2011).</li>
<li>Chiarello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((allograft+and+bone+substitutes+in+reconstructive+orthopedic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery.</a> Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).</li>
<li>Elangovan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enhancement+of+bone+regeneration+by+gene+activated+matrix+encoding+for+platelet+derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor.</a> Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).</li>
<li>Bouyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+delivery+of+tunable+doses+of+BMP-2+from+an+adaptable+polymeric+scaffold+induces+volumetric+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration.</a> Biomaterials. 104, 168-181 (2016).</li>
<li>Rezwan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+and+bioactive+porous+polymer%2Finorganic+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).</li>
<li>Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial+developments+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterial developments for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+collagen-based+biomaterials+with+immobilized+growth+factors+or+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides.</a> Methods. 84, 44-52 (2015).</li>
<li>Chen, G., Lv, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+and+Application+of+Electrospun+Nanofiber+Scaffold-based+Growth+Factor+in+Bone+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering.</a> Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).</li>
<li>Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-+and+gene-based+tissue+engineering+in+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).</li>
<li>Chen, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+and+novel+applications+of+release+technology+for+periodontal+reconstructive+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies.</a> J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).</li>
<li>Winn, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+approaches+for+modulating+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy approaches for modulating bone regeneration.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).</li>
<li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+Encoding+Human+Platelet-Derived+Growth+Factor-B+Delivered+to+Alveolar+Bone+Defects+Exhibits+Safety+and+Biodistribution+Profiles+Favorable+for+Clinical+Use%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use.</a> Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).</li>
<li>Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Platelet-Derived+Growth+Factor+as+a+Chemotactic+Factor+for+Mesenchymal+Stem+Cells+by+Bone-Mimetic+Electrospun+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds.</a> Plos One. 7 (7), (2012).</li>
<li>Gehmert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%3A+The+role+of+PDGF-BB+on+Adiopse-tissue+derived+Stem+Cells+%28ASCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Hemorheol+and+Microcirc%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs).</a> Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).</li>
<li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-B+gene+therapy+accelerates+bone+engineering+and+oral+implant+osseointegration%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration.</a> Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).</li>
<li>Javed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+the+platelet-derived+growth+factor+in+periodontal+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration.</a> Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).</li>
<li>Murali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+hybrid+porous+scaffolds+immobilized+with+platelet+derived+growth+factor-BB+promote+cellularization+and+vascularization+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).</li>
<li>Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+platelet-derived+growth+factors+in+physiology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine.</a> Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).</li>
<li>Wosnitza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+human+adipose+stem+cells+to+perform+adipogenic+and+endothelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation.</a> Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).</li>
<li>Hankenson, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in bone regeneration.</a> Injury. 42 (6), 556-561 (2011).</li>
<li>Schmidt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+three-dimensional+quantification+of+VEGF-induced+scaffold+neovascularisation+by+microcomputed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography.</a> Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).</li>
<li>Perng, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Angiogenesis+Effect+of+Porous+Collagen+Scaffold+with+Hyaluronic+Acid+Oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides.</a> J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tissue+engineering+scaffolds+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy.</a> Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+monitoring+of+placenta-specific+transgene+expression+by+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging.</a> PLoS One. 6 (1), e16348(2011).</li>
<li>Yeo, M. G., Kim, G. H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cm201119q">Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration.</a> Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).</li>
<li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+Vectors+Mediate+Long-Term+and+High+Efficiency+Transgene+Expression+in+HEK+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells.</a> Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+angiogenesis+in+bioactive+3-dimensional+poly+%28D%2CL-lactide-co-glycolide%29%2Fnano-hydroxyapatite+scaffolds+by+in+vivo+multiphoton+microscopy+in+murine+calvarial+critical+bone+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect.</a> Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).</li>
<li>Abbasi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector-mediated+transduction+of+goat+undifferentiated+spermatogonia%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia.</a> Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).</li>
<li>Pigossi, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cellulose-hydroxyapatite+composites+with+osteogenic+growth+peptide+%28OGP%29+or+pentapeptide+OGP+on+bone+regeneration+in+critical-size+calvarial+defect+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model.</a> J Biomed Mater Res A. , (2015).</li>
<li>Bos, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+histocompatibility+matching+on+canine+frozen+bone+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts.</a> J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).</li>
<li>Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+size+defect+as+an+experimental+model+to+test+bone+repair+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Craniofac+Surg%22%5BJournal%5D)">The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials.</a> J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).</li>
<li>Hollanders, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bevacizumab+Revisited%3A+Its+Use+in+Different+Mouse+Models+of+Ocular+Pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies.</a> Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).</li>
<li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QSIM%3A+quantitative+structured+illumination+microscopy+image+processing+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ.</a> Biomed Eng Online. 14, 4(2015).</li>
<li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li>
<li>Lohmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+regeneration+induced+by+a+3D+architectured+hydrogel+in+a+rat+critical-size+calvarial+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect.</a> Biomaterials. 113, 158-169 (2016).</li>
<li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+angiogenesis+and+osteogenesis+in+critical+bone+defects+by+the+controlled+release+of+BMP-2+and+VEGF%3A+implantation+of+electron+beam+melting-fabricated+porous+Ti6Al4V+scaffolds+incorporating+growth+factor-doped+fibrin+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue.</a> Biomed Mater. 10 (3), (2015).</li>
<li>Guldberg, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+of+tissue+integration+with+porous+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D imaging of tissue integration with porous biomaterials.</a> Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).</li>
<li>Boehler, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PLG%2FHAp+composite+scaffold+for+lentivirus+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery.</a> Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).</li>
<li>Heo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+characterization+of+novel+nano-+and+micro-HA%2FPCL+composite+scaffolds+using+a+modified+rapid+prototyping+process%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process.</a> J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kość jest silnie unaczynioną tkanką o wyjątkowej zdolności do ciągłego gojenia i przebudowy przez całe życie jednostki1. Poziom unaczynienia jest ważny dla osteogenezy i naprawy defektów. Niskie unaczynienie ogranicza szerokie zastosowanie kliniczne kości inżynierii tkankowej. Konstruowanie silnie unaczynionej kości inżynierii tkankowej zgodnie z teorią biomimetyki stało się narzędziem do naprawy ubytków kostnych o dużych segmentach. Różnego rodzaju rusztowania są z powodzeniem stosowane do napraw...

Kość jest wysoce unaczynioną tkanką, która kontynuuje przebudowę w ciągu życia osoby1. Szybka i skuteczna regeneracja kości dużych ubytków kostnych powstałych w wyniku urazu, braku zrostu, resekcji guza lub wad rozwojowych twarzoczaszki jest złożonym procesem fizjologicznym. Tradycyjne podejścia terapeutyczne stosowane do naprawy ubytków kostnych obejmują autoprzeszczep i implantację alloprzeszczepu, ale ich stosowanie wiąże się z kilkoma problemami i ograniczeniami, takimi jak ograniczona dostępność, znaczna zachorowalność na miejsce dawcze, wysokie ryzyko infekcji i odrzucenie immunologiczne gospodarza2,3. Jednak sztuczne przeszczepy kostne stanowią skuteczną alternatywę dla złagodzenia tych ograniczeń. Mogą być wykonane z materiałów biodegradowalnych, są łatwe do wytworzenia z odpowiednią wielkością porów i mogą być modyfikowane genetycznie4,5.
Obecnie, różne rusztowania inżynierii tkankowej są wykorzystywane do rozwoju kości z inżynierii tkankowej6,7. Aby skuteczniej indukować naprawę i regenerację kości, pojawiły się zmodyfikowane biomateriały w połączeniu z czynnikami wzrostu, które osiągnęły dobre wyniki8,9. Niestety, krótki okres półtrwania, łatwa do utraty aktywność i suprafizjologiczne dawkowanie czynników wzrostu dla skuteczności terapeutycznej ograniczają ich zastosowanie kliniczne10. Aby przezwyciężyć te problemy, wykazano, że dostarczanie genów czynnika wzrostu zamiast czynników wzrostu jest skutecznym podejściem do utrzymania bioaktywności w leczeniu wad i chorób kostnych11,12. Wektory wirusowe są obiecującymi narzędziami do regeneracji tkanek ze względu na ich wysoką skuteczność wyrażania13.
Wśród czynników wzrostu, w tym badaniu wybrano płytkowy czynnik wzrostu (PDGF-BB), ponieważ jest on nie tylko mitogenem i chemoatraktantem dla komórek mezenchymalnych i osteogennych, ale także stymulantem angiogenezy14,15. Wcześniejsze badania przedkliniczne i kliniczne wykazały, że PDGF-BB może bezpiecznie i skutecznie wspomagać naprawę kości w ubytkach kostnych przyzębia16,17. Ostatnie badania wykazały, że PDGF-BB stymuluje angiogenezę poprzez motywowanie migracji i proliferacji komórek śródbłonka in vivo18,19. Co więcej, PDGF-BB może również sprawić, że mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) będą zdolne do różnicowania się w komórki śródbłonka20, co dodatkowo podkreśla potencjalną rolę MSCs w neowaskularyzacji. Dlatego indukowanie de novo tworzenia naczyń krwionośnych w rusztowaniach za pomocą PDGF-BB jest ważnym krokiem w naprawie tkanki wyrosłej w rusztowania w inżynierii tkanki kostnej.
Gojenie wad kostnych to dynamiczny proces morfogenetyczny tkanek, który wymaga skoordynowanej osteogenezy i angiogenezy na pozycjach naprawczych21. Neoangiogeneza w wszczepionych rusztowaniach inżynierii tkankowej jest niezbędnym warunkiem wstępnym do zaopatrywania komórek w składniki odżywcze i tlen do wzrostu i przetrwania oraz do usuwania odpadów metabolicznych. Powszechnie stosowane metody obrazowania, w tym rentgenowska mikrotomografia komputerowa (microCT), obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM), optyczna koherentna tomografia (OCT) i konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa, są stosowane zamiast badania histologicznego w celu uzyskania informacji o angiogenezie22,23. Jednak metody te napotykają różne przeszkody w wizualizacji i pomiarze neowaskulatury w rusztowaniach 3D w inżynierii tkanki kostnej. Mikroskopia wielofotonowa (MPM) jest stosunkowo nowatorską techniką obrazowania biologicznego, która ma wyraźną zaletę jednoczesnej wizualizacji komórek, macierzy zewnątrzkomórkowej i otaczających sieci naczyniowych in vivo. Posiada wrodzoną zdolność trójwymiarowego obrazowania do głębokiej penetracji tkanek i powoduje niskie fotouszkodzenia. W związku z tym w ciągu ostatniej dekady MPM zyskał dużą uwagę w badaniach biomedycznych24, w tym w neurobiologii, immunologii i dynamice komórek macierzystych. Jest jednak prawie nie stosowany w badaniach ortopedycznych.

<table><tbody><tr><td>Poli(D,L-laktyd-ko-glikolid) (PLGA)</td><td>Sigma</td><td>P1941</td><td>Stosunek L/G 75:25, MW 66000-107000</td></tr><tr><td>Nanocząstki hydroksyapatytu</td><td>Sigma</td><td>702153</td><td>Średnia średnica < 200 nm</td></tr><tr><td>Sól difosforanu chlorochiny</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>250-kD dekstran sprzężony z FITC</td><td>Sigma</td><td>FD250S</td><td></td></tr><tr><td>1,4-dioksan</td><td>lingfeng, Szanghajskie</td><td></td> filtry Stericup <td>0,45 mikrona</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB Cdna</td><td>Sino Biological, Inc</td><td>MZ50801-G</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało poliklonalne anty-PDGF-BB</td><td>&nbsp; BioVision, Inc</td><td>5489-30T</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB rekombinowane białko</td><td></td><td>4489-50</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do transfekcji fosforanu wapnia</td><td>Promega Corporation</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>L-DMEM</td><td>Hyklon</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclon</td><td>SH30028.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, płyn</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Transwell&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>Samce myszy BALB/c</td><td>Centrum dla zwierząt w laboratorium medycznym Guangdong&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1063180500</td><td></td></tr><tr><td>mikroskopię</td><td></td><td></td> wielofotonową <td>domowej roboty w Instytucie Zaawansowanej Technologii w Shenzhen do wykrywania dwufotonowej wzbudzonej fluorescencji (TPEF) i sygnału generacji drugiej harmonicznej (SHG).</td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Keyuan, Shandong</td><td>401750169</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td><td>Takara</td><td>RR420B</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina i eozyna</td><td>Beyotime</td><td>C0105</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Leica& nbsp;</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka OPtima L-100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>Drukarka niskotemperaturowa&nbsp;</td>Uniwersytet <td></td><td>Tsinghua</td><td>Domowej roboty na uniwersytecie Tsinghua</td></tr><tr><td>Instrument LightCycler 480&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td></td></tr><tr><td>microCT</td><td>Bruker</td><td>1176</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie komercyjne</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3d-plga/nhap do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Rekonstrukcja krytycznie dużych ubytków kostnych pozostaje poważnym problemem klinicznym z powodu słabej angiogenezy w rusztowaniach inżynierii tkankowej podczas naprawy, co powoduje brak wystarczającego dopływu krwi i powoduje martwicę nowych tkanek. Szybkie unaczynienie jest niezbędnym warunkiem przetrwania nowej tkanki i integracji z istniejącą tkanką gospodarza. Wytwarzanie naczyń krwionośnych de novo w rusztowaniach jest jednym z najważniejszych kroków w kierunku zwiększenia wydajności regeneracji kości, umożliwiając naprawę tkanki w przekształcenie jej w rusztowanie. Aby rozwiązać ten problem, stosuje się modyfikację genetyczną rusztowania biomateriałowego w celu przyspieszenia angiogenezy i osteogenezy. Jednak wizualizacja i śledzenie in vivo tworzenia się naczyń krwionośnych w czasie rzeczywistym i w trójwymiarowych (3D) rusztowaniach lub nowej tkance kostnej nadal stanowi przeszkodę dla inżynierii tkanki kostnej. Mikroskopia wielofotonowa (MPM) to nowatorska metoda obrazowania biologicznego, która może pozyskiwać dane wolumetryczne ze struktur biologicznych w sposób wysokorozdzielczy i minimalnie inwazyjny. Celem pracy była wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości kalwarycznej. Rusztowania PLGA/nHAp funkcjonalizowano w celu zapewnienia trwałego dostarczania genu czynnika wzrostu pdgf-b przenoszącego wektory lentiwirusowe (LV-pdgfb) w celu ułatwienia angiogenezy i poprawy regeneracji kości. W mysim modelu krytycznego ubytku kości z implantacją rusztowania obszary naczyń krwionośnych (BVA) w rusztowaniach PHp były znacznie wyższe niż w rusztowaniach PH. Dodatkowo ekspresja pdgf-b i genów związanych z angiogenezą, vWF i VEGFR2, odpowiednio wzrosła. Analiza mikrotomografii komputerowej wykazała, że tworzenie się nowych kości w grupie PHp znacznie się poprawiło w porównaniu z innymi grupami. Według naszej wiedzy jest to pierwszy raz, kiedy mikroskopia wielofotonowa została wykorzystana w inżynierii tkanki kostnej do zbadania angiogenezy w biodegradowalnym rusztowaniu 3D in vivo i w czasie rzeczywistym.

Cylindryczne porowate rusztowania PLGA/nHAp o wysokości 0,6 mm i średnicy 4 mm zostały wykonane za pomocą drukarki 3D. Morfologię rusztowań przeanalizowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i mikro-CT. Rysunek 1A przedstawia fotografię wszczepionego rusztowania. Skanowanie mikro-CT wykazało, że ponad 85% porów miało rozmiary w zakresie od 20 do 40 µm (Rysunek 1B). Obrazowanie SEM wykazało, że powierzchnia rusztowania posiadała chropowatą mikr...

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wizualizacja tworzenia naczyń krwionośnych in vivo w rusztowaniach trójwymiarowych w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii wielofotonowej. Pomiary te odpowiadają na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji kości, takie jak sposób neutralizacji i stymulacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo w rusztowaniach trójwymiarowych w czasie rzeczywistym. Jedną z zalet tej techniki jest to, że umożliwia ona jednoczesną neutralizację CERES, macierzy zewnątrzkomórkowej oraz otaczających sieci molekularnych in vivo.W celu rozpoczęcia przygotuj jednorodny roztwór zawierający 20 g PLGA oraz 20 ml 1, 4 dioksanu. Następnie dodaj do roztworu dwa gramy sproszkowanego nHAP. Przy użyciu mieszadła magnetycznego intensywnie mieszaj zawiesinę przy 1500 rpm w temperaturze pokojowej przez 16 godzin, aby utworzyć jednolitą pastę, która zostanie wykorzystana do drukowania porowatych rusztowań PLGA NHAP.Po wydrukowaniu poddać rusztowania liofilizacji przez 48 godzin, aby całkowicie usunąć rozpuszczalnik. Następnie wysterylizować je w 75% etanolu przez jedną godzinę. Po tym czasie ponownie poddać je liofilizacji, aby uzyskać neutralny, antyseptyczny materiał.Następnie do każdego rusztowania należy dodać 4,5 × 10⁵ cząsteczek lentiwirusowych i pozostawić je do absorpcji w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Po absorpcji cząsteczek lentiwirusowych na rusztowaniach, należy przepłukać je dwukrotnie 2 ml PBS, aby usunąć wszelkie nieprzypisane pozostałości. Przemyte rusztowania należy zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie.Następnie, po ponownym liofilizowaniu, przechowywać je w temperaturze -80 °C do dalszych badań. Przenieść rusztowania 3D, uprzednio pokryte 4,5 × 10⁵ cząsteczkami lentiwirusowymi niosącymi zielone białko fluorescencyjne, do probówek kriogenicznych o pojemności 2,0 ml wypełnionych 1 ml pełnej pożywki DMEM i inkubować je w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez pięć dni. Co 12 godzin inkubacji pobierać 1 ml próbek pożywki zawierającej cząsteczki lentiwirusowe uwalniane z rusztowań i zastępować je 1 ml świeżej pożywki.Aby przeprowadzić transdukcję komórek HEK293T, najpierw usunąć pożywkę z komórek HEK293T hodowanych na płytce 12-dołkowej i przemyć komórki dwukrotnie roztworem PBS. Następnie do przemytych komórek HEK293T dodać jeden mililitr wcześniej zebranej pożywki i inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem. Po 48 godzinach inkubacji zmierzyć liczbę komórek HEK293T wykazujących ekspresję GFB za pomocą cytometrii przepływowej, aby określić liczbę bioaktywnych cząstek lentiwirusowych.Na początek należy losowo podzielić myszy C57 black six na trzy grupy badawcze: kontrolną, PH oraz PHp, po 14 zwierząt w każdej grupie. Należy ogolić skórę na głowie znieczulonej myszy i zdezynfekować powierzchnię nalewką z jodu, a następnie 75% roztworem alkoholu. Głowę myszy należy umieścić w aparacie stereotaktycznym, naciąć skórę skalpelem, a następnie za pomocą nożyczek wykonać cięcie liniowe o długości 1 cm.Za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego zeskrob okostną z kości czaszki, aby odsłonić jej powierzchnię. Następnie, po lewej stronie czaszki, wykonaj za pomocą wiertła trepanacyjnego ubytek o rozmiarze krytycznym o średnicy czterech milimetrów. Przeszczep rusztowanie do miejsca ubytku kostnego.Za pomocą pęsety okulistycznej delikatnie przykryj miejsce operacyjne okostną. Następnie zamknij ranę, nakładając trzy szwy na każdy centymetr nacięcia. Na koniec podaj lek przeciwbólowy buprenorfinę w celu opanowania bólu pooperacyjnego i pozostaw zwierzę na podgrzewaczce, aby utrzymać temperaturę jego ciała aż do momentu wybudzenia.Gdy mysz odzyska przytomność, należy zapewnić jej dostęp do pożywienia i wody oraz monitorować jej codzienną aktywność aż do końca eksperymentu. Po złożeniu układu do mikroskopii wielofotonowej do obrazowania TPEF i SHG, nastroić femtosekundowy laser tytano-szafirowy na 860 nm. Aby zwizualizować nowo powstałe naczynia krwionośne, wstrzyknąć myszy dożylnie 200 µL roztworu dekstranu o stężeniu 10 mg/mL w soli fizjologicznej, a następnie, używając instrumentu stereotaktycznego, unieruchomić znieczulone zwierzę na płycie grzejnej, aby utrzymać temperaturę jego ciała na poziomie 37 °C.Wstrzyknij myszy 200 µL soli fizjologicznej do jamy otrzewnej, aby zapobiec odwodnieniu. Na koniec podaj zwierzęciu 3% mieszaninę izofluranu w 100% tlenie, aby utrzymać wystarczającą anestezję i analgezję podczas obrazowania. Aby rozpocząć obrazowanie, przeskanuj parę luster galwanometrycznych w celu utworzenia obszaru próbkowania o wymiarach 512 by 512 µm.Następnie, używając obiektywu imersyjnego w wodzie o aperturze numerycznej NA 1.0, należy skupić wiązkę wzbudzenia na próbce i zebrać sygnał TPEF HSG rozproszony wstecznie. Pole widzenia należy ustawić tak, aby obejmowało ono obszar normalnej kości oraz krawędź ubytku w grupie kontrolnej, natomiast w przypadku obrazowania zwierzęcia z grupy PH lub PHp – wyłącznie wszczepiony rusztowanie. Następnie należy zeskanować pięć różnych obszarów ubytku.Należy pozyskiwać stosy obrazów co 12 sekund przez dwugodzinny okres obrazowania. Przedstawiono tutaj fotografię rusztowania przygotowanego techniką druku 3D wraz z obrazem mikro-CT pokazującym całkowitą porowatość przygotowanego materiału. Mikroporowata struktura rusztowania została pokazana na obrazie SEM wykonanym przy 5000-krotnym powiększeniu.Jak pokazano, komórki HEK293T traktowane pożywką zawierającą cząsteczki lentiwirusowe uwalniane z rusztowań efektywnie eksprimowały zielone białko fluorescencyjne. Zgodnie z szacunkami wykonanymi za pomocą cytometrii przepływowej, całkowita liczba uwolnionych cząsteczek osiągnęła około 40 procent. Najsilniejszy efekt uwalniania zaobserwowano w ciągu pierwszych 24 godzin badania, a następnie stopniowo malał on w czasie, co potwierdza, że cząsteczki lentiwirusowe naniesione na rusztowania zachowują swoją aktywność biologiczną do 96 godzin.Analiza in vivo naczyń krwionośnych utworzonych w obrębie ubytku kostnego sklepienia czaszki wykazała, że nowe naczynia krwionośne, niewykrywalne w grupie kontrolnej myszy, były wyraźnie widoczne w grupach PH i PHp osiem tygodni po transplantacji rusztowania. Dodatkowo, choć w obu grupach PH i PHp wykryto wiele miejsc odkładania kolagenu, tylko w grupie PHp zaobserwowano rosnącą liczbę mniejszych naczyń wrastających w rusztowania, a całkowita powierzchnia naczyń krwionośnych różniła się znacząco. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch godzin.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby unieruchomić głowę myszy, aby pozostała w bezruchu podczas skanowania i uniknąć powstania artefaktów. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak obrazowanie fotoakustyczne, w celu uzyskania dodatkowych danych, np. obrazów głębokich tkanek. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie regeneracji kości do badania angiogenezy w przeszczepach.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wizualizacji tworzenia się plazmy in vivo w rusztowaniach 3D w czasie rzeczywistym oraz na temat mikrofotonowej mikroskopii.

visualizing-angiogenesis-multiphoton-microscopy-vivo-genetically

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Opisujemy nowatorską technikę obrazowania in vivo, która łączy fluorescencyjne chimeryczne myszy z oknami wewnątrzczaszkowymi i mikroskopią 2-fotonową o wysokiej rozdzielczości. Ta platforma obrazowania wspomaga badania dynamicznych zmian w tkance mózgowej i mikrokrążeniu na poziomie pojedynczej komórki, po patologicznych urazach i jest przystosowana do oceny wewnątrzczaszkowego dostarczania i dystrybucji leków.

Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Model in vitro niszy naczyniowej szpiku kostnego jest tworzony przez wysiewanie komórek mezenchymalnych i śródbłonka na prefabrykowane hydrożele PEG 3D. Sieci śródbłonka, komponenty ECM i aktywność ALP w niszach różnią się w zależności od zastosowanego czynnika wzrostu. Platforma może być wykorzystywana do zaawansowanych modeli nowotworów.

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Mikroskopia przyżyciowa umożliwia badanie dynamicznych procesów biologicznych, takich jak regeneracja tkanek i rozwój guza. Szpik kostny kalwarii, wysoce dynamiczna tkanka, oferuje wgląd w hematopoezę i funkcję naczyń krwionośnych. Korzystanie z biokompatybilnego, wydrukowanego w 3D implantu mocującego głowę pozwala na powtarzalne obrazowanie podłużne, zwiększając naszą wiedzę na temat dynamiki tkanek i mikrośrodowiska guza.

Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Angiogeneza kiełkowania, fundamentalna dla rozwoju i choroby, obejmuje złożone procesy molekularne i mechaniczne. Przedstawiamy wszechstronny model 2,5D ex vivo, który analizuje kiełkowanie komórek z tętnic szyjnych świń, ujawniając angiogenezę zależną od sztywności i wyraźną mechanikę komórek lidera-podążacza. Model ten pomaga w rozwijaniu strategii inżynierii tkankowej i podejść do terapii nowotworów.

Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

Poznaj wizualizację angiogenezy in vivo za pomocą mikroskopii wielofotonowej w rusztowaniach 3D-PLGA/nHAp. Ta metoda pozwala obserwować tworzenie naczyń krwionośnych w czasie rzeczywistym u myszy z defektem kości calowej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Przeglądaj więcej filmów