Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

Ogólnym celem tej prostej, ale skutecznej procedury jest wyizolowanie i wzbogacenie o rzadkie limfocyty B wiążące antygen z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu nanocząstek magnetycznych do ich analizy fenotypowej i funkcjonalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii dotyczące fenotypu i biologii rzadkich limfocytów B wiążących antygen zarówno przed, jak i po spotkaniu z antygenem in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że eliminuje ona problemy związane z geometrią, szczególnie gdy używa się płyty styrenowej lub dużego koralika.

Eliminuje to problemy związane z szybkością przepływu, gdy izoluje się komórki za pomocą cytometrii przepływowej w celu wyizolowania rzadkich komórek w dość dużych początkowych populacjach komórek. Natychmiast po pobraniu od 30 do 50 mililitrów krwi pełnej do probówek do pobierania krwi w heparyniźnie, wymieszaj krew w stosunku 1:1 ze sterylnym PBS bez magnezu i wapnia w temperaturze pokojowej. Następnie ułóż mieszaninę krwi na 10 mililitrach roztworu gradientu gęstości o temperaturze pokojowej w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, używając powolnego, stałego ciśnienia spustu pipety.

Oddziel komórki przez odwirowanie. Wyrzuć górną warstwę osocza i płytek krwi i użyj sterylnej pipety, aby przenieść pojemnik na komórki jednojądrzaste Buffy Coat do nowej sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów. Napełnij probówkę do 50 mililitrami PBS do płukania komórek jednojądrzastych przez odwirowanie.

Następnie ponownie zawieś granulki w 10 mililitrach świeżego PBS w celu liczenia i ponownie zawieś komórki w stężeniu 1x10^7 komórek na mililitr w świeżym PBS na lodzie. Aby zabarwić komórki w celu wiązania kulek magnetycznych, najpierw przenieś podwielokrotności komórek 1-2x10^6 do pięciu mililitrowych rurek polistyrenowych dla każdej kompensacji fluorescencji i kontroli fluorescencji minus jeden, jeśli jest to odpowiednie. Następnie zbierz pozostałą część próbki komórek przez odwirowanie i ponownie zawieś osad do stężenia 3-6x10^7 komórek na mililitr w sterylnym, przefiltrowanym, zimnym buforze FACS.

Podziel roztwór komórkowy równo na cztery probówki FACS na lodzie i dodaj ludzki reagant blokujący receptor Fcgamma do tych czterech eksperymentalnych frakcji próbki. Pod koniec inkubacji blokującej wiązanie niespecyficzne dodać odpowiednie przeciwciała barwiące powierzchnię komórek sprzężone z fluorescencją do komórek we wszystkich czterech frakcjach próbki. Następnie dodać odpowiedni biotynylowany antygen do frakcji A i D, a następnie dodać wystarczającą ilość nieznakowanego antygenu do frakcji B, tak aby większość receptorów o powinowactwie co najmniej 1x10^6 molowych została zablokowana.

Inkubować wszystkie próbki przez 30 minut na lodzie, a następnie przez 30 minut inkubować frakcję B z odpowiednim antygenem biotynylowanym. Pod koniec inkubacji umyj komórki dwa razy w jednym mililitrze lodowatego buforu FACS na 5x10^7 komórek. I ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze 2% formaldehydu na komórki 5x10^7 przez pięć minut w ciemności na lodzie.

Po utrwaleniu umyj komórki jeszcze dwa razy, jak właśnie pokazano. I ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze świeżego, lodowatego bufora FACS na komórki 5x10^7. Następnie oznacz komórki jednym do dwóch mikrogramów odpowiedniego wtórnego przeciwciała sprzężonego ze streptawidyną przez 20 minut w ciemności na lodzie i umyj komórki jeszcze dwa razy.

W celu wzbogacenia opartego na nanocząstkach magnetycznych należy ponownie zawiesić frakcje komórek A, B i C w jednym mililitrze zimnego bufora separacyjnego na 5x10^7 komórek i przefiltrować komórki przez indywidualne sitka o pojemności 40 mikrolitrów, aby wyeliminować wszelkie grudki. Następnie dodaj nanocząstki barwnika fluorescencyjnego o odpowiednim stężeniu przez 10 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją i umyj próbki dwa razy w jednym mililitrze zimnego buforu separacyjnego. Ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze zimnego buforu separacyjnego na 5x10^7 komórek.

Następnie zrównoważyć trzy kolumny magnetyczne na ich magnesach o odpowiedniej wielkości z trzema mililitrami bufora separacyjnego każda, pozwalając całej objętości bufora separacyjnego przepłynąć przez każdą kolumnę do pojemnika na odpady. Teraz umieść jedną oznaczoną stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów pod każdą kolumną i dodaj komórki oznaczone cząstkami magnetycznymi do odpowiednich kolumn. Gdy cała objętość każdej frakcji komórkowej przejdzie przez każdą kolumnę, dodaj trzy mililitry świeżego, lodowatego buforu separacyjnego na górę każdej kolumny, zbierając ścieki w oznaczonych probówkach.

Po całkowitym przepłukaniu drugiego płukania przez kolumny, umieść probówki z ujemnie wybranymi komórkami z każdej frakcji na lodzie i przenieś kolumny do nowych 15-mililitrowych probówek dla każdej frakcji. Napełnij każdą kolumnę około sześcioma mililitrami świeżego buforu separacyjnego i natychmiast zanurz bufor w kolumnach, aby zebrać komórki związane magnetycznie. Następnie zebrać zarówno dodatnie, jak i ujemne frakcje komórek przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w odpowiednim roztworze do planowanej dalszej analizy.

Na tych wykresach częstość występowania reaktywnych komórek B toksoidu tężcowego od osoby, która została ostatnio zaszczepiona przeciwko tężcowi ponad dekadę temu, pokazuje zdolność tej metody do wykorzystania do wzbogacenia komórek wiążących toksoid tężcowy około siedmiokrotnie o czystości około 4%Dodanie 50-krotnego nadmiaru nieznakowanego toksoidu tężcowego do komórek od osoby, która została zaszczepiona około trzy lata przed pobraniem krwi. Przed dodaniem antygenu biotynylowanego wiązanie tężcowo-toksoidowe zmniejsza się o 83%, co świadczy o swoistości wiązania antygenu. Gdy biotynylowany antygen zostanie pominięty w procedurze, tylko 0,2% limfocytów B nadal się wiąże, przypuszczalnie odzwierciedlając wiązanie jakiegoś antygenu nietężcowego w absorbencie.

Wykresy te pokazują, w jaki sposób częstość występowania naiwnych limfocytów B specyficznych dla toksoidu tężcowego w próbce krwi pobranej siedem dni po szczepieniu przypominającym zdrowej osoby zmniejsza się z 84% do 64% po szczepieniu przypominającym. Podczas gdy odsetek populacji pamięci i plazmabblastów wzrasta odpowiednio z 16% do 36% i od zera do 40%. Co więcej, reprezentatywne dane ELISPOT z próbki krwi obwodowej uzyskanej siedem dni po podaniu dawki od zdrowego osobnika ilustrują czterokrotne wzbogacenie częstości komórek wydzielających przeciwciała toksoidu tężcowego obserwowane w izolowanych limfocytach B wiążących toksoid tężcowy.

Po opanowaniu tej techniki można ukończyć w około trzy do czterech godzin przy wszystkich odpowiednich kontrolach. Metodę tę można łączyć z testami wtórnymi, na przykład transferem komórek do adoptowanych biorców w celu późniejszych badań losu i funkcji komórki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i wzbogacać rzadkie limfocyty B wiążące antygen z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu odpowiednich kontroli.