Name: Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę izolacji rzadkich limfocytów B wiążących antygen z krwi obwodowej człowieka przy użyciu nanocząstek magnetycznych. Technika umożliwia szczegółową analizę fenotypową i funkcjonalną komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) i National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, i F30OD021477).

1. Izolacja ludzkich PBMC
<ol>
	<li>Pobrać 30-50 ml krwi za pomocą probówek do pobierania krwi w kolorze heparyny. 
	UWAGA: Ilość użytej krwi zależy od konkretnego pytania eksperymentalnego i częstości występowania we krwi limfocytów B specyficznych dla antygenu. Heparynizowana krew może być natychmiast przetworzona lub delikatnie kołysana przez noc w temperaturze pokojowej w celu przetworzenia następnego dnia. Opóźnienie w przetwarzaniu ma bardzo mały wpływ na efektywność wzbogacania i wiąże się z minimalną utratą żywotności.</li>
	<li>Wymieszaj krew pełną 1:1 ze sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) o temperaturze pokojowej (PBS).</li>
	<li>Do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać 10 ml roztworu gradientu gęstości o temperaturze pokojowej. Otwarte butelki z gradientem gęstości przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C, ale przed użyciem ogrzać je do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Jeśli to możliwe, ustaw pistolet do pipet na wolne ustawienie i/lub zastosuj bardzo mały, ale stały nacisk na spust, aby powoli nałożyć 30-35 ml rozcieńczonej krwi na gradient gęstości, uważając, aby nie wymieszać tych dwóch. 
	UWAGA: Przyłożenie końcówki pipety do krawędzi stożkowej pipety o pojemności 50 ml podczas dodawania rozcieńczonej krwi pomoże zapewnić stały, stały przepływ.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze 20 °C przy wyłączonym hamulcu.</li>
	<li>Usuń górną warstwę, która zawiera osocze i płytki krwi, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórek jednojądrzastych poniżej.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety zebrać warstwę komórek jednojądrzastych (kożuch) i umieścić w oddzielnej sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać PBS do zawiesiny komórek w objętości 50 ml. Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C z hamulcem.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w 10 ml PBS. Policz komórki i określ żywotność za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w stężeniu10-7 komórek/ml i umieścić na lodzie, aż będą gotowe do dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
2. Barwienie komórek
<ol>
	<li>Usuń 1-2 x 106 komórek dla każdej potrzebnej kompensacji fluorescencji/kontroli FMO, jeśli ma to zastosowanie. Odwirować pozostałe komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z hamulcem.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w sterylnym, przefiltrowanym, zimnym buforze FACS (PBS + 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 0,01% azydku sodu) w stężeniu 3-6 x 107 komórek/ml (usunąć w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml). Upewnij się, że bufor FACS jest zimny i utrzymuj go na lodzie przez cały czas trwania procedury barwienia.
	<ol>
		<li>Podziel populację komórek na ćwiartki (A-D) podczas optymalizacji testu. Użyj frakcji A do wzbogacenia komórek B specyficznych dla antygenu, użyj frakcji B i C, aby określić specyficzność wzbogacenia/barwienia (patrz 2.5 i 2.6 poniżej) i użyj frakcji D, aby określić częstość i liczbę komórek specyficznych dla antygenu w populacji niewzbogaconej, aby umożliwić obliczenie wydajności i wzbogacenia fałdowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać ludzki odczynnik blokujący FcγR do frakcji A-D na lodzie, aby zapobiec wiązaniu przeciwciał z receptorami Fc. 
	UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać odpowiednie warunki.</li>
	<li>Dodaj przeciwciała sprzężone z fluorochromem do antygenów powierzchniowych komórek interesujących frakcje A-D przez 30 minut na lodzie w ciemności, uważając, aby nie uwzględnić fluorochromów, które mogą reagować krzyżowo z przeciwciałami barwnika anty-dalekiej czerwieni fluorescencyjnej sprzężonymi z nanocząstkami magnetycznymi. 
	UWAGA: Należą do nich koniugaty przeciwciał przeciwko barwnikowi fluorescencyjnemu bliskiej podczerwieni, Cy5, Cy5.5 i Cy7. Wszelkie dodane plamy żywotności powinny być zgodne z użyciem utrwalacza. Jeśli ktoś nie zamierza analizować komórek za pomocą FACS, ale określa częstotliwość wydzielania przeciwciał, na przykład za pomocą ELISPOT, barwienie powierzchni przeciwciałami nie jest konieczne.</li>
	<li>Aby sprawdzić swoistość testu, inkubować frakcję B z wystarczającą ilością nieznakowanego antygenu przez 30 minut na lodzie, tak aby większość receptorów o powinowactwie co najmniej 10-6 M była zablokowana. 
	UWAGA: Zazwyczaj dobre stężenie początkowe to 50-100 krotne przekroczenie ilości antygenu uznanej za wystarczającą w 2,6 poniżej (np. 50-100 μM). Powinno to zablokować wiązanie się wszystkich komórek B o wysokim powinowactwie do nieznakowanego antygenu z antygenem biotynylowanym, który dodaje się w kroku 2.6 poniżej, umożliwiając w ten sposób potwierdzenie specyficzności wzbogaconych komórek. Ten krok można wykonać w połączeniu z krokiem 2.4 powyżej.</li>
	<li>Dodać biotynylowany antygen do frakcji A, B i D. Inkubować na lodzie przez 30 min. 
	UWAGA: Stężenie antygenu biotynylowanego należy miareczkować w celu określenia optymalnej ilości potrzebnej do zapewnienia odpowiedniego wykrywania i oddzielania komórek wiążących od niespecyficznych komórek postronnych. Zazwyczaj dobrym stężeniem początkowym do badania jest 1-5 μM. 
	UWAGA: W przypadku ułamków A i D ten krok można wykonać równolegle z krokiem 2.4 powyżej. W przypadku frakcji B ten krok należy wykonać po kroku 2.5 (mycie między krokami nie jest konieczne).</li>
	<li>Pomiń biotynylowany antygen z frakcji C w celu określenia jakiegokolwiek wiązania limfocytów B z innymi odczynnikami w protokole, takimi jak streptawidyna - barwnik fluorescencyjny dalekiej czerwieni i kulki magnetyczne.</li>
	<li>Przepłukać komórki dwukrotnie przez zawieszenie komórek w 1 ml zimnego buforu FACS na 5 x 107 komórek i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu rozcieńczyć skoncentrowaną zawiesinę komórkową w 1 ml 2% formaldehydu na 5 x 107 komórek i pozostawić w ciemności na lodzie przez 5 min. 
	UWAGA: Utrwalenie komórek w tym momencie zapewnia, że biotynylowany antygen pozostaje związany z BCR przez pozostałą część procedury. W przypadku komórek żywotnych – do dalszej analizy, takiej jak w przypadku ELISPOTs lub transferów adoptywnych, należy pominąć etap fiksacji.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu FACS na 5 x 107 komórek i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić w 1 ml zimnego buforu FACS na 5 x 107 komórek.</li>
	<li>Dodać 1-2 μg barwnika fluorescencyjnego streptawidyny dalekiej czerwieni/ml i inkubować na lodzie przez 20 minut w ciemności. Miareczkować ilość streptawidyny dla każdej aplikacji.</li>
	<li>Umyć komórki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu FACS na 5 x 107 komórek i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przygotowanie frakcji D jest zakończone w tym momencie, ponieważ nie będzie ona ulegać wzbogacaniu za pomocą kulek magnetycznych. 
	UWAGA: Ta próbka zostanie wykorzystana do określenia częstotliwości i liczby limfocytów B specyficznych dla antygenu w próbce. Zostanie to wykorzystane do określenia plonu i wzbogacenia fałdowego osiągniętego przez wzbogacenie.</li>
</ol>
3. Wzbogacanie oparte na nanocząstkach magnetycznych
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki z próbek A-C w 1 ml zimnego buforu do separacji (PBS + 0,5% BSA + 2mM EDTA) na 5 x 107 komórek i przepuścić przez filtr 40 μm w celu wyeliminowania wszelkich grudek, które mogłyby zatkać kolumnę.</li>
	<li>Dodaj nanocząsteczki barwnika anty-cy5/anty-dalekiej czerwonej fluorescencji. Aby uzyskać optymalne wyniki, stężenie nanocząstek należy miareczkować dla każdego użycia, ale dobrym punktem wyjścia jest 50 μl zawiesiny na 5 x 107 komórek/ml. Obracać w ciemności w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie 1 ml zimnego buforu rozdzielającego o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml zimnego buforu rozdzielającego na 5 x 107 komórek.</li>
</ol>
4. Wzbogacanie magnetyczne za pomocą kolumn LS lub LD
<ol>
	<li>Umieścić trzy kolumny LS lub LD w polu magnetycznym separatora magnetycznego i dodać 3 ml buforu separacyjnego w celu zwilżenia kolumn (patrz opis produktu, aby określić, który typ kolumny jest najbardziej odpowiedni). Pozwolić, aby wszystkie 3 ml przeszły przez kolumnę i wyrzucić po zebraniu. 
	UWAGA: Chociaż separację komórek znakowanych nanocząstkami magnetycznymi można przeprowadzić za pomocą dowolnego z dostępnych na rynku urządzeń do separacji magnetycznej, laboratorium odniosło największy sukces przy użyciu kolumn LS pod względem wydajności, czystości i efektywności wzbogacania.</li>
	<li>Umieścić pod kolumną trzy stożkowe probówki o pojemności 15 ml oznaczone jako "Frakcja A/(B)/(C) ujemna" dla ujemnie wybranych komórek. Dodaj komórki oznaczone cząstkami magnetycznymi do odpowiedniej kolumny i pozwól, aby cała objętość przeszła.</li>
	<li>Na wierzch dodać 3 ml zimnego buforu do rozdzielania i pozostawić do przejścia przez kolumnę, a następnie powtórzyć z 2 ml. Zebrać ujemnie wybrane komórki i odłożyć na lód.</li>
	<li>Usuń kolumnę z pola magnetycznego i umieść ją na stożkowej probówce o pojemności 15 ml oznaczonej jako "Frakcja A/(B)/(C) dodatnia", dla pozytywnie wybranych komórek.</li>
	<li>Napełnić kolumnę do góry około 6 ml buforu separacyjnego i natychmiast zanurzyć tę objętość w kolumnie, aby zebrać komórki, które związały się z polem magnetycznym za pomocą dostarczonego tłoka.</li>
	<li>Aby zwiększyć czystość, pozytywnie wybrane komórki można dodatkowo wzbogacić za pomocą drugiej czystej kolumny, powtarzając procedurę.</li>
	<li>Wirować zarówno ujemo, jak i dodatnio wybrane frakcje w temperaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zawiesić w żądanej objętości końcowej. Kontynuuj dalszą analizę, taką jak FACS, ELISPOT lub transfer adopcyjny.</li>
</ol>

<ol><li>de Wildt, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+analysis+and+production+of+monoclonal+antibody+fragments+originating+from+single+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells.</a> J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).</li>
<li>Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fractionation+and+arrangement+on+fibers%2C+beads%2C+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).</li>
<li>Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new%2C+simple+method+for+the+preparation+of+lymphocytes+bearing+specific+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors.</a> Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).</li>
<li>Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+centrifugation+procedure+for+the+purification+of+sheep+erythrocyte+antigen-binding+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells.</a> J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).</li>
<li>Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+antigen-enriched+b+cells.+I.+Purification+and+response+to+thymus-independent+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens.</a> J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).</li>
<li>Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+of+antigen-specific+B+lymphocytes+by+means+of+immunomagnetic+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles.</a> Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).</li>
<li>Smith, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+anergic+B+cells+in+prediabetic+and+new-onset+type+1+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients.</a> Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).</li>
<li>Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+specificity+contributes+to+the+outcome+of+diabetes+in+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice.</a> J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).</li>
<li>Woda, M., Mathew, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+dengue+viruses+as+probes+to+identify+antigen-specific+memory+B+cells+by+multiparametric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).</li>
<li>Nair, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+fluorescent+labeling+to+identify+memory+B+cells+specific+for+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+vaccine+antigens+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immun+Inflamm+Dis%22%5BJournal%5D)">Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo.</a> Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).</li>
<li>Amanna, I. J., Slifka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+rare+memory+B+cell+populations+by+two+independent+and+complementary+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches.</a> Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).</li>
<li>Scheid, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+identification+of+HIV+gp140+binding+memory+B+cells+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood.</a> Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).</li>
<li>Doucett, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+characterization+of+virus-specific+B+cells+by+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry.</a> Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).</li>
<li>Malkiel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints+for+Autoreactive+B+Cells+in+Peripheral+Blood+of+Lupus+Patients+Assessed+By+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry.</a> Arthritis Rheumatol. , (2016).</li>
<li>Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+B+cell+populations+mediate+early+and+late+memory+during+an+endogenous+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response.</a> Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).</li>
<li>Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD20+positive+human+B+lymphocytes+separated+with+the+magnetic+cell+sorter+%28MACS%29+can+be+induced+to+proliferation+and+antibody+secretion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro.</a> Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj opisujemy nowatorską metodę izolacji i wzbogacania limfocytów B wiążących antygen z ludzkiej krwi obwodowej. Metoda ta jest łatwo stosowana u myszy i innych tkanek, takich jak śledziona i węzły chłonne, i jest zgodna z analizą fenotypu i funkcji komórek po wzbogaceniu (manuskrypt w przygotowaniu).
Użytkownik powinien być świadomy wielu zmiennych, które mogą mieć wpływ na powodzenie tej procedury. Z doświadczenia wynika, że martwe komórki mają tendencję do przyklejania się do kulek magnet...

Analizy ograniczające rozcieńczenie częstotliwości prekursorów komórek wydzielających przeciwciała sugerują, że limfocyty B reagujące na określony antygen zazwyczaj występują z częstotliwością od 0,05 do 0,005% w normalnym repertuarze, w zależności od statusu szczepienia i wielkości/liczby epitopów obecnych na antygenie. Niska częstość występowania tych komórek utrudnia badanie zmian w ich statusie podczas rozwoju odpowiedzi immunologicznej, na przykład po szczepieniu lub ekspozycji na obcy antygen, lub podczas rozwoju autoimmunizacji. Wcześniej naukowcy podjęli się izolacji komórek B reagujących na antygen przy użyciu różnych technik, od płytek pokrytych antygenem lub adsorbentów kolumnowych, przez resetowanie czerwonych krwinek powlekanych antygenem, po sortowanie komórek aktywowane fluorescencją1,2,3,4,5,6. Chociaż techniki te okazały się skuteczne w identyfikacji i izolacji limfocytów B reagujących na antygen, wyniki różniły się pod względem wydajności, czystości i skalowalności. Niedawno opracowaliśmy nowatorską metodę wykrywania i wzbogacania rzadkich subpopulacji limfocytów B za pomocą nanocząstek magnetycznych. Metoda umożliwia wzbogacenie z relatywnie wysoką wydajnością i czystością z dużych populacji wyjściowych i jest kompatybilna z analizą odpowiedzi na antygen. Wzbogacając populacje komórek w zawiesinie, metoda eliminuje ograniczenia związane z geometrią płytek lub kolumn pokrytych antygenem i ogranicza przepustowość. Wreszcie, ponieważ wzbogacone komórki pozostają związane z antygenem i fluorescencyjnym reporterem, można je dalej oczyszczać przez sortowanie FACS. Jak opisano w niniejszym dokumencie, zastosowaliśmy to podejście do badania limfocytów B reaktywnych na toksoidy tężca we krwi obwodowej przed i po immunizacji ludzi, a także komórek B reagujących na autoantygen od osób z różnymi zaburzeniami autoimmunologicznymi, w tym cukrzycą typu 1, chorobą Gravesa-Basedowa i chorobą Hashimoto7. Metoda działa równie dobrze u myszy, jak i u ludzi i jest kompatybilna z analizą komórek B reagujących na antygen z różnych tkanek (manuskrypt w przygotowaniu).
W swoim podstawowym formacie, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są najpierw inkubowane z antygenem biotynylowanym wraz z przeciwciałami przeciwko antygenom powierzchniowym komórek wymaganym do analizy fenotypowej. Po tym etapie znakowania następuje mycie i utrwalanie oraz dodanie streptawidyny sprzężonej z barwnikiem fluorescencyjnym dalekiej czerwieni w celu wykrycia komórek wiążących antygen biotynylowany (ryc. 1). Poprzednie badania zidentyfikowały limfocyty B specyficzne dla antygenu w podobny sposób, ale przy użyciu antygenów bezpośrednio sprzężonych z fluorochromem8,9,10,11. Chociaż jest to godne uwagi podejście, stosowanie biotynylowanych antygenów w połączeniu ze streptawidyną umożliwia większe wzmocnienie sygnału (a tym samym lepsze różnicowanie komórek wiążących i niewiążących), szczególnie gdy antygeny są małe12,13,14. Dodatkową kwestią jest stosowanie streptawidyny zamiast awidyny, ponieważ streptawidyna jest deglikozylowana, co zmniejsza niespecyficzne wiązanie. Ponadto używamy barwnika fluorescencyjnego dalekiej czerwieni jako fluorochromu ze względu na jego fotostabilność, wydajność kwantową (jasność) i mały rozmiar (~1,3 kD). Fluorochromy białkowe, takie jak fikoerytryna (~250 kD) i allofikocyjanina (~105 kD)15 nie są optymalne, ponieważ potencjalnie zawierają wiele epitopów antygenowych. Zastosowanie małego organicznego barwnika fluorescencyjnego składającego się z pojedynczego epitopu, takiego jak barwnik fluorescencyjny dalekiej czerwieni, zmniejsza złożoność izolowanej populacji komórek.
Po zaadsorbowaniu antygenu biotynylowego i barwnika streptawidyny barwnika dalekiej czerwonej fluorescencji, są one wzbogacane za pomocą nanocząsteczek magnetycznych sprzężonych z barwnikiem anty-dalekiej czerwieni. Pojedyncze nanocząstki nie są wykrywane przez większość cytometrów przepływowych i dlatego nie muszą być usuwane przed oczyszczeniem przez sortowanie FACS i dalsze testy16. Selekcja magnetyczna limfocytów B specyficznych dla antygenu wzbogaca badaną populację, eliminując czas i koszty sortowania rzadkich zdarzeń za pomocą cytometru przepływowego.
Poniżej pokazujemy reprezentatywne wyniki wzbogacenia komórek B specyficznych dla toksoidu tężcowego od osoby badanej przed i siedem dni po szczepieniu przypominającym toksoidem tężcowym. Wybraliśmy to konkretne zastosowanie jako przykład, aby zademonstrować zdolność tej metody do wzbogacania limfocytów B specyficznych dla antygenu po ostrej stymulacji in vivo. W połączeniu z cytometrią przepływową, metoda ta jest w stanie wzbogacić i zróżnicować specyficzne dla antygenu naiwne, pamięciowe i plazmablastowe limfocyty B oraz pozwala badaczowi śledzić zmiany ich częstości w czasie. Ponadto uwzględniamy inny możliwy test dalszy, np. test ELISPOT, który pokazuje, że komórki zachowują zdolność do wydzielania przeciwciał po wzbogaceniu. Innym zastosowaniem tej metody może być adoptywny transfer wzbogaconych komórek do gospodarza. Wcześniej wykazaliśmy, że komórki zachowują zdolność do działania jako komórki prezentujące antygen limfocytom T specyficznym dla antygenu po izolacji i transferze (dane nie pokazane). W związku z tym istnieje szereg możliwych dalszych testów, które można sprzęgnąć z metodą, co razem informuje o zrozumieniu odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla antygenu. Poniżej opisaliśmy metodę, w tym kontrole w celu określenia ogólnej wydajności, czystości, swoistości komórek i wzbogacenia fałdowania.

<table><tbody><tr><td>Antygen o zmiennej zmiennej co</td><td></td><td></td><td>najmniej 100 &mu; g do łatwego biotynylowania; jeśli używasz białka, spróbuj użyć białka, które zostało zatwierdzone przez ELISA. Musi to być przewoźnik&nbsp; Nie zawiera białka.</td></tr><tr><td>Biotyna do etykietowania; np. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>Biotyna jest dostępna w różnych preparatach, takich jak te zawierające&nbsp; przekładki o różnej długości, więc rodzaj zastosowany powinien zostać określony przez badacza</td></tr><tr><td>Streptawidyna-Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S21374</td><td>Można uzyskać od innych dostawców.</td></tr><tr><td>Mikrogranulki Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-395</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separatory ręczne MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Zmienna</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyd</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczony do 2% z PBS; opcjonalnie, jeśli dalszy test wymaga żywych komórek</td></tr><tr><td>PBS bez wapnia i magnezu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Krew pełna w heparynizowanych probówkach</td><td></td><td></td><td></td>do pobierania</tr><tr><td>Bufor FACS (PBS + 1% BSA + 0,01% azydek sodu)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor separacyjny (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>stożkowe 15 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki Eppendorfa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marker powierzchniowy przeciwciała reaktywne, Fc Block, żywe/martwe barwienie dyskryminujące, w razie potrzeby</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zapasy ELISPOT, jeśli to konieczne</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów b specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Limfocyty B reagujące ze specyficznym antygenem zwykle występują z częstością <0,05% limfocytów. Przez dziesięciolecia naukowcy poszukiwali metod izolowania i wzbogacania tych rzadkich komórek do badań nad ich fenotypem i biologią. Podejścia te nieuchronnie opierają się na zasadzie, że limfocyty B rozpoznają natywny antygen dzięki receptorom na powierzchni komórki, które są reprezentatywne pod względem specyficzności przeciwciał, które ostatecznie zostaną wydzielane przez ich zróżnicowane córki. Być może najbardziej oczywistym podejściem do problemu jest użycie antygenów sprzężonych z fluorochromem w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS). Jednak użyteczność tych metod jest ograniczona przez częstotliwość komórek oraz osiągalną szybkość analizy i izolacji za pomocą sortowania elektronicznego. Opisano nowatorską metodę wzbogacania rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych, która skutkuje wysokowydajnym wzbogacaniem komórek B reagujących na antygen z dużych początkowych populacji komórek. Metoda ta umożliwia lepsze monitorowanie fenotypu i biologii komórek reagujących na antygen przed i po kontakcie z antygenem in vivo, np. po immunizacji lub w trakcie rozwoju autoimmunizacji.

Analiza czystości, wydajności i stopnia wzbogacenia z wykorzystaniem cytometrii przepływowej
Populacje wzbogacone zgodnie z powyższym opisem nieuchronnie zawierają komórki zanieczyszczające, które nie związały streptawidyny znakowanej barwnikiem fluorescencyjnym w dalekiej czerwieni, lecz zostały uwięzione w macierzy. Zanieczyszczenia te można usunąć z wzbogaconych populacji za pomocą sortowania FACS. Aby oszacować czystość wzbogac...

Opisana jest prosta, ale skuteczna metoda, która wykorzystuje magnetyczne nanocząstki do wykrywania i wzbogacania komórek B reagujących na antygen do analizy funkcjonalnej i fenotypowej.

Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Ogólnym celem tej prostej, lecz skutecznej procedury jest izolacja i wzbogacenie populacji rzadkich limfocytów B wiążących antygen z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu nanocząsteczek magnetycznych w celu przeprowadzenia analizy fenotypowej i funkcjonalnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii dotyczące fenotypu i biologii rzadkich limfocytów B wiążących antygen, zarówno przed, jak i po kontakcie z antygenem in-vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że eliminuje ona problemy związane z geometrią, szczególnie w przypadku stosowania płytek styrenowych lub dużych kulek.Eliminuje to problemy związane z szybkością przepływu podczas izolowania rzadkich komórek z dość dużych populacji wyjściowych przy użyciu cytometrii przepływowej. Bezpośrednio po pobraniu od 30 do 50 ml krwi pełnej do probówek z heparyną, wymieszaj krew w stosunku 1:1 ze sterylnym, pokojowym PBS pozbawionym magnezu i wapnia. Następnie, za pomocą wolnego i jednostajnego nacisku na tłok pipety, nanieś mieszaninę krwi na 10 ml roztworu gradientu gęstości o temperaturze pokojowej w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 ml.Rozdziel komórki poprzez wirowanie. Odrzuć osocze i

detection-enrichment-rare-antigen-specific-b-cells-for-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza procedura opisuje detekcję i izolację leukocytów TH17 myszy, które po stymulacji aktywnie wydzielają IL-17.

Wykrywanie i izolacja żywych limfocytów T wydzielających IL-17 u myszy

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tetramerów peptyd:MHC oraz magnetycznych mikrokulek do izolacji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o niskiej częstotliwości oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia bezpośrednie badanie endogennych populacji limfocytów T w systemach eksperymentalnych in vivo.

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Ten film demonstruje użycie testu ELISpot do oceny funkcji komórek B wydzielających przeciwciała, ASC. Przeciwciała wydzielane przez ASC oddziałują z fragmentami przeciwciał poliklonalnych związanymi z błoną, które są wykrywane przez przeciwciała IgG lub IgM sprzężone z enzymem. Kolorowa plamka wytworzona w każdym dołku wskazuje na obecność specyficznego izotypu przeciwciała, który koreluje z aktywnością wydzielniczą limfocytów B.

Ocena funkcjonalna limfocytów B wydzielających przeciwciała za pomocą testu ELISpot

Analiza in vitro rekombinacji przełączników klas u myszy jest trudna ze względu na cytofilne cząsteczki IgE związane z receptorami Fc na powierzchni komórek B.  Opisujemy metodę wykrywania IgE za pomocą rozszczepienia IgE związanego powierzchniowo za pośrednictwem trypsyny przed utrwaleniem i przepuszczalnością w celu barwienia fluorescencji cytoplazmatycznej.

Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Limfocyty T specyficzne dla antygenu są trudne do scharakteryzowania lub wykorzystania w terapiach ze względu na ich ekstremalnie niską częstotliwość. W tym miejscu przedstawiamy protokół rozwoju cząsteczki magnetycznej, która może wiązać się z limfocytami T specyficznymi dla antygenu, aby wzbogacić te komórki, a następnie rozszerzyć je kilkaset razy zarówno w celu charakteryzacji, jak i terapii.

Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Poznaj metodę izolacji rzadkich limfocytów B wiążących antygen z krwi obwodowej człowieka przy użyciu nanocząstek magnetycznych. Technika umożliwia szczegółową analizę fenotypową i funkcjonalną komórek immunologicznych.

Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

Przeglądaj więcej filmów